專利名稱：一種基于吡啶二羧酸的稀土發(fā)光納米粒子的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于吡啶二羧酸的稀土發(fā)光納米粒子的制備方法，主要用于 生物分子的熒光檢測和示蹤，屬于生物分子納米標記物制備的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
熒光檢測、成像技術(shù)在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等眾多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，然而 傳統(tǒng)的熒光分析使用的各種有機染料分子易受到各種非特異性熒光的干擾(激發(fā) 光、散射光及分析物背景熒光)，同時染料分子容易發(fā)生光漂白及淬滅效應(yīng)導(dǎo)致 熒光強度降低。納米標記物是近年來發(fā)展起來的一種新型標記物，由于納米粒子 通過表面吸附或包埋等方式裝載了若干個熒光分子，因此用納米粒子標記后，熒 光發(fā)射強度將大大增強，有力的提升測定的靈敏度。
有關(guān)熒光納米粒子的制備方法報道的有商業(yè)上(Bangs Laboratories, Dynal Inc， Molecular Probe etc)可獲得的各種裝載染料熒光分子的高分子微球，但 大部分高分子微球粒徑在pra量級(〉100 nm)，作為標記物尺寸常過大，疏水性一 的表面在水溶液中容易相互聚集，裝載的染料分子存在泄漏。國內(nèi)報道過通過微 乳液中聚合反應(yīng)制備納米到微米級的聚苯乙烯、聚丙稀酰胺、聚丙烯酸等微球的 方法(中國專利公開號CN1278534A, 2002年，趙藝強，高海峰，楊武利，府壽 寬，熒光標記的高分子微球及其制備方法)，在這些微球的表面吸附或共價鍵合 了多個FITC、 Rhodamine 6G、 Cy類熒光染料分子，由于是在微球表面攜帶熒光 分子，熒光分子本身易被光漂白和在水溶液中易受溶劑分子淬滅的不足，沒有得 到克服。
文獻報道了Si02包裹熒光分子制備納米粒子的方法(Nynke A. M. Verhaegh and Alfons van Blaaderen, Langmuir, 1994, 10, 1427-1438; Swadeshmukul Santra, Peng Zhang, Kemin Wang, Rovelyn Tapec and Weihong Tan, Anal Chem, 2001, 73， 4988-4993; Swadeshmukul Santra, Heesun Yang, Debamitra Dutta, Jessie T. Stanley,
4Paul H. Holloway, Weihong Tan, Brij M. Moudgilb and Robert A. Mericle, Chem Commun, 2004,2810-2811)，中國專利公開號CN 1342515A, 2002年，譚蔚泓，
王柯敏，肖丹，核殼型納米顆粒，公開了包裹熒光物質(zhì)的納米粒子制備方法。以 上這些方法以熒光染料分子Rhodamine、 FITC、 Ru(bpy)3等作為納米粒子的發(fā)光 內(nèi)核，通過在微乳液中聚合的方法形成Si02包裹的熒光納米粒子。這種納米粒子 標記物具有親水性、表面容易修飾，且與熒光分子相比具有更好的光學(xué)穩(wěn)定性和 亮度。但熒光分子固有的Stokes位移小、易受各種非特異性熒光干擾的不足仍沒 有得到克服。
以稀土化合物作熒光標記物具有一些獨特的優(yōu)點，如發(fā)射波長與激發(fā)波長相 距遠，Stokes位移可達150 nm以上；熒光發(fā)射峰窄，常小于10 nm;熒光壽命長， 可達毫秒級，比一般本底物質(zhì)的熒光壽命高5~6個數(shù)量級，因此可通過熒光延 遲測量技術(shù)進行時間分辨熒光分析，有效地消除各種非特異性熒光的干擾獲得高 的靈敏度和更清晰的熒光圖像。用稀土化合物制備的納米粒子則集合了稀土化合 物和納米粒子兩者的優(yōu)點，包含了許多發(fā)光分子具有更高的熒光強度。包裹層避 免了環(huán)境因素(溶劑分子、氧氣)對熒光的淬滅作用且更加容易修飾探針分子。
有關(guān)稀土納米粒子的制備文獻(Jun Feng, Guomin Shan, Angel Maquieira, Marja E. Koivunen, Bing Guo， Bruce D. Hammock and Ian M. Kennedy, Anal Chem， 2003, 75, 5282-5286)報道了一種包裹稀土氧化物的納米粒子制備方法；中國專 利公開號CN 1378083A, 2002年，孫寶全，衣光舜，陳德樸，趙淑英，周玉樣， 程京，用于生物材料標記的稀土納米粒子、其制備方法及用途，公開了一種包裹 稀土混合物的粒子制備的方法。由于這些方法使用非溶液均相制備，所制備粒子 形狀的均一性，大小的可控性，在水溶液中的分散性不夠理想。
中國專利公開號CN 1493647A， 2004年，袁景利，譚明乾，葉志強，王桂蘭， 一種功能性納米稀土熒光微粒及其制備和應(yīng)用，公開了一種包裹稀土配合物的粒 子制備方法，其方法是以發(fā)光強的稀土配合物為中心，采用Si02包裹成納米粒子 作為標記物，制備出的粒子有良好的均一性和較強的熒光強度，可用于時間分辨 熒光分析，但使用的稀土配合物的配體沒有商業(yè)來源，需通過多步有機反應(yīng)專門 合成，配體制備是復(fù)雜的，不易獲得。
中國專利公開號CN 1775898A， 2006年，陳揚，基于突光能量轉(zhuǎn)移原理發(fā)光的稀十納米粒子及制備方法，公開了一種包裹稀土配合物的粒子制備方法，其方 法是通過敏化分子熒光增強的方法制備水溶性的稀土配合物，所制備的稀土配合 物發(fā)光強度高，水溶性好，合成原料有商業(yè)來源，容易制備。制備出的粒子有良 好的均一性和強的熒光強度。
吡啶二羧酸與稀土離子能生成具有很強熒光強度的稀土配合物，曾用于測定 稀土離子Tb、 Eu、 Dy的含量(慈云祥，寧民柱，陽芳英，高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報， 1983， 4(1)， 115-118;譚培功，李蘭英，黃漢國，分析試驗室，1993， 12(5)， 44-46)。 應(yīng)用吡啶二羧酸與稀土離子形成的配合物制備發(fā)光納米粒子用于檢測各種生物 分子國內(nèi)外尚未見報道。通過溶液均相反應(yīng)制備Si02包裹的稀土納米粒子的關(guān)鍵 是合成具有良好水溶性、穩(wěn)定性、高發(fā)光強度的稀土配合物，目前這樣的稀土配 合物種類很少，且需要復(fù)雜的有機合成，成本昂貴，不易獲得。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題:本發(fā)明的目的是提供一種基于吡啶二羧酸的稀土發(fā)光納米粒子的 制備方法，既是一種無需復(fù)雜合成和使用昂貴原料制備稀土發(fā)光納米粒子的制備 方法，基于吡啶二羧酸方法制備的稀土納米粒子發(fā)光強度高、水溶性好，可用于 各種時間分辨熒光分析和成像。
技術(shù)方案:本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的以稀土配合物作為發(fā)光分子， 通過微乳液中聚合反應(yīng)形成Si02包裹稀土配合物的納米粒子,納米粒子的表面具 有可連接探針分子的活性官能團，用于生物分子的熒光檢測和成像，發(fā)光分子為 吡啶二羧酸與稀土離子生成的配合物。
所述的稀土離子是鋱離子(Tb3+)、銪離子(Eu3+)、釤離子(Sm3+)、鏑離子(Dy3+) 中的一種。
與稀土離子生成配合物的配體是吡啶-2， 6-二羧酸，即兩個羧基取代基是分 別連在吡啶環(huán)的2位和6位。
HO
OH
O o
吡啶-2， 6-二羧酸吡啶-2， 6-二羧酸(DPA)與稀土離子(Lrn生成的配合物是Ln(DPA)3或 Ln(DPA)2或Ln(DPA)類型配合物中的一種。 具體的步驟為
第一步，將稀土離子硝酸鹽或鹽酸鹽的水溶液與吡啶二羧酸溶液按1: 3摩 爾比混合反應(yīng)形成稀土配合物；
第二步，稀土納米粒子的制備油包水反相微乳液體系中，將油相試劑、表
面活性劑及助表面活性劑混合攪拌均勻后，加入第一步生成的稀土配合物的水溶
液，充分攪拌形成油包水的微乳液后，加入正硅酸乙酯和氨水進行水解反應(yīng)；在 水解反應(yīng)過程中或反應(yīng)后，加入硅垸化試劑繼續(xù)反應(yīng)，反應(yīng)完成后在乳白色懸浮 液中加入丙酮離心沉降，經(jīng)乙醇、水洗滌以除去反應(yīng)溶液，離心分離得到Si02 包裹的稀土納米粒子懸浮于水溶液中或干燥后備用。
油包水反相微乳液體系中油相為環(huán)己烷，表面活性劑為Triton X-100或壬 基酚聚氧乙烯醚(OP-10)，助表面活性劑為正己醇或正辛醇，水相為含有發(fā)光稀 土配合物的水溶液。
所制備的稀土納米粒子由油包水反相微乳液體系中氨水催化正硅酸乙酯水 解形成的Si02構(gòu)成。
所制備的稀土納米粒子表面的活性官能團通過在微乳液中加入帶有不同活 性官能團的硅垸化試劑生成，硅垸化試劑是氨基硅烷化試劑，或巰基硅烷化試劑， 或3-縮水甘油醚氧丙基硅垸化試劑，這些活性官能團可進一步共價連接各種探 針分子如DNA、抗體、生物素、酶等以識別和檢測或示蹤對應(yīng)的生物分子。
有益效果目前文獻報道的具有良好水溶性、穩(wěn)定性、高發(fā)光強度的稀土配 合物種類很少，配體制備需要復(fù)雜的有機合成，成本昂貴，不易獲得。本發(fā)明的 稀土配體吡啶-2， 6-二羧酸與稀土離子Tb、 Eu、 Dy、 Sm都能生成熒光配合物，且 熒光強度強，而一般配體通常只能與Eu、 Tb離子生成具有一定水溶性的足夠強熒 光的配合物。吡啶-2， 6-二羧酸與稀土離子生成的配合物具有良好的水溶性和穩(wěn) 定性，由于水溶性好，能制得更高摻雜發(fā)光分子濃度的納米粒子，具有高的發(fā)光 強度和能應(yīng)用于時間分辨熒光分析的長熒光壽命。所使用的配體吡啶二羧酸可以 從商業(yè)上獲得，價格便宜，與先前的稀土納米粒子制備方法相比，避免了合成配 體的復(fù)雜有機合成，制備成本大大降低，方法更簡單，有助于稀土納米標記物在 更廣泛的領(lǐng)域被應(yīng)用。


圖1.吡啶.二羧酸-Eu納米粒子的透射電鏡圖。圖2.吡啶-二羧酸-Eu納米粒子的時間分辨熒光光譜圖。圖3.吡啶.二羧酸-Tb納米粒子的透射電鏡圖。圖4.吡啶-二羧酸-Tb納米粒子的時間分辨熒光光譜圖。圖5.吡啶-二羧酸-Dy納米粒子的時間分辨熒光光譜圖。
具體實施例方式
稀土納米粒子由Si02包裹發(fā)光稀土配合物構(gòu)成；稀土配合物由配體吡啶二
羧酸結(jié)合稀土離子生成；Si02包裹稀土配合物通過油包水反相微乳液中氨水催化正硅酸乙酯的水解形成Si02生成。稀土納米粒子的直徑大小可通過控制水相與表面活性劑的摩爾比及正硅酸乙酯和氨水的摩爾用量來控制。生成的納米粒子大小通常在10-150 nm。在水解聚合過程中使用帶有不同活性官能團的硅烷化試劑，可在Si02表面分別生成不同的活性官能團，如硅垸化試劑3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-巰丙基三甲氧基硅烷、3-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷可在Si02表面分別生成-NH2、 -SH、 3-縮水甘油醚氧丙基官能團，這些官能團可進一步共價連接各種探針分子如DNA、抗體、生物素、酶等以識別和檢測或示蹤對應(yīng)的生物分子。
實施例1:寡核苷酸探針修飾的吡啶二羧酸-Eu納米粒子的制備
稀土配合物的制備將稀土 Eu"水溶液(Eu3+的鹽酸鹽)與吡啶二羧酸溶液按l: 3摩爾比混合反應(yīng)IO分鐘。
稀土納米粒子的制備將環(huán)己酮、正己醇、Triton X-100 (v/v， 4: 1: 1)混合并攪拌均勻，加入適量稀土配合物溶液(水相)，充分攪拌形成油包水微乳液后，加入正硅酸乙酯和濃氨水，攪拌2小時后，加入氨丙基三乙氧基硅烷(氨基硅烷化試劑)，反應(yīng)混合物在攪拌下反應(yīng)20小時，反應(yīng)完成后在乳白色懸浮液中加入適量丙酮離心沉降，分別用乙醇、水洗滌以除去反應(yīng)溶液，離心分離得到Si02包裹的稀土納米粒子懸浮于水溶液中或干燥后備用，圖1是制得的吡啶二羧酸-Eu納米粒子的透射電鏡圖，顯示具有良好的均一性和單一性。圖2是吡啶二羧酸-Eii納米粒子的時間分辨熒光光譜圖。
稀土納米粒子標記的寡核苷酸探針的制備稱取一定量干燥的表面NH2修
8飾的稀土納米粒子重新分散于lxPBS溶液中，加入25%的戊二醛(最終濃度約1%)溶液，室溫下反應(yīng)2小時，反應(yīng)完成后經(jīng)0.5% Tween-20水洗后，離心移走上清液，加入含適量鏈親和素的lxPBS溶液，室溫攪拌下反應(yīng)16小時，反應(yīng)完成后，用含0.5% Tween-20的lxPBS溶液洗滌，離心分離后加入足量Biotin-oligo的lxPBS溶液，室溫下反應(yīng)3小時，反應(yīng)完成后，用lxPBS溶液洗滌3次，洗滌后寡核苷酸修飾的納米粒子懸浮于lxPBS溶液中備用。實施例2:吡啶二羧酸-Tb納米粒子的制備
稀土配合物的制備將稀土 Tb"水溶液(Tb"的硝酸鹽或鹽酸鹽)與吡啶二羧酸溶液按l: 3摩爾比混合反應(yīng)10分鐘。
稀土納米粒子的制備將環(huán)己酮、正己醇、Triton X-100 (v/v， 4: 1: 1)混合并攪拌均勻，加入適量稀土配合物溶液(水相)，充分攪拌形成油包水微乳液后，加入正硅酸乙酯和濃氨水，攪拌2小時后，加入氨丙基三乙氧基硅烷(硅烷化試劑)，反應(yīng)混合物在攪拌下反應(yīng)20小時，反應(yīng)完成后在乳白色懸浮液中加入適量丙酮離心沉降，分別用乙醇、水洗滌以除去反應(yīng)溶液，離心分離得到Si02包裹的稀土納米粒子懸浮于水溶液中或干燥后備用。圖3是制得的吡啶二羧酸-Tb納米粒子的透射電鏡圖。圖4是其時間分辨熒光光譜圖。實施例3:吡啶二羧酸-Dy納米粒子的制備
稀土配合物的制備將稀土 Dy3+水溶液(Dy"的鹽酸鹽)與吡啶二羧酸溶液按l: 3摩爾比混合反應(yīng)10分鐘。
稀土納米粒子的制備將環(huán)己酮、正己醇、Triton X-100 (v/v， 4: 1: 1)混合并攪拌均勻，加入適量稀土配合物溶液(水相)，充分攪拌形成油包水微乳液后，加入正硅酸乙酯和濃氨水，攪拌2小時后，加入氨丙基三乙氧基硅烷(硅烷化試劑)，反應(yīng)混合物在攪拌下反應(yīng)20小時，反應(yīng)完成后在乳白色懸浮液中加入適量丙酮離心沉降，分別用乙醇、水洗滌以除去反應(yīng)溶液，離心分離得到Si02包裹的稀土納米粒子懸浮于水溶液中或干燥后備用。圖5是制得的吡啶二羧酸-Dy納米粒子的時間分辨熒光光譜圖。
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權(quán)利要求
1. 一種基于吡啶二羧酸的稀土發(fā)光納米粒子的制備方法，其特征是以稀土配合物作為發(fā)光分子，通過微乳液中聚合反應(yīng)形成SiO2包裹稀土配合物的納米粒子，納米粒子的表面具有可連接探針分子的活性官能團，用于生物分子的熒光檢測和成像，發(fā)光分子為吡啶二羧酸與稀土離子生成的配合物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于吡啶二羧酸的稀土發(fā)光納米粒子的制備方法，其特征是制備方法具體的步驟為第一步，將稀土離子硝酸鹽或鹽酸鹽的水溶液與吡啶二羧酸溶液按1: 3摩 爾比混合反應(yīng)形成稀土配合物；第二步，稀土納米粒子的制備油包水反相微乳液體系中，將油相試劑、表 面活性劑及助表面活性劑混合攪拌均勻后，加入第一步生成的稀土配合物的水溶 液，充分攪拌形成油包水的微乳液后，加入正硅酸乙酯和氨水進行水解反應(yīng)；在 水解反應(yīng)過程中或反應(yīng)后，加入硅垸化試劑繼續(xù)反應(yīng)，反應(yīng)完成后在乳白色懸浮 液中加入丙酮離心沉降，經(jīng)乙醇、水洗滌以除去反應(yīng)溶液，離心分離得到Si02 包裹的稀土納米粒子懸浮于水溶液中或干燥后備用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于吡啶二羧酸的稀土發(fā)光納米粒子的制備方法，其特征是所述的稀土離子是鋱離子(Tb3+)、銪離子(Eu3+)、釤離子(Sm3+)、 鏑離子(Dy3+)中的一種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種基于吡啶二羧酸的稀土發(fā)光納米粒子的 制備方法，其特征是與稀土離子生成配合物的配體是吡啶-2， 6-二羧酸，即兩個 羧基取代基是分別連在吡啶環(huán)的2位和6位。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于吡啶二羧酸的稀土發(fā)光納米粒子的制備 方法，其特征是吡啶二羧酸(DPA)與稀土離子(Ln")生成的配合物是Ln(DPA)3或 Ln (DPA) 2或Ln (DPA)類型配合物中的一種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于吡啶二羧酸的稀土發(fā)光納米粒子的制備 方法，其特征是油包水反相微乳液體系中油相為環(huán)己烷，表面活性劑為Triton X-100或壬基酚聚氧乙烯醚(OP-IO)，助表面活性劑為正己醇或正辛醇，水相為 含有發(fā)光稀土配合物的水溶液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于吡啶二羧酸的稀土發(fā)光納米粒子的制備 方法，其特征是所制備的稀土納米粒子由油包水反相微乳液體系中氨水催化正硅 酸乙酯水解形成的Si02構(gòu)成。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于吡啶二羧酸的稀土發(fā)光納米粒子的制備 方法，其特征是所制備的稀土納米粒子表面的活性官能團通過在微乳液中加入帶 有不同活性官能團的硅烷化試劑生成，硅垸化試劑是氨基硅烷化試劑，或巰基硅 垸化試劑，或3-縮水甘油醚氧丙基硅烷化試劑，這些活性官能團可進一步共價 連接各種探針分子如DNA、抗體、生物素、酶等以識別和檢測或示蹤對應(yīng)的生物 分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于吡啶二羧酸的稀土發(fā)光納米粒子的制備方法。稀土納米粒子由SiO₂包裹發(fā)光稀土配合物構(gòu)成；稀土配合物由配體吡啶二羧酸結(jié)合稀土離子生成；通過稀土配合物在微乳液中的聚合反應(yīng)和硅烷化形成表面含有活性官能團的SiO₂納米粒子。制備的稀土發(fā)光納米粒子發(fā)光強度高，水溶性好，可用于各種時間分辨熒光分析和成像。本制備方法與同類稀土納米粒子制備方法相比，制備成本低，方法簡單，可被廣泛應(yīng)用。
文檔編號C09K11/77GK101486903SQ200910024478
公開日2009年7月22日 申請日期2009年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月23日
發(fā)明者揚 陳 申請人:東南大學(xué)