專利名稱：水環(huán)境中致病菌高效富集技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從水環(huán)境中高效富集致病菌的方法。
背景技術(shù)：
水是人類賴以生存的物質(zhì)，不僅供人們飲用和生活用水，同時(shí)還是人和動(dòng)物機(jī)體 排泄物、生產(chǎn)和生活污水等的排放場(chǎng)所，因此，水中的微生物多種多樣。水中對(duì)人類健康威 脅最大的是致病菌歷史上，曾發(fā)生過多次世界范圍的霍亂大流行；在印度由于恒河水被 非0-1群霍亂弧菌(O139)污染而導(dǎo)致了新的霍亂流行；此外，由于自然災(zāi)害、戰(zhàn)爭、制裁、經(jīng) 濟(jì)落后所導(dǎo)致的衛(wèi)生狀況惡化、飲用水質(zhì)下降而造成其它細(xì)菌性疾病(如傷寒、菌痢、腹瀉 等)的暴發(fā)流行也十分常見。根據(jù)WHO年度報(bào)告，亞(不包括中國)、非、拉各洲僅小于5歲 的兒童每人每年發(fā)生腹瀉2. 2次，細(xì)菌性腹瀉的病例多達(dá)1. 5-2. 5億人；而我國每年腸道傳 染病的報(bào)告病例數(shù)多達(dá)100萬人次(實(shí)際發(fā)病人數(shù)可能遠(yuǎn)超過這些)，占全部35種法定傳 染病報(bào)告病例數(shù)總數(shù)的80%以上。目前，雖然城鎮(zhèn)衛(wèi)生水平有明顯提高，但由于生活方式的 改變，仍然存在引起介水細(xì)菌學(xué)疾病的隱患，軍團(tuán)桿菌介空調(diào)冷卻水進(jìn)行傳播和致病就是 其中一例。此外，據(jù)調(diào)查一些家庭使用純水機(jī)、桶裝水、礦泉水，由于其暴露時(shí)間長，導(dǎo)致二 次污染，仍有25%的水樣細(xì)菌總數(shù)或大腸菌群超標(biāo)。此外，水體是恐怖分子實(shí)施生物恐怖襲擊的重要介質(zhì)，因此，水環(huán)境的生物安全問 題已引起人們的極大關(guān)注。目前，美國對(duì)部分供水系統(tǒng)進(jìn)行的評(píng)估結(jié)果表明，大多數(shù)的供 水系統(tǒng)易受到恐怖分子的襲擊。在我國，恐怖襲擊事件也時(shí)有發(fā)生。如，2003年10月，河 南省汝陽縣發(fā)生的飲用水特大投毒案件造成了社會(huì)的極大恐慌。雖然理論上講采用烈性病 原體(生物戰(zhàn)劑)是恐怖分子發(fā)動(dòng)襲擊的首選，但由于烈性病原體國家控制非常嚴(yán)格，獲得 困難、生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸與釋放都要求有非常嚴(yán)格的技術(shù)保障措施(國內(nèi)可生產(chǎn)的實(shí)驗(yàn)室很 少)。因此，采用烈性病原體襲擊的可能性相對(duì)較小。而采用菌株來源廣泛，培養(yǎng)技術(shù)簡單， 成本低廉，容易大規(guī)模培養(yǎng)制備和投放的常見致病菌(如沙門氏菌、志賀氏菌、致病性大腸 桿菌等)進(jìn)行恐怖襲擊的可能性卻非常大。2008年北京奧運(yùn)會(huì)和2010年上海世博會(huì)是在 我國舉辦的具有國際影響的大型活動(dòng)，做好兩會(huì)期間的水安全保障工作對(duì)保證大型活動(dòng)的 順利開展、人們健康、社會(huì)安定、國家平穩(wěn)發(fā)展都將具有十分重要的意義。一般情況下，水環(huán)境中的病源微生物含量都非常少，遠(yuǎn)低于現(xiàn)有監(jiān)測(cè)方法的檢測(cè) 靈敏度。因此，水環(huán)境中病源微生物監(jiān)測(cè)的關(guān)鍵技術(shù)之 是如何從不同水體中將少量的病 源微生物富集、回收出來，以供實(shí)驗(yàn)室和/或現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效的從水環(huán)境中濃集回收致病菌的方法。本發(fā)明可以 將待檢水樣中小于1個(gè)/IOOml的致病菌進(jìn)行濃集回收，回收率可達(dá)到90%以上。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下水環(huán)境中致病菌高效富集技術(shù)及應(yīng)用，其特征是包括如下步驟
(1)載帶陽電荷濾料氫氧化鎂鋁的制備①氫氧化鎂鋁膠體的制備a.將AlCl3 · 6H20和MgCl2 · 6H20按摩爾比為1 3溶解到一定體積去離子水中， 使Al3+和Mg2+的終濃度分別達(dá)到0. lmol/L和0. 3mol/L。在150 500轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌下， 緩慢均勻的加入一定濃度的NaOH溶液若干至不再產(chǎn)生沉淀為止。用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 0左 右，繼續(xù)攪拌2h后進(jìn)行靜置老化。b.靜置老化過程中隔天傾倒出上清液，并用去離子水補(bǔ)足體積后攪拌均勻。共進(jìn) 行3次換水操作，持續(xù)時(shí)間約5天左右。②濾料的制備a.將老化完成后的氫氧化鎂鋁膠體進(jìn)行離心，離心參數(shù)為6000rpmX IOmin。傾倒
出上清，保留氫氧化鎂鋁沉淀。b.將氫氧化鎂鋁沉淀置于55°C烘箱烘烤48小時(shí)左右至基本干燥。c.將干燥的氫氧化鎂鋁沉淀置于馬弗爐中進(jìn)行烘烤，烘烤過程及參數(shù)如下 200°C下烘烤2小時(shí)，400°C烘烤2小時(shí)然后600°C烘烤4小時(shí)。d.破碎氫氧化鎂鋁塊體，并過孔徑0. 45mm和0. 2mm標(biāo)準(zhǔn)篩，保留直徑為0. 45 0. 2mm的顆粒。e.氫氧化鎂鋁顆粒在馬弗爐中以800°C烘烤4小時(shí)后自然冷卻。(2)濾器及過濾系統(tǒng)的組建①濾器的制作a.直徑2 6cm —定長度的有機(jī)玻璃管一端封閉插入直徑0. 5cm長約2cm的硬質(zhì) 塑料管作為出水管。距離出水端Icm左右固定一與有機(jī)玻璃管內(nèi)徑相同的200目左右的不 銹鋼網(wǎng)承載濾料并可過濾出水。有機(jī)玻璃管另一端加工出一段螺紋，并配直徑相當(dāng)?shù)乃芰?螺帽。該螺帽中間開一小孔并配合安裝直徑0. 5cm長度2cm的硬質(zhì)塑料進(jìn)水管。b.打開螺帽裝入一定量的氫氧化鎂鋁濾料后重新擰緊螺帽。②過濾系統(tǒng)的組建過濾系統(tǒng)由高位水槽、滅菌容器、塑料導(dǎo)管、濾器及流量控制裝置組成，以橡膠軟 管連接各個(gè)部件。過濾系統(tǒng)的組裝如圖3所示。(3)洗脫液的配制a.稱取一定量的Na2HPO4和NaH2PO4完全溶解到一定體積去離子水中，配成pH值 為6. 5左右的緩沖溶液。b.在上述緩沖溶液中加入分析純的吐溫-80并攪拌均勻，使吐溫-80的終濃度達(dá) 到 0. 5%。c.配好的洗脫液分裝后在121°C下高壓滅菌20分鐘。(4)過濾濃集方法a. 一定量的水樣置于高位水槽中，調(diào)節(jié)流量控制使水樣以勻速流過濾器，用滅菌 容器收集過濾水樣。b.從過濾系統(tǒng)中取出濾器，將IOmL洗脫液注入濾器中，封閉出、入水管后震蕩洗 脫濾料約3分鐘后將洗脫液放出。洗脫操作進(jìn)行4 5次，每次均用IOmL洗脫液。c.將多次洗脫的溶液混合作為最終的濃集液。
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本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、操作簡便，不需要任何儀器設(shè)備；2、富集回收致病菌效率高，處理水樣量大。3、這套技術(shù)可以明顯提高水環(huán)境中致病菌的檢測(cè)靈敏度，為飲水安全提供保證。


圖1為本發(fā)明采用KYKY-EM3200型掃描電鏡拍得的氫氧化鎂鋁濾料照片，其中(a) 為濾料的顆粒，(b)為濾料局部表面。圖2為濾料成分能譜分析。圖3為濾器的結(jié)構(gòu)示意圖。圖4為過濾系統(tǒng)組成示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明實(shí)施例1制作載帶陽電荷濾料，主要實(shí)施步驟如下①氫氧化鎂鋁膠體的制備a.分別稱取192克AlCl3 · 6H20和488克MgCl2 · 6H20溶解到8L去離子水中，在 300轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌下，緩慢均勻的加入3mol/L NaOH溶液2. 4L左右至不再產(chǎn)生沉淀為止。 用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 0左右，繼續(xù)攪拌2h后進(jìn)行靜置老化。b.靜置老化過程中隔天傾倒出上清液，并用去離子水補(bǔ)足體積后攪拌均勻。共進(jìn) 行3次換水操作，持續(xù)時(shí)間約5天左右。②濾料的制備a.將老化完成后的氫氧化鎂鋁膠體進(jìn)行離心，離心參數(shù)為6000rpmX IOmin。傾倒
出上清，保留氫氧化鎂鋁沉淀。b.將氫氧化鎂鋁沉淀置于55°C烘箱烘烤48小時(shí)左右至基本干燥。c.將干燥的氫氧化鎂鋁沉淀置于馬弗爐中進(jìn)行烘烤，烘烤過程及參數(shù)如下 200°C下烘烤2小時(shí)，400°C烘烤2小時(shí)然后600°C烘烤4小時(shí)。d.破碎氫氧化鎂鋁塊體，并過孔徑0. 45mm和0. 2mm標(biāo)準(zhǔn)篩，保留直徑為0. 45 0. 2mm的顆粒。e.氫氧化鎂鋁顆粒在馬弗爐中以800°C烘烤4小時(shí)后自然冷卻。實(shí)施例2制作過濾裝置及組建過濾系統(tǒng)，主要實(shí)施步驟如下①濾器的制作a.取直徑6cm長度20cm的有機(jī)玻璃管一根，一端封閉插入直徑0. 5cm長約2cm的 硬質(zhì)塑料管作為出水管。距離出水端Icm左右固定一與有機(jī)玻璃管內(nèi)徑相同的200目左右 的不銹鋼網(wǎng)承載濾料并可過濾出水。有機(jī)玻璃管另一端加工出一段螺紋，并配直徑相當(dāng)?shù)?塑料螺帽。該螺帽中間開一小孔并配合安裝直徑0. 5cm長度2cm的硬質(zhì)塑料進(jìn)水管。b.打開螺帽裝入高度15cm左右的氫氧化鎂鋁濾料后重新擰緊螺帽。
②過濾系統(tǒng)的組建將容積為3L左右的高位水槽、容積2L的滅菌容器、內(nèi)徑0. 5cm的塑料導(dǎo)管、制作 的濾器及流量控制以橡膠軟管按圖3連接，組成過濾系統(tǒng)。實(shí)施例3配制洗脫液，主要實(shí)施步驟如下a. 3. 723gNa2HP04和9. 238gNaH2P04完全溶解到IL去離子水中，配成pH值為6. 5左 右的緩沖溶液。b. IL上述緩沖溶液中加入5mL分析純的tween-80，并攪拌均勻。c.配好的洗脫液分裝到試管中每份10mL，在121°C下高壓滅菌20分鐘。實(shí)施例4過濾富集回收自來水中的細(xì)菌及致病菌，利用實(shí)施例2中制作的過濾系統(tǒng)實(shí)施濃 集回收，主要實(shí)施步驟如下a.取20L自來水分多次注入到高位水槽中，調(diào)節(jié)流量控制使自來水以勻速流過濾 器，用滅菌容器收集過濾水樣。b.從過濾系統(tǒng)中取出濾器，將IOmL洗脫液注入濾器中，封閉出、入水管后震蕩洗 脫濾料約3分鐘后將洗脫液放出。洗脫操作進(jìn)行4 5次，每次均用IOmL洗脫液。c.將多次洗脫的溶液混合作為最終的濃集液。d.取ImL濃集液或ImL經(jīng)過一定梯度稀釋的濃集液接種普通營養(yǎng)瓊脂平板經(jīng)培養(yǎng) 菌落計(jì)數(shù)后可推算出所富集的自來水水樣的含菌量。e.取ImL濃集液涂布接種選擇性培養(yǎng)基經(jīng)培養(yǎng)后可確定自來水中所含的致病菌 的種類及菌量。實(shí)施例4過濾富集回收水源水中的細(xì)菌及致病菌，利用實(shí)施例2中制作的過濾系統(tǒng)實(shí)施濃 集回收，主要實(shí)施步驟如下a.取20L水源水，如較潔凈的河水、湖泊水或水庫水，分多次注入到高位水槽中， 調(diào)節(jié)流量控制使自來水以勻速流過濾器，用滅菌容器收集過濾水樣。b.從過濾系統(tǒng)中取出濾器，將IOmL洗脫液注入濾器中，封閉出、入水管后震蕩洗 脫濾料約3分鐘后將洗脫液放出。洗脫操作進(jìn)行4 5次，每次均用IOmL洗脫液。c.將多次洗脫的溶液混合作為最終的濃集液。d.取ImL濃集液或ImL經(jīng)過一定梯度稀釋的濃集液接種普通營養(yǎng)瓊脂平板經(jīng)培養(yǎng) 菌落計(jì)數(shù)后可推算出所富集的水源水水樣的含菌量。e.取ImL濃集液涂布接種選擇性培養(yǎng)基經(jīng)培養(yǎng)后可確定水源水中所含的致病菌 的種類及菌量。實(shí)施例5過濾富集回收污染較重水體中的細(xì)菌及致病菌，利用實(shí)施例2中制作的過濾系統(tǒng) 實(shí)施濃集回收，主要實(shí)施步驟如下a.取5L污染較重的水，如海河水，分多次注入到高位水槽中，調(diào)節(jié)流量控制使自 來水以勻速流過濾器，用滅菌容器收集過濾水樣。b.從過濾系統(tǒng)中取出濾器，將IOmL洗脫液注入濾器中，封閉出、入水管后震蕩洗
7脫濾料約3分鐘后將洗脫液放出。洗脫操作進(jìn)行4 5次，每次均用IOmL洗脫液。c.將多次洗脫的溶液混合作為最終的濃集液。d.取ImL濃集液或ImL經(jīng)過一定梯度稀釋的濃集液接種普通營養(yǎng)瓊脂平板經(jīng)培養(yǎng) 菌落計(jì)數(shù)后可推算出所富集的海河水水樣的含菌量。e.取ImL濃集液涂布接種選擇性培養(yǎng)基經(jīng)培養(yǎng)后可確定海河水中所含的致病菌 的種類及菌量。實(shí)施例6過濾富集回收污水中的細(xì)菌及致病菌，利用實(shí)施例2中制作的過濾系統(tǒng)實(shí)施濃集 回收，主要實(shí)施步驟如下a.取5L污水，分多次注入到高位水槽中，調(diào)節(jié)流量控制使自來水以勻速流過濾 器，用滅菌容器收集過濾水樣。b.從過濾系統(tǒng)中取出濾器，將IOmL洗脫液注入濾器中，封閉出、入水管后震蕩洗 脫濾料約3分鐘后將洗脫液放出。洗脫操作進(jìn)行4 5次，每次均用IOmL洗脫液。c.將多次洗脫的溶液混合作為最終的濃集液。d.取ImL濃集液或ImL經(jīng)過一定梯度稀釋的濃集液接種普通營養(yǎng)瓊脂平板經(jīng)培養(yǎng) 菌落計(jì)數(shù)后可推算出所富集的污水水樣的含菌量。e.取ImL濃集液涂布接種選擇性培養(yǎng)基經(jīng)培養(yǎng)后可確定污水中所含的致病菌的 種類及菌量。
權(quán)利要求
水環(huán)境中致病菌高效富集技術(shù)及應(yīng)用，其特征是包括如下步驟(1)載帶陽電荷濾料氫氧化鎂鋁的制備①氫氧化鎂鋁膠體的制備a.將AlCl3·6H2O和MgCl2·6H2O按摩爾比為1∶3溶解到一定體積去離子水中，使Al3+和Mg2+的終濃度分別達(dá)到0.1mol/L和0.3mol/L。在150～500轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌下，緩慢均勻的加入一定濃度的NaOH溶液若干至不再產(chǎn)生沉淀為止。用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0左右，繼續(xù)攪拌2h后進(jìn)行靜置老化。b.靜置老化過程中隔天傾倒出上清液，并用去離子水補(bǔ)足體積后攪拌均勻。共進(jìn)行3次換水操作，持續(xù)時(shí)間約5天左右。②濾料的制備a.將老化完成后的氫氧化鎂鋁膠體進(jìn)行離心，離心參數(shù)為6000rpm×10min。傾倒出上清，保留氫氧化鎂鋁沉淀。b.將氫氧化鎂鋁沉淀置于55℃烘箱烘烤48小時(shí)左右至基本干燥。c.將干燥的氫氧化鎂鋁沉淀置于馬弗爐中進(jìn)行烘烤，烘烤過程及參數(shù)如下200℃下烘烤2小時(shí)，400℃烘烤2小時(shí)然后600℃烘烤4小時(shí)。d.破碎氫氧化鎂鋁塊體，并過孔徑0.45mm和0.2mm標(biāo)準(zhǔn)篩，保留直徑為0.45～0.2mm的顆粒。e.氫氧化鎂鋁顆粒在馬弗爐中以800℃烘烤4小時(shí)后自然冷卻。(2)濾器及過濾系統(tǒng)的組建①濾器的制作a.直徑2～6cm一定長度的有機(jī)玻璃管一端封閉插入直徑0.5cm長約2cm的硬質(zhì)塑料管作為出水管。距離出水端1cm左右固定一與有機(jī)玻璃管內(nèi)徑相同的200目左右的不銹鋼網(wǎng)承載濾料并可過濾出水。有機(jī)玻璃管另一端加工出一段螺紋，并配直徑相當(dāng)?shù)乃芰下菝?。該螺帽中間開一小孔并配合安裝直徑0.5cm長度2cm的硬質(zhì)塑料進(jìn)水管。b.打開螺帽裝入一定量的氫氧化鎂鋁濾料后重新擰緊螺帽。②過濾系統(tǒng)的組建過濾系統(tǒng)由高位水槽、滅菌容器、塑料導(dǎo)管、濾器及流量控制裝置組成，以橡膠軟管連接各個(gè)部件。過濾系統(tǒng)的組裝如圖3所示。(3)洗脫液的配制a.稱取一定量的Na2HPO4和NaH2PO4完全溶解到一定體積去離子水中，配成pH值為6.5左右的緩沖溶液。b.在上述緩沖溶液中加入分析純的吐溫 80并攪拌均勻，使吐溫 80的終濃度達(dá)到0.5％。c.配好的洗脫液分裝后在121℃下高壓滅菌20分鐘。(4)過濾濃集方法a.一定量的水樣置于高位水槽中，調(diào)節(jié)流量控制使水樣以勻速流過濾器，用滅菌容器收集過濾水樣。b.從過濾系統(tǒng)中取出濾器，將10mL洗脫液注入濾器中，封閉出、入水管后震蕩洗脫濾料約3分鐘后將洗脫液放出。洗脫操作進(jìn)行4～5次，每次均用10mL洗脫液。c.將多次洗脫的溶液混合作為最終的濃集液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效富集回收水環(huán)境中致病菌的技術(shù)與方法，其主要內(nèi)容包括(1)新型載帶陽電荷濾料的制備方法；(2)濾器的制作方法；(3)過濾濃集系統(tǒng)的組裝；(4)洗脫液的配置方法；(5)濃集回收致病菌的操作方法。本發(fā)明的技術(shù)和方法能夠高效的富集回收各種水環(huán)境如自來水、潔凈水源水、污染較重的水體及污水中的致病菌，濃集回收效率穩(wěn)定對(duì)于較潔凈水體回收率能達(dá)到90％以上，污染較重水體回收率能達(dá)到80％以上。且本發(fā)明中的濾料經(jīng)過簡單處理能夠反復(fù)使用，其它的器材也可多次使用，因此本發(fā)明中的技術(shù)和方法簡單、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用，非常適合實(shí)驗(yàn)室及現(xiàn)場(chǎng)使用。
文檔編號(hào)B01D39/06GK101928668SQ200910069389
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2009年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月23日
發(fā)明者李君文, 王新為, 王景峰, 諶志強(qiáng), 邱志剛, 金敏, 陳照立 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所