專利名稱：煙草屬核酸分子及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在煙草屬(Nicotiana)植物中的煙草屬核酸序列諸如編碼組成性，或乙烯或衰老誘導的多肽，特別是細胞色素p450酶(下文稱為p450和p450酶)的序列，以及使用這些核酸序列改變植物表型的方法。
背景在煙草成熟或熟化過程中，各種基因的表達被改變。這些基因可以影響涉及許多次級代謝物形成的代謝途徑，所述次級代謝物包括類萜，多酚和影響終產(chǎn)物質(zhì)量性狀的生物堿。例如，在許多煙草屬物種中，在植物衰老和在收獲后或葉熟化階段過程中，發(fā)生煙堿形成去甲煙堿的生物轉(zhuǎn)化。煙堿是去甲煙堿的主要來源。去甲煙堿生物堿是微生物介導的亞硝化作用的底物，以在葉熟化或隨后的葉貯存和處理過程中形成煙草特異性的亞硝胺(TSNA)N′-亞硝基去甲煙堿(NNN)。
在煙草成熟或熟化過程中表達的基因可以是組成性表達的、乙烯誘導或衰老相關(guān)的基因，例如編碼細胞色素p450的基因。細胞色素p450s，例如催化廣泛范圍的在化學上不相似的底物的酶促反應，其包括內(nèi)源性和異生底物的氧化、過氧化和還原代謝。在植物中，p450s參與生化途徑，所述生化途徑包括植物產(chǎn)物諸如所研究的phenylpropanoids，生物堿，類萜，脂質(zhì)，氰苷和芥子油苷的合成(Chappell，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.46521-547，1995)。細胞色素p450s，也已知為p450血紅素-硫醇鹽蛋白質(zhì)，通常充當被稱為包含p450的單氧化酶系統(tǒng)的多成分電子傳遞鏈中的末端氧化酶。由這些酶系統(tǒng)催化的具體反應包括脫甲基作用，羥基化作用，環(huán)氧化作用，N-氧化作用，硫代氧化作用，N-、S-、和O-脫烷基化，脫硫作用，脫氨作用和偶氮、硝基和N-氧化物基團的還原作用。
煙草屬植物p450酶的多樣作用涉及對多種植物代謝物的影響，所述植物代謝物諸如phenylpropanoids，生物堿，類萜，脂質(zhì)，氰苷，芥子油苷和許多其它的化學實體。一些p450酶可以影響植物代謝物的組成。例如，長期以來，理想的是通過育種來改變植物的選定脂肪酸的模式從而改善某些植物的香味和香氣；然而關(guān)于涉及控制這些葉組分的水平的機制知道的很少。與脂肪酸改變相關(guān)的p450酶的下調(diào)或上調(diào)可以促進需要的脂肪酸的積累，這提供了更為優(yōu)選的葉表型的品質(zhì)。
關(guān)于p450酶的功能和它們在植物組成中的更多作用仍舊在發(fā)現(xiàn)中。例如，發(fā)現(xiàn)一類特殊的p450酶催化脂肪酸分解為揮發(fā)性C6-和C9-醛和β-醇，其是水果和蔬菜的“鮮綠”氣味的主要起作用的因素?？梢愿淖兤渌碌哪繕藀450s的水平，從而通過改變在煙草屬葉中的脂質(zhì)組成和相關(guān)的分解代謝物來提高葉子組分的品質(zhì)。這些葉組分中的一些受到刺激葉品質(zhì)成熟的衰老的影響。還有其它的報道顯示p450s酶在改變脂肪酸中具有功能性作用，所述脂肪酸涉及植物-病原體相互作用和疾病抗性。
大量多樣的p450酶形式，它們不同的結(jié)構(gòu)和功能使得在本發(fā)明之前他們進行對煙草屬p450酶的研究非常困難。此外，因為這些膜定位的蛋白質(zhì)典型地以低豐度存在并且通常在純化過程中是不穩(wěn)定的，p450酶的克隆至少部分被阻礙。因此，存在鑒定植物中p450酶和與那些p450酶相關(guān)的核酸序列的需要。具體而言，煙草屬中僅有一些細胞色素p450蛋白質(zhì)已經(jīng)進行了報道。本文所述發(fā)明基于它們的序列同一性，發(fā)現(xiàn)了對應于數(shù)類p450物種的細胞色素450s和細胞色素p450片段。
除了p450序列之外，本發(fā)明包括其它組成性和乙烯或衰老誘導的序列的發(fā)現(xiàn)，其解決了調(diào)節(jié)涉及次級代謝物形成的代謝途徑的需要，所述次級代謝物影響煙草產(chǎn)品的品質(zhì)。這些序列還用在植物生殖質(zhì)的開發(fā)中，所述植物生殖質(zhì)具有理想的性狀以用于開發(fā)更理想的生殖質(zhì)，尤其是非-GMO(遺傳修飾的生物)類型的生殖質(zhì)的育種程序中。
發(fā)明概述本發(fā)明人已經(jīng)鑒定和表征了組成性，及乙烯和衰老誘導的序列，包括來自煙草的煙堿脫甲基酶的基因組克隆。還在本文中描述的是，這些序列在育種方法和在產(chǎn)生具有理想性質(zhì)的植物(例如，轉(zhuǎn)基因植物)的方法中的應用，所述理想性質(zhì)諸如相對于對照植物，去甲煙堿或N′-亞硝基去甲煙堿(″NNN″)或兩者的改變的水平。
在一方面，本發(fā)明的特征是產(chǎn)生具有減少的煙堿脫甲基酶基因的表達的煙草植物的育種方法，所述方法包括下列步驟(a)提供具有不同煙堿脫甲基酶基因表達的第一煙草植物；(b)提供包含至少一個表型性狀的第二煙草植物；(c)使所述第一煙草植物與所述第二煙草植物雜交以產(chǎn)生F1子代植物；(d)收集不同煙堿脫甲基酶基因的表達的F1子代的種子；和(e)萌發(fā)所述種子以產(chǎn)生具有減少的煙堿脫甲基酶基因的表達的煙草植物。
在一個實施方案中，使用本文所述的序列和本領(lǐng)域已知的標準方法將煙草植物鑒定為煙堿脫甲基酶基因表達的變體(例如，在轉(zhuǎn)錄、翻譯后或翻譯水平上或在酶活性水平上)。
在該育種方法的另一個實施方案中，所述第一煙草植物包含具有突變(例如，缺失、取代、點突變、易位、倒位、復制或插入)的內(nèi)源煙堿脫甲基酶基因。在另一個實施方案中，所述第一煙草植物包含具有無效突變的煙堿脫甲基酶基因，包含使內(nèi)源煙堿脫甲基酶基因沉默的重組基因，或包含具有減少的或改變的酶活性的煙堿脫甲基酶。在另一個實施方案中，第一煙草植物中的煙堿脫甲基酶基因不存在。在另一個實施方案中，所述第一煙草植物是轉(zhuǎn)基因植物。
用在本文公開的育種方法中的示例性第一煙草植物包括Nicotianaafricana，Nicotiana amplexicaulis，Nicotiana arentsii，Nicotianabenthamiana，Nicotiana bigelovii，Nicotiana corymbosa，Nicotiana debneyi，Nicotiana excelsior，Nicotiana exigua，Nicotiana glutinosa，Nicotianagoodspeedii，Nicotiana gossei，Nicotiana hesperis，Nicotiana ingulba，Nicotiana knightiana，Nicotiana maritima，Nicotiana megalosiphon，Nicotianamiersii，Nicotiana nesophila，Nicotiana noctiflora，Nicotiana nudicaulis，Nicotiana otophora，Nicotiana palmeri，Nicotiana paniculata，Nicotianapetunioides，Nicotiana plumbaginifolia，Nicotiana repanda，Nicotianarosulata，Nicotiana rotundifolia，黃花煙草(Nicotiana rustica)，Nicotianasetchelli，Nicotiana stocktonii，Nicotiana eastii，Nicotiana suaveolens或Nicotiana trigonophylla。理想地，所述第一煙草植物是Nicotianaamplexicaulis，Nicotiana benthamiana，Nicotiana bigelovii，Nicotianadebneyi，Nicotiana excelsior，Nicotiana glutinosa，Nicotiana goodspeedii，Nicotiana gossei，Nicotiana hesperis，Nicotiana knightiana，Nicotianamaritima，Nicotiana megalosiphon，Nicotiana nudicaulis，Nicotianapaniculata，Nicotiana plumbaginifolia，Nicotiana repanda，黃花煙草，Nicotiana suaveolens或Nicotiana trigonophylla。其它第一煙草植物包括各種煙草(Nicotiana tabacum)(或黃花煙草)或與其相關(guān)的已經(jīng)被改造而具有減少的水平的煙堿脫甲基酶的轉(zhuǎn)基因品系。其它的示例性第一煙草植物包括東方型煙草(Oriential tobacco)、深色煙草(dark tobacco)、煙熏煙或晾煙(flue or air-cured tobacco)、弗吉尼亞煙(Virginia)或白萊煙煙草(Burleytobacco)植物。
在上述育種方法的另一個實施方案中，所述第二煙草植物是煙草(Nicotiana tabacum)。煙草(Nicotiana tabacum)的示例性的種類包括商業(yè)種類諸如BU 64，CC 101，CC 200，CC 27，CC 301，CC 400，CC 500，CC 600，CC 700，CC 800，CC 900，Coker 176，Coker 319，Coker 371 Gold，Coker 48，CU 263，DF911，Galpao煙草，GL 26H，GL 350，GL 737，GL 939，GL 973，HB04P，K 149，K 326，K 346，K 358，K 394，K 399，K 730，KT 200，KY 10，KY14，KY 160，KY 17，KY 171，KY 907，KY 160，Little Crittenden，McNair 373，McNair 944，msKY 14xL8，Narrow Leaf Madole，NC 100，NC 102，NC 2000，NC 291，NC 297，NC 299，NC 3，NC 4，NC 5，NC 6，NC 606，NC 71，NC 72，NC 810，NC BH 129，OXFORD 207，′波瑞克′煙草，PVH03，PVH09，PVH19，PVH50，PVH51，R 610，R 630，R 7-11，R 7-12，RG 17，RG 81，RG H4，RGH51，RGH 4，RGH 51，RS 1410，SP 168，SP 172，SP 179，SP 210，SP 220，SPG-28，SP G-70，SP H20，SP NF3，TN 86，TN 90，TN 97，TN D94，TN D950，TR(Tom Rosson)Madole，VA 309，VA 309，或VA 359。
在另一個實施方案中，所述第二煙草植物的表型性狀包括疾病抗性；高產(chǎn)率；高級指標(high grade index)；可保存性(curability)；熟化質(zhì)量；可機械收割性；保持能力；葉子質(zhì)量；高度，植物成熟(例如，早期成熟，早期到中期成熟，中期成熟，中期到晚期成熟，或晚期成熟)；莖長(例如，短，中等的或長莖)；或每株植物的葉子數(shù)量(例如，少(例如5-10片葉子)，中等的(例如11-15片葉子)，或多(例如16-21片葉子)。在另一個實施方案中，該方法還包括自花傳粉或用步驟(b)的植物給能夠用在產(chǎn)生雜種或雄性不育雜種中的雄性不育花粉受體，花粉供體傳粉或使產(chǎn)生自步驟(e)的萌發(fā)的種子的植物回交或自花傳粉。
在另一個方面，本發(fā)明的特征是將煙堿脫甲基酶缺陷性狀培育到煙草植物中的方法，所述方法包括下列步驟a)使具有不同煙堿脫甲基酶基因表達的第一煙草植物與第二煙草植物雜交；b)產(chǎn)生雜交的子代煙草植物；c)從子代煙草植物中提取DNA樣品；d)使DNA樣品與標記核酸分子接觸，所述標記核酸分子與煙堿脫甲基酶基因或其片段雜交；和e)進行用于不同煙堿脫甲基酶基因表達性狀的標記輔助的育種方法。例如，將植物鑒定為具有不同的煙堿脫甲基酶的基因表達，并且如果需要，進一步測試煙堿脫甲基酶的基因表達或使用標準的生物堿圖譜或免疫印跡分析進行測試。典型地，這樣的標記輔助的育種方法包括使用擴增片段長度多態(tài)性，限制性片段長度多態(tài)性，隨機擴增多態(tài)性展示，單核苷酸多態(tài)性，微衛(wèi)星標記，或在煙草基因組中的靶向誘導的局部病灶。
在另一個方面，本發(fā)明的特征是產(chǎn)生煙草種子的方法，包括將選自由下列各項組成的組的任何一種煙草植物與其本身進行雜交Nicotianaafricana，Nicotiana amplexicaulis，Nicotiana arentsii，Nicotianabenthamiana，Nicotiana bigelovii，Nicotiana corymbosa，Nicotiana debneyi，Nicotiana excelsior，Nicotiana exigua，Nicotiana glutinosa，Nicotianagoodspeedii，Nicotiana gossei，Nicotiana hesperis，Nicotiana ingulba，Nicotiana knightiana，Nicotiana maritima，Nicotiana megalosiphon，Nicotianamiersii，Nicotiana nesophila，Nicotiana noctiflora，Nicotiana nudicaulis，Nicotiana otophora，Nicotiana palmeri，Nicotiana paniculata，Nicotianapetunioides，Nicotiana plumbaginifolia，Nicotiana repanda，Nicotianarosulata，Nicotiana rotundifolia，黃花煙草，Nicotiana setchelli，Nicotianastocktonii，Nicotiana eastii，Nicotiana suaveolens或Nicotianatrigonophylla。在一個實施方案中，所述方法還包括制備雜種煙草種子的方法，所述方法包括將具有不同煙堿脫甲基酶基因表達的煙草植物與第二種，獨特的煙草植物進行雜交。在該方法的另一個實施方案中，所述雜交包括下列步驟(a)種植種子，所述種子來自具有不同煙堿脫甲基酶基因表達的煙草植物和第二種，獨特的煙草植物的雜交；(b)從種子種植煙草植物直到植物開花；(c)用來自第二煙草植物的花粉給具有不同煙堿脫甲基酶基因表達的煙草植物的花進行傳粉或用來自具有不同煙堿脫甲基酶基因表達的煙草植物的花粉給所述第二煙草植物的花進行傳粉；和(d)收獲得自所述傳粉的種子。
在另一個方面，本發(fā)明的特征是在煙草育種程序中開發(fā)煙草植物的方法，其包括(a)提供具有不同的煙堿脫甲基酶基因表達的煙草植物，或其組分；和(b)將所述植物或植物組分作為使用煙草植物育種技術(shù)的育種原料的來源。用于進行該方法的示例性植物育種技術(shù)包括集團選擇，回交，自花傳粉，漸滲現(xiàn)象，譜系選擇，純系選擇，單倍體/二倍體育種，或單種譜系(single seed descent)。
在另一個方面，本發(fā)明的特征是用于產(chǎn)生具有改變的特性的煙草植物的育種方法，所述方法包括下列步驟(a)提供具有改變的特性的第一煙草植物，其包含核酸分子的不同的基因表達，所述核酸分子選自由下列各項組成的組中在

圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列；(b)提供包含至少一種表型性狀的第二煙草植物；(c)使所述第一煙草植物與第二煙草植物雜交以產(chǎn)生F1子代植物；(d)收集具有改變的特性的F1子代的種子；和(e)使種子萌發(fā)以產(chǎn)生具有改變的特性的煙草植物。在一個實施方案中，所述第一煙草植物包含內(nèi)源核酸分子，其選自由下列各項組成的組在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列，其中所述核酸包括突變。示例性突變包括缺失、取代、點突變、易位、倒位、復制或插入。
在另一個實施方案中，上述方法的第一煙草植物包含內(nèi)源核酸分子，所述內(nèi)源核酸分子選自由下列各項組成的組在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列，其中所述核酸包含無效突變。在另一個實施方案中，所述第一煙草植物包含重組基因，所述重組基因使內(nèi)源核酸分子，選自由下列各項組成的組的內(nèi)源核酸分子在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列的表達沉默。
如果需要，所述第一煙草植物包含內(nèi)源核酸分子，所述內(nèi)源核酸分子選自由下列各項組成的組在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列，其中所述核酸分子編碼具有減少的或改變的酶活性的多肽。在另一個實施方案中，第一煙草植物是轉(zhuǎn)基因植物。
用在本文公開的育種方法的示例性第一煙草植物包括Nicotianaafricana，Nicotiana amplexicaulis，Nicotiana arentsii，Nicotiana benthamiana，Nicotiana bigelovii，Nicotiana corymbosa，Nicotiana debneyi，Nicotianaexcelsior，Nicotiana exigua，Nicotiana glutinosa，Nicotiana goodspeedii，Nicotiana gossei，Nicotiana hesperis，Nicotiana ingulba，Nicotianaknightiana，Nicotiana maritima，Nicotiana megalosiphon，Nicotiana miersii，Nicotiana nesophila，Nicotiana noctiflora，Nicotiana nudicaulis，Nicotianaotophora，Nicotiana palmeri，Nicotiana paniculata，Nicotiana petunioides，Nicotiana plumbaginifolia，Nicotiana repanda，Nicotiana rosulata，Nicotianarotundifolia，黃花煙草，Nicotiana setchelli，Nicotiana stocktonii，Nicotiana eastii，Nicotiana suaveolens或Nicotiana trigonophylla。其它第一煙草植物包括各種煙草(Nicotiana tabacum)或黃花煙草。其它的第一煙草植物是東方型煙草、深色煙草、煙熏煙或晾煙、弗吉尼亞煙或白萊煙煙草植物。
在上述育種方法的另一個實施方案中，所述第二煙草植物是煙草(Nicotiana tabacum)。煙草的示例性種類包括商業(yè)種類諸如BU 64，CC 101，CC 200，CC 27，CC 301，CC 400，CC 500，CC 600，CC 700，CC 800，CC 900，Coker 176，Coker 319，Coker 371 Gold，Coker 48，CU 263，DF911，Galpao煙草，GL 26H，GL 350，GL 737，GL 939，GL 973，HB 04P，K 149，K 326，K 346，K 358，K 394，K 399，K 730，KT 200，KY 10，KY 14，KY 160，KY 17，KY 171，KY 907，KY 160，Little Crittenden，McNair 373，McNair 944，msKY 14xL8，Narrow Leaf Madole，NC 100，NC 102，NC 2000，NC 291，NC 297，NC 299，NC 3，NC 4，NC 5，NC 6，NC 606，NC 71，NC 72，NC 810，NC BH 129，OXFORD 207，′波瑞克′煙草，PVH03，PVH09，PVH19，PVH50，PVH51，R610，R 630，R 7-11，R 7-12，RG 17，RG 81，RG H4，RG H51，RGH 4，RGH 51，RS 1410，SP 168，SP 172，SP 179，SP 210，SP 220，SP G-28，SP G-70，SP H20，SP NF3，TN 86，TN 90，TN 97，TN D94，TN D950，TR(Tom Rosson)Madole，VA 309，VA 309，或VA 359。
在另一個實施方案中，所述第二煙草植物的表型性狀包括疾病抗性；高產(chǎn)率；高級指標；可保存性；熟化質(zhì)量；可機械收割性；保持能力；葉子質(zhì)量；高度，植物成熟(例如，早期成熟，早期到中期成熟，中期成熟，中期到晚期成熟，或晚期成熟)；莖長(例如，短，中等的或長莖)；或每株植物的葉子數(shù)量(例如，少(例如5-10片葉子)，中等的(例如11-15片葉子)，或多(例如16-21片葉子)。
在另一個實施方案中，所述方法包括用步驟(b)的植物給雄性不育或雄性不育雜種傳粉或使產(chǎn)生自步驟(e)的萌發(fā)的種子的植物回交或給其傳粉。在另一個方面，本發(fā)明的特征是將某種特性培育到煙草植物中的方法，所述方法包括下列步驟a)使第一煙草植物與第二煙草植物進行雜交，所述第一煙草植物具有改變的特性，其包含選自由在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列組成的組的核酸分子的不同的基因表達；b)產(chǎn)生雜交的子代煙草植物；c)從子代煙草植物中提取DNA樣品；d)使DNA樣品與標記核酸分子接觸，所述標記核酸分子與選自由下列各項組成的組的核酸分子雜交在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列或其片段；和e)進行改變的特性的標記輔助的育種方法。典型地，這樣的標記輔助育種方法包括使用擴增片段長度多態(tài)性，限制性片段長度多態(tài)性，隨機擴增多態(tài)性展示，單核苷酸多態(tài)性，微衛(wèi)星標記，或在煙草基因組中的靶向誘導的局部病灶。
在另一個方面中，本發(fā)明的特征是產(chǎn)生煙草種子的方法，其包括使得選自由Nicotiana africana，Nicotiana amplexicaulis，Nicotiana arentsii，Nicotiana benthamiana，Nicotiana bigelovii，Nicotiana corymbosa，Nicotiana debneyi，Nicotiana excelsior，Nicotiana exigua，Nicotianaglutinosa，Nicotiana goodspeedii，Nicotiana gossei，Nicotiana hesperis，Nicotiana ingulba，Nicotiana knightiana，Nicotiana maritima，Nicotianamegalosiphon，Nicotiana miersii，Nicotiana nesophila，Nicotiana noctiflora，Nicotiana nudicaulis，Nicotiana otophora，Nicotiana palmeri，Nicotianapaniculata，Nicotiana petunioides，Nicotiana plumbaginifolia，Nicotianarepanda，Nicotiana rosulata，Nicotiana rotundifolia，黃花煙草，Nicotianasetchelli，Nicotiana stocktonii，Nicotiana eastii，Nicotiana suaveolens或Nicotiana trigonophylla組成的組的任一種植物，具有改變的特性的煙草植物到第二種，獨特的煙草植物進行雜交，所述改變的特性包括選自由在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列組成的組的核酸分子的不同的基因表達。
在另一個實施方案中，雜交包括下列步驟(a)種植種子，所述種子來自具有改變的特性的煙草植物和第二種，獨特的煙草植物的雜交；(b)從種子種植煙草植物直到植物開花；(c)用來自第二煙草植物的花粉給具有改變的特性的煙草植物的花進行傳粉或用來自具有改變的特性的煙草植物的花粉給所述第二煙草植物的花進行傳粉；和(d)收獲得自所述傳粉的種子。
在另一個方面中，本發(fā)明的特征是在煙草育種程序中培育煙草植物的方法，其包括(a)提供具有改變的特性的煙草植物，或其組分，所述改變的特性包括選自由在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列組成的組的核酸分子的不同的基因表達；和(b)將所述植物或植物組分作為使用煙草植物育種技術(shù)的育種原料的來源。示例性植物育種技術(shù)包括集團選擇，回交，自花傳粉，漸滲現(xiàn)象，譜系選擇，純系選擇，單倍體/二倍體育種，或單種譜系(single seeddescent)。
在相關(guān)方面中，本發(fā)明的特征是按照上述育種方法的任一種產(chǎn)生的煙草植物或其組分。在另一個相關(guān)方面，本發(fā)明的特征是可再生的煙草細胞的組織培養(yǎng)物，所述煙草細胞獲自按照本文所述方法培育或產(chǎn)生的植物的任一種。這些組織培養(yǎng)物再生出這樣的煙草植物，所述煙草植物能夠表達具有不同的煙堿脫甲基酶基因表達或改變的特性的煙草植物的所有生理和形態(tài)特征。示例性可再生的細胞是胚、分生細胞、種子、花粉、葉、根、根端、或花或是來自其中的原生質(zhì)體或胼胝體。
在另一個相關(guān)方面，本發(fā)明的特征是產(chǎn)生煙草產(chǎn)品的方法，包括(a)按照前述育種方法的任一種產(chǎn)生煙草植物；和(b)從煙草植物中制備煙草產(chǎn)品。示例性煙草產(chǎn)品包括葉子或莖或兩者；無煙煙草產(chǎn)品；濕或干鼻煙(snuff)；嚼煙(chewing tobaccos)；卷煙(cigarette products)；雪茄煙(cigarproducts)；小雪茄煙(cigarillos)；pipe tobacco或bidis。
本發(fā)明的另一個方面的特征是分離的遺傳標記，其包括與在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列基本上相同，理想地至少70％相同的核酸序列。在本發(fā)明的該方面的理想實施方案中，所述核酸序列包含這樣的序列，所述序列在嚴格條件下與在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列的互補序列雜交。在其它的理想實施方案中，所述核酸序列是組成性的，或乙烯或衰老誘導的。此外，所述核酸序列理想地編碼與在圖1，圖3和4，圖10-158，圖160A-160E，圖162到170和圖172-1到172-19中顯示的氨基酸序列基本上相同的多肽。
在本發(fā)明的其它理想實施方案中，所述核酸序列與異源基因可操縱地連接或所述核酸序列與可誘導的、組成性的、病原體或創(chuàng)傷誘導的、環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)的或細胞-或組織-特異性的啟動子可操縱地連接。
在另一個方面，本發(fā)明的特征是包含在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列的表達載體，其中所述載體能夠指導由所述核酸序列編碼的多肽的表達。
本發(fā)明的另一個方面的特征是包含在圖1，圖3和4，圖10-158，圖160A-160E，圖162到170或圖172-1到172-19中顯示的多肽的氨基酸序列的基本純的多肽，以及特異性識別所述多肽的抗體。
本發(fā)明的另一個方面的特征是包含在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的分離的核酸序列的植物或植物組分，其中所述核酸序列在植物或植物組分中表達，或編碼多肽的核酸序列，所述多肽與在圖1，圖3和4，圖10-158，圖160A-160E，圖162到170或圖172-1到172-19中顯示的氨基酸序列基本上相同，其中所述核酸序列在植物或植物組分中表達。理想地，所述植物或植物組分是煙草屬物種，例如在表8中顯示的煙草屬物種。在其它理想的實施方案中，所述植物組分是葉，例如加工處理的(cured)煙草葉，莖或種子。理想的實施方案的特征是來自萌發(fā)的種子的植物。
在另一個方面，本發(fā)明的特征是包含植物或植物組分的煙草產(chǎn)品，所述植物或植物組分包含在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的分離的核酸序列，其中所述核酸序列在植物或植物組分中進行表達。理想地，將內(nèi)源基因在加工處理的煙草植物或植物組分中的表達沉默。在其它理想的實施方案中，所述煙草產(chǎn)品是無煙煙草產(chǎn)品，濕或干的鼻煙，嚼煙，卷煙，雪茄煙，小雪茄煙，pipetobaccos或bidis。具體而言，本發(fā)明的該方面的煙草產(chǎn)品可以包含深色煙草，研磨過的煙草，或包含加香成分。
本發(fā)明的另一個方面的特征是在植物細胞中減少組成性，或乙烯誘導的或衰老誘導的煙草多肽的表達或酶活性的方法。該方法包括減少植物細胞中內(nèi)源組成性的或乙烯或衰老誘導的煙草多肽的水平或酶活性。在理想的實施方案中，所述煙草多肽是p450。在其它理想的實施方案中，所述植物細胞來自煙草屬物種，例如在表8中顯示的煙草屬物種的其中之一。
在另一個理想的實施方案中，減少內(nèi)源組成性，或乙烯或衰老誘導的煙草多肽的水平包括在植物細胞中表達轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因編碼在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列或編碼包含在圖1，圖3和4，圖10-158，圖160A-160E，圖162-170和圖172-1到172-19中顯示的氨基酸序列的多肽的核酸序列的反義核酸分子。在另一個理想的實施方案中，所述轉(zhuǎn)基因在植物細胞中編碼組成性，或乙烯或衰老誘導的煙草核酸或氨基酸序列的雙鏈RNA分子。在其它理想的實施方案中，所述轉(zhuǎn)基因以，例如組織特異性，細胞特異性，或器官特異性方式進行表達。此外，減少內(nèi)源組成性，或乙烯或衰老誘導的煙草多肽的水平理想地包括在植物細胞中共抑制組成性，或乙烯或衰老誘導的煙草多肽。在另一個理想的實施方案中，減少內(nèi)源組成性，或乙烯或衰老誘導的煙草多肽的水平包括在植物細胞中表達顯性負調(diào)控的基因產(chǎn)物。理想地，所述內(nèi)源組成性，或乙烯或衰老誘導的煙草多肽包括基因中的突變，所述基因編碼在圖1，圖3和4，圖10到158，圖160A到160E，圖162-170和圖172-1到172-19中顯示的氨基酸序列。在其它的理想實施方案中，減少的表達發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，翻譯水平或在翻譯后水平。
本發(fā)明的另一個方面的特征是在植物細胞中增加組成性，或乙烯或衰老誘導的煙草多肽的表達或酶活性的方法。該方法包括在植物細胞中增加內(nèi)源組成性，或乙烯或衰老誘導的煙草多肽的水平或酶活性。在本發(fā)明的該方面的理想實施方案中，所述植物細胞來自煙草屬物種，例如在表8中顯示的煙草屬物種。在另一個理想的實施方案中，增加組成性，或乙烯或衰老誘導的煙草多肽的水平包括在植物細胞中表達轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因包括在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列或編碼包含在圖1，圖3和4，圖10-158，圖160A-160E，圖162-170和圖172-1到172-19中顯示的氨基酸序列的多肽的核酸序列。理想地，增加的表達發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，翻譯水平或在翻譯后水平。
本發(fā)明的另一個方面的特征是產(chǎn)生組成性，或乙烯或衰老誘導的煙草多肽的方法。該方法包括下列步驟(a)提供用包含在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列的分離的核酸分子轉(zhuǎn)化的細胞；(b)在表達所述分離的核酸分子的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的細胞；和(c)回收所述組成性，或乙烯或衰老誘導的煙草多肽。理想地，所述組成性，或乙烯或衰老誘導的煙草多肽是p450。在另一個理想的實施方案中，本發(fā)明的特征是按照本發(fā)明的該方面的方法產(chǎn)生的重組的組成性，或乙烯或衰老誘導的煙草多肽。
在另一個方面中，本發(fā)明的特征是分離組成性，或乙烯或衰老誘導的煙草多肽或其片段的方法。該方法包括下列步驟(a)使在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列或其部分與制備自植物細胞的核酸制備物在嚴格雜交條件下接觸，所述雜交條件提供與在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列具有至少70％或更大的序列同一性的核酸序列的檢測；和(b)分離雜交的核酸序列。理想地，所述組成性，或乙烯或衰老誘導的煙草多肽是p450。
本發(fā)明另一個方面的特征是包含編碼煙堿脫甲基酶的核苷酸序列的分離的核酸分子，例如DNA序列。在理想的實施方案中，第一方面的核苷酸序列基本上與編碼煙草煙堿脫甲基酶的核苷酸序列相同，所述煙草煙堿脫甲基酶諸如這樣的煙草煙堿脫甲基酶，其包含與SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的核苷酸序列至少70％同一性的核苷酸序列，或包含SEQ IDNO4的核苷酸2010-2949和/或3947-4562，或包含SEQ ID NO4或SEQID NO5的序列。本發(fā)明的第一個方面的分離的核酸分子，例如與在植物細胞中有功能的啟動子可操縱地連接，并且理想地包含在表達載體內(nèi)。在其它理想的實施方案中，表達載體被包含在細胞，例如植物細胞中。理想地，所述植物細胞，諸如煙草植物細胞包括在植物中。在另一個理想的實施方案中，本發(fā)明的特征是來自包含表達載體的植物的種子，例如煙草種子，其中所述種子包含分離的核酸分子，所述核酸分子在嚴格雜交條件下與SEQ ID NO4的序列雜交，其與異源啟動子序列可操縱地連接。此外，本發(fā)明的特征是來自包含表達載體的萌發(fā)的種子的植物，來自所述植物的綠色或加工處理的葉子，和制備自所述葉子的制品。
在另一個理想的實施方案中，所述核苷酸序列包含這樣的序列，其在嚴格雜交條件下與SEQ ID NO4和/或SEQ ID NO5的核苷酸序列的互補序列，或SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的片段雜交。理想地，所述核苷酸序列編碼煙堿脫甲基酶，其與SEQ ID NO3的氨基酸序列基本上相同。在本發(fā)明的第一個方面的另一個理想的實施方案中，所述煙堿脫甲基酶與SEQ ID NO3的煙堿脫甲基酶氨基酸序列或煙堿脫甲基酶的片段具有至少70％的氨基酸序列同一性，所述煙堿脫甲基酶的片段與全長多肽相比具有改變(例如，減少)的酶活性。理想地，所述煙堿脫甲基酶包含SEQ ID NO3的氨基酸序列。
在另一個方面，本發(fā)明的特征是分離的核酸分子，其包含這樣的啟動子，所述啟動子在嚴格條件下雜交于SEQ ID NO8的序列，或驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的其片段。理想地，所述啟動子(i)在用乙烯處理后或在衰老過程中被誘導；并且(ii)包括(a)SEQ ID NO4的堿基對1-2009，或(b)至少200個連續(xù)的堿基對，其與由SEQ ID NO4的堿基對1-2009限定的200個連續(xù)的堿基對的序列相同，或(c)20個堿基對核苷酸部分，其在序列上與在SEQ ID NO4的堿基對1-2009中提出的20個連續(xù)堿基對部分的序列相同。
本發(fā)明的另一個方面的特征是分離的核酸啟動子，其包含與SEQ IDNO8的序列具有50％或更多的序列同一性的核苷酸序列。理想地，該分離的核酸啟動子在用乙烯處理后，或在衰老過程中被誘導，并且例如包含SEQ ID NO8的序列。備選地，所述啟動子可以包含可從SEQ ID NO8中獲得的片段，其中所述片段驅(qū)動異源基因的轉(zhuǎn)錄或減少或改變煙堿脫甲基酶活性(例如，使基因表達沉默)。在理想的實施方案中，所述啟動子序列與異源核酸序列可操縱地連接，并且可以例如被包含在表達載體中。在其它理想的實施方案中，所述表達載體被包含在細胞，例如植物細胞中。理想地，植物細胞，諸如煙草植物細胞，被包含在植物中。在另一個理想的實施方案中，本發(fā)明的特征是來自包含表達載體的植物的種子，例如煙草種子，其中所述種子包含分離的核酸分子，其在嚴格條件下，雜交于SEQID NO8的序列，其與異源核酸序列可操縱地連接。此外，本發(fā)明的特征是來自包含本發(fā)明的該方面的啟動子的萌發(fā)種子的植物，來自所述植物的綠色或加工處理的葉子，和由所述葉子制成的制品。
本發(fā)明的另一個方面的特征是在植物中表達異源基因的方法。該方法包括(i)將包含啟動子序列的載體引入植物細胞，所述啟動子序列與SEQ IDNO8的序列具有50％或更多的序列同一性，其與異源核酸序列可操縱地連接；和(ii)從所述細胞中再生植物。此外，該方法可以包括將載體性傳遞到子代，并且進一步可以包括收集從子代中產(chǎn)生的種子的步驟。
在另一個方面，本發(fā)明的特征是在煙草植物中減少煙堿脫甲基酶的表達的方法。該方法包括下列步驟(i)將包含SEQ ID NO8的序列或可從SEQ ID NO8獲得的片段的載體引入煙草植物中，所述SEQ ID NO8的序列或可從SEQ ID NO8獲得的片段與異源核酸序列可操縱地連接和(ii)在煙草植物中表達所述載體。在該方法的理想實施方案中，煙堿脫甲基酶的表達被沉默。在其它理想的實施方案中，所述載體表達RNA，諸如反義RNA或能夠誘導RNA干擾(RNAi)的RNA分子。
在另一個理想的方面中，本發(fā)明的特征是包含這樣的內(nèi)含子的分離的核酸分子，所述內(nèi)含子在嚴格條件下雜交于SEQ ID NO7的序列或其片段，SEQ ID NO7的序列或其片段減少或改變煙堿脫甲基酶的酶活性(例如，沉默基因表達)或可以充當分子標記以鑒定煙堿脫甲基酶核酸序列。在理想的實施方案中，內(nèi)含子包含(a)SEQ ID NO4的堿基對2950-3946，或(b)至少200個連續(xù)的堿基對，其與SEQ ID NO4的堿基對2950-3946所定義的200個連續(xù)的堿基對的序列相同，或(c)20個堿基對核苷酸部分，其在序列上與在SEQ ID NO4的堿基對2950-3946中提出的20個連續(xù)的堿基對部分的序列相同。
本發(fā)明的另一個理想的方面的特征是分離的核酸內(nèi)含子，所述內(nèi)含子包括與SEQ ID NO7的序列或其片段具有50％或更多序列同一性的核苷酸序列，所述SEQ ID NO7的序列或其片段減少或改變煙堿脫甲基酶的酶活性(例如，沉默基因表達)或可以充當分子標記以鑒定煙堿脫甲基酶核酸序列。使基因表達沉默，可以例如，包括導致不具有煙堿脫甲基酶活性的基因產(chǎn)物的同源重組(例如使用SEQ ID NO188的序列或其片段)或突變。具體而言，所述內(nèi)含子可以包含SEQ ID NO7的序列或可以從SEQ ID NO7獲得的片段。理想地，包含內(nèi)含子的分離的核酸分子與異源核酸序列可操縱地連接并且該序列理想地被包含在表達載體中。在另一個實施方案中，所述表達載體被包含在細胞，諸如植物細胞中。具體而言，所述細胞可以是煙草細胞。包含這樣的植物細胞的植物，例如煙草植物是本發(fā)明的另一個理想的實施方案，所述植物細胞包含SEQ ID NO7的序列或可從SEQ ID NO7獲得的片段，其在表達載體中與異源核酸序列可操縱地連接。另外，來自植物的種子，例如煙草種子也是理想的，其中所述種子包含內(nèi)含子，所述內(nèi)含子在嚴格條件下雜交于與異源核酸序列可操縱地連接的SEQ ID NO7。此外，本發(fā)明的特征是來自包含本發(fā)明的該方面的內(nèi)含子的萌發(fā)的種子的植物，來自所述植物的綠色或加工處理的葉子，和從所述綠色或加工處理的葉子制成的制品。
本發(fā)明的另一個方面的特征是在植物中表達內(nèi)含子的方法。該方法包括(i)將表達載體引入植物細胞，所述表達載體包含SEQ ID NO7的序列或可從SEQ ID NO7獲得的片段，其與異源核酸序列可操縱地連接；和(ii)從細胞中再生植物。在理想的實施方案中，該方法還包括(iii)將載體性傳遞到子代，并可以包括收集由子代產(chǎn)生的種子的另外的步驟。所述方法理想地包括，例如從萌發(fā)的種子再生植物，和來自所述植物的綠色或加工處理的葉子，和從所述葉子制備制品的方法。
在另一個方面中，本發(fā)明的特征是減少煙草植物中煙堿脫甲基酶的表達的方法。該方法包括下列步驟(i)將載體引入煙草植物，所述載體包含SEQ ID NO7的序列或可從SEQ ID NO7獲得的片段，所述SEQ ID NO7或可從SEQ ID NO7獲得的片段可操縱地與異源核酸序列連接和(ii)在煙草植物中表達所述載體。在該方法的理想實施方案中，使煙堿脫甲基酶的表達被沉默。在其它理想的實施方案中，所述載體表達RNA，諸如反義RNA或能夠誘導RNA干擾(RNAi)的RNA分子。
在另一個方面，本發(fā)明的特征是包含非翻譯區(qū)的分離的核酸分子，所述非翻譯區(qū)在嚴格條件下雜交于SEQ ID NO9的序列或其片段，其可以改變基因的表達模式，減少或改變煙堿脫甲基酶酶活性(例如，使基因表達沉默)，或可以用作標記來鑒定煙堿脫甲基酶核酸序列。在本發(fā)明該方面的理想實施方案中，非翻譯區(qū)包括(a)SEQ ID NO4的堿基對4563-6347，或(b)至少200個連續(xù)的堿基對，其與SEQ ID NO4的堿基對4563-6347所限定的序列的200個連續(xù)的堿基對相同，或(c)20個堿基對核苷酸部分，其在序列上與SEQ ID NO4的堿基對4563-6347中提出的序列的20個連續(xù)的堿基對部分相同。
本發(fā)明的另一個理想的方面的特征是分離的核酸非翻譯區(qū)，所述核酸非翻譯區(qū)包含這樣的核苷酸序列，其與SEQ ID NO9的序列具有50％或更多的序列同一性。理想地，所述非翻譯區(qū)包含SEQ ID NO9的序列或所述非翻譯區(qū)包括可從SEQ ID NO9獲得的片段，其可以改變基因的表達模式，減少或改變煙堿脫甲基酶的酶活性(例如，使基因表達沉默)，或可以用作標記來鑒定煙堿脫甲基酶核酸序列。所述非翻譯區(qū)理想地與異源核酸序列可操縱地連接并且可以包含在表達載體中。此外，該表達載體理想地包含在細胞，諸如植物細胞，例如煙草細胞中。本發(fā)明的另一個理想的實施方案的特征是包含植物細胞的植物，諸如煙草植物，所述植物細胞包含包括分離的核酸序列的載體，所述分離的核酸序列與SEQ ID NO9的序列具有50％或更多的序列同一性并且與異源核酸序列可操縱地連接。
本發(fā)明的特征還在于來自植物的種子，例如煙草種子，其中所述種子包含非翻譯區(qū)，所述非翻譯區(qū)在嚴格條件下雜交于SEQ ID NO9，其與異源核酸序列可操縱地連接。此外，本發(fā)明的特征是來自包含本發(fā)明的該方面的非翻譯區(qū)的萌發(fā)的種子的植物，來自所述植物的綠色或加工處理的葉子，和由綠色或加工處理的葉子制成的制品。
在另一個方面，本發(fā)明的特征是在植物中表達非翻譯區(qū)的方法。該方法包括(i)將載體引入植物細胞，所述載體包含這樣的分離的核酸序列，所述核酸序列與SEQ ID NO9的序列具有50％或更多的序列同一性，并且與異源核酸序列可操縱地連接；和(ii)從所述細胞中再生植物。此外，該方法還可以包括(iii)將載體性傳遞到子代，并且理想地，包括收集由子代產(chǎn)生的種子的另外的步驟。該方法理想地包括從萌發(fā)的種子再生植物，從所述植物再生綠色或加工處理的葉子，和從綠色或加工處理的葉子制備制品的方法。
此外，本發(fā)明的特征是在煙草植物中減少煙堿脫甲基酶的表達或改變煙堿脫甲基酶的酶活性的方法。該方法包括下列步驟(i)將載體引入煙草植物中，所述載體包含這樣的分離的核酸序列，所述分離的核酸序列與SEQ ID NO9的序列具有50％或更多的序列同一性并且與異源核酸序列可操縱地連接和(ii)在煙草植物中表達載體。理想地，煙堿脫甲基酶的表達被沉默。在其它理想的實施方案中，載體表達RNA，例如反義RNA或能夠誘導RNA干擾(RNAi)的RNA分子。
本發(fā)明的另一個方面的特征是表達載體，所述表達載體包括包含編碼煙堿脫甲基酶的核苷酸序列的核酸分子，其中所述載體能夠指導由分離的核酸分子編碼的煙堿脫甲基酶的表達。理想地，所述載體包含SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的序列。在其它理想的實施方案中，本發(fā)明的特征是植物或植物組分，例如煙草植物或植物組分(例如，煙草葉子或莖)，其包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼使煙堿脫甲基的多肽的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一個方面的特征是包含分離的核酸分子的細胞，所述分離的核酸分子包括編碼煙堿脫甲基酶的核苷酸序列。理想地，該細胞是植物細胞或細菌細胞，諸如土壤桿菌屬(Agrobacterium)。
本發(fā)明的另一個方面的特征是植物或植物組分(例如煙草葉子或莖)，其包含編碼煙堿脫甲基酶的分離的核酸分子，其中所述核酸分子在植物或植物組分中進行表達。理想地，所述植物或植物組分是被子植物、雙子葉植物、茄科植物或煙草屬物種。該方面的其它理想的實施方案是來自所述植物或植物組分的種子或細胞，以及來自所述植物的綠色或加工處理的葉子和由其制備的制品。
在另外的方面中，本發(fā)明的特征是煙草植物，其具有編碼多肽的核酸序列的減少的表達，所述多肽例如包括SEQ ID NO3的序列并且使煙堿脫甲基的多肽，其中所述減少的表達(或酶活性的減少)減少植物中去甲煙堿的水平。在理想的實施方案中，所述煙草植物是轉(zhuǎn)基因植物，諸如包括轉(zhuǎn)基因的植物，當所述轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因植物中進行表達時，使內(nèi)源煙草煙堿脫甲基酶的基因表達沉默。
具體而言，所述轉(zhuǎn)基因植物理想地包括下列各項中的一個或多個表達煙草煙堿脫甲基酶的反義分子或能夠誘導RNA干擾(RNAi)的RNA分子的轉(zhuǎn)基因；當在轉(zhuǎn)基因植物中表達時，共抑制煙草煙堿脫甲基酶的表達的轉(zhuǎn)基因；編碼顯性失活(dominant negative)基因產(chǎn)物，例如SEQ ID NO3的氨基酸序列的突變形式的轉(zhuǎn)基因；在編碼SEQ ID NO3的氨基酸序列的基因中的點突變；在編碼煙草煙堿脫甲基酶的基因中的缺失；和在編碼煙草煙堿脫甲基酶的基因中的插入。
在其它理想的實施方案中，編碼多肽的核酸序列的減少的表達在轉(zhuǎn)錄水平、在翻譯水平或在翻譯后水平發(fā)生。
本發(fā)明的另一個方面的特征是煙草植物，所述煙草植物包含被穩(wěn)定整合到其基因組中的重組表達盒，其中所述盒能夠?qū)崿F(xiàn)煙堿脫甲基酶活性的減少。該煙草植物的種子是理想的實施方案中的特征。其它的理想的實施方案包括來自該植物的綠色或加工處理的葉子和由其制備的制品。
本發(fā)明的另一個方面的特征是在植物中表達煙草煙堿脫甲基酶的方法。該方法包括(i)將表達載體引入植物細胞中，所述表達載體包括包含編碼煙堿脫甲基酶的核苷酸序列的核酸分子；和(ii)從所述細胞中再生植物。在理想的實施方案中，該方法的特征是將載體性傳遞到子代，并且理想地還包括收集由子代產(chǎn)生的種子的另外的步驟。另外的理想的實施方案包括來自萌發(fā)的種子的植物，來自所述植物的綠色或加工處理的葉子，或由所述綠色或加工處理的葉子制備的制品。
本發(fā)明的另一個方面的特征是基本純的煙草煙堿脫甲基酶。理想地，該煙草煙堿脫甲基酶包括與SEQ ID NO3的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列或包括SEQ ID NO3的氨基酸序列。在理想的實施方案中，所述煙草煙堿脫甲基酶，在植物細胞中表達后，將煙堿轉(zhuǎn)化為去甲煙堿。在其它理想的實施方案中，所述煙草煙堿脫甲基酶，在植物細胞中表達后，被主要定位在葉子中，或所述煙草煙堿脫甲基酶由乙烯誘導或在植物衰老的過程中進行表達。
在另一個方面，本發(fā)明的特征是基本純的抗體，其特異性地識別并且結(jié)合煙草煙堿脫甲基酶。理想地，所述抗體識別并且結(jié)合重組煙草煙堿脫甲基酶，例如包含SEQ ID NO3的序列或其片段的重組煙草煙堿脫甲基酶。
本發(fā)明的另一個方面的特征是產(chǎn)生煙草煙堿脫甲基酶的方法。該方法包括下列步驟(a)提供被用分離的核酸分子轉(zhuǎn)化的細胞，所述分離的核酸分子包含編碼使煙堿脫甲基的多肽的核苷酸序列；(b)在表達所述分離的核酸分子的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的細胞；和(c)回收所述煙草煙堿脫甲基酶。本發(fā)明的特征還在于按照該方法產(chǎn)生的重組煙草煙堿脫甲基酶。
在另一個方面，本發(fā)明的特征是分離煙草煙堿脫甲基酶或其片段的方法。該方法包括下列步驟(a)使SEQ ID NOS4，5，7，8，或9的核酸分子或其部分與來自植物細胞的核酸制備物在這樣的雜交條件下進行接觸，所述雜交條件提供核酸序列的檢測，所述核酸序列與SEQ ID NOS4，5，7，8，或9的核酸序列具有至少70％或更大的序列同一性；和(b)分離所述雜交的核酸序列。
在另一個方面，本發(fā)明的特征是分離煙草煙堿脫甲基酶或其片段的另一種方法。該方法包括下列步驟(a)提供植物細胞DNA的樣品；(b)提供寡核苷酸對，其與具有SEQ ID NOS4，5，7，8，或9的序列的核酸分子的區(qū)域具有序列同一性；(c)使所述寡核苷酸對與植物細胞DNA在這樣的條件下進行接觸，所述條件適合于聚合酶鏈反應介導的DNA擴增；和(d)分離所述擴增的煙草煙堿脫甲基酶或其片段。在該方面的理想的實施方案中，使用制備自植物細胞的cDNA的樣品進行擴增步驟。在另一個理想的實施方案中，所述煙草煙堿脫甲基酶編碼多肽，所述多肽與SEQ IDNO3的氨基酸序列具有至少70％的同一性。
本發(fā)明的另一個方面的特征是在植物或植物組分中減少煙草煙堿脫甲基酶的表達的方法。該方法包括下列步驟(a)將編碼煙草煙堿脫甲基酶的轉(zhuǎn)基因引入植物細胞中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物細胞，所述轉(zhuǎn)基因與在植物細胞中有功能的啟動子可操縱地連接；和(b)從轉(zhuǎn)化的植物細胞中再生植物或植物組分，其中所述煙草煙堿脫甲基酶在植物或植物組分的細胞中進行表達，由此在植物或植物組分中減少煙草煙堿脫甲基酶的表達。在本發(fā)明的該方面的具體實施方案中，將編碼煙草煙堿脫甲基酶的轉(zhuǎn)基因例如，以組織特異性，細胞特異性或器官特異性方式，組成性地表達或誘導性地進行表達。在本發(fā)明的該方面的另一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因的表達共抑制內(nèi)源煙草煙堿脫甲基酶或任何本文所述的其它多肽的表達。
本發(fā)明的另一個方面的特征是在植物或植物組分中減少煙草煙堿脫甲基酶或任何本文所述的其它多肽的表達的另一種方法。該方法包括下列步驟(a)將編碼煙草煙堿脫甲基酶的反義編碼序列或能夠誘導RNA干擾(RNAi)的RNA分子的轉(zhuǎn)基因引入植物細胞中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物細胞，所述轉(zhuǎn)基因與在植物細胞中有功能的啟動子可操縱地連接；和(b)從轉(zhuǎn)化的植物細胞中再生植物或植物組分，其中煙草煙堿脫甲基酶的編碼序列的反義或能夠誘導RNA干擾(RNAi)的RNA分子在植物或植物組分的細胞中進行表達，由此在植物或植物組分中減少煙草煙堿脫甲基酶的表達。理想地，編碼煙草煙堿脫甲基酶的反義序列或能夠誘導RNA干擾(RNAi)的RNA分子的轉(zhuǎn)基因，例如以組織特異性、細胞特異性或器官特異性方式組成性地表達或誘導性地進行表達。在其它理想的實施方案中，煙草煙堿脫甲基酶的編碼序列的反義或能夠誘導RNAi的RNA分子包含SEQ ID NO1，SEQID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQID NO61，SEQ ID NO188的互補序列，或其片段。
本發(fā)明的另一個方面的特征是在植物或植物組分中減少煙草煙堿脫甲基酶的表達的另一種方法。該方法包括下列步驟(a)將轉(zhuǎn)基因引入植物細胞中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物細胞，所述轉(zhuǎn)基因編碼煙草煙堿脫甲基酶的顯性失活的基因產(chǎn)物，其與在植物細胞中有功能的啟動子可操縱地連接；和(b)從轉(zhuǎn)化的植物細胞再生植物或植物組分，其中煙草煙堿脫甲基酶的顯性失活基因產(chǎn)物在植物或植物組分的細胞中進行表達，由此在植物或植物組分中減少煙草煙堿脫甲基酶的表達。在本發(fā)明的該方面的具體實施方案中，編碼顯性失活基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因以例如組織-特異性、細胞特異性或器官特異性方式進行組成性表達或誘導性表達。
本發(fā)明的另一個方面的特征是在植物細胞中減少煙草煙堿脫甲基酶的表達或酶活性的另一種方法。該方法包括在植物細胞中減少內(nèi)源煙草煙堿脫甲基酶的水平，或其酶活性。理想地，所述植物細胞來自雙子葉植物、茄科植物，或煙草屬植物物種。在該方面的理想實施方案中，減少內(nèi)源煙草煙堿脫甲基酶水平包括在植物細胞中表達編碼煙草煙堿脫甲基酶的反義核酸分子或誘導RNA干擾(RNAi)的RNA分子的轉(zhuǎn)基因，或包括在植物細胞中表達編碼煙草煙堿脫甲基酶的雙鏈RNA分子的轉(zhuǎn)基因。理想地，所述雙鏈RNA是對應于SEQ ID NO1，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO61，SEQ ID NO188序列的RNA序列，或其片段。在另一個實施方案中，減少內(nèi)源煙草煙堿脫甲基酶的水平包括在植物細胞中共抑制內(nèi)源煙草煙堿脫甲基酶或包括在植物細胞中表達顯性失活基因產(chǎn)物。具體而言，所述顯性失活基因產(chǎn)物可以包括編碼SEQ ID NO3的氨基酸序列的突變形式或任何本文所述的其它氨基酸序列的基因。
在本發(fā)明的該方面的其它理想實施方案中，內(nèi)源煙草煙堿脫甲基酶包括在編碼SEQ ID NO3的氨基酸序列的基因中的點突變。在其它理想的實施方案中，減少內(nèi)源煙草煙堿脫甲基酶的表達的水平包括在編碼煙草煙堿脫甲基酶的基因中的缺失或包括在編碼煙草煙堿脫甲基酶的基因中的插入。減少的表達可以在轉(zhuǎn)錄水平，在翻譯水平，或在翻譯后水平發(fā)生。
在本發(fā)明的另一個方面的特征是鑒定在細胞中改變煙草煙堿脫甲基酶的表達的化合物的方法。該方法包括下列步驟(a)提供包含編碼煙草煙堿脫甲基酶的基因的細胞；(b)將候選化合物應用到細胞中；和(c)測量編碼煙草煙堿脫甲基酶的基因的表達，其中相對于未處理的對照樣品在表達中的增加或減少是化合物改變煙草煙堿脫甲基酶的表達的指示。
在該方法的理想實施方案中，部分(a)的基因編碼這樣的煙草煙堿脫甲基酶，其與SEQ ID NO3的氨基酸序列具有至少70％的同一性。理想地，所述化合物減少或增加編碼所述煙草煙堿脫甲基酶的基因的表達。
在另一個方面，本發(fā)明的特征是鑒定在細胞中改變煙草煙堿脫甲基酶的活性的化合物的另一種方法。該方法包括下列步驟(a)提供表達編碼煙草煙堿脫甲基酶的基因的細胞；(b)將候選化合物應用到細胞中；和(c)測量所述煙草煙堿脫甲基酶的活性，其中相對于未處理的對照樣品的活性的增加或減少是化合物改變所述煙草煙堿脫甲基酶的活性的指示。在本發(fā)明的該方面的理想實施方案中，步驟(a)的基因編碼這樣的煙草煙堿脫甲基酶，其與SEQ ID NO3的氨基酸序列具有至少70％的同一性。理想地，所述化合物減少或增加煙草煙堿脫甲基酶的活性。
本發(fā)明的另一個方面的特征是加工處理的煙草植物或植物組分，其包含(i)減少的水平的煙堿脫甲基酶或(ii)具有改變的酶活性的煙堿脫甲基酶和減少量的亞硝胺。理想地，所述植物組分是煙草葉子或煙草莖。在理想的實施方案中，亞硝胺是去甲煙堿，并且所述去甲煙堿的含量理想地是少于5mg/g，4.5mg/g，4.0mg/g，3.5mg/g，3.0mg/g，更理想地少于2.5mg/g，2.0mg/g，1.5mg/g，1.0mg/g，更理想地少于750μg/g，500μg/g，250μg/g，100μg/g，甚至更理想地少于75μg/g，50μg/g，25μg/g，10μg/g，7.0μg/g，5.0μg/g，4.0μg/g，和甚至更理想地少于2.0μg/g，1.0μg/g，0.5μg/g，0.4μg/g，0.2μg/g，0.1μg/g，0.05μg/g，或0.01μg/g，或其中次級生物堿相對于其中總的生物堿含量的百分比少于90％，70％，50％，30％，10％，理想地少于5％，4％，3％，2％，1.5％，1％，并且更理想地少于0.75％，0.5％，0.25％，或0.1％。在另一個理想的實施方案中，亞硝胺是N’-亞硝基去甲煙堿(NNN)，并且N’-NNN的含量理想地是少于5mg/g，4.5mg/g，4.0mg/g，3.5mg/g，3.0mg/g，更理想地少于2.5mg/g，2.0mg/g，1.5mg/g，1.0mg/g，更理想地少于750μg/g，500μg/g，250μg/g，100μg/g，甚至更理想地少于75μg/g，50μg/g，25μg/g，10μg/g，7.0μg/g，5.0μg/g，4.0μg/g，并且甚至更理想地少于2.0μg/g，1.0μg/g，0.5μg/g，0.4μg/g，0.2μg/g，0.1μg/g，0.05μg/g，或0.01μg/g，或其中次級生物堿相對于其中包含的總生物堿含量的百分比是少于90％，70％，50％，30％，10％，理想地少于5％，4％，3％，2％，1.5％，1％，并且更理想地少于0.75％，0.5％，0.25％，或0.1％。在本發(fā)明的該方面的另一個理想的實施方案中，所述加工處理的煙草植物或植物組分是深色煙草、白萊煙、煙熏煙(flue-cured tobacco)、弗吉尼亞煙、晾煙或東方型煙草。
此外，本發(fā)明的加工處理的煙草植物或植物組分理想地包含重組煙堿脫甲基酶基因，例如包含SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的序列，或其片段的基因。理想地，在加工處理的煙草植物或植物成分中，內(nèi)源煙堿脫甲基酶基因或任何其它本文所述的核酸序列的表達被沉默。
本發(fā)明的另一個方面的特征是包含加工處理的植物或植物組分的煙草產(chǎn)品，其包括(i)煙堿脫甲基酶或本文所述的任何其它多肽的減少的表達或(ii)具有改變活性的煙堿脫甲基酶或本文所述的其它的多肽，和減少量的亞硝胺。理想地，所述煙草產(chǎn)品是無煙煙草、濕或干鼻煙、嚼煙、卷煙、雪茄煙、小雪茄煙、pipe tobacco或bidis。具體而言，本發(fā)明的該方面的煙草產(chǎn)品可以包含深色煙草、研磨過的煙草，或包括加香成分。
本發(fā)明的特征還在于制備煙草產(chǎn)品，例如無煙煙草產(chǎn)品的方法，其包含(i)煙堿脫甲基酶的減少的表達或(ii)具有改變(例如減少的)酶活性的煙堿脫甲基酶，和減少量的亞硝胺。該方法包括提供加工處理的煙草植物或植物組分，和從所述加工處理的煙草植物或植物成分中制備煙草產(chǎn)品，所述加工處理的煙草植物或植物組分包含(i)減少水平的煙堿脫甲基酶或(ii)具有改變的酶活性的煙堿脫甲基酶和減少量的亞硝胺。
定義“酶活性”指包括，但不限于脫甲基作用，羥基化作用，環(huán)氧化作用，N-氧化作用，硫代氧化作用，N-、S-、和O-脫烷基化，脫硫作用，脫氨作用和偶氮、硝基和N-氧化物和其它這樣的酶促反應性化學基團的還原作用。改變的酶活性指相對于對照酶(例如，野生型煙草植物煙堿脫甲基酶)的活性而言減少酶活性(例如，煙草煙堿脫甲基酶的)達至少10-20％，優(yōu)選地至少25-50％，和更優(yōu)選地至少55-95％或更多。酶，如煙堿脫甲基酶的活性可以使用本領(lǐng)域標準方法，例如本文所述的通過酵母微粒體測定進行測定。
術(shù)語“核酸”指單鏈或雙鏈形式存在的，或有義或反義的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限定，涵蓋天然核苷酸的已知類似物，其以類似于天然存在的核苷酸的方式與核酸雜交。除非另外指出，特定的核酸序列包括其互補序列。術(shù)語“可操縱地連接”，“以可操縱的組合”和“以可操縱的順序”指在核酸表達控制序列(諸如啟動子、信號序列或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的陣列)和第二核酸序列之間的功能連接，其中所述表達控制序列影響對應于第二序列的核酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。理想地，可操縱連接的核酸序列指這樣的基因的片段，其與相同的基因的其它序列連接以形成全長基因。
當關(guān)于細胞使用時，術(shù)語“重組”指細胞復制異源核酸，表達所述核酸或表達肽，異源肽，或由異源核酸編碼的蛋白質(zhì)。重組細胞可以表達在細胞的天然(native)(非重組)形式中未發(fā)現(xiàn)的有義或反義形式的基因或基因片段或能夠誘導RNA干擾(RNAi)的RNA分子。重組細胞也可以表達在細胞的天然形式中發(fā)現(xiàn)的基因，但是其中所述基因被以人工方式進行修飾并再次引入細胞中。
“結(jié)構(gòu)基因”是包括編碼蛋白質(zhì)、多肽或其部分的DNA片段的基因的部分，并且不包括，例如，驅(qū)動轉(zhuǎn)錄起始的5′序列或3′UTR。所述結(jié)構(gòu)基因可以備選地編碼不可翻譯的產(chǎn)物。所述結(jié)構(gòu)基因可以是通常在細胞中發(fā)現(xiàn)的基因或在細胞或其被引入的細胞定位中通常未被發(fā)現(xiàn)的基因，在該種情況下其被稱為“異源基因”。異源基因可以完全或部分來自本領(lǐng)域已知的任何來源，包括細菌基因組或游離基因，真核生物的核或質(zhì)粒DNA、cDNA、病毒DNA或化學合成的DNA。結(jié)構(gòu)基因可以包含可以影響生物學活性或其特征、表達產(chǎn)物的生物學活性或化學結(jié)構(gòu)，表達的速率或表達控制的方式的一個或多個修飾。這些修飾包括，但不限于，一個或多個核苷酸的突變、插入、缺失和置換。
結(jié)構(gòu)基因可以由不間斷的編碼序列構(gòu)成或其可以包括一個或多個由適合的剪接點結(jié)合的內(nèi)含子。所述結(jié)構(gòu)基因可以是可翻譯或不可翻譯的，包括反義或能夠誘導RNA干擾(RNAi)的RNA分子。結(jié)構(gòu)基因可以是來自多個來源和來自多個基因序列(天然存在或合成的，其中合成的指化學合成的DNA)的片段的組合。
關(guān)于核酸序列，用于本文時，“外顯子”指基因的核酸序列的部分，其中外顯子的核酸序列編碼基因產(chǎn)物的至少一個氨基酸。外顯子典型地鄰近于非編碼DNA片段諸如內(nèi)含子。
關(guān)于核酸序列，用于本文時，“內(nèi)含子”指位于側(cè)接編碼區(qū)的基因的非編碼區(qū)。內(nèi)含子典型地是基因的非編碼區(qū)，其被轉(zhuǎn)錄為RNA分子，但是接著在產(chǎn)生信使RNA或其它功能性結(jié)構(gòu)RNA的過程中通過RNA剪接被切除。
關(guān)于核酸序列，用于本文時，“3′UTR”指鄰近于外顯子的終止密碼子的非編碼核酸序列。
“衍生自”用于指取自、獲自、接受自、發(fā)現(xiàn)自、復制自或遺傳自某一來源(化學和/或生物的)。衍生物可以通過原始來源的化學或生物操作(包括，但不限于，置換、添加、插入、缺失、提取、分離、突變和復制)而進行制備。
與DNA序列相關(guān)的“化學合成”指將組成核苷酸的部分在體外裝配。DNA的手動化學合成可以使用公知的方法來完成(Caruthers，Methodologyof DNA and RNA Sequencing，(1983)，Weissman(ed.)，Praeger Publishers，紐約，第一章)；自動化學合成可以使用許多商購機械之一來進行。
進行比較的序列的優(yōu)化排比可以，例如通過Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)的局部同源性算法，通過Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)的同源性排比算法，通過Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)852444(1988)的進行相似性方法的搜索，通過這些算法的計算機執(zhí)行(在Wisconsin遺傳軟件包中的GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA，和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.)，或通過目測進行。
NCBI基本局部排比搜索工具(BLAST)(Altschul等，1990)獲自幾種來源，包括生物信息國家中心(National Center for Biological Information)(NCBI，Bethesda，Md.)和在網(wǎng)上，與序列分析程序blastp，blastn，blastx，tblastn，和tblastx組合使用。其可以在http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上進行評估。關(guān)于怎樣使用該程序確定序列同一性的描述在http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast help.html可獲得。
用于氨基酸序列并且用于本文時，術(shù)語“基本的氨基酸同一性”或“基本的氨基酸序列同一性”指多肽的特征，其中所述肽包括與在圖10-159，160A-160E，162-170和172-1到172-19中顯示的蛋白質(zhì)序列比較，具有至少70％序列同一性，優(yōu)選地80％氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地90％氨基酸序列同一性，和最優(yōu)選地至少99到100％的序列同一性的序列。理想地，對于煙堿脫甲基酶而言，序列比較理想地用于細胞色素p450基序GXRXCX(G/A)(SEQ ID NO2265)到翻譯肽的終止密碼子的區(qū)域的比較。
用于核酸序列和用于本文時，術(shù)語“基本的核酸同一性”或“基本的核酸序列同一性”指多核苷酸序列的特征，其中多核苷酸包含這樣的序列，其與參照組在跨越一段區(qū)域相比，所述區(qū)域?qū)诰幋a細胞色素p450基序GXRXCX(G/A)(SEQ ID NO2265)的區(qū)域后第一核酸到翻譯肽的終止密碼子，具有至少50％，優(yōu)選地60％，65％，70％，或75％的序列同一性，更優(yōu)選地81％或91％的核酸序列同一性，并且最優(yōu)選地具有至少95％，99％，或甚至100％序列同一性。
核苷酸序列是基本上相同的另一個指示是兩個分子是否在嚴格條件下彼此雜交。嚴格條件是序列依賴型的并且將在不同的情況下是不同的。一般而言，在限定的離子強度和pH上，對于具體序列選擇的嚴格條件是低于熱熔點(Tm)約5℃到約20℃，通常是約10℃到約15℃。Tm是這樣的溫度(在限定的離子強度和pH)，其中靶序列的50％與匹配的探針雜交。典型地，嚴格條件將是其中鹽濃度在pH 7是約0.02摩爾并且溫度是至少約60℃的那些。例如，在標準的DNA雜交方法中，嚴格條件將包括于42℃在6xSSC中的開始的洗滌，隨后在至少約55℃、典型地約60℃，通常約65℃的溫度上在0.2xSSC中進行的一次或多次另外的洗滌。
出于本發(fā)明的目的，當所述核苷酸序列編碼基本上相同的多肽和/或蛋白質(zhì)時，核苷酸序列也是基本上相同的。因此，當一個核酸序列編碼基本上與第二個核酸序列相同的多肽時，所述兩個核酸序列是基本上相同的，即使它們由于遺傳密碼所容許的簡并性在嚴格條件下不雜交(見，Darnell等.(1990)Molecular Cell Biology，Second Edition Scientific American BooksW.H.Freeman and Company New York for an explanation of codondegeneracy and the genetic code)。蛋白質(zhì)純度或均一性可以通過許多本領(lǐng)域眾所周知的方式來指示，所述方式諸如蛋白質(zhì)樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后通過染色進行觀察。對于某些目的而言，可能需要高分辨率，并且可以使用HPLC或類似的用于純化的方式。
所謂“特異性結(jié)合”或“特異性識別”特定多肽，諸如煙草煙堿脫甲基酶的抗體意為相對于等量的任何其它蛋白質(zhì)，對于所述多肽具有增加的親和性的抗體。理想的抗體是特異性結(jié)合這樣的多肽的抗體，所述多肽具有在圖1，圖3和4，圖10-158，圖160A-160E，圖162-170，或圖172-1到172-19中顯示的氨基酸序列。例如，特異性結(jié)合包含SEQ ID NO3的氨基酸序列的煙草煙堿脫甲基酶的抗體理想地對于其抗原具有這樣的親和性，所述親和性與等量的任何其它抗原，包括相關(guān)抗原相比，至少2倍、5倍、10倍、30倍或100倍更大。抗體與抗原，例如煙草煙堿脫甲基酶的結(jié)合可以通過許多本領(lǐng)域標準的方法例如，蛋白質(zhì)印跡分析、ELISA或共免疫沉淀進行確定。特異性結(jié)合多肽，例如煙堿脫甲基酶的抗體在純化多肽中也是有用的。
用于本文時，術(shù)語“載體”是用于將DNA片段傳遞給細胞的核酸分子。載體可以作用于復制DNA并且可以獨立地在宿主細胞中增殖。術(shù)語“媒介物”有時與“載體”交互使用。用于本文時，術(shù)語“表達載體”指這樣的重組DNA分子，其包含需要的編碼序列和在具體宿主生物中表達可操縱連接的編碼序列所必需的適合的核酸序列。在原核生物中用于表達必需的核酸序列通常包括啟動子、操縱子(任選)和核糖體結(jié)合位點，經(jīng)常還伴隨其它序列。理想地，所述啟動子包括SEQ ID NO8的序列或驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的其片段。此外，理想的是與SEQ ID NO8的序列具有至少50％，60％，75％，80％，90％，95％，或甚至99％序列同一性并且驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的啟動子序列。已知真核生物細胞使用啟動子、增強子和終止子以及多腺苷酸化信號，諸如SEQ ID NO9的3′UTR序列。在某些情形中，已經(jīng)觀察到植物表達載體需要植物來源的內(nèi)含子，諸如具有SEQ ID NO7的序列的內(nèi)含子的存在以具有穩(wěn)定的表達。同樣，SEQ ID NO7的序列，或具有適合的RNA剪接點的任何其它內(nèi)含子可以如本文進一步描述進行使用。理想的載體包括在圖1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19或173-1到173-294中顯示的核酸序列。
出于再生具有根的全遺傳改造的植物的目的，可以將核酸插入植物細胞中，例如通過任何技術(shù)諸如體內(nèi)接種或通過任何已知的體外組織培養(yǎng)技術(shù)以產(chǎn)生可以再生為全植物的轉(zhuǎn)化的植物細胞。因此，例如，插入植物細胞可以通過由致病性或非致病性的A.tumefaciens的體外接種來進行。還可以使用其它這樣的組織培養(yǎng)技術(shù)。
“植物組織”，“植物組分”或“植物細胞”包括植物的分化和未分化的組織，包括，但不限于，培養(yǎng)的根、莖、葉、花粉、種子、腫瘤組織和各種形式的細胞，諸如單細胞、原生質(zhì)體、胚和胼胝體組織。所述植物組織可以是在植物中的或以器官、組織或細胞培養(yǎng)物形式存在。
用于本文時，“植物細胞”包括在植物中的植物細胞和培養(yǎng)的植物細胞和原生質(zhì)體。“cDNA”或“互補的DNA”通常指具有這樣的核苷酸序列的單鏈DNA分子，所述核苷酸序列互補于包含內(nèi)含子的未加工的RNA分子，或缺乏內(nèi)含子的加工的mRNA。通過在RNA模板上的酶逆轉(zhuǎn)錄酶的作用來形成cDNA。
用于本文時，“煙草”包括煙熏煙、弗吉尼亞煙、白萊煙、深色煙、東方型煙和在煙草屬中的其它類型的植物。煙草屬的種子容易以煙草(Nicotiana tabacum)的形式商購獲得。
“制品”或“煙草產(chǎn)品”包括產(chǎn)品諸如濕和干鼻煙、嚼煙、卷煙、雪茄煙、小雪茄煙、pipe tobacco、bidis和類似的煙草來源的產(chǎn)品。
至于“基因沉默”指相對于對照植物(例如，野生型煙草植物)的水平，在基因表達(例如，編碼煙草煙堿脫甲基酶的基因的表達)水平中的減少達至少30-50％，優(yōu)選地至少50-80％，和更優(yōu)選地至少80-95％或更大。這種表達水平的減少可以通過使用本領(lǐng)域已知的標準方法或通過使用標準誘變技術(shù)，諸如本文描述的那些進行突變基因的產(chǎn)生來完成，所述標準方法包括，但不限于，RNA干擾、三鏈干擾、核酶、同源重組、病毒誘導的基因沉默、反義和共抑制技術(shù)、顯性失活基因產(chǎn)物的表達。按照任何標準技術(shù)監(jiān)測煙草煙堿脫甲基酶多肽或轉(zhuǎn)錄物，或兩者的水平，所述標準技術(shù)包括，但不限于，RNA印跡、核糖核酸酶保護或免疫印跡。
至于氨基酸序列的“片段”或“部分”指在圖1，3，4，10到158，160A到160E，162到170和172-1到172-19中顯示的任何氨基酸序列的至少例如20，15，30，50，75，100，250，300，400，或500個連續(xù)氨基酸。示范性的理想的片段是SEQ ID NO3的序列的氨基酸1-313和SEQ ID NO3的序列的氨基酸314-517以及SEQ ID NOS2和63的序列。此外，關(guān)于核酸序列的片段或部分，理想的片段包括在圖1，3到7，10到158，162到170，172-1到172-19和173-1到173-294中顯示的任何核酸序列的至少100，250，500，750，1000，或1500個連續(xù)的核酸。示范性的理想的片段是SEQ IDNO4的序列的核酸1-2009，2010-2949，2950-3946，3947-4562，4563-6347，和4731-6347。
至于“基本純的多肽”指已經(jīng)從天然伴隨其的大多數(shù)成分中分離的多肽；然而，也將這樣的其它蛋白質(zhì)認為是基本純的多肽，所述其它蛋白質(zhì)見于與制備物相關(guān)的微粒體部分(microsomal fraction)中，具有至少8.3pKat/mg蛋白質(zhì)的酶活性。典型地，當去除了至少60重量％的與其天然相關(guān)的蛋白質(zhì)和天然存在的有機分子時，所述多肽是基本純的。優(yōu)選地，所述制備物是至少75重量％，更優(yōu)選地至少90重量％和最優(yōu)選地至少99重量％的理想的多肽?？梢酝ㄟ^，例如從天然來源(例如，煙草植物細胞)中提??；通過編碼所述多肽的重組核酸的表達；或通過蛋白質(zhì)的化學合成來獲得基本純的多肽?？梢酝ㄟ^任何適合的方法，例如柱色譜法、聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過HPLC分析來測量純度。
至于“分離的核酸分子”指去除了天然位于生物的基因組的核酸分子序列兩側(cè)的核酸序列的核酸序列。
至于“轉(zhuǎn)化的細胞”指其中(或其祖先中)已經(jīng)通過重組DNA技術(shù)引入DNA分子，例如編碼煙草煙堿脫甲基酶的DNA分子或任何本文所述的核酸序列(例如，在圖1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19和173-1到173-294中顯示的核酸序列)的細胞。
用于本文時，“煙草煙堿脫甲基酶”或“煙堿脫甲基酶”指，基本上與SEQ ID NO3的序列相同的多肽。理想地，煙草煙堿脫甲基酶能夠?qū)焿A(C10H14N2，也稱為3-(1-甲基-2-吡咯烷基)吡啶)轉(zhuǎn)化為去甲煙堿(C9H12N2)。如本文所述，可以使用本領(lǐng)域標準的方法來評估煙草煙堿脫甲基酶的活性，所述本領(lǐng)域標準方法諸如通過測量酵母表達的微粒體進行的對放射性煙堿的脫甲基作用來進行。
如本文提供的，術(shù)語“細胞色素p450”和“p450”交替使用。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢將通過下列詳細描述，附圖和權(quán)利要求變得更加顯而易見。
附圖簡述圖1是D35-BG11(SEQ ID NO1)的核酸序列及其翻譯產(chǎn)物(SEQ IDNO2)。
圖2是煙草煙堿脫甲基酶基因的基因組結(jié)構(gòu)的示意圖。
圖3是基因組煙草煙堿脫甲基酶核酸序列(SEQ ID NO4)及其翻譯產(chǎn)物(SEQ ID NO3)。
圖4是煙草煙堿脫甲基酶基因的編碼區(qū)的核酸序列(SEQ ID NO5)及其翻譯產(chǎn)物(SEQ ID NO6)。
圖5是存在于煙草煙堿脫甲基酶基因組序列中的內(nèi)含子的核酸序列(SEQ ID NO7)。
圖6是煙草脫甲基酶基因啟動子的核酸序列(SEQ ID NO8)。
圖7是煙草煙堿脫甲基酶基因的3′UTR的核酸序列(SEQ ID NO9)。
圖8是顯示具有Geno全長(″FL″)引物組的煙草品系的PCR產(chǎn)物的電泳圖。
圖9是電泳圖，其顯示如在實施例17中所陳述的具有引物組(1)，(2)，(3)，和(4)的煙草品系的PCR產(chǎn)物。所述條帶的大致大小對于FL是3,500個核苷酸(nt)，對于(1)是2,600nt，對于(2)是1,400nt，對于(3)是600nt，和對于(4)是1,400nt。
圖10是D58-BG7的核酸序列(SEQ ID NO10)，作為D58-BG7(SEQID NO10)的翻譯產(chǎn)物的D58-BG7的氨基酸序列(SEQ ID NO11)。
圖11是D58-AB1的核酸序列(SEQ ID NO12)，和作為D58-AB1(SEQ ID NO12)的翻譯產(chǎn)物的D58-AB1的氨基酸序列(SEQ ID NO13)。
圖12是D186-AH4的核酸序列(SEQ ID NO14)，和作為D186-AH4(SEQ ID NO14)的翻譯產(chǎn)物的D186-AH4的氨基酸序列(SEQ IDNO15)。
圖13是D58-BE4的核酸序列(SEQ ID NO16)，和作為D58-BE4(SEQ ID NO16)的翻譯產(chǎn)物的D58-BE4的氨基酸序列(SEQ ID NO17)。
圖14是D56-AH7(SEQ ID NO18)的核酸序列，和作為D56-AH7(SEQ ID NO18)的翻譯產(chǎn)物的D56-AH7的氨基酸序列(SEQ ID NO19)。
圖15是D13a-5的核酸序列(SEQ ID NO20)，和作為D13a-5(SEQ IDNO20)的翻譯產(chǎn)物的D13a-5的氨基酸序列(SEQ ID NO21)。
圖16是D56-AG10的核酸序列(SEQ ID NO22)，和作為D56-AG10(SEQ ID NO22)的翻譯產(chǎn)物的D56-AG10的氨基酸序列(SEQ ID NO23)。
圖17是D35-33的核酸序列(SEQ ID NO24)，和作為D35-33(SEQ IDNO24)的翻譯產(chǎn)物的D35-33的氨基酸序列(SEQ ID NO25)。
圖18是D34-62的核酸序列(SEQ ID NO26)，和作為D34-62(SEQID NO26)的翻譯產(chǎn)物的D34-62的氨基酸序列(SEQ ID NO27)。
圖19是D56-AA7的核酸序列(SEQ ID NO28)，和作為D56-AA7(SEQ ID NO28)的翻譯產(chǎn)物的D56-AA7的氨基酸序列(SEQ ID NO29)。
圖20是D56-AE1的核酸序列(SEQ ID NO30)，和作為D56-AE1(SEQID NO30)的翻譯產(chǎn)物的D56-AE1的氨基酸序列(SEQ ID NO31)。
圖21是D35-BB7的核酸序列(SEQ ID NO32)，和作為D35-BB7(SEQID NO32)的翻譯產(chǎn)物的D35-BB7的氨基酸序列(SEQ ID NO33)。
圖22是D177-BA7的核酸序列(SEQ ID NO34)，和作為D177-BA7(SEQ ID NO34)的翻譯產(chǎn)物的D177-BA7的氨基酸序列(SEQ ID NO35)。
圖23是D56A-AB6的核酸序列(SEQ ID NO36)，和作為D56A-AB6(SEQ ID NO36)的翻譯產(chǎn)物的D56A-AB6的氨基酸序列(SEQ ID NO37)。
圖24是D144-AE2的核酸序列(SEQ ID NO38)，和作為D144-AE2(SEQ ID NO38)的翻譯產(chǎn)物的D144-AE2的氨基酸序列(SEQ ID NO39)。
圖25是D56-AG11的核酸序列(SEQ ID NO40)，和作為D56-AG11(SEQ ID NO40)的翻譯產(chǎn)物的D56-AG11的氨基酸序列(SEQ ID NO41)。
圖26是D179-AA1的核酸序列(SEQ ID NO42)，和作為D179-AA1(SEQ ID NO42)的翻譯產(chǎn)物的D179-AA1的氨基酸序列(SEQ IDNO43)。
圖27是D56-AC7的核酸序列(SEQ ID NO44)，和作為D56-AC7(SEQ ID NO44)的翻譯產(chǎn)物的D56-AC7的氨基酸序列(SEQ IDNO45)。
圖28是D144-AD1的核酸序列(SEQ ID NO46)，和作為D144-AD1(SEQ ID NO46)的翻譯產(chǎn)物的D144-AD1的氨基酸序列(SEQ ID NO47)。
圖29是D144-AB5的核酸序列(SEQ ID NO48)，和作為D144-AB5(SEQ ID NO48)的翻譯產(chǎn)物的D144-AB5的氨基酸序列(SEQ ID NO49)。
圖30是D181-AB5的核酸序列(SEQ ID NO50)，和作為D181-AB5(SEQ ID NO50)的翻譯產(chǎn)物的D181-AB5的氨基酸序列(SEQ ID NO51)。
圖31是D73-AC9的核酸序列(SEQ ID NO52)，和作為D73-AC9(SEQ ID NO52)的翻譯產(chǎn)物的D73-AC9的氨基酸序列(SEQ ID NO53)。
圖32是D56-AC12的核酸序列(SEQ ID NO54)，和作為D56-AC12(SEQ ID NO54)的翻譯產(chǎn)物的D56-AC12的氨基酸序列(SEQ ID NO55)。
圖33是D58-AB9的核酸序列(SEQ ID NO56)，和作為D58-AB9(SEQ ID NO56)的翻譯產(chǎn)物的D58-AB9的氨基酸序列(SEQ ID NO57)。
圖34是D56-AG9的核酸序列(SEQ ID NO58)，和作為D56-AG9(SEQ ID NO58)的翻譯產(chǎn)物的D56-AG9的氨基酸序列(SEQ IDNO59)。
圖35是D56-AG6的核酸序列(SEQ ID NO60)，和作為D56-AG6(SEQ ID NO60)的翻譯產(chǎn)物的D56-AG6的氨基酸序列(SEQ IDNO61)。
圖36是D35-BG11的核酸序列(SEQ ID NO62)，和作為D35-BG11(SEQ ID NO62)的翻譯產(chǎn)物的D35-BG11的氨基酸序列(SEQ ID NO63)。
圖37是D35-42的核酸序列(SEQ ID NO64)，和作為D35-42(SEQ IDNO64)的翻譯產(chǎn)物的D35-42的氨基酸序列(SEQ ID NO65)。
圖38是D35-BA3的核酸序列(SEQ ID NO66)，和作為D35-BA3(SEQID NO66)的翻譯產(chǎn)物的D35-BA3的氨基酸序列(SEQ ID NO67)。
圖39是D34-57的核酸序列(SEQ ID NO68)，和作為D34-57(SEQ IDNO68)的翻譯產(chǎn)物的D34-57的氨基酸序列(SEQ ID NO69)。
圖40是D34-52的核酸序列(SEQ ID NO70)，和作為D34-52(SEQ IDNO70)的翻譯產(chǎn)物的D34-52的氨基酸序列(SEQ ID NO71)。
圖41是D34-25的核酸序列(SEQ ID NO72)，和作為D34-25(SEQ IDNO72)的翻譯產(chǎn)物的D34-25的氨基酸序列(SEQ ID NO73)。
圖42是D56AD10的核酸序列(SEQ ID NO74)，和作為D56AD10(SEQ ID NO74)的翻譯產(chǎn)物的D56AD10的氨基酸序列(SEQ ID NO75)。
圖43是D56-AA11的核酸序列(SEQ ID NO76)，和作為D56-AA11(SEQ ID NO76)的翻譯產(chǎn)物的D56-AA11的氨基酸序列(SEQ ID NO77)。
圖44是D177-BD5的核酸序列(SEQ ID NO78)，和作為D177-BD5(SEQ ID NO78)的翻譯產(chǎn)物的D177-BD5的氨基酸序列(SEQ ID NO79)。
圖45是D56A-AG10的核酸序列(SEQ ID NO80)，和作為D56A-AG10(SEQ ID NO80)的翻譯產(chǎn)物的D56A-AG10的氨基酸序列(SEQ ID NO81)。
圖46是D58-BC5的核酸序列(SEQ ID NO82)，和作為D58-BC5(SEQID NO82)的翻譯產(chǎn)物的D58-BC5的氨基酸序列(SEQ ID NO83)。
圖47是D58-AD12的核酸序列(SEQ ID NO84)，和作為D58-AD12(SEQ ID NO84)的翻譯產(chǎn)物的D58-AD12的氨基酸序列(SEQ ID NO85)。
圖48是D56-AC11的核酸序列(SEQ ID NO86)，和作為D56-AC11(SEQ ID NO86)的翻譯產(chǎn)物的D56-AC11的氨基酸序列(SEQ ID NO87)。
圖49是D35-39的核酸序列(SEQ ID NO88)，和作為D35-39(SEQ IDNO88)的翻譯產(chǎn)物的D35-39的氨基酸序列(SEQ ID NO89)。
圖50是D58-BH4的核酸序列(SEQ ID NO90)，和作為D58-BH4(SEQID NO90)的翻譯產(chǎn)物的D58-BH4的氨基酸序列(SEQ ID NO91)。
圖51是D177-BD7的核酸序列(SEQ ID NO92)，和作為D177-BD7(SEQ ID NO92)的翻譯產(chǎn)物的D177-BD7的氨基酸序列(SEQ ID NO93)。
圖52是D176-BF2的核酸序列(SEQ ID NO94)，和作為D176-BF2(SEQ ID NO94)的翻譯產(chǎn)物的D176-BF2的氨基酸序列(SEQ ID NO95)。
圖53是D56-AD6的核酸序列(SEQ ID NO96)，和作為D56-AD6(SEQ ID NO96)的翻譯產(chǎn)物的D56-AD6的氨基酸序列(SEQ ID NO97)。
圖54是D73A-AD6的核酸序列(SEQ ID NO98)，和作為D73A-AD6(SEQ ID NO98)的翻譯產(chǎn)物的D73A-AD6的氨基酸序列(SEQ ID NO99)。
圖55是D70A-BA11的核酸序列(SEQ ID NO100)，和作為D70A-BA11(SEQ ID NO100)的翻譯產(chǎn)物的D70A-BA11的氨基酸序列(SEQ ID NO101)。
圖56是D70A-BB5的核酸序列(SEQ ID NO102)，和作為D70A-BB5(SEQ ID NO102)的翻譯產(chǎn)物的D70A-BB5的氨基酸序列(SEQID NO103)。
圖57是D70A-AB5的核酸序列(SEQ ID NO104)，和作為D70A-AB5(SEQ ID NO104)的翻譯產(chǎn)物的D70A-AB5的氨基酸序列(SEQ IDNO105)。
圖58是D70A-AA8的核酸序列(SEQ ID NO106)，和作為D70A-AA8(SEQ ID NO106)的翻譯產(chǎn)物的D70A-AA8的氨基酸序列(SEQ IDNO107)。
圖59是D70A-AB8的核酸序列(SEQ ID NO108)，和作為D70A-AB8(SEQ ID NO108)的翻譯產(chǎn)物的D70A-AB8的氨基酸序列(SEQ IDNO109)。
圖60是D70A-BH2的核酸序列(SEQ ID NO110)，和作為D70A-BH2(SEQ ID NO110)的翻譯產(chǎn)物的D70A-BH2的氨基酸序列(SEQ IDNO111)。
圖61是D70A-AA4的核酸序列(SEQ ID NO112)，和作為D70A-AA4(SEQ ID NO112)的翻譯產(chǎn)物的D70A-AA4的氨基酸序列(SEQ IDNO113)。
圖62是D70A-BA1的核酸序列(SEQ ID NO114)，和作為D70A-BA1(SEQ ID NO114)的翻譯產(chǎn)物的D70A-BA1的氨基酸序列(SEQ IDNO115)。
圖63是D70A-BA9的核酸序列(SEQ ID NO116)，和作為D70A-BA9(SEQ ID NO116)的翻譯產(chǎn)物的D70A-BA9的氨基酸序列(SEQ IDNO117)。
圖64是D70A-BD4的核酸序列(SEQ ID NO118)，和作為D70A-BD4(SEQ ID NO118)的翻譯產(chǎn)物的D70A-BD4的氨基酸序列(SEQ IDNO119)。
圖65是D181-AC5的核酸序列(SEQ ID NO120)，和作為D181-AC5(SEQ ID NO120)的翻譯產(chǎn)物的D181-AC5的氨基酸序列(SEQ IDNO121)。
圖66是D144-AH1的核酸序列(SEQ ID NO122)，和作為D144-AH1(SEQ ID NO122)的翻譯產(chǎn)物的D144-AH1的氨基酸序列(SEQ IDNO123)。
圖67是D34-65的核酸序列(SEQ ID NO124)，和作為D34-65(SEQ IDNO124)的翻譯產(chǎn)物的D34-65的氨基酸序列(SEQ ID NO125)。
圖68是D35-BG2的核酸序列(SEQ ID NO126)，和作為D35-BG2(SEQ ID NO126)的翻譯產(chǎn)物的D35-BG2的氨基酸序列(SEQ ID NO127)。
圖69是D73A-AH7的核酸序列(SEQ ID NO128)，和作為D73A-AH7(SEQ ID NO128)的翻譯產(chǎn)物的D73A-AH7的氨基酸序列(SEQ IDNO129)。
圖70是D58-AA1的核酸序列(SEQ ID NO130)，和作為D58-AA1(SEQ ID NO130)的翻譯產(chǎn)物的D58-AA1的氨基酸序列(SEQ ID NO131)。
圖71是D73A-AE10的核酸序列(SEQ ID NO132)，和作為D73A-AE10(SEQ ID NO132)的翻譯產(chǎn)物的D73A-AE10的氨基酸序列(SEQ ID NO133)。
圖72是D56A-AC12的核酸序列(SEQ ID NO134)，和作為D56A-AC12(SEQ ID NO134)的翻譯產(chǎn)物的D56A-AC12的氨基酸序列(SEQ ID NO135)。
圖73是D177-BF7的核酸序列(SEQ ID NO136)，和作為D177-BF7(SEQ ID NO136)的翻譯產(chǎn)物的D177-BF7的氨基酸序列(SEQ ID NO137)。
圖74是D73A-AG3的核酸序列(SEQ ID NO138)，和作為D73A-AG3(SEQ ID NO138)的翻譯產(chǎn)物的D73A-AG3的氨基酸序列(SEQ IDNO139)。
圖75是D70A-AA12的核酸序列(SEQ ID NO140)，和作為D70A-AA12(SEQ ID NO140)的翻譯產(chǎn)物的D70A-AA12的氨基酸序列(SEQ ID NO141)。
圖76是D185-BC1的核酸序列(SEQ ID NO142)，和作為D185-BC1(SEQ ID NO142)的翻譯產(chǎn)物的D185-BC1的氨基酸序列(SEQ ID NO143)。
圖77是D185-BG2的核酸序列(SEQ ID NO144)，和作為D185-BG2(SEQ ID NO144)的翻譯產(chǎn)物的D185-BG2的氨基酸序列(SEQ IDNO145)。
圖78是D185-BE1的核酸序列(SEQ ID NO146)，和作為D185-BE1(SEQ ID NO146)的翻譯產(chǎn)物的D185-BE1的氨基酸序列(SEQ ID NO147)。
圖79是D185-BD2的核酸序列(SEQ ID NO148)，和作為D185-BD2(SEQ ID NO148)的翻譯產(chǎn)物的D185-BD2的氨基酸序列(SEQ IDNO149)。
圖80是D176-BG2的核酸序列(SEQ ID NO150)，和作為D176-BG2(SEQ ID NO150)的翻譯產(chǎn)物的D176-BG2的氨基酸序列(SEQ IDNO151)。
圖81是D185-BD3的核酸序列(SEQ ID NO152)，和作為D185-BD3(SEQ ID NO152)的翻譯產(chǎn)物的D185-BD3的氨基酸序列(SEQ IDNO153)。
圖82是D176-BC3的核酸序列(SEQ ID NO154)，和作為D176-BC3(SEQ ID NO154)的翻譯產(chǎn)物的D176-BC3的氨基酸序列(SEQ ID NO155)。
圖83是D176-BB3的核酸序列(SEQ ID NO156)，和作為D176-BB3(SEQ ID NO156)的翻譯產(chǎn)物的D176-BB3的氨基酸序列(SEQ ID NO157)。
圖84是D89-AB1的核酸序列(SEQ ID NO158)，和作為D89-AB1(SEQ ID NO158)的翻譯產(chǎn)物的D89-AB1的氨基酸序列(SEQ ID NO159)。
圖85是D89-AD2的核酸序列(SEQ ID NO160)，和作為D89-AD2(SEQ ID NO160)的翻譯產(chǎn)物的D89-AD2的氨基酸序列(SEQ ID NO161)。
圖86是D90A-BB3的核酸序列(SEQ ID NO162)，和作為D90A-BB3(SEQ ID NO162)的翻譯產(chǎn)物的D90A-BB3的氨基酸序列(SEQ IDNO163)。
圖87是D95-AG1的核酸序列(SEQ ID NO164)，和作為D95-AG1(SEQ ID NO164)的翻譯產(chǎn)物的D95-AG1的氨基酸序列(SEQ ID NO165)。
圖88是D96-AB6的核酸序列(SEQ ID NO166)，和作為D96-AB6(SEQ ID NO166)的翻譯產(chǎn)物的D96-AB6的氨基酸序列(SEQ ID NO167)。
圖89是D96-AC2的核酸序列(SEQ ID NO168)，和作為D96-AC2(SEQ ID NO168)的翻譯產(chǎn)物的D96-AC2的氨基酸序列(SEQ ID NO169)。
圖90是D98-AA1的核酸序列(SEQ ID NO170)，和作為D98-AA1(SEQ ID NO170)的翻譯產(chǎn)物的D98-AA1的氨基酸序列(SEQ ID NO171)。
圖91是D98-AG1的核酸序列(SEQ ID NO172)，和作為D98-AG1(SEQ ID NO172)的翻譯產(chǎn)物的D98-AG1的氨基酸序列(SEQ ID NO173)。
圖92是D100-BE2的核酸序列(SEQ ID NO174)，和作為D100-BE2(SEQ ID NO174)的翻譯產(chǎn)物的D100-BE2的氨基酸序列(SEQ ID NO175)。
圖93是D100A-AC3的核酸序列(SEQ ID NO176)，和作為D100A-AC3(SEQ ID NO176)的翻譯產(chǎn)物的D100A-AC3的氨基酸序列(SEQ ID NO177)。
圖94是D104A-AE8(69，1755)的核酸序列(SEQ ID NO178)，和作為D104A-AE8(69，1755)(SEQ ID NO178)的翻譯產(chǎn)物的D104A-AE8(69，1755)的氨基酸序列(SEQ ID NO179)。
圖95是D105-AD6的核酸序列(SEQ ID NO180)，和作為D105-AD6(SEQ ID NO180)的翻譯產(chǎn)物的D105-AD6的氨基酸序列(SEQ IDNO181)。
圖96是D109-AH8(14，1697)的核酸序列(SEQ ID NO182)，和作為D109-AH8(14，1697)(SEQ ID NO182)的翻譯產(chǎn)物的D109-AH8(14，1697)的氨基酸序列(SEQ ID NO183)。
圖97是D110-AF12(166，1631)的核酸序列(SEQ ID NO184)，和作為D110-AF12(166，1631)(SEQ ID NO184)的翻譯產(chǎn)物的D110-AF12(166，1631)的氨基酸序列(SEQ ID NO185)。
圖98是D112-AA5的核酸序列(SEQ ID NO186)，和作為D112-AA5(SEQ ID NO186)的翻譯產(chǎn)物的D112-AA5的氨基酸序列(SEQ IDNO187)。
圖99是D120-AH4的核酸序列(SEQ ID NO188)，和作為D120-AH4(SEQ ID NO188)的翻譯產(chǎn)物的D120-AH4的氨基酸序列(SEQ IDNO189)。
圖100是D121-AA8的核酸序列(SEQ ID NO190)，和作為D121-AA8(SEQ ID NO190)的翻譯產(chǎn)物的D121-AA8的氨基酸序列(SEQ IDNO191)。
圖101是D122-AF10的核酸序列(SEQ ID NO192)，和作為D122-AF10(SEQ ID NO192)的翻譯產(chǎn)物的D122-AF10的氨基酸序列(SEQ IDNO193)。
圖102是D128-AB7的核酸序列(SEQ ID NO194)，和作為D128-AB7(SEQ ID NO194)的翻譯產(chǎn)物的D128-AB7的氨基酸序列(SEQ IDNO195)。
圖103是D129-AD10的核酸序列(SEQ ID NO196)，和作為D129-AD10(SEQ ID NO196)的翻譯產(chǎn)物的D129-AD10的氨基酸序列(SEQ ID NO197)。
圖104是D135-AE1的核酸序列(SEQ ID NO198)，和作為D135-AE1(SEQ ID NO198)的翻譯產(chǎn)物的D135-AE1的氨基酸序列(SEQ ID NO199)。
圖105是D141-AD7的核酸序列(SEQ ID NO200)，和作為D141-AD7(SEQ ID NO200)的翻譯產(chǎn)物的D141-AD7的氨基酸序列(SEQ IDNO201)。
圖106是D147-AD3的核酸序列(SEQ ID NO202)，和作為D147-AD3(SEQ ID NO202)的翻譯產(chǎn)物的D147-AD3的氨基酸序列(SEQ IDNO203)。
圖107是D163-AF12的核酸序列(SEQ ID NO204)，和作為D163-AF12(SEQ ID NO204)的翻譯產(chǎn)物的D163-AF12的氨基酸序列(SEQ IDNO205)。
圖108是D163-AG11的核酸序列(SEQ ID NO206)，和作為D163-AG11(SEQ ID NO206)的翻譯產(chǎn)物的D163-AG11的氨基酸序列(SEQ ID NO207)。
圖109是D163-AG12的核酸序列(SEQ ID NO208)，和作為D163-AG12(SEQ ID NO208)的翻譯產(chǎn)物的D163-AG12的氨基酸序列(SEQ ID NO209)。
圖110是D205-BG9的核酸序列(SEQ ID NO2 10)，和作為D205-BG9(SEQ ID NO210)的翻譯產(chǎn)物的D205-BG9的氨基酸序列(SEQ ID NO211)。
圖111是D207-AA5的核酸序列(SEQ ID NO212)，和作為D207-AA5(SEQ ID NO212)的翻譯產(chǎn)物的D207-AA5的氨基酸序列(SEQ IDNO213)。
圖112是D207-AB4的核酸序列(SEQ ID NO214)，和作為D207-AB4(SEQ ID NO214)的翻譯產(chǎn)物的D207-AB4的氨基酸序列(SEQ IDNO215)。
圖113是D207-AC4的核酸序列(SEQ ID NO216)，和作為D207-AC4(SEQ ID NO216)的翻譯產(chǎn)物的D207-AC4的氨基酸序列(SEQ IDNO217)。
圖114是D209-AA10的核酸序列(SEQ ID NO218)，和作為D209-AA10(SEQ ID NO218)的翻譯產(chǎn)物的D209-AA10的氨基酸序列(SEQ ID NO219)。
圖115是D209-AA12的核酸序列(SEQ ID NO220)，和作為D209-AA12(SEQ ID NO220)的翻譯產(chǎn)物的D209-AA12的氨基酸序列(SEQ ID NO221)。
圖116是D209-AH10的核酸序列(SEQ ID NO222)，和作為D209-AH10(SEQ ID NO222)的翻譯產(chǎn)物的D209-AH10的氨基酸序列(SEQ ID NO223)。
圖117是D87A-AF3的核酸序列(SEQ ID NO224)，和作為D87A-AF3(SEQ ID NO224)的翻譯產(chǎn)物的D87A-AF3的氨基酸序列(SEQ IDNO225)。
圖118是D208-AC8的核酸序列(SEQ ID NO226)，和作為D208-AC8(SEQ ID NO226)的翻譯產(chǎn)物的D208-AC8的氨基酸序列(SEQ IDNO227)。
圖119是D215-AB5的核酸序列(SEQ ID NO228)，和作為D215-AB5(SEQ ID NO228)的翻譯產(chǎn)物的D215-AB5的氨基酸序列(SEQ IDNO229)。
圖120是D103-AH3的核酸序列(SEQ ID NO230)，和作為D103-AH3(SEQ ID NO230)的翻譯產(chǎn)物的D103-AH3的氨基酸序列(SEQ IDNO231)。
圖121是D208-AD9的核酸序列(SEQ ID NO232)，和作為D208-AD9(SEQ ID NO232)的翻譯產(chǎn)物的D208-AD9的氨基酸序列(SEQ IDNO233)。
圖122是D237-AD1的核酸序列(SEQ ID NO234)，和作為D237-AD1(SEQ ID NO234)的翻譯產(chǎn)物的D237-AD1的氨基酸序列(SEQ IDNO235)。
圖123是D125-AF11的核酸序列(SEQ ID NO236)，和作為D125-AF11(SEQ ID NO236)的翻譯產(chǎn)物的D125-AF11的氨基酸序列(SEQ IDNO237)。
圖124是D134-AE11的核酸序列(SEQ ID NO238)，和作為D134-AE11(SEQ ID NO238)的翻譯產(chǎn)物的D134-AE11的氨基酸序列(SEQ IDNO239)。
圖125是D209-AH12的核酸序列(SEQ ID NO240)，和作為D209-AH12(SEQ ID NO240)的翻譯產(chǎn)物的D209-AH12的氨基酸序列(SEQ ID NO241)。
圖126是D221-BB8的核酸序列(SEQ ID NO242)，和作為D221-BB8(SEQ ID NO242)的翻譯產(chǎn)物的D221-BB8的氨基酸序列(SEQ ID NO243)。
圖127是D222-BH4的核酸序列(SEQ ID NO244)，和作為D222-BH4(SEQ ID NO244)的翻譯產(chǎn)物的D222-BH4的氨基酸序列(SEQ IDNO245)。
圖128是D224-AF10的核酸序列(SEQ ID NO246)，和作為D224-AF10(SEQ ID NO246)的翻譯產(chǎn)物的D224-AF10的氨基酸序列(SEQ IDNO247)。
圖129是D224-BD11的核酸序列(SEQ ID NO248)，和作為D224-BD11(SEQ ID NO248)的翻譯產(chǎn)物的D224-BD11的氨基酸序列(SEQ IDNO249)。
圖130是D228-AD7的核酸序列(SEQ ID NO250)，和作為D228-AD7(SEQ ID NO250)的翻譯產(chǎn)物的D228-AD7的氨基酸序列(SEQ IDNO251)。
圖131是D228-AH8的核酸序列(SEQ ID NO252)，和作為D228-AH8(SEQ ID NO252)的翻譯產(chǎn)物的D228-AH8的氨基酸序列(SEQ IDNO253)。
圖132是D235-AB1的核酸序列(SEQ ID NO254)，和作為D235-AB1(SEQ ID NO254)的翻譯產(chǎn)物的D235-AB1的氨基酸序列(SEQ IDNO255)。
圖133是D243-AA2的核酸序列(SEQ ID NO256)，和作為D243-AA2(SEQ ID NO256)的翻譯產(chǎn)物的D243-AA2的氨基酸序列(SEQ IDNO257)。
圖134是D244-AD4的核酸序列(SEQ ID NO258)，和作為D244-AD4(SEQ ID NO258)的翻譯產(chǎn)物的D244-AD4的氨基酸序列(SEQ IDNO259)。
圖135是D247-AH1的核酸序列(SEQ ID NO260)，和作為D247-AH1(SEQ ID NO260)的翻譯產(chǎn)物的D247-AH1的氨基酸序列(SEQ IDNO261)。
圖136是D248-AA6的核酸序列(SEQ ID NO262)，和作為D248-AA6(SEQ ID NO262)的翻譯產(chǎn)物的D248-AA6的氨基酸序列(SEQ IDNO263)。
圖137是D249-AE8的核酸序列(SEQ ID NO264)，和作為D249-AE8(SEQ ID NO264)的翻譯產(chǎn)物的D249-AE8的氨基酸序列(SEQ ID NO265)。
圖138是D250-AC11的核酸序列(SEQ ID NO266)，和作為D250-AC11(SEQ ID NO266)的翻譯產(chǎn)物的D250-AC11的氨基酸序列(SEQ IDNO267)。
圖139是D259-AB9的核酸序列(SEQ ID NO268)，和作為D259-AB9(SEQ ID NO268)的翻譯產(chǎn)物的D259-AB9的氨基酸序列(SEQ IDNO269)。
圖140是D218A-AC2的核酸序列(SEQ ID NO270)，和作為D218A-AC2(SEQ ID NO270)的翻譯產(chǎn)物的D218A-AC2的氨基酸序列(SEQ ID NO271)。
圖141是D210-BD4的核酸序列(SEQ ID NO272)，和作為D210-BD4(SEQ ID NO272)的翻譯產(chǎn)物的D210-BD4的氨基酸序列(SEQ IDNO273)。
圖142是D233-AG7的核酸序列(SEQ ID NO274)，和作為D233-AG7(SEQ ID NO274)的翻譯產(chǎn)物的D233-AG7的氨基酸序列(SEQ IDNO275)。
圖143是D257-AE4的核酸序列(SEQ ID NO276)，和作為D257-AE4(SEQ ID NO276)的翻譯產(chǎn)物的D257-AE4的氨基酸序列(SEQ ID NO277)。
圖144是D268-AE2的核酸序列(SEQ ID NO278)，和作為D268-AE2(SEQ ID NO278)的翻譯產(chǎn)物的D268-AE2的氨基酸序列(SEQ ID NO279)。
圖145是D283-AC1的核酸序列(SEQ ID NO280)，和作為D283-AC1(SEQ ID NO280)的翻譯產(chǎn)物的D283-AC1的氨基酸序列(SEQ IDNO281)。
圖146是D244-AB6的核酸序列(SEQ ID NO282)，和作為D244-AB6(SEQ ID NO282)的翻譯產(chǎn)物的D244-AB6的氨基酸序列(SEQ IDNO283)。
圖147是D205-BE9的核酸序列(SEQ ID NO284)，和作為D205-BE9(SEQ ID NO284)的翻譯產(chǎn)物的D205-BE9的氨基酸序列(SEQ ID NO285)。
圖148是D136-AF4的核酸序列(SEQ ID NO286)，和作為D136-AF4(SEQ ID NO286)的翻譯產(chǎn)物的D136-AF4的氨基酸序列(SEQ ID NO287)。
圖149是D101-BA2的核酸序列(SEQ ID NO288)，和作為D101-BA2(SEQ ID NO288)的翻譯產(chǎn)物的D101-BA2的氨基酸序列(SEQ IDNO289)。
圖150是D130-AA1的核酸序列(SEQ ID NO290)，和作為D130-AA1(SEQ ID NO290)的翻譯產(chǎn)物的D130-AA1的氨基酸序列(SEQ IDNO291)。
圖151是D136-AD5的核酸序列(SEQ ID NO292)，和作為D136-AD5(SEQ ID NO292)的翻譯產(chǎn)物的D136-AD5的氨基酸序列(SEQ IDNO293)。
圖152是D138-AD12的核酸序列(SEQ ID NO294)，和作為D138-AD12(SEQ ID NO294)的翻譯產(chǎn)物的D138-AD12的氨基酸序列(SEQ ID NO295)。
圖153是D216-AG8的核酸序列(SEQ ID NO296)，和作為D216-AG8(SEQ ID NO296)的翻譯產(chǎn)物的D216-AG8的氨基酸序列(SEQ IDNO297)。
圖154是D243-AB3的核酸序列(SEQ ID NO298)，和作為D243-AB3(SEQ ID NO298)的翻譯產(chǎn)物的D243-AB3的氨基酸序列(SEQ IDNO299)。
圖155是D250-AC11的核酸序列(SEQ ID NO300)，和作為D250-AC11(SEQ ID NO300)的翻譯產(chǎn)物的D250-AC11的氨基酸序列(SEQ IDNO301)。
圖156是D205-AH4的核酸序列(SEQ ID NO302)，和作為D205-AH4(SEQ ID NO302)的翻譯產(chǎn)物的D205-AH4的氨基酸序列(SEQ IDNO303)。
圖157是D267-AF10的核酸序列(SEQ ID NO304)，和作為D267-AF10(SEQ ID NO304)的翻譯產(chǎn)物的D267-AF10的氨基酸序列(SEQ IDNO305)。
圖158是D284-AH5的核酸序列(SEQ ID NO306)，和作為D284-AH5(SEQ ID NO306)的翻譯產(chǎn)物的D284-AH5的氨基酸序列(SEQ IDNO307)。
圖159A是一組由下列各項組成的核酸序列排比D58-BG7(SEQ IDNO10)，D58-AB1(SEQ ID NO12)，和D58-BE4(SEQID NO16)的排比；和D56-AH7(SEQ ID NO18)和D13a-5(SEQ ID NO20)的排比。在各個排比下方顯示每個排比的序列之間的百分比同一性。
圖159B是一組由下列各項組成的核酸序列排比D56-AG10(SEQ IDNO22)，D35-33(SEQ ID NO24)，和D34-62(SEQ ID NO26)的排比；和D56-AA7(SEQ ID NO28)，D56-AE1(SEQ ID NO30)，和D185-BD3(SEQID NO152)的排比。在各個排比下方顯示每個排比的序列之間的百分比同一性。
圖159C是一組由下列各項組成的核酸序列排比D56A-AB6(SEQ IDNO36)，D35-BB7(SEQ ID NO32)，D177-BA7(SEQ ID NO34)，和D144-AE2(SEQ ID NO38)的排比；和D56-AG11(SEQ ID NO40)和D179-AA1(SEQ ID NO42)的排比。在各個排比下方顯示每個排比的序列之間的百分比同一性。
圖159D是一組由下列各項組成的核酸序列排比D56-AC7(SEQ IDNO44)和D144-AD1(SEQ ID NO46)的排比；和D181-AB5(SEQ ID NO50)和D73-AC9(SEQ ID NO52)的排比。在各個排比下方顯示每個排比的序列之間的百分比同一性。
圖159E是核酸序列D58-AB9(SEQ ID NO56)，D56-AG9(SEQ ID NO58)，D35-BG11(SEQ ID NO62)，D34-25(SEQ ID NO72)，D35-BA3(SEQID NO66)，D34-52(SEQ ID NO70)，D56-AG6(SEQ ID NO60)，D35-42(SEQ ID NO64)，和D34-57(SEQ ID NO68)之間的排比。在排比下方顯示排比的序列之間的百分比同一性。
圖159F是一組由下列各項組成的核酸序列排比D177-BD7(SEQ IDNO92)和D177-BD5(SEQ ID NO78)的排比；D56A-AG10(SEQ IDNO80)，D58-AD12(SEQ ID NO84)，和D58-BC5(SEQ ID NO82)的排比。在各個排比下方顯示每個排比的序列之間的百分比同一性。
圖159G是一組由下列各項組成的核酸序列排比D56-AD6(SEQ IDNO96)，D56-AC11(SEQ ID NO86)，D35-39(SEQ ID NO88)，和D58-BH4(SEQ ID NO90)的排比；和D73A-AD6(SEQ ID NO98)和D70A-BA11(SEQ ID NO100)的排比。在各個排比下方顯示每個排比的序列之間的百分比同一性。
圖159H是一組由下列各項組成的核酸序列排比D70A-AB5(SEQ IDNO104)和D70A-AA8(SEQ ID NO106)的排比；和D70A-AB8(SEQ IDNO108)，D70A-BH2(SEQ ID NO110)，D70A-AA4(SEQ ID NO112)的排比。在各個排比下方顯示每個排比的序列之間的百分比同一性。
圖159I是一組由下列各項組成的核酸序列排比D70A-BA1(SEQ IDNO114)和D70A-BA9(SEQ ID NO116)的排比；和D144-AH1(SEQ ID NO122)，D34-65(SEQ ID NO124)，和D181-AC5(SEQ ID NO120)的排比。在各個排比下方顯示每個排比的序列之間的百分比同一性。
圖159J是一組由下列各項組成的核酸序列排比D58-AA1(SEQ IDNO130)，D185-BC1(SEQ ID NO142)，和D185-BG2(SEQ ID NO144)的排比，和D177-BF7(SEQ ID NO136)，D185-BD2(SEQ ID NO148)，和D185-BE1(SEQ ID NO146)的排比。在各個排比下方顯示每個排比的序列之間的百分比同一性。
圖159K是D70-AA12(SEQ ID NO140)和D176-BF2(SEQ ID NO94)的核酸序列排比。在各個排比下方顯示每個排比的序列之間的百分比同一性。
圖160A是一組由下列各項組成的氨基酸序列排比D208-AD9(SEQID NO2196)，D120-AH4(SEQ ID NO2197)，D121-AA8(SEQ ID NO2198)，D122-AF10(SEQ ID NO2199)，D103-AH3(SEQ ID NO2200)，D208-AC8(SEQ ID NO2201)，和D235-AB1(SEQ ID NO2202)的序列排比；D244-AD4(SEQ ID NO2203)，D244-AB6(SEQ ID NO2204)，D285-AA8(SEQ ID NO2205)，D285-AB9(SEQ ID NO2206)，和D268-AE2(SEQ IDNO2207)的序列排比；和D100A-AC3(SEQ ID NO2208)和D100A-BE2(SEQ ID NO2209)的序列排比。
圖160B是一組由下列各項組成的氨基酸序列排比D205-BG9(SEQID NO2210)，D205-BE9(SEQ ID NO2211)，和D205-AH4(SEQ IDNO2212)的序列排比；D259-AB9(SEQ ID NO2213)，D257-AE4(SEQ IDNO2214)，和D147-AD3(SEQ ID NO2215)的序列排比；D249-AEB(SEQ IDNO2216)和D248-AA6(SEQ ID NO2217)的序列排比；D233-AG7(SEQID NO2218)，D224-BD11(SEQ ID NO2219)，和D224-AF10(SEQ ID NO2220)的序列排比；和D105-AD6(SEQ ID NO2221)，D215-AB5(SEQ IDNO2222)，和D135-AE1(SEQ ID NO2223)的序列排比。
圖160C是一組由下列各項組成的氨基酸序列排比D87A-AF3(SEQID NO2224)和D210-BD4(SEQ ID NO2225)的序列排比；D89-AB1(SEQID NO2226)，D89-AD2(SEQ ID NO2227)，D163-AG12(SEQ ID NO2228)，D163-AG11(SEQ ID NO2229)，和D163-AF12(SEQ ID NO2230)的序列排比；D267-AF10(SEQ ID NO2231)，D96-AC2(SEQ ID NO2232)，D96-AB6(SEQ ID NO2233)，D207-AA5(SEQ ID NO2234)，D207-AB4(SEQ ID NO2235)，和D207-AC4(SEQ ID NO2236)的序列排比；和D98-AG1(SEQ ID NO2237)和D98-AA1(SEQ ID NO2238)的序列排比。
圖160D是一組由下列各項組成的氨基酸序列排比D209-AA10(SEQID NO2239)，D209-AA12(SEQ ID NO2240)，D209-AH10(SEQ IDNO2241)，D209-AH12(SEQ ID NO2242)，和D90a-BB3(SEQ ID NO2243)的序列排比；D129-AD10(SEQ ID NO2244)和D104A-AE8(SEQ ID NO2245)的序列排比；D228-AH8(SEQ ID NO2246)，D228-AD7(SEQ ID NO2247)，D250-AC11(SEQ ID NO2248)，和D247-AH1(SEQ ID NO2249)的序列排比；和D128-AB7(SEQ ID NO2250)，D243-AA2(SEQ IDNO2251)，和D125-AF11(SEQ ID NO2252)的序列排比。
圖160E是D284-AH5(SEQ ID NO2253)和D110-AF12(SEQ IDNO2254)的氨基酸序列排比。
圖161是顯示通過PCR克隆細胞色素p450 cDNA片段的示意圖。用于克隆的引物列為DM(SEQ ID NO2255)，DM4(SEQ ID NO2256)，DM12(SEQ ID NO2257)，DM13(SEQ ID NO2258)，DM17(SEQ ID NO2259)，OLIGO d(T)(SEQ ID NO2260)，T7(SEQ ID NO2261)，和SP6(SEQ IDNO2262)。
圖162是D425-AB10的核酸序列(SEQ ID NO367)和作為D425-AB10(SEQ ID NO367)的翻譯產(chǎn)物的D425-AB10的氨基酸序列(SEQID NO368)。
圖163是D425-AB11的核酸序列(SEQ ID NO369)和作為D425-AB11(SEQ ID NO369)的翻譯產(chǎn)物的D425-AB11的氨基酸序列(SEQID NO370)。
圖164是D425-AC9的核酸序列(SEQ ID NO371)和作為D425-AC9(SEQ ID NO371)的翻譯產(chǎn)物的D425-AC9的氨基酸序列(SEQ IDNO372)。
圖165是D425-AC10的核酸序列(SEQ ID NO373)和作為D425-AC10(SEQ ID NO373)的翻譯產(chǎn)物的D425-AC10的氨基酸序列(SEQ IDNO374)。
圖166是D425-AC11的核酸序列(SEQ ID NO375)和作為D425-AC11(SEQ ID NO375)的翻譯產(chǎn)物的D425-AC11的氨基酸序列(SEQ IDNO376)。
圖167是D425-AG11的核酸序列(SEQ ID NO377)和作為D425-AG11(SEQ ID NO377)的翻譯產(chǎn)物的D425-AG11的氨基酸序列(SEQ IDNO378)。
圖168是D425-AH7的核酸序列(SEQ ID NO379)和作為D425-AH7(SEQ ID NO379)的翻譯產(chǎn)物的D425-AH7的氨基酸序列(SEQ IDNO380)。
圖169是D425-AH11的核酸序列(SEQ ID NO381)和作為D425-AH11(SEQ ID NO381)的翻譯產(chǎn)物的D425-AH11的氨基酸序列(SEQ IDNO382)。
圖170是D427-AA5的核酸序列(SEQ ID NO383)和作為D427-AA5(SEQ ID NO383)的翻譯產(chǎn)物的D427-AA5的氨基酸序列(SEQ IDNO384)。
圖171是列出在GeneChip微陣列上的克隆的探針組序列(SEQ IDNO385-SEQ ID NO445)的表。
圖172-1是由下列各項組成的核酸和氨基酸序列的組D424-AA4的核酸序列(SEQ ID NO446)；D424-AF5的核酸序列(SEQ ID NO447)和作為D424-AF5(SEQ ID NO447)的翻譯產(chǎn)物的D424-AF5的氨基酸序列(SEQID NO448)，D425-AA11的核酸序列(SEQ ID NO449)和作為D425-AA11(SEQ ID NO449)的翻譯產(chǎn)物的D425-AA11的氨基酸序列(SEQ ID NO450)；和D425-AF11的核酸序列(SEQ ID NO451)。
圖172-2是由下列各項組成的核酸和氨基酸序列的組作為D425-AF11(SEQ ID NO451)的翻譯產(chǎn)物的D425-AF11的氨基酸序列(SEQ IDNO452)；D425-AH10的核酸序列(SEQ ID NO453)和作為D425-AH10(SEQ ID NO453)的翻譯產(chǎn)物的D425-AH10的氨基酸序列(SEQ IDNO454)；D426-AA3的核酸序列(SEQ ID NO455)和作為D426-AA3(SEQID NO455)的翻譯產(chǎn)物的D426-AA3的氨基酸序列(SEQ ID NO456)；和D426-AG1的核酸序列(SEQ ID NO457)和作為D426-AG1(SEQ IDNO457)的翻譯產(chǎn)物的D426-AG1的氨基酸序列(SEQ ID NO458)。
圖172-3是由下列各項組成的核酸和氨基酸序列的組D427-AA6的核酸序列(SEQ ID NO459)和作為D427-AA6(SEQ ID NO459)的翻譯產(chǎn)物的D427-AA6的氨基酸序列(SEQ ID NO460)；D427-AB6的核酸序列(SEQID NO461)和作為D427-AB6(SEQ ID NO461)的翻譯產(chǎn)物的D427-AB6的氨基酸序列(SEQ ID NO462)；D428-AC9的核酸序列(SEQ ID NO463)和作為D428-AC9(SEQ ID NO463)的翻譯產(chǎn)物的D428-AC9的氨基酸序列(SEQ ID NO464)；和D428-AH10的核酸序列(SEQ ID NO465)。
圖172-4是由下列各項組成的核酸和氨基酸序列的組作為D428-AH10(SEQ ID NO465)的翻譯產(chǎn)物的D428-AH10的氨基酸序列(SEQ ID NO466)；D429-AA1的核酸序列(SEQ ID NO467)和作為D429-AA1(SEQ ID NO467)的翻譯產(chǎn)物的D429-AA1的氨基酸序列(SEQID NO468)；D430-AA3的核酸序列(SEQ ID NO469)和作為D430-AA3(SEQ ID NO469)的翻譯產(chǎn)物的D430-AA3的氨基酸序列(SEQ IDNO470)；和D431-AE6的核酸序列(SEQ ID NO471)和作為D431-AE6(SEQ ID NO471)的翻譯產(chǎn)物的D431-AE6的氨基酸序列(SEQ ID NO472)。
圖172-5是由下列各項組成的核酸和氨基酸序列的組D113-AE9的核酸序列(SEQ ID NO473)和作為D113-AE9(SEQ ID NO473)的翻譯產(chǎn)物的D113-AE9的氨基酸序列(SEQ ID NO474)；和D114-AE12的核酸序列(SEQ ID NO475)。
圖172-6是由下列各項組成的核酸和氨基酸序列的組作為D114-AE12(SEQ ID NO475)的翻譯產(chǎn)物的D114-AE12的氨基酸序列(SEQID NO476)；D119-AC3的核酸序列(SEQ ID NO477)和作為D119-AC3(SEQ ID NO477)的翻譯產(chǎn)物的D119-AC3的氨基酸序列(SEQID NO478)；和D132-AA5的核酸序列(SEQ ID NO479)。
圖172-7是由下列各項組成的核酸和氨基酸序列的組作為D132-AA5(SEQ ID NO479)的翻譯產(chǎn)物的D132-AA5的氨基酸序列(SEQ IDNO480)；D223-BB10的核酸序列(SEQ ID NO481)和作為D223-BB10(SEQ ID NO481)的翻譯產(chǎn)物的D223-BB10的氨基酸序列(SEQ ID NO482)；D245-AA8的核酸序列(SEQ ID NO483)和作為D245-AA8(SEQ IDNO483)的翻譯產(chǎn)物的D245-AA8的氨基酸序列(SEQ ID NO484)。
圖172-8是由下列各項組成的核酸和氨基酸序列的組D246-AE12的核酸序列(SEQ ID NO485)和作為D246-AE12(SEQ ID NO485)的翻譯產(chǎn)物的D246-AE12的氨基酸序列(SEQ ID NO486)；和D279-AD1的核酸序列(SEQ ID NO487)和作為D279-AD1(SEQ ID NO487)的翻譯產(chǎn)物的D279-AD1的氨基酸序列(SEQ ID NO488)。
圖172-9是由下列各項組成的核酸和氨基酸序列的組D282-AA10的核酸序列(SEQ ID NO489)和作為D282-AA10(SEQ ID NO489)的翻譯產(chǎn)物的D282-AA10的氨基酸序列(SEQ ID NO490)；和D295-AA1的核酸序列(SEQ ID NO491)。
圖172-10是由下列各項組成的核酸和氨基酸序列的組作為D295-AA1(SEQ ID NO491)的翻譯產(chǎn)物的D295-AA1的氨基酸序列(SEQID NO492)；D101A-AE2的核酸序列(SEQ ID NO493)和作為D101A-AE2(SEQ ID NO493)的翻譯產(chǎn)物的D101A-AE2的氨基酸序列(SEQ ID NO494)；和D108-AA4的核酸序列(SEQ ID NO495)。
圖172-11是由下列各項組成的核酸和氨基酸序列的組作為D108-AA4(SEQ ID NO495)的翻譯產(chǎn)物的D108-AA4的氨基酸序列(SEQID NO496)；D124-AC5(5′)的核酸序列(SEQ ID NO497)和作為D124-AC5(5′)(SEQ ID NO497)的翻譯產(chǎn)物的D124-AC5(5′)的氨基酸序列(SEQ ID NO498)；D124-AC5(3′)的核酸序列(SEQ ID NO499)和作為D124-AC5(3′)(SEQ ID NO499)的翻譯產(chǎn)物的D124-AC5(3′)的氨基酸序列(SEQ ID NO500)；和D141-AD7的核酸序列(SEQID NO501)。
圖172-12是由下列各項組成的核酸和氨基酸序列的組作為D141-AD7(SEQ ID NO501)的翻譯產(chǎn)物的D141-AD7的氨基酸序列(SEQID NO502)；和D148-AD1的核酸序列(SEQ ID NO503)和作為D148-AD1(SEQ ID NO503)的翻譯產(chǎn)物的D148-AD1的氨基酸序列(SEQ IDNO504)。
圖172-13是由下列各項組成的核酸和氨基酸序列的組D212-BC11的核酸序列(SEQ ID NO505)和作為D212-BC11(SEQ ID NO505)的翻譯產(chǎn)物的D212-BC11的氨基酸序列(SEQ ID NO506)；和D217-AB10的核酸序列(SEQ ID NO507)和作為D217-AB10(SEQ ID NO507)的翻譯產(chǎn)物的D217-AB10的氨基酸序列(SEQ ID NO508)。
圖172-14是由下列各項組成的核酸和氨基酸序列的組D220-BC6的核酸序列(SEQ ID NO509)和作為D220-BC6(SEQ ID NO509)的翻譯產(chǎn)物的D220-BC6的氨基酸序列(SEQ ID NO510)；D225-AG9的核酸序列(SEQID NO511)和作為D225-AG9(SEQ ID NO511)的翻譯產(chǎn)物的D225-AG9的氨基酸序列(SEQ ID NO512)；D231-AF1的核酸序列(SEQ ID NO513)和作為D231-AF1(SEQ ID NO513)的翻譯產(chǎn)物的D231-AF1的氨基酸序列(SEQID NO514)；和D232-AH5的核酸序列(SEQ ID NO515)。
圖172-15是由下列各項組成的核酸和氨基酸序列的組作為D232-AH5(SEQ ID NO515)的翻譯產(chǎn)物的D232-AH5的氨基酸序列(SEQID NO516)；D240-BB8的核酸序列(SEQ ID NO517)和作為D240-BB8(SEQ ID NO517)的翻譯產(chǎn)物的D240-BB8的氨基酸序列(SEQ ID NO518)；D280-AA6的核酸序列(SEQ ID NO519)和作為D280-AA6(SEQ ID NO519)的翻譯產(chǎn)物的D280-AA6的氨基酸序列(SEQ ID NO520)；和D285-AD7的核酸序列(SEQ ID NO521)和作為D285-AD7(SEQ ID NO521)的翻譯產(chǎn)物的D285-AD7的氨基酸序列(SEQ ID NO522)。
圖172-16是由下列各項組成的核酸和氨基酸序列的組D285-AH9的核酸序列(SEQ ID NO523)和作為D285-AH9(SEQ ID NO523)的翻譯產(chǎn)物的D285-AH9的氨基酸序列(SEQ ID NO524)；D99-AB3的核酸序列(SEQID NO525)和作為D99-AB3(SEQ ID NO525)的翻譯產(chǎn)物的D99-AB3的氨基酸序列(SEQ ID NO526)；和D99-AC2的核酸序列(SEQ ID NO527)和作為D99-AC2(SEQ ID NO527)的翻譯產(chǎn)物的D99-AC2的氨基酸序列(SEQ ID NO528)。
圖172-17是由下列各項組成的核酸和氨基酸序列的組D99-AF11的核酸序列(SEQ ID NO529)和作為D99-AF11(SEQ ID NO529)的翻譯產(chǎn)物的D99-AF11的氨基酸序列(SEQ ID NO530)；D99-AH4的核酸序列(SEQID NO531)和作為D99-AH4(SEQ ID NO531)的翻譯產(chǎn)物的D99-AH4的氨基酸序列(SEQ ID NO532)；D99-AH7的核酸序列(SEQ ID NO533)和作為D99-AH7(SEQ ID NO533)的翻譯產(chǎn)物的D99-AH7的氨基酸序列(SEQ IDNO534)；D99-DB4的核酸序列(SEQ ID NO535)和作為D99-DB4(SEQ IDNO535)的翻譯產(chǎn)物的D99-DB4的氨基酸序列(SEQ ID NO536)。
圖172-18是由下列各項組成的核酸和氨基酸序列的組D99-DG4的核酸序列(SEQ ID NO537)和作為D99-DG4(SEQ ID NO537)的翻譯產(chǎn)物的D99-DG4的氨基酸序列(SEQ ID NO538)；D40-2的核酸序列(SEQ IDNO539)和作為D40-2(SEQ ID NO539)的翻譯產(chǎn)物的D40-2的氨基酸序列(SEQ ID NO540)；D301-EE11的核酸序列(SEQ ID NO541)和作為D301-EE11(SEQ ID NO541)的翻譯產(chǎn)物的D301-EE11的氨基酸序列(SEQ IDNO542)；和D302-AE10的核酸序列(SEQ ID NO543)。
圖172-19是由下列各項組成的核酸和氨基酸序列的組作為D302-AE10(SEQ ID NO543)的翻譯產(chǎn)物的D302-AE10的氨基酸序列(SEQID NO544)；D303-AC6的核酸序列(SEQ ID NO545)和作為D303-AC6(SEQ ID NO545)的翻譯產(chǎn)物的D303-AC6的氨基酸序列(SEQ ID NO546)；和D303-AC11的核酸序列(SEQ ID NO547)和作為D303-AC11(SEQID NO547)的翻譯產(chǎn)物的D303-AC11的氨基酸序列(SEQ ID NO548)。
圖173-1是40-17(SEQ ID NO549)，40-20(SEQ ID NO550)，40-23(SEQ ID NO551)，40-26(SEQ ID NO552)，D40-27(SEQ ID NO553)，40-28(SEQ ID NO554)，和40-78(SEQ ID NO555)的核酸序列。
圖173-2是40-83(SEQ ID NO556)，D40-86(SEQ ID NO557)，D40-97(SEQ ID NO558)，40-100(SEQ ID NO559)，40-107(SEQ ID NO560)，D41-41(SEQ ID NO561)，和D41-60(SEQ ID NO562)的核酸序列。
圖173-3是D41-65(SEQ ID NO563)，D41-67(SEQ ID NO564)，D41-69(SEQ ID NO565)，D41-99(SEQ ID NO566)，D42-AA3(SEQ IDNO567)，D42-AA7(SEQ ID NO568)，和D42-AC3(SEQ ID NO569)的核酸序列。
圖173-4是D42-AC7(SEQ ID NO570)，D42-AC8(SEQ ID NO571)，D42-AD3(SEQ ID NO572)，D42-AD12(SEQ ID NO573)，D42-AF3(SEQID NO574)，和D42-AH3(SEQ ID NO575)的核酸序列。
圖173-5是D42-BA2(SEQ ID NO576)，D42-BB11(SEQ ID NO577)，D42-KC9(SEQ ID NO578)，D42-KC10(SEQ ID NO579)，D42-LB2(SEQID NO580)，D42-LC7(SEQ ID NO581)，D42-TG7(SEQ ID NO582)，和D42-UG8(SEQ ID NO583)的核酸序列。
圖173-6是D42-ZB1(SEQ ID NO584)，D300-AA7(SEQ ID NO585)，D300-AB3(SEQ ID NO586)，D300-AB7(SEQ ID NO587)，D300-AB10(SEQ ID NO588)，D300-AB11(SEQ ID NO589)，和D300-AC2(SEQ IDNO590)的核酸序列。
圖173-7是D300-AC6(SEQ ID NO591)，D300-AC7(SEQ ID NO592)，D300-AD4(SEQ ID NO593)，D300-AD6(SEQ ID NO594)，D300-AD10(SEQ ID NO595)，D300-AE3(SEQ ID NO596)，和D300-AE9(SEQ ID NO597)的核酸序列。
圖173-8是D300-AE11(SEQ ID NO598)，D300-AF4(SEQ ID NO599)，D300-AF5(SEQ ID NO600)，D300-AF7(SEQ ID NO601)，D300-AF8(SEQID NO602)，D300-AF9(SEQ ID NO603)，和D300-AF11(SEQ ID NO604)的核酸序列。
圖173-9是D300-AG1(SEQ ID NO605)，D300-AG2(SEQ ID NO606)，D300-AG3(SEQ ID NO607)，D300-AG10(SEQ ID NO608)，D300-AH6(SEQ ID NO609)，D300-AH9(SEQ ID NO610)，D300-AH10(SEQ IDNO611)，和D300-AH11(SEQ ID NO612)的核酸序列。
圖173-10是D300-BA5(SEQ ID NO613)，D300-BA6(SEQ ID NO614)，D300-BA7(SEQ ID NO615)，D300-BA12(SEQ ID NO616)，D300-BB6(SEQ ID NO617)，D300-BB7(SEQ ID NO618)，和D300-BC1(SEQ IDNO619)的核酸序列。
圖173-11是D300-BC4(SEQ ID NO620)，D300-BC7(SEQ ID NO621)，D300-BC8(SEQ ID NO622)，D300-BC9(SEQ ID NO623)，D300-BD2(SEQ ID NO624)，D300-BD7(SEQ ID NO625)，和D300-BE1(SEQ IDNO626)的核酸序列。
圖173-12是D300-BE2(SEQ ID NO627)，D300-BE7(SEQ ID NO628)，D300-BE8(SEQ ID NO629)，D300-BE9(SEQ ID NO630)，D300-BE12(SEQ ID NO631)，D300-BF7(SEQ ID NO632)，D300-BF11(SEQ ID NO633)，和D300-BG1(SEQ ID NO634)的核酸序列。
圖173-13是D300-BG2(SEQ ID NO635)，D300-BG5(SEQ ID NO636)，D300-BH6(SEQ ID NO637)，D300-BH9(SEQ ID NO638)，D300-CA1(SEQ ID NO639)，D300-CA6(SEQ ID NO640)，和D300-CB1(SEQ IDNO641)的核酸序列。
圖173-14是D300-CB12(SEQ ID NO642)，D300-CC2(SEQ IDNO643)，D300-CD2(SEQ ID NO644)，D300-CD3(SEQ ID NO645)，D300-CD4(SEQ ID NO646)，D300-CD5(SEQ ID NO647)，和D300-CE3(SEQ ID NO648)的核酸序列。
圖173-15是D300-CE7(SEQ ID NO649)，D300-CF1(SEQ ID NO650)，D300-CF2(SEQ ID NO651)，D300-CF11(SEQ ID NO652)，D300-CG2(SEQ ID NO653)，D300-CG7(SEQ ID NO654)，D300-CH1(SEQ ID NO655)，和D300-CH3(SEQ ID NO656)的核酸序列。
圖173-16是D300-CH5(SEQ ID NO657)，D300-CH7(SEQ ID NO658)，D300-DA1(SEQ ID NO659)，D300-DA4(SEQ ID NO660)，D300-DB2(SEQ ID NO661)，D300-DB4(SEQ ID NO662)，D300-DB6(SEQ ID NO663)，和D300-DB7-c(SEQ ID NO664)的核酸序列。
圖173-17是D300-DB8(SEQ ID NO665)，D300-DC2(SEQ ID NO666)，D300-DC4(SEQ ID NO667)，D300-DC7(SEQ ID NO668)，D300-DC10(SEQ ID NO669)，D300-DC11(SEQ ID NO670)，和D300-DD5(SEQ ID NO671)的核酸序列。
圖173-18是D300-DD6(SEQ ID NO672)，D300-DE2(SEQ ID NO673)，D300-DE9(SEQ ID NO674)，D300-DE10(SEQ ID NO675)，D300-DF5(SEQ ID NO676)，D300-DF6(SEQ ID NO677)，D300-DF8(SEQID NO678)，和D300-DF12(SEQ ID NO679)的核酸序列。
圖173-19是D300-DG1(SEQ ID NO680)，D300-DG3(SEQ ID NO681)，D300-DG9(SEQ ID NO682)，D300-DG11(SEQ ID NO683)，D300-DH10(SEQ ID NO684)，D301-AB10(SEQ ID NO685)，和D301-AC5(SEQ IDNO686)的核酸序列。
圖173-20是D301-AC7(SEQ ID NO687)，D301-AC9(SEQ IDNO688)，D301-AD1(SEQ ID NO689)，D301-AD2(SEQ ID NO690)，D301-AE4c(SEQ ID NO691)，D301-AF12(SEQ ID NO692)，D301-AH6(SEQ ID NO693)，和D301-AH12(SEQ ID NO694)的核酸序列。
圖173-21是D301-BB8(SEQ ID NO695)，D301-BB9(SEQ ID NO696)，D301-BC1(SEQ ID NO697)，D301-BC8(SEQ ID NO698)，D301-BD1(SEQ ID NO699)，D301-BD2(SEQ ID NO700)，和D301-BF3(SEQ IDNO701)的核酸序列。
圖173-22是D301-DA4(SEQ ID NO702)，D301-DA8(SEQ IDNO703)，D301-DB5(SEQ ID NO704)，D301-DC6(SEQ ID NO705)，D301-DD4(SEQ ID NO706)，D301-DG1(SEQ ID NO707)，D301-DG4c(SEQ ID NO708)，和D301-EA5(SEQ ID NO709)的核酸序列。
圖173-23是D301-EA6(SEQ ID NO710)，D301-EA7(SEQ ID NO711)，D301-EC9(SEQ ID NO712)，D301-EC10(SEQ ID NO713)，D301-ED5(SEQID NO714)，D301-ED7(SEQID NO715)，和D301-EE7(SEQ ID NO716)的核酸序列。
圖173-24是D301-EF2(SEQ ID NO717)，D301-EF5(SEQ ID NO718)，D301-EF10(SEQ ID NO719)，D301-EG12(SEQ ID NO720)，D302-AB8(SEQ ID NO721)，D302-AB9(SEQ ID NO722)，D302-AB12(SEQ ID NO723)，和D302-AC1(SEQ ID NO724)的核酸序列。
圖173-25是D302-AC5(SEQ ID NO725)，D302-AC6(SEQ ID NO726)，D302-AC7(SEQ ID NO727)，D302-AC12(SEQ ID NO728)，D302-AD4(SEQ ID NO729)，D302-AD7(SEQ ID NO730)，和D302-AE7(SEQ ID NO731)的核酸序列。
圖173-26是D302-AF6(SEQ ID NO732)，D302-AF8(SEQ ID NO733)，D302-AG2(SEQ ID NO734)，D302-AH10(SEQ ID NO735)，D302-BA2(SEQ ID NO736)，D302-BA6(SEQ ID NO737)，D302-BC3(SEQ ID NO738)，和D302-BC6(SEQ ID NO739)的核酸序列。
圖173-27是D302-BC9(SEQ ID NO740)，D302-BD3(SEQ ID NO741)，D302-BD7(SEQ ID NO742)，D302-BD9(SEQ ID NO743)，D302-BE1(SEQ ID NO744)，和D302-BE2(SEQ ID NO745)的核酸序列。
圖173-28是D302-BE6(SEQ ID NO746)，D302-BE7(SEQ ID NO747)，D302-BF1(SEQ ID NO748)，D302-BF5(SEQ ID NO749)，D302-BG1(SEQID NO750)，D302-bg3(SEQ ID NO751)，和D302-BG7(SEQ ID NO752)的核酸序列。
圖173-29是D302-Bg9(SEQ ID NO753)，D302-BH1(SEQ ID NO754)，D302-bh9(SEQ ID NO755)，D302-CA5(SEQ ID NO756)，D302-CB7(SEQID NO757)，D302-CC1(SEQ ID NO758)，D302-CC3(SEQ ID NO759)，和D302-CD2(SEQ ID NO760)的核酸序列。
圖173-30是D302-CE3(SEQ ID NO761)，D302-CE9(SEQ ID NO762)，D302-CF2(SEQ ID NO763)，D302-CF5(SEQ ID NO764)，D302-CF6(SEQID NO765)，D302-CH1(SEQ ID NO766)，和D302-CH4(SEQ ID NO767)的核酸序列。
圖173-31是D302-CH5(SEQ ID NO768)，D302-CH6(SEQ ID NO769)，D302-DA2(SEQ ID NO770)，D302-DA5(SEQ ID NO771)，D302-DA9(SEQID NO772)，D302-DC4(SEQ ID NO773)，和D302-DC7(SEQ ID NO774)的核酸序列。
圖173-32是D302-DC8(SEQ ID NO775)，D302-DC11(SEQ ID NO776)，D302-DD3(SEQ ID NO777)，D302-DF5(SEQ ID NO778)，D302-DF7(SEQ ID NO779)，D302-DG9(SEQ ID NO780)，和D302-DH8(SEQ IDNO781)的核酸序列。
圖173-33是D303-AA9(SEQ ID NO782)，D303-AA10(SEQ ID NO783)，D303-AB11(SEQ ID NO784)，D303-AC4(SEQ ID NO785)，D303-AD3(SEQ ID NO786)，D303-AD11(SEQ ID NO787)，D303-AE1(SEQ ID NO788)，和D303-ae2(SEQ ID NO789)的核酸序列。
圖173-34是D303-ae6(SEQ ID NO790)，D303-AF5(SEQ ID NO791)，D303-AF12(SEQ ID NO792)，D303-AG1(SEQ ID NO793)，D303-AG8(SEQ ID NO794)，D303-AG9(SEQ ID NO795)，D303-AH5(SEQ ID NO796)，和D303-BA1(SEQ ID NO797)的核酸序列。
圖173-35是D303-BA5(SEQ ID NO798)，D303-BB6(SEQ ID NO799)，D303-BC1(SEQ ID NO800)，D303-BC2(SEQ ID NO801)，D303-BC8(SEQ ID NO802)，D303-BC11(SEQ ID NO803)，D303-bd2(SEQID NO804)，和D303-BD6(SEQ ID NO805)的核酸序列。
圖173-36是D303-BD9(SEQ ID NO806)，D303-BE3(SEQ ID NO807)，D303-BE4(SEQ ID NO808)，D303-BE7(SEQ ID NO809)，D303-BF1(SEQ ID NO810)，D303-BF6(SEQ ID NO811)，D303-BG2(SEQ ID NO812)，和D303-BG1(SEQ ID NO813)的核酸序列。
圖173-37是D303-BH1(SEQ ID NO814)，D303-BH6(SEQ IDNO815)，D414-AG2(SEQ ID NO816)，D35-33(SEQ ID NO817)，D35-34(SEQ ID NO818)，和D35-35(SEQ ID NO819)的核酸序列。
圖173-38是D35-41(SEQ ID NO820)，D35-43(SEQ ID NO821)，D35-51(SEQ ID NO822)，和D35-AC4(SEQ ID NO823)的核酸序列。
圖173-39是D35-AC12(SEQ ID NO824)，D35-AE2(SEQ ID NO825)，D35-AE6(SEQ ID NO826)，D35-AF1(SEQ ID NO827)，D35-AF3(SEQ IDNO828)，和D35-AG3(SEQ ID NO829)的核酸序列。
圖173-40是D35-BA5(SEQ ID NO830)，D35-BA12(SEQ ID NO831)，D35-BB1(SEQ ID NO832)，D35-BB3(SEQ ID NO833)，和D35-BB10(SEQID NO834)的核酸序列。
圖173-41是D35-BB12(SEQ ID NO835)，D55-AA8(SEQ ID NO836)，D55-AB1(SEQ ID NO837)，D55-AB5(SEQ ID NO838)，和D55-AB6(SEQ ID NO839)的核酸序列。
圖173-42是D55-AB7(SEQ ID NO840)，D55-AB10(SEQ ID NO841)，D55-AA2(SEQ ID NO842)，D55-AC2(SEQ ID NO843)，和D55-AC5(SEQID NO844)的核酸序列。
圖173-43是D55-AC7(SEQ ID NO845)，D55-BA7(SEQ ID NO846)，D55-BA8(SEQ ID NO847)，D55-BA10(SEQ ID NO848)，D55-BA11(SEQ ID NO849)，和D55-BB9(SEQ ID NO850)的核酸序列。
圖173-44是D55-BB10(SEQ ID NO851)，D55-BB12(SEQ ID NO852)，D55-BC4(SEQ ID NO853)，D55-BC5(SEQ ID NO854)，D55-AA6(SEQ IDNO855)，和D56-AE5(SEQ ID NO856)的核酸序列。
圖173-45是D56-AA2(SEQ ID NO857)，D56-AA4(SEQ ID NO858)，D56-AA8(SEQ ID NO859)，D56-AA9(SEQ ID NO860)，D56-AB1(SEQ IDNO861)，和D56-AB7(SEQ ID NO862)的核酸序列。
圖173-46是D56-AB9(SEQ ID NO863)，D56-AC9(SEQ ID NO864)，D56-AD3(SEQ ID NO865)，D56-AG8(SEQ ID NO866)，和D56-AH1(SEQID NO867)的核酸序列。
圖173-47是D56-AH10(SEQ ID NO868)，D56-AE2(SEQ ID NO869)，D57-AB2(SEQ ID NO870)，D57-AB5(SEQ ID NO871)，和D57-AB6(SEQID NO872)的核酸序列。
圖173-48是D57-AB8(SEQ ID NO873)，D57-AB11(SEQ ID NO874)，D57-AB12(SEQ ID NO875)，D57-AC1(SEQ ID NO876)，D57-AC4(SEQ ID NO877)，和D57-AC12(SEQ ID NO878)的核酸序列。
圖173-49是D57-AD5(SEQ ID NO879)，D57-AD8(SEQ ID NO880)，D57-AD9(SEQ ID NO881)，D57-AE1(SEQ ID NO882)，D57-AE2(SEQ IDNO883)，和D57-AE7(SEQ ID NO884)的核酸序列。
圖173-50是D57-AF2(SEQ ID NO885)，D57-AE12(SEQ ID NO886)，D57-AF3(SEQ ID NO887)，D57-AF5(SEQ ID NO888)，和D57-AF9(SEQID NO889)的核酸序列。
圖173-51是D57-AG5(SEQ ID NO890)，D57-AG7(SEQ ID NO891)，D57-AG11(SEQ ID NO892)，和D57-AH10(SEQ ID NO893)的核酸序列。
圖173-52是D58-AA3(SEQ ID NO894)，D58-AA5(SEQ ID NO895)，D58-AB3(SEQ ID NO896)，D58-AB5(SEQ ID NO897)，和D58-AC1(SEQID NO898)的核酸序列。
圖173-53是D58-AC9(SEQ ID NO899)，D58-AC11(SEQ ID NO900)，D58-AD2(SEQ ID NO901)，和D58-AD5(SEQ ID NO902)的核酸序列。
圖173-54是D58-AD7(SEQ ID NO903)，D58-AD8(SEQ ID NO904)，D58-AD10(SEQ ID NO905)，D58-AE1(SEQ ID NO906)，和D58-AE2(SEQ ID NO907)的核酸序列。
圖173-55是D58-AE5(SEQ ID NO908)，D58-AE9(SEQ ID NO909)，D58-AE10(SEQ ID NO910)，D58-AE11(SEQ ID NO911)，和D58-AF3(SEQID NO912)的核酸序列。
圖173-56是D58-AF6(SEQ ID NO913)，D58-AH4(SEQ ID NO914)，D58-AH7(SEQ ID NO915)，D58-AH9(SEQ ID NO916)，和D58-AH10(SEQ ID NO917)的核酸序列。
圖173-57是D58-BA5(SEQ ID NO918)，D58-BA7(SEQ ID NO919)，D58-BB7(SEQ ID NO920)，D58-BC5(SEQ ID NO921)，D58-BD3(SEQ IDNO922)，和D58-BD7(SEQ ID NO923)的核酸序列。
圖173-58是D58-BD8(SEQ ID NO924)，D58-BD10(SEQ ID NO925)，D58-BE2(SEQ ID NO926)，D58-BE11(SEQ ID NO927)，和D58-BF1(SEQID NO928)的核酸序列。
圖173-59是D58-BF2(SEQ ID NO929)，D58-BG3(SEQ ID NO930)，D58-BG5(SEQ ID NO931)，D58-BG8(SEQ ID NO932)，D58-BG10(SEQ IDNO933)，和D58-BG12(SEQ ID NO934)的核酸序列。
圖173-60是D58-BH10(SEQ ID NO935)，D58-BH8(SEQ ID NO936)，D58-BH2(SEQ ID NO937)，D60-AA1(SEQ ID NO938)，D60-AA2(SEQ IDNO939)，和D60-AA3(SEQ ID NO940)的核酸序列。
圖173-61是D60-AA5(SEQ ID NO941)，D60-AA6(SEQ ID NO942)，D60-AA7(SEQ ID NO943)，D60-AA8(SEQ ID NO944)，D60-AA10(SEQID NO945)，和D60-AA11(SEQ ID NO946)的核酸序列。
圖173-62是D60-AA12(SEQ ID NO947)，D60-AB3(SEQ ID NO948)，D60-AB5(SEQ ID NO949)，D60-AB6(SEQ ID NO950)，D60-AB7(SEQ ID NO951)，和D60-AB8(SEQ ID NO952)的核酸序列。
圖173-63是D60-AB11(SEQ ID NO953)，D60-AC3(SEQID NO954)，D60-AC5(SEQ ID NO955)，D60-AC7(SEQ ID NO956)，D60-AC8(SEQID NO957)，和D60-AC11(SEQ ID NO958)的核酸序列。
圖173-64是D60-AC12(SEQ ID NO959)，D60-AD3(SEQ ID NO960)，D60-AD4(SEQ ID NO961)，D60-AD5(SEQ ID NO962)，D60-AD7(SEQID NO963)，和D60-AE1(SEQ ID NO964)的核酸序列。
圖173-65是D60-AE4(SEQ ID NO965)，D60-AE6(SEQ ID NO966)，D60-AE8(SEQ ID NO967)，D60-AE12(SEQ ID NO968)，D60-AF5(SEQID NO969)，和D60-AF8(SEQ ID NO970)的核酸序列。
圖173-66是D60-AF11(SEQ ID NO971)，D60-AG1(SEQ ID NO972)，D60-AG10(SEQ ID NO973)，D60-AG12(SEQ ID NO974)，D60-AH1(SEQID NO975)，和D60-AH5(SEQ ID NO976)的核酸序列。
圖173-67是D60-AH6(SEQ ID NO977)，D60-AH9(SEQ ID NO978)，D60-AH10(SEQ ID NO979)，D60-AH11(SEQ ID NO980)，和D63-AA12(SEQ ID NO981)的核酸序列。
圖173-68是D64-4(SEQ ID NO982)，D64-AB4(SEQ ID NO983)，D64-AB10(SEQ ID NO984)，D65-AA6(SEQ ID NO985)，和D65-AA7(SEQ ID NO986)的核酸序列。
圖173-69是D65-AA9(SEQ ID NO987)，D65-AB4(SEQ ID NO988)，D65-AB5(SEQ ID NO989)，D65-AB8(SEQ ID NO990)，D65-AB9(SEQID NO991)，和D65-AB11(SEQ ID NO992)的核酸序列。
圖173-70是D65-AC1(SEQ ID NO993)，D65-AC6(SEQ ID NO994)，D65-AC10(SEQ ID NO995)，D65-AC11(SEQ ID NO996)，D65-AD3(SEQID NO997)，和D65-AE1(SEQ ID NO998)的核酸序列。
圖173-71是D65-AE2(SEQ ID NO999)，D65-AE10(SEQ ID NO1000)，D65-AE11(SEQ ID NO1001)，D65-AE12(SEQ ID NO1002)，D65-AF1(SEQ ID NO1003)，和D65-AF5(SEQ ID NO1004)的核酸序列。
圖173-72是D65-AF7(SEQ ID NO1005)，D65-AG11(SEQ ID NO1006)，D65-CE1(SEQ ID NO1007)，D65-CE2(SEQ ID NO1008)，D65-CE7(SEQ ID NO1009)，和D65-CE9(SEQ ID NO1010)的核酸序列。
圖173-73是D65-CE12(SEQ ID NO1011)，D65-CF3(SEQ IDNO1012)，D65-CF10(SEQ ID NO1013)，D65-CF12(SEQ ID NO1014)，D65-CG2(SEQ ID NO1015)，D65-CG5(SEQ ID NO1016)，和D65-CH3(SEQ ID NO1017)的核酸序列。
圖173-74是D65-CH4(SEQ ID NO1018)，D65-CH6(SEQ ID NO1019)，D65-CH8(SEQ ID NO1020)，D65-CH9(SEQ ID NO1021)，D65-CH11(SEQ ID NO1022)，和D65-CH12(SEQ ID NO1023)的核酸序列。
圖173-75是D66-AA4(SEQ ID NO1024)，D66-AA5(SEQ ID NO1025)，D66-AA6(SEQ ID NO1026)，D66-AA9(SEQ ID NO1027)，和D66-AB5(SEQ ID NO1028)的核酸序列。
圖173-76是D66-AB1(SEQ ID NO1029)，D66-AB7(SEQ ID NO1030)，D66-AC1(SEQ ID NO1031)，D66-AC2(SEQ ID NO1032)，和D66-AC4(SEQID NO1033)的核酸序列。
圖173-77是D66-AC7(SEQ ID NO1034)，D66-AD1(SEQ ID NO1035)，D66-AD3(SEQ ID NO1036)，和D66-AD6(SEQ ID NO1037)的核酸序列。
圖173-78是D66-AD8(SEQ ID NO1038)，D66-AE1(SEQ ID NO1039)，D66-AE3(SEQ ID NO1040)，D66-AE6(SEQ ID NO1041)，D66-AE8(SEQ ID NO1042)，和D66-AF3(SEQ ID NO2263)的核酸序列。
圖173-79是D66-AF5(SEQ ID NO1043)，D66-AF8(SEQ ID NO1044)，D66-AF9(SEQ ID NO1045)，和D66-AG1(SEQ ID NO1046)的核酸序列。
圖173-80是D66-AG4(SEQ ID NO1047)，D66-AG5(SEQ ID NO1048)，D66-AH4(SEQ ID NO1049)，D66-AH5(SEQ ID NO1050)，D66-AH7(SEQ ID NO1051)，和D66-AH8(SEQ ID NO1052)的核酸序列。
圖173-81是D66-AH9(SEQ ID NO1053)，D66-BA3(SEQ ID NO1054)，D66-BA8(SEQ ID NO1055)，和D66-BB1(SEQ ID NO1056)的核酸序列。
圖173-82是D66-BB2(SEQ ID NO1057)，D66-BB3(SEQ ID NO1058)，D66-BB5(SEQ ID NO1059)，和D66-BB7(SEQ ID NO1060)的核酸序列。
圖173-83是D66-BB9(SEQ ID NO1061)，D66-BB10(SEQ ID NO1062)，D66-BC6(SEQ ID NO1063)，D66-BD1(SEQ ID NO1064)，和D66-BD2(SEQ ID NO1065)的核酸序列。
圖173-84是D66-BD9(SEQ ID NO1066)，D67-AA2(SEQ ID NO1067)，D67-AA3(SEQ ID NO1068)，D67-AB1(SEQ ID NO1069)，和D67-AC5(SEQ ID NO1070)的核酸序列。
圖173-85是D67-AD1(SEQ ID NO1071)，D67-AD4(SEQ ID NO1072)，D67-AD6(SEQ ID NO1073)，D67-AE2(SEQ ID NO1074)，和D67-AE6(SEQ ID NO1075)的核酸序列。
圖173-86是D67-AF6(SEQ ID NO1076)，D67-AG1(SEQ ID NO1077)，D67-AG3(SEQ ID NO1078)，D67-AG5(SEQ ID NO1079)，和D67-AG6(SEQ ID NO1080)的核酸序列。
圖173-87是D69-AA5(SEQ ID NO1081)，D69-AB1(SEQ ID NO1082)，D69-AB8(SEQ ID NO1083)，D69-AB9(SEQ ID NO1084)，和D69-AC4(SEQ ID NO1085)的核酸序列。
圖173-88是D70A-AB10(SEQ ID NO1086)，D70A-AC2(SEQ ID NO1087)，D70A-AC3(SEQ ID NO1088)，D70A-AD3(SEQ ID NO1089)，D70A-AD5(SEQ ID NO1090)，和D70A-AD6(SEQ ID NO1091)的核酸序列。
圖173-89是D70A-AD11(SEQ ID NO1092)，D70A-AE10(SEQ ID NO1093)，D70A-AF6(SEQ ID NO1094)，D70A-AF8(SEQ ID NO1095)，D70A-AF10(SEQ ID NO1096)，D70A-AH5(SEQ ID NO1097)，和D70A-AH8(SEQ ID NO1098)的核酸序列。
圖173-90是D70A-BA3(SEQ ID NO1099)，D70A-BA6(SEQ ID NO1100)，D70A-BA10(SEQ ID NO1101)，D70A-BB8(SEQ ID NO1102)，和D70A-BB11(SEQ ID NO1103)的核酸序列。
圖173-91是D70A-BC7(SEQ ID NO1104)，D70A-BD8(SEQ IDNO1105)，D70A-BE1(SEQ ID NO1106)，D70A-BE5(SEQ ID NO1107)，D70A-BE6(SEQ ID NO1108)，和D70A-BE8(SEQ ID NO1109)的核酸序列。
圖173-92是D70A-BF2(SEQ ID NO1110)，D70A-BF3(SEQ IDNO1111)，D70A-BF10(SEQ ID NO1112)，D70A-BG9(SEQ ID NO1113)，D70A-BH8(SEQ ID NO1114)，和D70-AE2(SEQ ID NO1115)的核酸序列。
圖173-93是D70-AE6(SEQ ID NO1116)，D70-AF3(SEQ IDNO1117)，D70-AG10(SEQ ID NO1118)，D70-AH7(SEQ ID NO1119)，D70-BE6(SEQ ID NO1120)，和D70-BE7(SEQ ID NO1121)的核酸序列。
圖173-94是D70A-BC12(SEQ ID NO1122)，D72-AB2(SEQ IDNO1123)，D72-AB6(SEQ ID NO1124)，D73A-AA12(SEQ ID NO1125)，和D73A-AB4(SEQ ID NO1126)的核酸序列。
圖173-95是D73A-AB9(SEQ ID NO1127)，D73A-AB 11(SEQ ID NO1128)，D73A-AC1(SEQ ID NO1129)，D73A-AC3(SEQ ID NO1130)，和D73A-AC8(SEQ IDNO1131)的核酸序列。
圖173-96是D73A-AD3(SEQ ID NO1132)，D73A-AE1(SEQ IDNO1133)，D73A-AE3(SEQ ID NO1134)，D73A-AE4(SEQ ID NO1135)，D73A-AE5(SEQ ID NO1136)，和D73A-AE9(SEQ ID NO1137)的核酸序列。
圖173-97是D73A-AE10(SEQ ID NO1138)，D73A-AF3(SEQ ID NO1139)，D73A-AF4(SEQ ID NO1140)，D73A-AF7(SEQ ID NO1141)，D73A-AF8(SEQ ID NO1142)，和D73A-AG11(SEQ ID NO1143)的核酸序列。
圖173-98是D73A-AH1(SEQ ID NO1144)，D73A-AH5(SEQ ID NO1145)，D73A-AH9(SEQ ID NO1146)，D73A-AH12(SEQ ID NO1147)，D73A-BA9(SEQ ID NO1148)，和D73A-BB3(SEQ ID NO1149)的核酸序列。
圖173-99是D73A-BB9(SEQ ID NO1150)，D73A-BE1(SEQ IDNO1151)，D73A-BF3(SEQ ID NO1152)，D73A-BG1(SEQ ID NO1153)，和D73A-BG3(SEQ ID NO1154)的核酸序列。
圖173-100是D73A-BG5(SEQ ID NO1155)，D73A-BH1(SEQ IDNO1156)，D73-AC1(SEQ ID NO1157)，D73-AD8(SEQ ID NO1158)，和D73-AD12(SEQ ID NO1159)的核酸序列。
圖173-101是D80-AB2(SEQ ID NO1160)，D81-AA5(SEQ ID NO1161)，D81-AB4(SEQ ID NO1162)，D81-AB6(SEQ ID NO1163)，和D81-AC5(SEQ ID NO1164)的核酸序列。
圖173-102是D82-AA8(SEQ ID NO1165)，D82-AC9(SEQ ID NO1166)，D82-AH9(SEQ ID NO1167)，和D83-AD10(SEQ ID NO1168)的核酸序列。
圖173-103是D83-AG10(SEQ ID NO1169)，D84-AD3(SEQ IDNO1170)，D84-AE1(SEQ ID NO1171)，D84-AF4(SEQ ID NO1172)，D84-AG1(SEQ ID NO1173)，和D87-AA1(SEQ ID NO1174)的核酸序列。
圖173-104是D87-AA3(SEQ ID NO1175)，D87A-AA1(SEQ IDNO1176)，D87A-AB1(SEQ ID NO1177)，D87A-AB3(SEQ ID NO1178)，D87A-AC1(SEQ ID NO1179)，和D87A-AC3(SEQ ID NO1180)的核酸序列。
圖173-105是D87A-AF2(SEQ ID NO1181)，D87A-AG1(SEQ ID NO1182)，D87A-AH1(SEQ ID NO1183)，D87A-AH3(SEQ ID NO1184)，D87-AB2(SEQ ID NO1185)，和D88-AA10(SEQ ID NO1186)的核酸序列。
圖173-106是D88-AB3(SEQ ID NO1187)，D88-AB6(SEQ IDNO1188)，D88-AB7(SEQ ID NO1189)，D88-AB8(SEQ ID NO1190)，D88-AC5(SEQ ID NO1191)，和D88-AC9(SEQ ID NO1192)的核酸序列。
圖173-107是D88-AD8(SEQ ID NO1193)，D88-AE5(SEQ IDNO1194)，D88-AE6(SEQ ID NO1195)，D88-AE8(SEQ ID NO1196)，和D91-AA4(SEQ ID NO1197)的核酸序列。
圖173-108是D92-AD9(SEQ ID NO1198)，D92-AE9(SEQ ID NO1199)，D92-AF8(SEQ ID NO1200)，D92-AG10(SEQ ID NO1201)，D92-AH9(SEQ ID NO1202)，和D93-AA1(SEQ ID NO1203)的核酸序列。
圖173-109是D93-AA2(SEQ ID NO1204)，D93-AB1(SEQ ID NO1205)，D93-AC3(SEQ ID NO1206)，D93-AC4(SEQ ID NO1207)，和D93-AD1(SEQ ID NO1208)的核酸序列。
圖173-110是D93-AE3(SEQ ID NO1209)，D93-AE4(SEQ ID NO1210)，D93-AF3(SEQ ID NO1211)，D93-AG1(SEQ ID NO1212)，D93-AH2(SEQ ID NO1213)，和D93-AH3(SEQ ID NO1214)的核酸序列。
圖173-111是D93-AH4(SEQ ID NO1215)，D93-BA10(SEQ IDNO1216)，D93-BA12(SEQ ID NO1217)，D93-BD11(SEQ ID NO1218)，D93-BE11(SEQ ID NO1219)，和D93-BF12(SEQ ID NO1220)的核酸序列。
圖173-112是D94-AA2(SEQ ID NO1221)，D94-AA3(SEQ ID NO1222)，D94-AB1(SEQ ID NO1223)，D94-AB2(SEQ ID NO1224)，和D94-AC3(SEQ ID NO1225)的核酸序列。
圖173-113是D94-AD1(SEQ ID NO1226)，D94-AE1(SEQ ID NO1227)，D94-AE3(SEQ ID NO1228)，D94-AG2(SEQ ID NO1229)，和D94-AH1(SEQ ID NO1230)的核酸序列。
圖173-114是D94-AH2(SEQ ID NO1231)，D94-AH3(SEQ ID NO1232)，D95-AC1(SEQ ID NO1233)，D95-AD2(SEQ ID NO1234)，D96-AA3(SEQ ID NO1235)，和D96-AA4(SEQ ID NO1236)的核酸序列。
圖173-115是D96-AA7(SEQ ID NO1237)，D96-AB7(SEQ ID NO2264)，D96-AC5(SEQ ID NO1238)，D96-AC6(SEQ ID NO1239)，和D96-AD6(SEQ ID NO1240)的核酸序列。
圖173-116是D96-AE6(SEQ ID NO1241)，D96-AG3(SEQ ID NO1242)，D96-AH8(SEQ ID NO1243)，D97-AA1(SEQ ID NO1244)，D97-AB1(SEQ ID NO1245)，和D97-AB3(SEQ ID NO1246)的核酸序列。
圖173-117是D97-AD1(SEQ ID NO1247)，D97-AD2(SEQ ID NO1248)，D97-AD4(SEQ ID NO1249)，D97-AE1(SEQ ID NO1250)，和D97-AE2(SEQ ID NO1251)的核酸序列。
圖173-118是D97-AE4(SEQ ID NO1252)，D97-AF3(SEQ ID NO1253)，D97-AG2(SEQ ID NO1254)，D97-AG3(SEQ ID NO1255)，和D97-AH1(SEQ ID NO1256)的核酸序列。
圖173-119是D97-AH2(SEQ ID NO1257)，D97-AH4(SEQ ID NO1258)，D98-AB2(SEQ ID NO1259)，D98-AE3(SEQ ID NO1260)，和D98-AF1(SEQ ID NO1261)的核酸序列。
圖173-120是D98-AH2(SEQ ID NO1262)，D99-AC5(SEQ ID NO1263)，D99-AC8(SEQ ID NO1264)，D99-AD2(SEQ ID NO1265)，D99-AD3(SEQ ID NO1266)，和D99-AD4(SEQ ID NO1267)的核酸序列。
圖173-121是D99-AD6(SEQ ID NO1268)，D99-AE1(SEQ ID NO1269)，D99-AE5(SEQ ID NO1270)，D99-AE6(SEQ ID NO1271)，D99-AE7(SEQ ID NO1272)，和D99-AE8(SEQ ID NO1273)的核酸序列。
圖173-122是D99-AF1(SEQ ID NO1274)，D99-AF5(SEQ ID NO1275)，D99-AF7(SEQ ID NO1276)，D99-AG2(SEQ ID NO1277)，D99-AG4(SEQ ID NO1278)，D99-AG7(SEQ ID NO1279)，和D99-AH2(SEQ ID NO1280)的核酸序列。
圖173-123是D99-AH10(SEQ ID NO1281)，D99-DA3(SEQ ID NO1282)，D99-DB5(SEQ ID NO1283)，D99-DC2(SEQ ID NO1284)，和D99-DC3(SEQ ID NO1285)的核酸序列。
圖173-124是D99-DD5(SEQ ID NO1286)，D99-DG4(SEQ ID NO1287)，D100A-AA4(SEQ ID NO1288)，和D101-BG2(SEQ ID NO1289)的核酸序列。
圖173-125是D101A-AC2(SEQ ID NO1290)，D101A-AD1(SEQ IDNO1291)，D101A-AD2(SEQ ID NO1292)，D101A-AE1(SEQ ID NO1293)，和D101A-AF1(SEQ ID NO1294)的核酸序列。
圖173-126是D101C-AA1(SEQ ID NO1295)，D 101C-AB1(SEQ IDNO1296)，D101C-AC1(SEQ ID NO1297)，D101C-AD3(SEQ ID NO1298)，和D101C-BD12(SEQ ID NO1299)的核酸序列。
圖173-127是D101C-BE12(SEQ ID NO1300)，D101C-BF12(SEQ IDNO1301)，D101C-BG12(SEQ ID NO1302)，和D101D-AB6(SEQ IDNO1303)的核酸序列。
圖173-128是D101D-AC5(SEQ ID NO1304)，D101D-AG5(SEQ IDNO1305)，D101D-AG6(SEQ ID NO1306)，D101D-AH4(SEQ IDNO1307)，和D101D-AH6(SEQ ID NO1308)的核酸序列。
圖173-129是D101D-BB11(SEQ ID NO1309)，D101D-BD11(SEQ IDNO1310)，D107-AA3(SEQ ID NO1311)，D107-AB2(SEQ ID NO1312)，D107-AC2(SEQ ID NO1313)，和D107-AC3(SEQ ID NO1314)的核酸序列。
圖173-130是D107-AD2(SEQ ID NO1315)，D107-AD3(SEQ ID NO1316)，D107-AF1(SEQ ID NO1317)，D107-AH1(SEQ ID NO1318)，D108-AA6(SEQ ID NO1319)，和D108-AB4(SEQ ID NO1320)的核酸序列。
圖173-131是D108-AB5(SEQ ID NO1321)，D108-AC6(SEQ ID NO1322)，D108-AD6(SEQ ID NO1323)，D108-AF6(SEQ ID NO1324)，D109-AA7(SEQ ID NO1325)，和D109-AA8(SEQ ID NO1326)的核酸序列。
圖173-132是D109-AA9(SEQ ID NO1327)，D109-AB8(SEQ ID NO1328)，D109-AC7(SEQ ID NO1329)，D109-AC8(SEQ ID NO1330)，D109-AC9(SEQ ID NO1331)，和D109-AE7(SEQ ID NO1332)的核酸序列。
圖173-133是D109-AF9(SEQ ID NO1333)，D109-AH7(SEQ ID NO1334)，D110-AB11(SEQ ID NO1335)，D110-AF10(SEQ ID NO1336)，D111-AA2(SEQ ID NO1337)，和D111-AB1(SEQ ID NO1338)的核酸序列。
圖173-134是D111-AB3(SEQ ID NO1339)，D111-AC3(SEQ ID NO1340)，D111-AD1(SEQ ID NO1341)，D111-AF1(SEQ ID NO1342)，和D111-AG3(SEQ ID NO1343)的核酸序列。
圖173-135是D111-AH1(SEQ ID NO1344)，D111-AH2(SEQ ID NO1345)，D112-AD6(SEQ ID NO1346)，D112-AE6(SEQ ID NO1347)，和D112-AF5(SEQ ID NO1348)的核酸序列。
圖173-136是D112-AG5(SEQ ID NO1349)，D112-AH4(SEQ IDNO1350)，D113-AA9(SEQ ID NO1351)，D113A-AC3(SEQ ID NO1352)，和D113A-AD1(SEQ ID NO1353)的核酸序列。
圖173-137是D113A-AD3(SEQ ID NO1354)，D113A-AF3(SEQ IDNO1355)，D113A-AG2(SEQ ID NO1356)，D113A-AH2(SEQ ID NO1357)，D113-AB9(SEQ ID NO1358)，和D113-AC7(SEQ ID NO1359)的核酸序列。
圖173-138是D113-AD8(SEQ ID NO1360)，D113-AD9(SEQ IDNO1361)，D113-AE7(SEQ ID NO1362)，D113-AF8(SEQ ID NO1363)，和D113-AF9(SEQ ID NO1364)的核酸序列。
圖173-139是D113-AG7(SEQ ID NO1365)，D113-AG9(SEQ IDNO1366)，D114-AE10(SEQ ID NO1367)，D114-AF11(SEQ ID NO1368)，和D115-AA6(SEQ ID NO1369)的核酸序列。
圖173-140是D133-AA7(SEQ ID NO1370)，D133-AE8(SEQ ID NO1371)，D133-AF9(SEQ ID NO1372)，D133-AG8(SEQ ID NO1373)，D138-AD10(SEQ ID NO1374)，和D139-AD1(SEQ ID NO1375)的核酸序列。
圖173-141是D140-AA4(SEQ ID NO1376)，D140-AD4(SEQ ID NO1377)，D140-AF4(SEQ ID NO1378)，D141-AA7(SEQ ID NO1379)，D141-AB7(SEQ ID NO1380)，和D142-AB11(SEQ ID NO1381)的核酸序列。
圖173-142是D142-AC10(SEQ ID NO1382)，D142-AE10(SEQ IDNO1383)，D142-AE11(SEQ ID NO1384)，D142-AF10(SEQ ID NO1385)，D144-AA1(SEQ ID NO1386)，和D144A-AA9(SEQ ID NO1387)的核酸序列。
圖173-143是D144A-AB12(SEQ ID NO1388)，D144A-AC9(SEQ IDNO1389)，D144A-AC10(SEQ ID NO1390)，D144A-AD12(SEQ IDNO1391)，D144A-AE12(SEQ ID NO1392)，和D144A-AF11(SEQ ID NO1393)的核酸序列。
圖173-144是D144A-AF12(SEQ ID NO1394)，D144A-AG11(SEQ IDNO1395)，D144A-AH9(SEQ ID NO1396)，D144A-AH11(SEQ ID NO1397)，和D144-AE4(SEQ ID NO1398)的核酸序列。
圖173-145是D144-AH3(SEQ ID NO1399)，D145-AA8(SEQ IDNO1400)，D145-AC10(SEQ ID NO1401)，D145-AD7(SEQ ID NO1402)，D145-AD9(SEQ ID NO1403)和D145-AD10(SEQ ID NO1404)的核酸序列。
圖173-146是D145-AE7(SEQ ID NO1405)，D145-AF7(SEQ IDNO1406)，D145-AF8(SEQ ID NO1407)，D145-AG8(SEQ ID NO1408)，D145-AG9(SEQ ID NO1409)，和D145-AG10(SEQ ID NO1410)的核酸序列。
圖173-147是D145-AH9(SEQ ID NO1411)，D146-BB2(SEQ IDNO1412)，D146-BC1(SEQ ID NO1413)，D146-BD1(SEQ ID NO1414)，和D146-BD2(SEQ ID NO1415)的核酸序列。
圖173-148是D146-BF2(SEQ ID NO1416)，D147-AE2(SEQ IDNO1417)，D150-AA2(SEQ ID NO1418)，D150-AC2(SEQ ID NO1419)，和D150-AD1(SEQ ID NO1420)的核酸序列。
圖173-149是D151-AA1(SEQ ID NO1421)，D152-AA2(SEQ ID NO1422)，D152-AB2(SEQ ID NO1423)，D152-AC1(SEQ ID NO1424)，D152-AD2(SEQ ID NO1425)，和D152-AG2(SEQ ID NO1426)的核酸序列。
圖173-150是D152-AH2(SEQ ID NO1427)，D153-AA7(SEQ ID NO1428)，D153-AB2(SEQ ID NO1429)，D153-AF2(SEQ ID NO1430)，D153-AF7(SEQ ID NO1431)，和D153-AF9(SEQ ID NO1432)的核酸序列。
圖173-151是D153-AG6(SEQ ID NO1433)，D153-AG7(SEQ ID NO1434)，D153-AG9(SEQ ID NO1435)，D153-AH6(SEQ ID NO1436)，和D153-AH9(SEQ ID NO1437)的核酸序列。
圖173-152是D154-AC2(SEQ ID NO1438)，D154-AE9(SEQ IDNO1439)，D155-AB1(SEQ ID NO1440)，D155-AC1(SEQ ID NO1441)，和D155-AC2(SEQ ID NO1442)的核酸序列。
圖173-153是D155-AE1(SEQ ID NO1443)，D155-AE2(SEQ ID NO1444)，D155-AF1(SEQ ID NO1445)，D155-AF2(SEQ ID NO1446)，和D155-AH2(SEQ ID NO1447)的核酸序列。
圖173-154是D156-AB1(SEQ ID NO1448)，D156-AC3(SEQ ID NO1449)，D156-AC4(SEQ ID NO1450)，D156-AD3(SEQ ID NO1451)，和D156-AF2(SEQ ID NO1452)的核酸序列。
圖173-155是D156-AF4(SEQ ID NO1453)，D156-AG1(SEQ IDNO1454)，D156-AG2(SEQ ID NO1455)，D156-AG4(SEQ ID NO1456)，和D156-AH1(SEQ ID NO1457)的核酸序列。
圖173-156是D157-AG4(SEQ ID NO1458)，D158-AB8(SEQ ID NO1459)，D158-AD5(SEQ ID NO1460)，D158-AD6(SEQ ID NO1461)，和D158-AD8(SEQ ID NO1462)的核酸序列。
圖173-157是D158-AE8(SEQ ID NO1463)，D159-AD2(SEQ ID NO1464)，D160-AB4(SEQ ID NO1465)，D160-AC4(SEQ ID NO1466)，和D160-AE4(SEQ ID NO1467)的核酸序列。
圖173-158是D160-AF4(SEQ ID NO1468)，D160-AH4(SEQ ID NO1469)，D161-AE5(SEQ ID NO1470)，D161-AH5(SEQ ID NO1471)，D164-AB1(SEQ ID NO1472)，和D164-AB3(SEQ ID NO1473)的核酸序列。
圖173-159是D164-AC1(SEQ ID NO1474)，D164-AC2(SEQ ID NO1475)，D164-AC5(SEQ ID NO1476)，D164-AE1(SEQ ID NO1477)，和D164-AF1(SEQ ID NO1478)的核酸序列。
圖173-160是D165-AH8(SEQ ID NO1479)，D177-BB7(SEQ IDNO1480)，D178-AA6(SEQ ID NO1481)，D178-AD5(SEQ ID NO1482)，和D180-AA9(SEQ ID NO1483)的核酸序列。
圖173-161是D181-AB6(SEQ ID NO1484)，D181-AC6(SEQ ID NO1485)，D181-AD7(SEQ ID NO1486)，D181-AG7(SEQ ID NO1487)，和D181-AH6(SEQ ID NO1488)的核酸序列。
圖173-162是D182-AA1(SEQ ID NO1489)，D182-AA2(SEQ IDNO1490)，D182-AA4(SEQ ID NO1491)，D182-AB2(SEQ ID NO1492)，和D182-AC2(SEQ ID NO1493)的核酸序列。
圖173-163是D182-AC4(SEQ ID NO1494)，D182-AD1(SEQ IDNO1495)，D182-AD3(SEQ ID NO1496)，D182-AF1(SEQ ID NO1497)，和D182-AF4(SEQ ID NO1498)的核酸序列。
圖173-164是D182-Ag1(SEQ ID NO1499)，D183-AC8(SEQ IDNO1500)，D185-AB10(SEQ ID NO1501)，D185-AC10(SEQ ID NO1502)，D185-AF10(SEQ ID NO1503)，和D185-BA1(SEQ ID NO1504)的核酸序列。
圖173-165是D185-BB3(SEQ ID NO1505)，D186-AA3(SEQ ID NO1506)，D186-AB4(SEQ ID NO1507)，D186-AC2(SEQ ID NO1508)，D186-AC3(SEQ ID NO1509)，和D186-AD2(SEQ ID NO1510)的核酸序列。
圖173-166是D186-AD3(SEQ ID NO1511)，D186-AE3(SEQ IDNO1512)，D187-AB2(SEQ ID NO1513)，D187-AB3(SEQ ID NO1514)，D187-AC4(SEQ ID NO1515)，D187-AE4(SEQ ID NO1516)，和D187-AF4(SEQ ID NO1517)的核酸序列。
圖173-167是D187-AG1(SEQ ID NO1518)，D187-AG2(SEQ IDNO1519)，D187-AG3(SEQ ID NO1520)，D187-AH2(SEQ ID NO1521)，D184-AA1(SEQ ID NO1522)，和D188-AC7(SEQ ID NO1523)的核酸序列圖173-168是D188-AC8(SEQ ID NO1524)，D188-AD8(SEQ IDNO1525)，D188-AE8(SEQ ID NO1526)，D188-AF6(SEQ ID NO1527)，D188-AG5(SEQ ID NO1528)，和D188-AG7(SEQ ID NO1529)的核酸序列。
圖173-169是D188-AH7(SEQ ID NO1530)，D189-AA12(SEQ IDNO1531)，D189-AB10(SEQ ID NO1532)，D189-AE9(SEQ ID NO1533)，D189-AE12(SEQ ID NO1534)，和D189-AF12(SEQ ID NO1535)的核酸序列。
圖173-170是D189-AG10(SEQ ID NO1536)，D190-BA6(SEQ ID NO1537)，D190-BD6(SEQ ID NO1538)，D190-BF6(SEQ ID NO1539)，D190-BG6(SEQ ID NO1540)，和D190-BH6(SEQ ID NO1541)的核酸序列。
圖173-171是D191-BC5(SEQ ID NO1542)，D191-BD5(SEQ ID NO1543)，D191-BF5(SEQ ID NO1544)，D191-BG5(SEQ ID NO1545)，和D194-AA1(SEQ ID NO1546)的核酸序列。
圖173-172是D194-AA2(SEQ ID NO1547)，D194-AB1(SEQ ID NO1548)，D194-AB2(SEQ ID NO1549)，D194-AC1(SEQ ID NO1550)，和D194-AC2(SEQ ID NO1551)的核酸序列。
圖173-173是D194-AD1(SEQ ID NO1552)，D194-AD2(SEQ IDNO1553)，D194-AD3(SEQ ID NO1554)，D194-AE1(SEQ ID NO1555)，和D194-AE2(SEQ ID NO1556)的核酸序列。
圖173-174是D194-AE3(SEQ ID NO1557)，D194-AF1(SEQ IDNO1558)，D194-AF2(SEQ ID NO1559)，D194-AG2(SEQ ID NO1560)，和D194-AG3(SEQ ID NO1561)的核酸序列。
圖173-175是D194-AH1(SEQ ID NO1562)，D194-AH2(SEQ IDNO1563)，D194-AH3(SEQ ID NO1564)，D195-AB6(SEQ ID NO1565)，D195-AD5(SEQ ID NO1566)，和D195-AE4(SEQ ID NO1567)的核酸序列。
圖173-176是D195-AE5(SEQ ID NO1568)，D195-AG5(SEQ IDNO1569)，D195-AH5(SEQ ID NO1570)，D196-AD7(SEQ ID NO1571)，和D196-AF7(SEQ ID NO1572)的核酸序列。
圖173-177是D196-AG7(SEQ ID NO1573)，D197-AE8(SEQ IDNO1574)，D198-AB9(SEQ ID NO1575)，D198-AC9(SEQ ID NO1576)，和D198-AF9(SEQ ID NO1577)的核酸序列。
圖173-178是D199-AA10(SEQ ID NO1578)，D199-AB10(SEQ IDNO1579)，D199-AD10(SEQ ID NO1580)，D199-AF10(SEQ ID NO1581)，和D199-AG10(SEQ ID NO1582)的核酸序列。
圖173-179是D200-AB11(SEQ ID NO1583)，D200-AC11(SEQ IDNO1584)，D200-AD11(SEQ ID NO1585)，D200-AE11(SEQ ID NO1586)，和D200-AG1(SEQ ID NO1587)的核酸序列。
圖173-180是D200-AH11(SEQ ID NO1588)，D201-AD12(SEQ ID NO1589)，D201-AE12(SEQ ID NO1590)，D201-AF12(SEQ ID NO1591)，D201-AG12(SEQ ID NO1592)，和D203-BE11(SEQ ID NO1593)的核酸序列。
圖173-181是D203-BF11(SEQ ID NO1594)，D204-AA1(SEQ ID NO1595)，D204-AA2(SEQ ID NO1596)，D204-AA4(SEQ ID NO1597)，和D204-AB1(SEQ ID NO1598)的核酸序列。
圖173-182是D204-AB3(SEQ ID NO1599)，D204-AC1(SEQ ID NO1600)，D204-AC2(SEQ ID NO1601)，D204-AC4(SEQ ID NO1602)，和D204-AD1(SEQ ID NO1603)的核酸序列。
圖173-183是D204-AD2(SEQ ID NO1604)，D204-AD3(SEQ ID NO1605)，D204-AD4(SEQ ID NO1606)，D204-AE3(SEQ ID NO1607)，和D204-AE4(SEQ ID NO1608)的核酸序列。
圖173-184是D204-AF1(SEQ ID NO1609)，D204-AF3(SEQ ID NO1610)，D204-AF4(SEQ ID NO1611)，D204-AG1(SEQ ID NO1612)，和D204-AG2(SEQ ID NO1613)的核酸序列。
圖173-185是D204-AG3(SEQ ID NO1614)，D203-BA11(SEQ ID NO1615)，D204-AG4(SEQ ID NO1616)，D204-AH2(SEQ ID NO1617)，和D204-AH1(SEQ ID NO1618)的核酸序列。
圖173-186是D204-AH3(SEQ ID NO1619)，D205-BC9(SEQ ID NO1620)，D205-BD9(SEQ ID NO1621)，D206-CB3(SEQ ID NO1622)，D206-CE3(SEQ ID NO1623)，和D206-CF3(SEQ ID NO1624)的核酸序列。
圖173-187是D206-CG1(SEQ ID NO1625)，D206-CH1(SEQ ID NO1626)，D210-BF4(SEQ ID NO1627)，和D210-BF6(SEQ ID NO1628)的核酸序列。
圖173-188是D210-BH6(SEQ ID NO1629)，D211-BA9(SEQ ID NO1630)，D211-BB8(SEQ ID NO1631)，D211-BB9(SEQ ID NO1632)，D211-BC9(SEQ ID NO1633)，和D211-BD8(SEQ ID NO1634)的核酸序列。
圖173-189是D211-BD9(SEQ ID NO1635)，D211-BE7(SEQ ID NO1636)，D211-BE8(SEQ ID NO1637)，和D211-BF8(SEQ ID NO1638)的核酸序列。
圖173-190是D211-BF9(SEQ ID NO1639)，D211-BG8(SEQ ID NO1640)，D211-BH7(SEQ ID NO1641)，D212-BB11(SEQ ID NO1642)，和D212-BB12(SEQ ID NO1643)的核酸序列。
圖173-191是D212-BD10(SEQ ID NO1644)，D212-BD11(SEQ IDNO1645)，D212-BE10(SEQ ID NO1646)，D212-BE11(SEQ ID NO1647)，D212-BF10(SEQ ID NO1648)，和D212-BF11(SEQ ID NO1649)的核酸序列。
圖173-192是D213-BD1(SEQ ID NO1650)，D213-BF2(SEQ ID NO1651)，D214-AA1(SEQ ID NO1652)，D214-AA3(SEQ ID NO1653)，和D214-AC1(SEQ ID NO1654)的核酸序列。
圖173-193是D214-AE1(SEQ ID NO1655)，D214-AE3(SEQ ID NO1656)，D214-AG1(SEQ ID NO1657)，D214-AH2(SEQID NO1658)，和D214-AH3(SEQ ID NO1659)的核酸序列。
圖173-194是D216-AB7(SEQ ID NO1660)，D216-AC8(SEQ IDNO1661)，D216-AH9(SEQ ID NO1662)，D219-BA1(SEQ ID NO1663)，D219-BB1(SEQ ID NO1664)，和D219-BB2(SEQ ID NO1665)的核酸序列。
圖173-195是D219-BC1(SEQ ID NO1666)，D219-BD1(SEQ IDNO1667)，D219-BD2(SEQ ID NO1668)，D219-BE1(SEQ ID NO1669)，D219-BE2(SEQ ID NO1670)，和D219-BF2(SEQ ID NO1671)的核酸序列。
圖173-196是D219-BH1(SEQ ID NO1672)，D220-BF6(SEQ ID NO1673)，D220-BD6(SEQ ID NO1674)，D223-BC11(SEQ ID NO1675)，和D221-BC7(SEQ ID NO1676)的核酸序列。
圖173-197是D227-AE3(SEQ ID NO1677)，D223-BB10(SEQ ID NO1678)，D221-BF9(SEQ ID NO1679)，D229-AD2(SEQ ID NO1680)，D229-AE2(SEQ ID NO1681)，D229-AF2(SEQ ID NO1682)，和D229-AG1(SEQ ID NO1683)的核酸序列。
圖173-198是D229-AH1(SEQ ID NO1684)，D230-AB1(SEQ IDNO1685)，D230-AC1(SEQ ID NO1686)，D230-AC2(SEQ ID NO1687)，D230-AF2(SEQ ID NO1688)，和D230-AG1(SEQ ID NO1689)的核酸序列。
圖173-199是D230-AG2(SEQ ID NO1690)，D231-AA1(SEQ ID NO1691)，D231-AA2(SEQ ID NO1692)，D231-AA3(SEQ ID NO1693)，D231-AC1(SEQ ID NO1694)，和D231-AC2(SEQ ID NO1695)的核酸序列。
圖173-200是D231-AD2(SEQ ID NO1696)，D231-AE1(SEQ ID NO1697)，D231-AG2(SEQ ID NO1698)，D231-AH1(SEQ ID NO1699)，D231-AH2(SEQ ID NO1700)，和D231-AH3(SEQ ID NO1701)的核酸序列。
圖173-201是D232-AD4(SEQ ID NO1702)，D232-AE5(SEQ ID NO1703)，D232-AE6(SEQ ID NO1704)，和D232-AF5(SEQ ID NO1705)的核酸序列。
圖173-202是D233-AA7(SEQ ID NO1706)，D233-AA8(SEQ ID NO1707)，D233-AB7(SEQ ID NO1708)，D233-AC7(SEQ ID NO1709)，和D233-AC8(SEQ ID NO1710)的核酸序列。
圖173-203是D233-AH9(SEQ ID NO1711)，D234-AA11(SEQ ID NO1712)，D234-AC11(SEQ ID NO1713)，D234-AD11(SEQ ID NO1714)，D238-AA2(SEQ ID NO1715)，和D239-BC3(SEQ ID NO1716)的核酸序列。
圖173-204是D239-BD4(SEQ ID NO1717)，D239-BD6(SEQ ID NO1718)，D239-BE4(SEQ ID NO1719)，D240-BB7(SEQ ID NO1720)，和D241-BC9(SEQ ID NO1721)的核酸序列。
圖173-205是D241-BE9(SEQ ID NO1722)，D242-BA11(SEQ ID NO1723)，D242-BB11(SEQ ID NO1724)，D242-BB12(SEQ ID NO1725)，D242-BC12(SEQ ID NO1726)，和D242-BF12(SEQ ID NO1727)的核酸序列。
圖173-206是D242-BG12(SEQ ID NO1728)，D242-BH11(SEQ IDNO1729)，D244-AA5(SEQ ID NO1730)，D244-AA6(SEQ ID NO1731)，D244-AF6(SEQ ID NO1732)，和D245-AE7(SEQ ID NO1733)的核酸序列。
圖173-207是D245-AE8(SEQ ID NO1734)，D245-AF7(SEQ ID NO1735)，D246-AA12(SEQ ID NO1736)，D248-AG4(SEQ ID NO1737)，和D249-AG9(SEQ ID NO1738)的核酸序列。
圖173-208是D250-AE10(SEQ ID NO1739)，D251-AF2(SEQ IDNO1740)，D251-AG2(SEQ ID NO1741)，D252-AA5(SEQ ID NO1742)，和D252-AB5(SEQ ID NO1743)的核酸序列。
圖173-209是D252-AC5(SEQ ID NO1744)，D252-AD5(SEQ ID NO1745)，D252-AF4(SEQ ID NO1746)，D252-AF5(SEQ ID NO1747)，D252-AG5(SEQ ID NO1748)，和D254-AE2(SEQ ID NO1749)的核酸序列。
圖173-210是D254-AG2(SEQ ID NO1750)，D255-AA5(SEQ IDNO1751)，D255-AA6(SEQ ID NO1752)，D255-AD5(SEQ ID NO1753)，和D255-AD6(SEQ ID NO1754)的核酸序列。
圖173-211是D255-AF5(SEQ ID NO1755)，D255-AG5(SEQ ID NO1756)，D256-AA10(SEQ ID NO1757)，和D256-AB10(SEQ ID NO1758)的核酸序列。
圖173-212是D256-AC10(SEQ ID NO1759)，D256-AE10(SEQ IDNO1760)，D256-AF9(SEQ ID NO1761)，D256-AF10(SEQ ID NO1762)，和D256-AG10(SEQ ID NO1763)的核酸序列。
圖173-213是D256-AH10(SEQ ID NO1764)，D258-AC5(SEQ ID NO1765)，D263-AE12(SEQ ID NO1766)，D263-AF12(SEQ ID NO1767)，和D263-AH12(SEQ ID NO1768)的核酸序列。
圖173-214是D264-AA1(SEQ ID NO1769)，D264-AA2(SEQ ID NO1770)，D264-AA3(SEQ ID NO1771)，D264-AB2(SEQ ID NO1772)，和D264-AC3(SEQ ID NO1773)的核酸序列。
圖173-215是D264-AD3(SEQ ID NO1774)，D264-AE1(SEQ ID NO1775)，D264-AE2(SEQ ID NO1776)，和D264-AE3(SEQ ID NO1777)的核酸序列。
圖173-216是D264-AF2(SEQ ID NO1778)，D264-AG2(SEQ ID NO1779)，D264-AH2(SEQ ID NO1780)，和D265-AA4(SEQ ID NO1781)的核酸序列。
圖173-217是D265-AA6(SEQ ID NO1782)，D265-AC5(SEQ ID NO1783)，D265-AC6(SEQ ID NO1784)，和D265-AD4(SEQ ID NO1785)的核酸序列。
圖173-218是D265-AD5(SEQ ID NO1786)，D266-AB7(SEQ ID NO1787)，D266-AB8(SEQ ID NO1788)，D266-AC9(SEQ ID NO1789)，和D266-AD7(SEQ ID NO1790)的核酸序列。
圖173-219是D267-AD10(SEQ ID NO1791)，D268-AA2(SEQ ID NO1792)，D268-AC3(SEQ ID NO1793)，D268-AD1(SEQ ID NO1794)，和D268-AD2(SEQ ID NO1795)的核酸序列。
圖173-220是D268-AD3(SEQ ID NO1796)，D268-AE3(SEQ ID NO1797)，D268-AG2(SEQ ID NO1798)，和D268-AG3(SEQ ID NO1799)的核酸序列。
圖173-221是D269-AA5(SEQ ID NO1800)，D269-AD4(SEQ ID NO1801)，D269-AE4(SEQ ID NO1802)，D269-AF5(SEQ ID NO1803)，D269-AF6(SEQ ID NO1804)，和D270-AA8(SEQ ID NO1805)的核酸序列。
圖173-222是D270-AB9(SEQ ID NO1806)，D270-AD8(SEQ ID NO1807)，D270-AD9(SEQ ID NO1808)，D270-AE9(SEQ ID NO1809)，和D270-AF8(SEQ ID NO1810)的核酸序列。
圖173-223是D271-AG11(SEQ ID NO1811)，D271-AH11(SEQ IDNO1812)，D276-AD5(SEQ ID NO1813)，和D276-AG6(SEQ ID NO1814)的核酸序列。
圖173-224是D276-AH4(SEQ ID NO1815)，D276-AH6(SEQ IDNO1816)，D277-AE8(SEQ ID NO1817)，D277-AF9(SEQ ID NO1818)，和D277-AH9(SEQ ID NO1819)的核酸序列。
圖173-225是D278-AF10(SEQ ID NO1820)，D279-AA3(SEQ ID NO1821)，D279-AB2(SEQ ID NO1822)，D279-AC1(SEQ ID NO1823)，和D279-AD2(SEQ ID NO1824)的核酸序列。
圖173-226是D279-AE1(SEQ ID NO1825)，D279-AE3(SEQ ID NO1826)，D279-AG3(SEQ ID NO1827)，D279-BA1(SEQ ID NO1828)，和D279-BA2(SEQ ID NO1829)的核酸序列。
圖173-227是D279-BB3(SEQ ID NO1830)，D279-BC2(SEQ IDNO1831)，D279-BD2(SEQ ID NO1832)，D279-BE2(SEQ ID NO1833)，和D279-BF3(SEQ ID NO1834)的核酸序列。
圖173-228是D279-BG1(SEQ ID NO1835)，D279-BH3(SEQ ID NO1836)，D280-AB5(SEQ ID NO1837)，D280-AB6(SEQ ID NO1838)，和D280-AC4(SEQ ID NO1839)的核酸序列。
圖173-229是D280-AC6(SEQ ID NO1840)，D280-AD4(SEQ ID NO1841)，D280-AD5(SEQ ID NO1842)，D280-AD6(SEQ ID NO1843)，和D280-AE4(SEQ ID NO1844)的核酸序列。
圖173-230是D280-AE5(SEQ ID NO1845)，D280-AE6(SEQ ID NO1846)，D280-AF5(SEQ ID NO1847)，D280-AF6(SEQ ID NO1848)，和D280-AG4(SEQ ID NO1849)的核酸序列。
圖173-231是D280-AG5(SEQ ID NO1850)，D280-AG6(SEQ IDNO1851)，D280-AH4(SEQ ID NO1852)，D280-AH5(SEQ ID NO1853)，和D280-BC4(SEQ ID NO1854)的核酸序列。
圖173-232是D280-BD4(SEQ ID NO1855)，D280-BE4(SEQ ID NO1856)，D280-BE6(SEQ ID NO1857)，和D280-BF4(SEQ ID NO1858)的核酸序列。
圖173-233是D280-BG4(SEQ ID NO1859)，D280-BH4(SEQ IDNO1860)，D280-BH6(SEQ ID NO1861)，D281-AA8(SEQ ID NO1862)，和D281-AD7(SEQ ID NO1863)的核酸序列。
圖173-234是D281-AD8(SEQ ID NO1864)，D281-AE7(SEQ IDNO1865)，D281-AE8(SEQ ID NO1866)，D281-AE9(SEQ ID NO1867)，D281-AG7(SEQ ID NO1868)，和D282-AB10(SEQ ID NO1869)的核酸序列。
圖173-235是D282-AB11(SEQ ID NO1870)，D282-AD10(SEQ IDNO1871)，D282-AH11(SEQ ID NO1872)，D282-BA10(SEQ ID NO1873)，D282-BB10(SEQ ID NO1874)，和D282-BD10(SEQ ID NO1875)的核酸序列。
圖173-236是D288-AB3(SEQ ID NO1876)，D289-AA4(SEQ IDNO1877)，D289-AA6(SEQ ID NO1878)，D289-AB4(SEQ ID NO1879)，和D289-AB6(SEQ ID NO1880)的核酸序列。
圖173-237是D289-AD4(SEQ ID NO1881)，D289-AE4(SEQ ID NO1882)，D289-AE6(SEQ ID NO1883)，D289-AF4(SEQ ID NO1884)，和D289-AF6(SEQ ID NO1885)的核酸序列。
圖173-238是D289-AG4(SEQ ID NO1886)，D289-AG6(SEQ ID NO1887)，D289-AH4(SEQ ID NO1888)，D289-AH6(SEQ ID NO1889)，和D290-AA7(SEQ ID NO1890)的核酸序列。
圖173-239是D290-AA8(SEQ ID NO1891)，D290-AA9(SEQ ID NO1892)，D290-AB7(SEQ ID NO1893)，D290-AB9(SEQ ID NO1894)，和D290-AC8(SEQ ID NO1895)的核酸序列。
圖173-240是D290-AC9(SEQ ID NO1896)，D290-AD7(SEQ ID NO1897)，D290-AD8(SEQ ID NO1898)，D290-AD9(SEQ ID NO1899)，和D291-AA12(SEQ ID NO1900)的核酸序列。
圖173-241是D291-AB10(SEQ ID NO1901)，D291-AB11(SEQ IDNO1902)，D291-AC12(SEQ ID NO1903)，D291-AD11(SEQ ID NO1904)，和D291-AD12(SEQ ID NO1905)的核酸序列。
圖173-242是D291-AE10(SEQ ID NO1906)，D291-AE12(SEQ IDNO1907)，D291-AF10(SEQ ID NO1908)，D291-AF12(SEQ ID NO1909)，和D291-AG11(SEQ ID NO1910)的核酸序列。
圖173-243是D291-AG12(SEQ ID NO1911)，D291-AH11(SEQ ID NO1912)，D292-AA2(SEQ ID NO1913)，D292-AA3(SEQ ID NO1914)，D292-AB2(SEQ ID NO1915)，和D292-AC2(SEQ ID NO1916)的核酸序列。
圖173-244是D292-AD1(SEQ ID NO1917)，D292-AD2(SEQ ID NO1918)，D292-AE1(SEQ ID NO1919)，D292-AE2(SEQ ID NO1920)，D292-AF1(SEQ ID NO1921)，D292-AF3(SEQ ID NO1922)，和D292-AH3(SEQ ID NO1923)的核酸序列。
圖173-245是D291-AA10(SEQ ID NO1924)，D294-AB7(SEQ ID NO1925)，D294-AB8(SEQ ID NO1926)，D294-AB9(SEQ ID NO1927)，和D294-AC7(SEQ ID NO1928)的核酸序列。
圖173-246是D294-AC8(SEQ ID NO1929)，D294-AE9(SEQ IDNO1930)，D294-AG8(SEQ ID NO1931)，D294-AH7(SEQ ID NO1932)，和D295-AA3(SEQ ID NO1933)的核酸序列。
圖173-247是D295-AB1(SEQ ID NO1934)，D295-AB2(SEQ ID NO1935)，D295-AC2(SEQ ID NO1936)，D295-AC3(SEQ ID NO1937)，和D295-AD1(SEQ ID NO1938)的核酸序列。
圖173-248是D295-AD2(SEQ ID NO1939)，D295-AE3(SEQ ID NO1940)，D295-AF1(SEQ ID NO1941)，D295-AF2(SEQ ID NO1942)，和D295-AG3(SEQ ID NO1943)的核酸序列。
圖173-249是D295-AH1(SEQ ID NO1944)，D296-AA6(SEQ IDNO1945)，D296-AE5(SEQ ID NO1946)，D296-AF5(SEQ ID NO1947)，和D296-AG4(SEQ ID NO1948)的核酸序列。
圖173-250是D296-AG5(SEQ ID NO1949)，D297-AA7(SEQ ID NO1950)，D297-AA8(SEQ ID NO1951)，D297-AB7(SEQ ID NO1952)，和D297-AE7(SEQ ID NO1953)的核酸序列。
圖173-251是D297-AF7(SEQ ID NO1954)，D298-AA10(SEQ IDNO1955)，D298-AB11(SEQ ID NO1956)，D298-AF11(SEQ ID NO1957)，和D298-AG12(SEQ ID NO1958)的核酸序列。
圖173-252是D35-40(SEQ ID NO1959)，D35-AC6(SEQ ID NO1960)，D35-BB2(SEQ ID NO1961)，D55-AB9(SEQ ID NO1962)，和D55-BB1(SEQ ID NO1963)的核酸序列。
圖173-253是D55-BB2(SEQ ID NO1964)，D55-BB3(SEQ ID NO1965)，D55-BB7(SEQ ID NO1966)，D56-AA1(SEQ ID NO1967)，D56-AE4(SEQ ID NO1968)，和D56-AE9(SEQ ID NO1969)的核酸序列圖173-254是D56-AD1(SEQ ID NO1970)，D56-AG12(SEQ ID NO1971)，D56-AH11(SEQ ID NO1972)，D57-AA5(SEQ ID NO1973)，和D57-AA7(SEQ ID NO1974)的核酸序列。
圖173-255是D57-AB10(SEQ ID NO1975)，D57-AC2(SEQ ID NO1976)，D57-AC3(SEQ ID NO1977)，D57-AC6(SEQ ID NO1978)，D57-AC9(SEQ ID NO1979)，和D57-AC11(SEQ ID NO1980)的核酸序列。
圖173-256是D57-AD3(SEQ ID NO1981)，D57-AE4(SEQ ID NO1982)，D57-AE6(SEQ ID NO1983)，D57-AE9(SEQ ID NO1984)，和D57-AF4(SEQ ID NO1985)的核酸序列。
圖173-257是D57-AF11(SEQ ID NO1986)，D57-AG3(SEQ ID NO1987)，D57-AH11(SEQ ID NO1988)，D58-AB2(SEQ ID NO1989)，D58-AC8(SEQ ID NO1990)，和D58-AG9(SEQ ID NO1991)的核酸序列。
圖173-258是D58-BA9(SEQ ID NO1992)，D58-BB9(SEQ IDNO1993)，D58-BC1(SEQ ID NO1994)，D58-BC10(SEQ ID NO1995)，D58-BC11(SEQ ID NO1996)，和D58-BD4(SEQ ID NO1997)的核酸序列。
圖173-259是D58-BE8(SEQ ID NO1998)，D58-BF4(SEQ ID NO1999)，D60-AB4(SEQ ID NO2000)，D60-AC4(SEQ ID NO2001)，D60-AD11(SEQ ID NO2002)，和D60-AF9(SEQ ID NO2003)的核酸序列。
圖173-260是D65-AB6(SEQ ID NO2004)，D65-AC3(SEQ ID NO2005)，D65-AC9(SEQ ID NO2006)，D65-AC12(SEQ ID NO2007)，D65-AE3(SEQ ID NO2008)，和D65-AG1(SEQ ID NO2009)的核酸序列。
圖173-261是D65-CE10(SEQ ID NO2010)，D65-CE11(SEQ IDNO2011)，D65-CF11(SEQ ID NO2012)，D65-CH5(SEQ ID NO2013)，D66-AA1(SEQ ID NO2014)，和D66-AA3(SEQ ID NO2015)的核酸序列。
圖173-262是D66-AE5(SEQ ID NO2016)，D66-AF1(SEQ ID NO2017)，D66-AG2(SEQ ID NO2018)，D66-AG6(SEQ ID NO2019)，和D66-AH3(SEQ ID NO2020)的核酸序列。
圖173-263是D66-BA11(SEQ ID NO2021)，D66-BD6(SEQ ID NO2022)，D66-BD8(SEQ ID NO2023)，D67-AA5(SEQ ID NO2024)，D67-AD3(SEQ ID NO2025)，和D67-AE1(SEQ ID NO2026)的核酸序列。
圖173-264是D67-AE4(SEQ ID NO2027)，D67-AG4(SEQ ID NO2028)，D68-AF3(SEQ ID NO2029)，D70A-AE1(SEQ ID NO2030)，D70A-AG7(SEQ ID NO2031)，和D70A-BC6(SEQ ID NO2032)的核酸序列。
圖173-265是D70A-BF7(SEQ ID NO2033)，D70A-BF8(SEQ ID NO2034)，D70A-BH1(SEQ ID NO2035)，D70A-BH3(SEQ ID NO2036)，和D73A-AA1(SEQ ID NO2037)的核酸序列。
圖173-266是D73A-AA3(SEQ ID NO2038)，D73A-AA5(SEQ ID NO2039)，D73A-AA6(SEQ ID NO2040)，D73A-AA8(SEQ ID NO2041)，D73A-AA9(SEQ ID NO2042)，和D73A-AB1(SEQ ID NO2043)的核酸序列。
圖173-267是D73A-AB3(SEQ ID NO2044)，D73A-AB5(SEQ ID NO2045)，D73A-AB10(SEQ ID NO2046)，D73A-AC2(SEQ ID NO2047)，和D73A-AC5(SEQ ID NO2048)的核酸序列。
圖173-268是D73A-AC11(SEQ ID NO2049)，D73A-AC12(SEQ IDNO2050)，D73A-AD7(SEQ ID NO2051)，D73A-AD10(SEQ ID NO2052)，D73A-AE6(SEQ ID NO2053)，和D73A-AE7(SEQ ID NO2054)的核酸序列。
圖173-269是D73A-AE8(SEQ ID NO2055)，D73A-AE12(SEQ IDNO2056)，D73A-AF5(SEQ ID NO2057)，D73A-AF6(SEQ ID NO2058)，D73A-AF12(SEQ ID NO2059)，和D73A-AG4(SEQ ID NO2060)的核酸序列。
圖173-270是D73A-AG6(SEQ ID NO2061)，D73A-AG10(SEQ IDNO2062)，D73A-AH2(SEQ ID NO2063)，D73A-AH3(SEQ ID NO2064)，和D73A-AH10(SEQ ID NO2065)的核酸序列。
圖173-271是D93-AD3(SEQ ID NO2066)，D97-AD3(SEQ ID NO2067)，D97-AE3(SEQ ID NO2068)，D97-AF1(SEQ ID NO2069)，和D113-AH8(SEQ ID NO2070)的核酸序列。
圖173-272是D114-AA10(SEQ ID NO2071)，D114-AC11(SEQ IDNO2072)，D131-AD1(SEQ ID NO2073)，D133-AD7(SEQ ID NO2074)，和D139-AD2(SEQ ID NO2075)的核酸序列。
圖173-273是D139-AF2(SEQ ID NO2076)，D144A-AB10(SEQ IDNO2077)，D144A-AE9(SEQ ID NO2078)，D144A-AG12(SEQ ID NO2079)，D145-AC7(SEQ ID NO2080)，和D145-AH7(SEQ ID NO2081)的核酸序列。
圖173-274是D150-AA3(SEQ ID NO2082)，D150-AG3(SEQ ID NO2083)，D151-AG3(SEQ ID NO2084)，D153-AA8(SEQ ID NO2085)，D153-AB7(SEQ ID NO2086)，和D153-AC9(SEQ ID NO2087)的核酸序列。
圖173-275是D153-AF8(SEQ ID NO2088)，D155-AA2(SEQ ID NO2089)，D155-AG2(SEQ ID NO2090)，D156-AH3(SEQ ID NO2091)，D159-AA2(SEQ ID NO2092)，和D164-AD1(SEQ ID NO2093)的核酸序列。
圖173-276是D181-AG6(SEQ ID NO2094)，D182-AB1(SEQ ID NO2095)，D182-AF2(SEQ ID NO2096)，D185-AE10(SEQ ID NO2097)，D186-AH3(SEQ ID NO2098)，和D188-AC6(SEQ ID NO2099)的核酸序列。
圖173-277是D188-AF5(SEQ ID NO2100)，D189-AD12(SEQ IDNO2101)，D258-AG6(SEQ ID NO2102)，D194-AA3(SEQ ID NO2103)，D194-AB3(SEQ ID NO2104)，D198-AD9(SEQ ID NO2105)，和D198-AE9(SEQ ID NO2106)的核酸序列。
圖173-278是D203-BB11(SEQ ID NO2107)，D203-BC11(SEQ IDNO2108)，D204-AA3(SEQ ID NO2109)，D204-AF2(SEQ ID NO2110)，D206-CB(SEQ ID NO2111)，和D214-AB1(SEQ ID NO2112)的核酸序列。
圖173-279是D214-AF2(SEQ ID NO2113)，D216-AA7(SEQ IDNO2114)，D216-AD7(SEQ ID NO2115)，D219-BA2(SEQ ID NO2116)，D219-BF1(SEQ ID NO2117)，和D229-AB2(SEQ ID NO2118)的核酸序列。
圖173-280是D230-AD2(SEQ ID NO2119)，D230-AE2(SEQ IDNO2120)，D234-AE12(SEQ ID NO2121)，D241-BG10(SEQ ID NO2122)，D249-AA9(SEQ ID NO2123)，和D255-AC5(SEQ ID NO2124)的核酸序列。
圖173-281是D270-AE7(SEQ ID NO2125)，D270-AE8(SEQ IDNO2126)，D276-AH5(SEQ ID NO2127)，D279-AA2(SEQ ID NO2128)，和D279-AB3(SEQ ID NO2129)的核酸序列。
圖173-282是D279-AC2(SEQ ID NO2130)，D279-AC3(SEQ IDNO2131)，D279-AD3(SEQ ID NO2132)，和D279-AE2(SEQ ID NO2133)的核酸序列。
圖173-283是D279-AG2(SEQ ID NO2134)，D279-AH3(SEQ IDNO2135)，D280-BF6(SEQ ID NO2136)，D281-AB8(SEQ ID NO2137)，和D281-AC7(SEQ ID NO2138)的核酸序列。
圖173-284是D282-AG10(SEQ ID NO2139)，D288-AC2(SEQ ID NO2140)，D289-AC6(SEQ ID NO2141)，D290-AB8(SEQ ID NO2142)，和D291-AD10(SEQ ID NO2143)的核酸序列。
圖173-285是D291-AE11(SEQ ID NO2144)，D291-AH12(SEQ IDNO2145)，D292-AB3(SEQ ID NO2146)，D292-AD3(SEQ ID NO2147)，D292-AE3(SEQ ID NO2148)，和D294-AE7(SEQ ID NO2149)的核酸序列。
圖173-286是D419-AH11(SEQ ID NO2150)，D295-AE2(SEQ IDNO2151)，D295-AG2(SEQ ID NO2152)，D295-AH2(SEQ ID NO2153)，D295-AH3(SEQ ID NO2154)，和D296-AD4(SEQ ID NO2155)的核酸序列。
圖173-287是D296-AF4(SEQ ID NO2156)，D296-AG6(SEQ IDNO2157)，D297-AD7(SEQ ID NO2158)，D297-AG7(SEQ ID NO2159)，和D298-AD11(SEQ ID NO2160)的核酸序列。
圖173-288是D418-AH9(SEQ ID NO2161)，D418-AG10(SEQ IDNO2162)，D416-AA6(SEQ ID NO2163)，D414-AA2(SEQ ID NO2164)，和D269-AD5(SEQ ID NO2165)的核酸序列。
圖173-289是D268-AE1(SEQ ID NO2166)，D258-AF6(SEQ IDNO2167)，D256-AG9(SEQ ID NO2168)，D255-AH6(SEQ ID NO2169)，和D255-AE5(SEQ ID NO2170)的核酸序列。
圖173-290是D419-AE11(SEQ ID NO2171)，D142-AA10(SEQ ID NO2172)，D140-AH4(SEQ ID NO2173)，D66-AF7(SEQ ID NO2174)，和D66-AA7(SEQ ID NO2175)的核酸序列。
圖173-291是D65-AF9(SEQ ID NO2176)，D65-AB3(SEQ IDNO2177)，D65-AB2(SEQ ID NO2178)，D144A-AA12(SEQ ID NO2179)，和D64-7(SEQ ID NO2180)的核酸序列。
圖173-292是D109-BF9(SEQ ID NO2181)，D109-BG9(SEQ IDNO2182)，D118-AA11(SEQ ID NO2183)，D142-AB11(5′)(SEQ IDNO2184)，和D142-AE10(5′)(SEQ ID NO2185)的核酸序列。
圖173-293是D207-AH5(SEQ ID NO2186)，D231-AA1(5′)(SEQ IDNO2187)，D232-AD4(5′)(SEQ ID NO2188)，D232-AE6(5′)(SEQ IDNO2189)，和D288-AA3(SEQ ID NO2190)的核酸序列。
圖173-294是D289-AE6(SEQ ID NO2191)，D290-AC7(SEQ ID NO2192)，D58-AA2(SEQ ID NO2193)的核酸序列。
詳細描述常規(guī)上，許多步驟涉及任何新的，理想的植物生殖質(zhì)的開發(fā)。植物育種的開始要進行目前生殖質(zhì)的問題和缺點的分析和明確，建立計劃目標，并且明確具體的育種目標。下一個步驟是選擇具有符合計劃目標的要求的性狀的生殖質(zhì)。目標是將來自母體生殖質(zhì)的理想的性狀的改善的組合組合到單一種類中。理想的性狀包括，例如更高的種子產(chǎn)率，對于疾病和昆蟲的抗性，對干旱和熱的耐受性，和更好的農(nóng)學品質(zhì)。然而，導致銷售和分配的最終步驟的這些方法從進行第一次雜交的時間開始要花費6-12年的時間。因此，開發(fā)新品種是耗費時間的過程，其需要精確的遠期計劃，資源的有效使用，和定向上的最少變化。
通過遺傳轉(zhuǎn)化改善植物種類對于現(xiàn)代植物育種變得越來越重要。具有潛在商業(yè)利益的基因，諸如傳遞特定的，疾病抗性、昆蟲抗性或改善的品質(zhì)的理想的植物性狀的基因可以通過各種基因傳遞技術(shù)結(jié)合到作物物種中。操控基因表達的能力提供在轉(zhuǎn)化的植物中產(chǎn)生新特征的方式。在一些情形中，高或增加的水平的基因表達可以是理想的。例如，理想的是增加蛋白質(zhì)的制備，所述蛋白質(zhì)本身使疾病抗性、產(chǎn)率、氣味，或植物的任何其它商業(yè)理想的特性最大化。類似地，通過，例如基因沉默的內(nèi)源基因表達的調(diào)節(jié)可以導致更有價值的植物或植物產(chǎn)品的產(chǎn)生。
在煙草成熟或熟化的過程中，被鑒定為乙烯誘導或衰老相關(guān)的任何基因(例如具有SEQ ID NOS4，40，44，52，54，60，70，104，138，140，158，162，188，212，226，234，和288的序列的那些)的激活、上調(diào)或下調(diào)可以影響那些代謝途徑，所述代謝途徑涉及許多次級代謝物的形成，所述次級代謝物包括類萜、多酚、生物堿等，其影響最終產(chǎn)物品質(zhì)性狀(例如，疾病抗性、昆蟲抗性、改善的品質(zhì)、改變的香味，改變的氣味等)。受到本文所鑒定的基因的類似影響的可以是與在衰老過程中累積的干物質(zhì)的速率和類型或在衰老過程中在植物中的干物質(zhì)分配相關(guān)的代謝途徑。可以顯示的是在淀粉累積、木質(zhì)素形成、纖維素沉積和糖轉(zhuǎn)運的速率和類型中的變化。本文鑒定的基因的控制還可以影響那些代謝途徑，所述代謝途徑涉及衰老速率的確定，在葉子中衰老和在單一植物中的多片葉子中的衰老的一致性，和通過人工或天然方式對衰老的誘導。刺激或激活本文鑒定的基因的衰老誘導劑或活性包括例如化學品諸如弱過氧化物，殺蟲劑，除草劑，生長調(diào)節(jié)劑，熱處理，傷，或氣體諸如臭氧和升高濃度的二氧化碳。
鑒定煙草組成性表達的，或乙烯或衰老誘導的序列按照本發(fā)明，從轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體煙草屬品系的煙草屬組織中提取RNA。接著，將提取的RNA用于產(chǎn)生cDNA。接著，使用兩種策略來產(chǎn)生本發(fā)明的核酸序列。
在第一個策略中，從植物組織中提取富聚腺苷酸的RNA，并且通過反轉(zhuǎn)錄PCR來制備cDNA。接著，使用簡并引物加寡d(T)反向引物，將單鏈cDNA用于產(chǎn)生p450特異性PCR群。引物設計基于其它植物細胞色素p450基因序列的高度保守基序進行。特異性簡并引物的實例在US2004/0103449 A1和US 2004/0111759 A1和US 2004/0117869 A1專利申請出版物中的圖1中提出，將其并入本文作為參考。將來自包含適合大小的插入片段的質(zhì)粒的片段的序列進行進一步分析。根據(jù)所用的引物，這些大小的插入片段典型地在從約300到約800核苷酸。
在第二個策略中，開始構(gòu)建cDNA文庫。使用簡并引物加作為反向引物的在質(zhì)粒上的T7引物將質(zhì)粒中的cDNA用于產(chǎn)生p450特異性PCR群。如在第一個策略中，對來自包含適合大小的插入片段的質(zhì)粒的片段的序列進行進一步分析。
可以將已知產(chǎn)生高水平的去甲煙堿的煙草屬植物品系(轉(zhuǎn)化體)和具有低水平去甲煙堿的植物品系用作原材料。接著可以從植物中去除葉子，并且用乙烯進行處理以激活本文定義的p450酶活性。使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)來提取總的RNA。接著，可以使用以在圖161中所述的寡d(T)引物(SEQID NO2260)進行的PCR(RT-PCR)來產(chǎn)生cDNA片段。接著，可以如在本文實施例中所更充分的描述來構(gòu)建cDNA文庫。
將p450型酶的保守區(qū)用作簡并引物的模板，其實例顯示在圖161中。使用簡并引物，通過PCR來擴增p450特異性條帶。通過DNA測序來鑒定指示p450樣酶的帶。使用BLAST搜索，排比或其它工具來對PCR片段進行表征以鑒定適合的候選物。
將來自被鑒定的片段的序列信息用于開發(fā)PCR引物。將這些引物與cDNA文庫中的質(zhì)粒引物組合以用于克隆全長p450基因。進行大規(guī)模Southern反向分析來檢查獲得的所有的片段克隆和在某些情形中的全長克隆的差異表達。在本發(fā)明的該方面中，可以使用來自不同組織的標記的總cDNAs作為探針與克隆的DNA片段進行雜交來進行這些大規(guī)模的反向Southern測定從而篩選所有的克隆的插入片段。還將非放射性和放射性(P32)RNA印跡法用于表征克隆的p450片段和全長克隆。
一旦獲得了表達需要水平的p450酶的植物細胞，可以使用本領(lǐng)域眾所周知的方法和技術(shù)來從其中再生植物組織和完整的植物。接著，通過常規(guī)方式來繁殖再生的植物，并且可以通過常規(guī)植物育種技術(shù)將引入的基因傳遞到其它植株和栽培種中。
乙烯誘導的或衰老誘導的基因，例如在SEQ ID NOS4，40，44，52，54，60，70，104，138，140，158，162，188，212，226，234，和288中鑒定的那些，可以編碼作為煙草葉子質(zhì)量參數(shù)的重要決定因素的酶，所述煙草葉子質(zhì)量參數(shù)對于各種煙草產(chǎn)品是重要的。所述煙草產(chǎn)品包括濕或干鼻煙，嚼煙，卷煙，雪茄煙，小雪茄煙，pipe tobaccos，bidis和類似熏煙產(chǎn)品。所述葉子品質(zhì)參數(shù)可以包括視覺品質(zhì)諸如顏色、表面均一性、質(zhì)地、或彩斑；結(jié)構(gòu)或物理特征，例示為葉片-莖比率、油質(zhì)、卷煙填充潛能、松密度、保濕性和柔韌性；與氣味、香味、發(fā)酵能力、燃燒速率、燃燒溫度、人工香味吸收和釋放相關(guān)的化學或生化性狀；和煙組分，包括焦油或顆粒物質(zhì)，生物堿的產(chǎn)生，和其它類似屬性。由這些乙烯誘導或衰老相關(guān)的基因?qū)е碌拿复俜磻€可以產(chǎn)生影響病原體或昆蟲相互作用的次級代謝物，其影響煙草葉子產(chǎn)率和質(zhì)量。例如Wagner，et al.(Nature Biotechnology，19371-374，2001)顯示p450羥化酶基因的抑制大大增加cembratiene-ol，一種影響蚜蟲抗性的次級代謝物的累積。
抗體的產(chǎn)生通過衍生它們的氨基酸序列和選擇具備抗原性且相對于其它克隆是獨特的肽區(qū)域來制備肽特異性抗體。制備兔抗體以合成與載體蛋白綴合的肽。使用這些抗體，在植物組織上進行蛋白質(zhì)印跡分析或其它免疫方法。此外，通過衍生它們的氨基酸序列和選擇具有潛在抗原性并且相對于其它克隆是獨特的肽區(qū)域來制備針對數(shù)種全長克隆的肽特異性抗體。制備兔抗體以合成與載體蛋白綴合的肽。使用這些抗體，進行蛋白質(zhì)印跡分析。
基因表達的下調(diào)和改變酶活性按照標準基因沉默方法來產(chǎn)生具有減少的多肽的表達的植物。(至于綜述，見Arndt和Rank，Genome 40785-797，1997；Turner和Schuch，Journal of Chemical Technology and Biotechnology 75869-882，2000；和Klink和Wolniak，Journal of Plant Growth Regulation 19(4)371-384，2000.)具體而言，可以將煙草煙堿脫甲基酶核酸序列(例如，SEQ ID NOS4，5，7，8，和9或其片段諸如SEQ ID NOS1和62的序列)，以及基本相同的核酸序列(例如，SEQ ID NO188的序列)用于改變煙草表型或煙草代謝物，例如在任何煙草種類中的去甲煙堿。煙草煙堿脫甲基酶基因的減少的表達可以使用，例如下述途徑來實現(xiàn)RNA干擾(RNAi)(Smith et al.，Nature407319-320，2000；Fire et al.，Nature 391306-311，1998；Waterhouse et al.，PNAS 9513959-13964，1998；Stalberg et al.，Plant Molecular Biology 23671-683，1993；Brignetti et al.，EMBO J.176739-6746，1998；Allen et al.，NatureBiotechnology 221559-1566，2004)；病毒誘導的基因沉默(″VIGS″)(Baulcombe，Current Opinions in Plant Biology，2109-113，1999；Cogoni和Macino，Genes Dev 10638-643，2000；Ngelbrecht et al.，PNAS9110502-10506，1994)；通過在有義方向傳遞植物內(nèi)源基因來使目標基因沉默(Jorgensen et al.，Plant Mol Biol 31957-973，1996)；反義基因的表達；同源重組(Ohl et al.，Homologous Recombination and Gene Silencing inPlants Kluwer，Dordrecht，The Netherlands，1994)；Cre/lox系統(tǒng)(Qin et al.，PNAS 911706-1710，1994；Koshinsky et al.，The Plant Journal 23715-722，2000；Chou，et al.，Plant and Animal GenomeVII Conference Abstracts.SanDiego，CA，17-21 1999年1月)；基因捕獲和T-DNA標記(Burns et al.，GenesDev.81087-1105，1994；Spradling，et al.，PNAS 9210824-10830，1995；Skarnes et al.，Bio/Technology 8，827-831，1990；Sundaresan，et al.，Genes Dev.91797-1810，1995)；和任何其它可能的基因沉默系統(tǒng)進行，所述基因沉默系統(tǒng)可在沉默區(qū)獲得，其導致煙草多肽的表達的下調(diào)或在其酶活性中的減少。如本文進一步提供，使用本文所述的技術(shù)和在本領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)的其它技術(shù)可以將本文提供的任何核酸序列進行下調(diào)或上調(diào)。在下面更詳細地描述示例性方法。
RNA干擾RNA干擾(″RNAi″)是通常在許多生物包括植物中用于誘導有效的和特異性的翻譯后基因沉默的可應用的方法(見，例如，Bosher et al.，Nat.CellBiol.2E31-36，2000；和Tavernarakis et al.，Nat.Genetics 24180-183，2000)。RNAi包括將具有部分或全長雙鏈特征的RNA引入細胞或引入細胞外環(huán)境中。抑制是特異性的，因為選擇來自目標基因(例如煙草煙堿脫甲基酶)的部分的核苷酸序列來產(chǎn)生抑制RNA。選擇的部分通常包括目標基因的外顯子，但是選擇的部分還可以包括非翻譯序列(UTRs)，以及內(nèi)含子(例如SEQ ID NO7的序列，或來自理想的植物基因的核酸序列，諸如在圖1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19，和173-1到173-294中顯示的任何核酸序列)。
例如，為了構(gòu)建產(chǎn)生能夠形成雙鏈體的RNAs的轉(zhuǎn)化載體，可以將一個在有義方向，另一個在反義方向的兩個核酸序列，可操縱地進行連接，并且將其置于強病毒啟動子的控制下，所述強病毒啟動子諸如CaMV 35S，或從木薯棕色條紋病毒(CBSV)中分離的啟動子。然而，使用內(nèi)源啟動子，諸如具有SEQ ID NO8的序列的煙堿脫甲基酶啟動子，或驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的其片段也可以是理想的。包括在這種構(gòu)建體中的煙草煙堿脫甲基酶核酸序列的長度理想地是至少25個核苷酸，但是可以包括這樣的序列，其包括直到全長的煙草煙堿脫甲基酶基因。
可以通過土壤桿菌介導的轉(zhuǎn)化(Chuang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 974985-4990，2000)將產(chǎn)生能夠形成雙鏈體的RNAs的構(gòu)建體引入植物諸如煙草植物的基因組，導致煙草煙堿脫甲基酶中的特異性和可遺傳的遺傳干擾。還可以將雙鏈RNA直接引入細胞(即，細胞內(nèi)地)或細胞外地引入，例如通過將種子、幼苗或植物浸浴在包含雙鏈RNA的溶液中來進行。
根據(jù)遞送的雙鏈RNA物質(zhì)的劑量，所述RNAi可以提供目標基因的功能的部分或完全的損失。可以在至少99％的目標細胞中獲得基因表達的減少或損失。通常，被注射物質(zhì)的更低的劑量和在施用dsRNA后的更長時間導致更少部分的細胞的抑制。
在RNAi中所用的RNA可以包括聚合的核糖核苷酸的一條或多條鏈；其可以包括對磷酸—糖主鏈或核苷的改變。雙鏈結(jié)構(gòu)可以通過單一自我互補的RNA鏈或通過兩條互補的RNA鏈來形成并且RNA雙鏈體形成可以在細胞的內(nèi)部或外部開始?？梢砸匀菰S每個細胞遞送至少一個拷貝的量來引入RNA。然而，更高的劑量(例如，每個細胞至少5，10，100，500或1000個拷貝)的雙鏈物質(zhì)可以產(chǎn)生更有效的抑制。抑制是序列特異性的，因為遺傳抑制針對對應于RNA的雙鏈體區(qū)的核苷酸序列。對于抑制，優(yōu)選包含與目標基因的部分相同的核苷酸序列的RNA。相對于目標序列具有插入、缺失和單點突變的RNA序列對于抑制也可以是有效的。因此，可以通過本領(lǐng)域已知的排比算法和在核苷酸序列之間計算百分比差異來優(yōu)化序列同一性。備選地，可以將RNA的雙鏈體區(qū)在功能上定義為能夠與目標基因轉(zhuǎn)錄物的部分雜交的核苷酸序列。
此外，用于RNAi的RNA可以在體內(nèi)或體外進行合成。例如，在細胞中的內(nèi)源RNA聚合酶可以介導體內(nèi)轉(zhuǎn)錄，或可以將克隆的RNA聚合酶用于體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄。對于從體內(nèi)的轉(zhuǎn)基因或表達的構(gòu)建體中進行轉(zhuǎn)錄，可以將調(diào)節(jié)區(qū)用于轉(zhuǎn)錄RNA一條鏈(或多條鏈)。
三鏈干擾內(nèi)源煙草煙堿脫甲基酶基因表達或來自需要的植物基因的核酸片段，諸如在圖1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19，和173-1到173-294中顯示的任何核酸序列的表達還可以通過靶向互補于煙草基因的調(diào)節(jié)區(qū)(例如，啟動子或增強子區(qū))的脫氧核糖核苷酸序列以形成三股螺旋結(jié)構(gòu)來進行下調(diào)，所述三股螺旋結(jié)構(gòu)阻止靶細胞中的目標基因的轉(zhuǎn)錄(通常見，Helene，Anticancer Drug Des.6569-584，1991；Helene et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.66027-36，1992；和Maher，Bioassays 14807-815，1992)。
對于轉(zhuǎn)錄的抑制，在三股螺旋形成中所用的核酸分子優(yōu)選地是單鏈的并且由脫氧核糖核苷酸組成。這些寡核苷酸的堿基組成應該以Hoogsteen堿基配對法則來促進三股螺旋形成，其通常需要相當大的嘌呤或嘧啶的一段序列存在于雙鏈體的一條鏈上。核苷酸序列可以是基于嘧啶的，其將導致穿過得到的三股螺旋的三條相關(guān)鏈的TAT和CGC三聯(lián)體。富含嘧啶的分子以與該鏈平行的方向提供對于所述雙鏈體的單鏈的富含嘌呤區(qū)的堿基互補性。此外，可以選擇富含嘌呤的核酸分子，例如包含G殘基的一段序列。這些分子將與富含GC對的DNA雙鏈體形成三股螺旋，其中大部分的嘌呤殘基位于目標雙鏈體的單鏈上，導致穿過在三股螺旋中的三條鏈的CGC三聯(lián)體。
或者，對于三股螺旋形成可以被靶向的可能序列可以通過產(chǎn)生“轉(zhuǎn)向”核酸分子得以增加。轉(zhuǎn)向分子以交替的5′-3′，3′-5′方式進行合成，從而使得它們與雙鏈體的第一條鏈堿基配對，接著與另一條鏈堿基配對，消除了存在于雙鏈體的一條鏈上的嘌呤或嘧啶的相當大的一段序列的必要性。
核糖核酸酶核糖核酸酶是這樣的RNA分子，其充當酶起作用并且可以被改造以裂解其它的RNA分子?？梢詫颂呛怂崦高M行設計以特異性地與實際上任何目標RNA配對并且裂解在特定位點的磷酸二酯骨架，由此在功能上使目標RNA失活。在此過程中，核糖核酸酶本身沒有消耗，并且可以在催化上起作用來裂解多拷貝的mRNA目標分子。因此，還可以將核糖核酸酶用作下調(diào)煙草煙堿脫甲基酶的表達的工具。目標RNA-特異性核糖核酸酶的設計和使用描述在Haseloff et al.(Nature 334585-591，1988)中。優(yōu)選地，核糖核酸酶在核糖核酸酶的活性位點的每一側(cè)上包括互補于目標序列(例如，煙草煙堿脫甲基酶或來自需要的植物基因的核酸片段，諸如在圖1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19，和173-1到173-294中顯示的任何核酸序列)的至少約20個連續(xù)的核苷酸。
此外，核糖核酸酶序列還可以被包括在反義RNA中以賦予在反義RNA上的RNA-裂解活性并且因此增加反義構(gòu)建體的有效性。
同源重組基因替代技術(shù)是下調(diào)給定基因的表達的另一種理想的方法?；蛱娲夹g(shù)基于同源重組(見，Schnable et al.，Curr.Opinions Plant Biol.1123-129，1998)?？梢酝ㄟ^誘變(例如，插入、缺失、復制或替代)來操縱目標酶諸如煙草煙堿脫甲基酶的核酸序列或由在圖1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19，和173-1到173-294中顯示的任何核酸序列編碼的多肽以減少酶的功能。接著，可以將改變的序列引入基因組中通過同源重組以替代現(xiàn)存的，例如野生型的基因(Puchta et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA935055-5060，1996；和Kempin et al.，Nature 389802-803，1997)?；蛘?，可以用不具有脫甲基酶活性的基因，例如SEQ ID NO188的序列來取代內(nèi)源煙草煙堿脫甲基酶基因。
共抑制使基因表達沉默的另一種理想的方法是共抑制(也稱為有義抑制)。該技術(shù)已經(jīng)顯示對目標基因的轉(zhuǎn)錄的有效地封閉(見，例如，Napoli et al.，PlantCell，2279-289，1990和Jorgensen et al.，美國專利號5,034,323)，所述技術(shù)以有義方向構(gòu)造引入核酸，例如來自需要的植物基因的核酸片段，諸如在圖1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19，和173-1到173-294中顯示的任何核酸序列。
一般而言，有義抑制包括被引入序列的轉(zhuǎn)錄。然而，共抑制還可以發(fā)生在被引入的序列本身不包含編碼序列的時候，但是僅有內(nèi)含子或非翻譯序列或基本上與存在于內(nèi)源基因的初級轉(zhuǎn)錄物中的序列相同的其它這樣的序列將被抑制。被引入的序列通?；旧吓c被靶向抑制的內(nèi)源基因相同。這樣的同一性典型地大于約50％，但是優(yōu)選更高的同一性(例如，80％或甚至95％)，因為它們導致更有效的抑制。共抑制的效果還可以被應用于在顯示同源性或基本的同源性的基因的類似家族中的其它蛋白質(zhì)?？梢詫碜砸环N植物的基因的片段用于直接，例如，抑制在不同植物種類中的同源基因的表達。
在有義抑制中，要求更少絕對同一性的被引入序列，相對于初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或充分加工的mRNA，不需要是全長的。在短于全長的序列中的更高程度的序列同一性彌補更少同一性的更長序列。此外，被引入的序列不需要具有相同的內(nèi)含子或外顯子模式，并且非編碼片段的同一性可以是一樣有效的。優(yōu)選至少50個堿基對的序列，其中更優(yōu)選更長長度的被引入序列(見，例如，描述在Jorgensen et al.，美國專利號5,034,323中的方法)。反義抑制在反義技術(shù)中，克隆來自需要的植物的基因的核酸片段，諸如圖1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19，和173-1到173-294中顯示的任何核酸序列，并且將其與表達控制區(qū)可操縱地連接從而合成RNA的反義鏈。接著，將構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到植物中并且產(chǎn)生RNA的反義鏈。在植物細胞中，已經(jīng)顯示反義RNA抑制基因表達。
被引入反義抑制的核酸片段通?；旧吓c被抑制的內(nèi)源一個或多個基因的至少一部分相同，但是不需要是相同的。本文公開的煙草煙堿脫甲基酶的核酸序列可以被包括在設計的載體中從而使抑制作用應用于顯示與目標基因同源或基本同源的基因的家族中的其它蛋白質(zhì)?？梢詫碜砸环N植物的基因的片段直接用于，例如抑制在不同煙草種類中的同源基因的表達。
相對于初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或充分加工的mRNA，被引入的序列也不需要是全長的。一般而言，可以將更高的同源性用于彌補更短序列的使用。而且，被引入的序列不需要具有相同的內(nèi)含子或外顯子模式，并且非編碼片段的同源性將是一樣的有效。通常，這樣的反義序列在長度上將通常是至少15個堿基對，優(yōu)選地是約15-200個堿基對，并且更優(yōu)選地是200-2,000個堿基對或更長。反義序列可以互補于待抑制基因的全部或部分，并且如本領(lǐng)域技術(shù)那些技術(shù)人員所理解，根據(jù)需要抑制的程度和反義序列的獨特性，反義序列結(jié)合的特定一個或多個位點以及反義序列的長度將會變化。表達植物負調(diào)節(jié)物反義核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄構(gòu)建體在轉(zhuǎn)錄的方向上包括，啟動子，編碼有義鏈上的反義RNA的序列，和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)?？梢詷?gòu)建反義序列并且將其如例如在van der Krol et al.(Gene 7245-50，1988)；Rodermel etal.(Cell 55673-681，1988)；Mol et al.(FEBS Lett.268427-430，1990)；Weigel和Nilsson(Nature 377495-500，1995)；Cheung et al.，(Cell82383-393，1995)；和Shewmaker et al.(美國專利號5,107,065)中所述進行表達。
顯性負調(diào)控可以在人工環(huán)境或在田間來測定轉(zhuǎn)基因植物，從而證實所述轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因植物中賦予下調(diào)煙草基因產(chǎn)物，所述轉(zhuǎn)基因植物表達編碼煙草基因產(chǎn)物的顯性負調(diào)控基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因。按照本領(lǐng)域已知的方法來構(gòu)建顯性負調(diào)控轉(zhuǎn)基因。典型地，顯性負調(diào)控基因編碼煙草基因產(chǎn)物的突變的負調(diào)節(jié)物多肽，其當過量表達時，干擾野生型酶的活性。
突變體還可以使用標準的誘變的方法來產(chǎn)生具有減少的煙草基因產(chǎn)物的表達或酶活性的植物。這些誘變的方法包括，但不限于，用甲基硫酸乙酯處理種子(Hildering和Verkerk，In，The use of induced mutations in plantbreeding.Pergamon press，pp 317-320，1965)或UV-輻射，X-射線，和快中子輻射(見，例如，Verkerk，Neth.J.Agric.Sci.19197-203，1971；和Poehlman，Breeding Field Crops，Van Nostrand Reinhold，New York(3.sup.rd ed)，1987)，使用轉(zhuǎn)座子(Fedoroff et al.，1984；美國專利號4,732,856和美國專利號5,013,658)，以及T-DNA插入方法(Hoekema et al.，1983；美國專利號5,149,645)?？梢源嬖谟跓煵莼蛑械耐蛔兊念愋?，包括，例如點突變、缺失、插入、復制和倒位。這些突變理想地存在于煙草基因的編碼區(qū)中；然而，在煙草基因的啟動子區(qū)，和內(nèi)含子，或非翻譯區(qū)中的突變也可以是理想的。
例如，可以將T-DNA插入誘變用于在煙草基因中產(chǎn)生插入突變以下調(diào)所述基因的表達。在理論上，對于在任何給定基因中獲得插入片段的95％的可能性，需要約100,000個獨立的T-DNA插入片段(McKinnet，PlantJ.8613-622，1995；和Forsthoefel et al.，Aust.J.Plant Physiol.19353-366，1992)?？梢允褂镁酆厦告準椒磻?PCR)分析來篩選植物的T-DNA標記的品系。例如，可以設計用于T-DNA的一端的引物，并且可以設計用于目標基因的另一種引物，兩種引物都可以用在PCR分析中。如果沒有獲得PCR產(chǎn)物，那么在目標基因中沒有插入片段。相反，如果獲得PCR產(chǎn)物，那些在目標基因中有插入片段。
可以按照標準方法(例如，在本文中所述的那些)來評估突變的煙草基因產(chǎn)物的表達，并且任選地可以與未突變酶的表達進行比較。當與未突變植物進行比較時，具有減少的基因的表達的突變植物是本發(fā)明的理想實施方案，所述基因編碼煙草基因產(chǎn)物?？梢詫⑦@樣的植物用在本文所述的育種程序中，所述植物具有在本文所述的任何核酸序列中的突變。
組成性，或乙烯或衰老誘導的序列的過量表達可以將本發(fā)明的核酸序列(例如，在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列，或其片段)用于在煙草屬品系或制備自該品系的植物的煙草產(chǎn)品中增加理想的性狀。具體而言，可以將本發(fā)明的核酸序列的過量表達，和/或它們的翻譯產(chǎn)物用于增加來自次級代謝物的理想的氣味和香味的產(chǎn)物的生物合成。此外，可以將編碼煙草多肽的核酸序列的過量表達用于在煙草屬品系中增加多肽的表達。
可以通過本發(fā)明的核酸序列的過量表達被賦予煙草屬品系的另外的理想性狀包括對細菌性萎蔫病、南方細菌萎蔫病、鐮刀菌萎蔫癥、馬鈴薯病毒Y、煙草花葉病毒、煙草蝕斑病毒、煙草葉脈斑紋病毒、苜?；ㄈ~病毒、野火病、根癌線蟲、南方根癌線蟲、胞囊線蟲、黑色根腐病、青霉病、0種黑脛病真菌，和1種黑脛病真菌的抗性?？梢酝ㄟ^過量表達本發(fā)明的核酸序列在煙草屬植物中增加的其它理想性狀包括增加的產(chǎn)率和/或等級、更好的可保存性、可收獲性、保持能力、葉子品質(zhì)，或熟化質(zhì)量，增加或減少的高度，改變的成熟時間(例如早期成熟，早期到中期成熟，中期成熟，中期到晚期成熟，或晚期成熟)，增加或減少的莖長度，和每株植物的葉子數(shù)量的增加或減少。
植物啟動子理想的啟動子是花椰菜花葉病毒啟動子，例如花椰菜花葉病毒(CaMV)啟動子或木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)啟動子。這些啟動子在大多數(shù)植物組織中賦予高水平的表達，并且這些啟動子的活性不依賴于病毒編碼的蛋白質(zhì)。CaMV是35S和19S啟動子兩者的來源。使用這些啟動子的植物表達構(gòu)建體的實例是本領(lǐng)域已知的。在轉(zhuǎn)基因植物的大多數(shù)組織中，所述CaMV 35S啟動子是強啟動子。所述CaMV啟動子在單子葉植物中也是具有高度活性的。而且，該啟動子的活性可以通過CaMV 35S啟動子的復制進一步增加(即，在2-10倍之間)。
其它有用的植物啟動子包括，但不限于，胭脂氨酸合成酶(NOS)啟動子，章魚堿合酶啟動子，玄參(figwort)花葉病毒(FMV)啟動子，水稻肌動蛋白啟動子，和遍在蛋白啟動子系統(tǒng)。
示例性的單子葉植物啟動子包括，但不限于，鴨跖草黃斑駁病毒(commelina yellow mottle virus)啟動子，甘蔗badna病毒啟動子，水稻tungro桿狀病毒啟動子，玉米條紋病毒元件，和小麥矮縮病毒啟動子。
對于某些應用而言，可能理想的是以適合的水平，或在適合的發(fā)育時間，在適合的組織中產(chǎn)生煙草基因產(chǎn)物，諸如顯性負調(diào)控突變的基因產(chǎn)物。對此目的，存在各類基因啟動子，每種具有體現(xiàn)在其調(diào)節(jié)序列中的本身的獨特的特性，響應于可誘導的信號諸如環(huán)境、激素和/或發(fā)育信息(developmental cue)時顯示被調(diào)節(jié)。這些包括，但不限于，負責熱調(diào)節(jié)的基因表達，光調(diào)節(jié)的基因表達的基因啟動子(例如，豌豆rbcS-3A；玉米rbcS啟動子；發(fā)現(xiàn)于豌豆中的葉綠素a/b結(jié)合蛋白質(zhì)基因；或Arabssu啟動子)，激素調(diào)節(jié)的基因表達(例如，來自小麥Em基因的脫落酸(ABA)反應序列；可ABA誘導的HVA1和HVA22，和大麥和擬南芥(Arabidopsis)的rd29A啟動子；和創(chuàng)傷誘導的基因表達(例如，wunI的)，器官特異性基因表達(例如，塊莖特異性的貯存蛋白質(zhì)基因；來自所述的玉米的23-kDa玉米蛋白基因；或法國菜豆β-菜豆蛋白基因的)，或可病原體誘導的啟動子(例如，PR-1，prp-1，或β-1，3-葡聚糖酶啟動子，小麥的可真菌誘導的wirla啟動子，和可線蟲誘導的啟動子，分別為煙草和芹菜的TobRB7-5A和Hmg-1))。
植物表達載體典型地，植物表達載體包括(1)在5′和3′調(diào)節(jié)序列的轉(zhuǎn)錄控制下克隆的植物基因和(2)顯性可選擇的標記。如果需要，這樣的植物表達載體還可以包含，啟動子調(diào)節(jié)區(qū)(例如賦予可誘導的或組成性的，病原體或創(chuàng)傷誘導的，環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)的，或細胞或組織特異性的表達的啟動子調(diào)節(jié)區(qū))，轉(zhuǎn)錄開始起始位點，核糖體結(jié)合位點，RNA加工信號，轉(zhuǎn)錄終止位點和/或多腺苷酸化信號。
植物表達載體還可以任選地包含RNA加工信號，例如內(nèi)含子，其已經(jīng)顯示對于有效的RNA合成和累積是重要的。RNA剪接序列的定位可以大大影響植物中轉(zhuǎn)基因表達的水平。鑒于該事實，內(nèi)含子可以位于轉(zhuǎn)基因中的煙草煙堿脫甲基酶編碼序列的上游或下游以改變基因表達的水平。
除了上述5′調(diào)節(jié)控制序列之外，表達載體還可以包含調(diào)節(jié)控制區(qū)，其通常存在于植物基因的3′區(qū)中。例如，3′終止子區(qū)可以被包含在表達載體中以增加mRNA的穩(wěn)定性。一個這樣的終止子區(qū)可以來自馬鈴薯的PI-II終止子區(qū)。此外，其它常用的終止子來自章魚氨酸或胭脂氨酸合成酶信號。
植物表達載體還典型地包含顯性可選擇的標記基因，所述標記基因用于鑒定已經(jīng)被轉(zhuǎn)化的那些細胞。用于植物系統(tǒng)的有用的可選擇的基因包括轉(zhuǎn)座子Tn5(Aph II)的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，編碼抗生素的抗性基因，例如編碼對于潮霉素、卡那霉素、博來霉素、新霉素G418、鏈霉素或大觀霉素的抗性的那些。光合作用所需的基因還可以用作光合作用缺陷型品系的可選擇的標記。最后，編碼除草劑抗性的基因可以用作可選擇的標記；有用的除草劑抗性基因包括編碼酶膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶且賦予對廣譜除草劑Basta(Bayer Cropscience Deutschland GmbH，Langenfeld，德國)的抗性的bar基因。其它的可選擇的標記包括提供對于其它這樣的除草劑諸如草甘膦等，和咪唑啉酮，磺酰脲，三唑并嘧啶除草劑，諸如chlorosulfron，bromoxynil，dalapon等的抗性的基因。此外，編碼二氫葉酸還原酶的基因可以與分子諸如methatrexate組合使用。
通過確定植物細胞對特定可選擇試劑的敏感性和確定有效殺死大多數(shù)，如果不是全部的，被轉(zhuǎn)化細胞的該試劑的濃度來促進可選擇標記的有效使用。用于煙草轉(zhuǎn)化的一些有用的抗生素濃度包括，例如20-100μg/ml(卡那霉素)，20-50μg/ml(潮霉素)，或5-10μg/ml(博來霉素)。用于選擇除草劑抗性的轉(zhuǎn)化體的有用策略由，例如Vasil描述(Cell Culture andSomatic Cell Genetics of Plants，Vol I，II，III Laboratory Procedures and TheirApplications Academic Press，New York，1984)。
除了可選擇的標記之外，可能理想的是使用報道基因。在某些情形中，可以使用報道基因，而不用可選擇的標記。報道基因是這樣的基因，其典型地在受體生物或組織中不存在或不表達。報道基因典型地編碼提供一些表型變化或酶性質(zhì)的蛋白質(zhì)。這些基因的實例在Weising等(Ann.Rev.Genetics 22421，1988)中進行提供，將其并入本文作為參考。優(yōu)選的報道基因包括，但不限于，葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因和GFP基因。
在構(gòu)建植物表達載體后，可以使用一些標準的方法將載體引入植物宿主中，由此產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。這些方法包括(1)土壤桿菌介導的轉(zhuǎn)化(A.tumefaciens或A.rhizogenes)(見，例如，Lichtenstein和Fuller InGeneticEngineering，vol 6，PWJ Rigby，ed，London，Academic Press，1987；和Lichtenstein，C.P.，和Draper，J，.InDNA Cloning，Vol II，D.M.Glover，ed，Oxford，IRI Press，1985；美國專利號4,693,976，4,762,785，4,940,838，5,004,863，5,104,310，5,149,645，5,159,135，5,177,010，5,231,019，5,463,174，5,469,976，和5,464,763；和歐洲專利號0131624，0159418，0120516，0176112，0116718，0290799，0292435，0320500，和0627752和歐洲專利申請?zhí)?267159和0604622)，(2)顆粒遞送系統(tǒng)(見，例如美國專利號4,945,050和5,141,131)，(3)微注射方法，(4)聚乙二醇(PEG)方法，(5)脂質(zhì)體介導的DNA吸收，(6)電穿孔方法(見，例如WO87/06614，和美國專利號5,384,253，5,472,869，5,641,664，5,679,558，5,712,135，6,002,070，和6,074,877(7)渦旋方法，或(8)所謂的whiskers方法(見，例如，Coffee etal.，美國專利號5,302,523和5,464,765)?？梢杂帽磉_載體轉(zhuǎn)化的植物組織的類型包括胚胎組織，I型和II型胼胝體組織，下胚軸，分生組織等。
一旦被引入植物組織中，結(jié)構(gòu)基因的表達可以通過任何本領(lǐng)域已知方式進行測定，并且表達可以測量為轉(zhuǎn)錄的mRNA，合成的蛋白質(zhì)，或基因沉默的量，其通過對煙草中的次級生物堿進行化學分析的代謝物監(jiān)測進行測定(如本文所述；還見美國專利號5,583,021，將其并入本文作為參考)。已知用于植物組織的體外培養(yǎng)的技術(shù)，并且在許多情形中，已知用于再生為完整植物的技術(shù)(見，例如美國專利號5,595,733和5,766,900)。將引入的表達復合體傳遞到商用栽培品種中的方法是本領(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的。
一旦獲得了表達需要水平的理想基因產(chǎn)物的植物細胞，可以使用本領(lǐng)域眾所周知的方法和技術(shù)從其中再生植物組織和完整植物。接著，通過常規(guī)方式來繁殖再生的植物并且通過常規(guī)植物育種技術(shù)可以將被引入的基因遞送到其它品系和栽培品種中。
轉(zhuǎn)基因煙草植物可以以不同的方向結(jié)合基因組基因的任何部分的核酸，所述方向例如反義方向用于下調(diào)，或例如有義方向用于過量表達。對于在煙草屬品系中增加基因產(chǎn)物的表達，編碼全長煙草基因的氨基酸序列的完整或功能部分的核酸序列的過量表達是理想的。
煙草基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯水平的確定基因的表達可以例如，使用煙草基因或基因片段作為雜交探針，通過標準RNA印跡分析來進行測量(Ausubel et al.，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY，(2001)，和Sambrooket al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，N.Y.，(1989))。RNA表達水平的確定還可以通過反轉(zhuǎn)錄PCR(rtPCR)來輔助，所述反轉(zhuǎn)錄PCR(rtPCR)包括定量rtPCR(見，例如Kawasaki et al.，in PCR TechnologyPrinciples and Applications of DNAAmplification(H.A.Erlich，Ed.)Stockton Press(1989)；Wang et al.in PCRProtocolsA Guide to Methods and Applications(M.A.Innis，et al.，Eds.)Academic Press(1990)；和Freeman et al.，Biotechniques 26112-122和124-125，1999)。用于確定煙草酶基因的表達的另外的眾所周知的技術(shù)包括原位雜交，和熒光原位雜交(見，例如，Ausubel et al.，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY，(2001))。上述標準技術(shù)還用于比較植物之間，例如在煙草基因中具有突變的植物和對照植物之間來比較表達水平。
如果需要，煙草基因的表達(例如，在圖1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19，和173-1到173-294中顯示的核酸序列，或其片段)可以在蛋白質(zhì)產(chǎn)生的水平上，使用相同的通用方法和標準蛋白質(zhì)分析技術(shù)包括Bradford測定、分光光度測定和免疫檢測技術(shù)，諸如用特異于需要的多肽的抗體進行的蛋白質(zhì)印跡或免疫沉淀來測量(Ausubel et al.，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY，(2001)，和Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，N.Y.，(1989))。
可以使用本領(lǐng)域的標準方法來對本文所述的任何多肽的活性進行測定。例如，p450的活性典型地使用基于熒光的測定法來進行測定(見，例如，Donato et al.Drug Metab Dispos.32699-706，2004)。具體而言，煙堿脫甲基酶的活性可以如本文所述使用酵母微粒體測定法進行測定。
煙草基因產(chǎn)物調(diào)節(jié)劑的鑒定cDNA的分離還有利于增加或減少所述基因產(chǎn)物的表達的分子的鑒定。按照一種方法，將候選分子以不同的濃度加入表達煙草mRNA的細胞(例如，原核生物細胞諸如大腸桿菌或真核生物細胞諸如酵母、哺乳動物、昆蟲或植物細胞)的培養(yǎng)基中。接著，使用標準方法諸如在本文中提到的那些，在存在和缺乏候選分子的情況下測量基因產(chǎn)物的表達。
候選的調(diào)節(jié)劑可以是純化(或基本純)的分子或可以是化合物的混合物的一種成分。在混合的化合物測定中，針對越來越小的候選化合物庫的子集(例如，通過標準純化技術(shù)，例如HPLC)來測試基因產(chǎn)物的表達直到證實單一化合物或最少化合物混合物改變煙草煙堿脫甲基酶基因的表達。在本發(fā)明的一個實施方案中，認為促進減少基因產(chǎn)物的表達的分子是特別理想的?？梢宰C實發(fā)現(xiàn)在基因產(chǎn)物的表達或活性水平上有效的調(diào)節(jié)劑在植物中是有用的。
對于農(nóng)業(yè)應用，使用本文公開的方法鑒定的分子、化合物或試劑可以用作化學品，所述化學品被用作在植物的葉子上的噴霧劑或粉劑。所述分子、化合物或試劑還可以與另一種分子組合應用于植物，所述另一種分子對植物提供某種益處。
應用通過，例如基因沉默來調(diào)節(jié)對應于本文所述的任何序列的內(nèi)源基因可以導致更有價值的植物或植物產(chǎn)物。具體而言，可以將本文的被鑒定為乙烯誘導或衰老相關(guān)的序列(例如，具有SEQ ID NOS4，40，44，52，54，60，70，104，138，140，158，162，188，212，226，234，和288的序列或在圖1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19和173-1到173-294中顯示的核酸序列，或其片段的那些)用于影響代謝途徑，所述代謝途徑涉及許多次級代謝物的形成，所述次級代謝物包括影響最終產(chǎn)物質(zhì)量性狀的類萜、多酚、生物堿等。類似地，可以將本文鑒定的基因用于調(diào)節(jié)與在衰老過程中累積的干物質(zhì)的速率和類型或在衰老過程中在植物中干物質(zhì)的分配相關(guān)的代謝途徑。調(diào)節(jié)本文鑒定的基因還可以用于影響這樣的代謝途徑，所述代謝途徑涉及衰老速率的確定，在葉子和在單一植物的多片葉子中的衰老的一致性，和由刺激或激活本文鑒定的基因的試劑或活性劑對衰老的誘導，并且由此控制包括葉子或其它植物組分的產(chǎn)物或產(chǎn)品的質(zhì)量。
可以將本文所述的基因的啟動子區(qū)用于驅(qū)動任何理想的基因產(chǎn)物的表達從而改善作物質(zhì)量或提高具體的性狀?？烧T導的并且在植物生活周期的特定階段表達的啟動子可以用在構(gòu)建體中以被引入植物來表達涉及氣味和芳香產(chǎn)物的生物合成的獨特基因，所述氣味和芳香產(chǎn)物得自次級代謝物。煙草基因啟動子還可以用于增加或改變影響最終使用特性的結(jié)構(gòu)糖或蛋白質(zhì)的表達。此外，煙草基因啟動子可以組合以異源基因，所述異源基因包括涉及營養(yǎng)產(chǎn)物、藥劑或工業(yè)原料的生物合成的基因。還可以將啟動子序列的調(diào)節(jié)用于下調(diào)內(nèi)源煙草基因，包括涉及生物堿生物合成和/或其它途徑的基因。理想地，煙草基因啟動子區(qū)或其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)用于改變化學品的性質(zhì)諸如植物中去甲煙堿的含量和亞硝胺的水平。此外，使用本領(lǐng)域的標準方法可以容易地在啟動子序列中鑒定的啟動子基序可以用于鑒定與煙草基因產(chǎn)物，例如p450的表達相關(guān)或調(diào)節(jié)其的因子。
而且，使用本文所述的標準技術(shù)，可以將本發(fā)明的任何序列(例如在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列或其片段)用在減少基因表達或改變基因產(chǎn)物，諸如p450的酶活性的方法中。這些技術(shù)包括，但不限于，RNA干擾、三鏈干擾、核糖核酸酶、同源重組、病毒誘導的基因沉默，反義和共抑制技術(shù)，顯性失活基因產(chǎn)物的表達，和使用標準誘變技術(shù)產(chǎn)生突變的基因。例如，減少p450的表達或改變p450的酶活性可以用于改變涉及植物-病原體相互作用和疾病抗性的脂肪酸或可以用于改變植物的選定脂肪酸的模式并且由此改變植物或植物組分的氣味或香味。
此外，使用標準方法，可以將煙草基因的任何部分，包括啟動子、編碼序列、內(nèi)含子或3′UTR或其片段用作遺傳標記來分離相關(guān)基因，啟動子或調(diào)節(jié)區(qū)從而在其它煙草或煙草屬物種中篩選相關(guān)基因，或確定植物是否在相應的內(nèi)源基因中具有突變。煙草基因的部分還可以用于通過追蹤特定基因的內(nèi)部移位(intergression)或損失的育種嘗試來監(jiān)測基因流動。
例如，如其它的煙草屬物種中的一些，煙草(Nicotiana tabacum)是異源四倍體，并且可以將遺傳標記用于在親代基因組中鑒定同源基因或相關(guān)基因，所述親代基因組不同于其中存在原始基因的基因組。還可以將相關(guān)基因的標記用于篩選現(xiàn)存的煙草生殖質(zhì)，通過雜交產(chǎn)生的隔離的或合成群，從誘變處理產(chǎn)生的群或通過各種組織培養(yǎng)方法產(chǎn)生的群。同樣，本文所述的核酸序列(例如，在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列或其片段)可以用于鑒定或影響涉及疾病或昆蟲抗性、氣味和香味性質(zhì)、除草劑耐受性、與不需要的組分相關(guān)的質(zhì)量因素的基因，或增加葉子產(chǎn)率的基因，或影響與結(jié)構(gòu)性狀或纖維含量相關(guān)的葉子或植物組分諸如木質(zhì)素，纖維素等。
產(chǎn)物按照本領(lǐng)域已知的標準方法，使用本文所述的任何煙草植物材料，產(chǎn)生具有減少量的亞硝胺含量的煙草產(chǎn)品。在一個實施方案中，使用獲自加工處理的煙草植物的煙草植物材料來產(chǎn)生煙草產(chǎn)品，所述加工處理的煙草植物可以包含或被培育從而包含減少的煙堿脫甲基酶活性。例如，所述加工處理的煙草植物可以是得自雜交的煙草植物，包括被鑒定為具有煙堿脫甲基酶的不同的表達的煙草植物。理想地，所述煙草產(chǎn)品具有少于約5mg/g，4.5mg/g，4.0mg/g，3.5mg/g，3.0mg/g，2.5mg/g，2.0mg/g，1.5mg/g，1.0mg/g，750μg/g，500μg/g，250μg/g，100μg/g，75μg/g，50μg/g，25μg/g，10μg/g，7.0μg/g，5.0μg/g，4.0μg/g，2.0μg/g，1.0μg/g，0.5μg/g，0.4μg/g，0.2μg/g，0.1μg/g，0.05μg/g，或0.01μg/g的減少量的去甲煙堿或NNN，或其中相對于包含在其中的總生物堿含量，次級生物堿的百分比少于90％，70％，50％，30％，10％，5％，4％，3％，2％，1.5％，1％，0.75％，0.5％，0.25％，或0.1％。短語“減少的量”指與在野生型煙草植物、或植物組分或以相同方式處理的來自相同種類的煙草的煙草產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)的相比，在煙草植物或植物組分或煙草產(chǎn)品中存在的去甲煙堿或NNN或兩者的量較少，所述野生型煙草植物或植物組分或以相同方式處理的來自相同種類的煙草的煙草產(chǎn)品沒有被制成減少去甲煙堿或NNN的轉(zhuǎn)基因材料。在一個實例中，以相同方式加工的相同種類的野生型煙草植物被用作對照，以測量是否已經(jīng)通過本文所述的方法獲得去甲煙堿或NNN或兩者的減少。在另一個實例中，使用標準方法，例如通過監(jiān)測基因或基因產(chǎn)物，例如煙堿脫甲基酶，或在基因中的具體突變的存在或缺乏，來評估具有減少量的亞硝胺含量的植物。在另一個實例中，將來自育種程序的植物的亞硝胺含量與用于培育具有減少量的亞硝胺的植物的受體品系或供體品系或兩者的亞硝胺含量進行比較。按照需要，還使用其它本領(lǐng)域已知的適合的對照。按照煙草領(lǐng)域眾所周知的方法來測量去甲煙堿和NNN或兩者的水平。
下列實施例舉例說明了實施本發(fā)明的方法并且應當被理解為對于本發(fā)明范圍的例證而非限制，所述范圍在后附的權(quán)利要求書中進行限定。
實施例1植物組織的發(fā)育和乙烯處理植物的生長將植物種在花盆中并于溫室中生長4周。將4周齡的幼苗移植入單個花盆中并于溫室中生長2個月。在生長過程中將植物用含有150ppm NPK肥料的水一天澆水2次。將展開的綠葉從植物上分離進行下述的乙烯處理。
細胞系78379將煙草品系78379用作植物材料來源，所述煙草品系78379是由肯塔基大學給出的白萊煙煙草品系。將一百株植物按照培養(yǎng)煙草領(lǐng)域的標準進行培養(yǎng)，移植，并用不同數(shù)字(1-100)進行標記。根據(jù)推薦地那樣進行受精和田間管理。
所述100株植物中的四分之三將20和100％之間的煙堿轉(zhuǎn)化為去甲煙堿。所述100株植物中的四分之一將少于5％的煙堿轉(zhuǎn)化為去甲煙堿。87號植物具有最少的轉(zhuǎn)化(2％)而21號植物具有100％的轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化少于3％的植物歸類為非轉(zhuǎn)化體。制備87號植物和21號植物的自花傳粉種子，以及雜交(21×87和87×21)種子來研究基因和表型差異。來自自交21的植物為轉(zhuǎn)化體，而99％的來自87的自交株為非轉(zhuǎn)化體。來自87的植物的另外1％顯示低轉(zhuǎn)化(5-15％)。來自反交的植物全部為轉(zhuǎn)化體。
細胞系4407將煙草屬品系4407用作植物材料的來源，所述煙草品系4407為白萊煙品系。選擇一致和代表性的植物(100)并進行標記。100株植物的97株為非轉(zhuǎn)化體而三株為轉(zhuǎn)化體。56號植物具有最少的轉(zhuǎn)化量(1.2％)而58號植物具有最高的轉(zhuǎn)化水平(96％)。用這兩種植物制備自花傳粉種子和雜交種子。
來自自交58的植物以3∶1轉(zhuǎn)化體對非轉(zhuǎn)化體的比例分離。植物58-33和58-25分別被鑒定為純合的轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體植物品系。通過其后代的分析確認了58-33的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。
細胞系PBLB01PBLB01是由ProfiGen，Inc.開發(fā)的白萊煙品系并被用作植物材料的來源。轉(zhuǎn)化體植物選自PBLB01的起始種子。
乙烯處理方法將綠葉從2-3個月溫室培養(yǎng)的植物上取下并噴以0.3％乙烯溶液(Prep brand Ethephon(Rhone-Poulenc))。將每片噴過的葉子懸掛于處理架上，所述處理架裝備了增濕器并覆以塑料。在處理過程中，用乙烯溶液周期性地噴樣品葉子。在乙烯處理后的大約24-48個小時，收集葉子進行RNA抽提。取另一份小樣進行代謝組分分析以測定葉代謝物的濃度和更加具體的目標組分如多種生物堿。
作為實例，可以如下進行生物堿分析。將樣品(0.1g)于150rpm與0.5ml 2N NaOH和5ml抽提溶液一起進行搖動，所述抽提溶液包含作為內(nèi)標的喹啉和甲基叔丁醚。在配備了FID檢測器的HP 6890 GC上分析樣品。對于檢測器和注射器使用250℃的溫度。在以每分鐘10℃的110-185℃的溫度梯度上使用由熔融的硅石組成的HP柱(30m-0.32nm-1mm)，所述熔融的硅石交聯(lián)了5％的苯酚和95％的聚甲基硅氧烷。于100℃以1.7cm3min-1的流速以40∶1的裂解比率以2∶1的注射體積利用氦作為載氣來操作所述柱。
實施例2RNA分離為了進行RNA提取，如上述用乙烯處理來自兩個月齡的溫室培養(yǎng)的植物的中葉。將0和24-48小時的樣品用于RNA抽提。在一些情況下，從除去花頭后10天的植物上取在衰老過程之下的葉子樣品。也將這些樣品用于抽提。根據(jù)生產(chǎn)商的方案利用Rneasy Plant Mini Kit(Qiagen，Inc.，Valencia，California)分離總RNA。
利用DEPC處理的研體和研杵將組織樣品在液氮下研磨成精細粉末。將大約100毫克的研磨組織轉(zhuǎn)移入無菌的1.5ml Eppendorf管中。將此樣品試管置于液氮中直到收集了所有樣品。隨后，將如試劑盒中提供的450μl緩沖液RLT(加入巰基乙醇)加入到每只單個管中。劇烈渦旋樣品并于56℃溫育3分鐘。隨后將裂解物應用到置于2ml收集管中的QIAshredder離心柱上，并以最大速度離心2分鐘。收集流過物并將0.5體積的乙醇加入到清除的裂解物中。充分混合樣品并轉(zhuǎn)移到置于2ml收集管中的Rneasy微型離心柱上。于10,000rpm將樣品離心1分鐘。接下來，將700μl的緩沖液RW1吸移到Rneasy柱上并于10,000rpm離心1分鐘。將緩沖液RPE吸移到在新收集管中的Rneasy柱上并于10,000rpm離心1分鐘。再次將緩沖液RPE加入到Rneasy離心柱上并以最大速度離心2分鐘以干燥所述膜。為了除去任何殘余的乙醇，將膜置于單獨的收集管中并以最大速度再離心1分鐘。將Rneasy柱轉(zhuǎn)移入新的1.5ml收集管中，并將40μl不含RNA酶的水直接吸移到Rneasy膜上。將此最終洗脫管于10,000rpm離心1分鐘。通過變性甲醛凝膠和分光光度計分析總RNA的質(zhì)與量。
遵照生產(chǎn)商的方案使用Oligotex聚A+RNA純化試劑盒(QiagenInc.)分離聚(A)RNA。使用250μl最大體積中的大約200μg的總RNA。將250μl體積的緩沖液OBB和15μl的Oligotex混懸液加入到250μl的總RNA中。通過吸移將組分充分混合并在加熱模塊上于70℃溫育3分鐘。隨后將樣品置于室溫大約20分鐘。通過以最大速度離心2分鐘將OligotexmRNA復合物沉淀。除了50μl上清液之外，將全部從微量離心管中除去。用OBB緩沖液進一步處理樣品。通過渦旋將OligotexmRNA沉淀重懸于400μl的緩沖液OW2中。將此混合物轉(zhuǎn)移到置于新管中的小離心柱上并以最大速度離心1分鐘。將離心柱轉(zhuǎn)移到新的管中并向柱中加入另外400μl的緩沖液OW2。隨后以最大速度將所述管離心1分鐘。將所述離心柱轉(zhuǎn)移到最終的1.5ml微量離心管中。用60μl的熱(70℃)緩沖液OEB洗脫樣品。通過變性甲醛凝膠和分光光度分析來分析聚腺苷酸產(chǎn)物。
實施例3
反轉(zhuǎn)錄PCR按照生產(chǎn)商的方案使用SuperScript反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，Carlsbad，California)制備第一鏈cDNA。富含聚A+的RNA/寡dT引物混合物由少于5μg的總RNA，1μl的10mM dNTP混合物，1μl的寡d(T)12-18(0.5μg/μl)，和多達10μl的DEPC處理的水組成。將每個樣品于65℃溫育5分鐘，隨后置于冰上至少1分鐘。反應混合物通過順序加入每種下列組分進行制備2μl 10X RT緩沖液，4μl的25mM MgCl2，2μl的0.1M DTT，和1μl的RNA酶OUT重組RNA酶抑制劑。將另外9μl的反應混合物吸移到每種RNA/引物混合物中并輕輕混合。將其于42℃溫育2分鐘并將1μl的Super ScriptII RT加入到每管中。將所述管于42℃溫育50分鐘。于70℃終止反應15分鐘并于冰上冷卻。通過離心收集樣品并將1μl的RNA酶H加入到每管中并于37℃溫育20分鐘。用200pmoles的正向引物和100pmoles反向引物(后帶1個隨機堿基的18nt寡d(T)的混合物)進行第二次PCR。
反應條件為94℃ 2分鐘和隨后在94℃ 1分鐘，45℃-60℃ 2分鐘，72℃ 3分鐘的40個PCR循環(huán)，于72℃再延伸10min。利用1％的瓊脂糖凝膠通過電泳分析10微升的擴增樣品。將正確大小的片段從瓊脂糖凝膠上純化出來。
實施例4PCR片段群的生成按照生產(chǎn)商的說明書將來自實施例3的PCR片段連接入pGEM-TEasy載體(Promega，Madison，Wisconsin)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入JM109感受態(tài)細胞中并接種在LB培養(yǎng)基板上進行藍/白篩選。選擇菌落并將其于37℃過夜培養(yǎng)于具有1.2ml LB培養(yǎng)基的96孔板中。對于所有選定的菌落都制成冷凍的貯存母液。以Wizard SV小量制備試劑盒(Promega)利用Beckman′s Biomeck 2000小量制備機器人由板中純化質(zhì)粒DNA。用100μl水洗脫質(zhì)粒DNA并保存于96孔板中。通過EcoRI消化質(zhì)粒并利用1％的瓊脂糖凝膠進行分析以確定DNA量和插入片段的大小。利用CEQ 2000測序儀(Beckman，F(xiàn)ullerton，California)對包含400-600bp插入片段的質(zhì)粒進行測序。通過BLAST搜索將序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對(見，例如圖159A到159K)。鑒定p450相關(guān)片段并進一步進行分析。或者，將p450片段從扣除文庫中分離。也如上所述對這些片段進行分析。
實施例5cDNA文庫構(gòu)建如下通過由乙烯處理的葉子制備總RNA來構(gòu)建cDNA文庫。首先，利用改進的酸苯酚和氯仿抽提方法由乙烯處理的煙草品系58-33的葉子中抽提總RNA。改進所述方法以使用一克組織，所述組織進行過研磨并隨后在5ml抽提緩沖液(100mM Tris-HCl，pH 8.5；200mM NaCl；10mMEDTA；0.5％SDS)中進行渦旋，向其中加入5ml苯酚(pH5.5)和5ml氯仿。將抽提樣品離心并保留上清液。將此抽提步驟重復2-3次直到上清液看起來清亮。加入大約5ml的氯仿以去除痕量的苯酚。通過加入3倍體積的乙醇和1/10體積的3M NaOAc(pH5.2)將RNA由合并的上清液級分中沉淀并于-20℃保存1小時。在轉(zhuǎn)移到Corex玻璃容器中后將RNA級分于9,000RPM于4℃離心45分鐘。用70％乙醇洗滌沉淀物并于9,000RPM于4℃離心5分鐘。干燥沉淀后，將沉淀的RNA溶解于0.5ml不含RNA酶的水中。分別通過變性甲醛凝膠和分光光度計分析總RNA的質(zhì)與量。
通過下列方案利用寡(dT)纖維素方法(Invitrogen)和微量離心柱(Invitrogen)將得到的總RNA用于分離聚A+RNA。將大約20mg的總RNA進行兩次純化以獲得高質(zhì)量的聚A+RNA。通過進行變性甲醛凝膠和隨后的已知全長基因的RT-PCR來分析聚A+RNA產(chǎn)物以確保高質(zhì)量的mRNA。
接下來，采用cDNA合成試劑盒，ZAP-cDNA合成試劑盒，和ZAP-cDNA Gigapack III gold克隆試劑盒(Stratagene，La Jolla，California)將聚A+RNA用作模板來產(chǎn)生cDNA文庫。所述方法包括遵循指定的生產(chǎn)商方案。將大約8μg的聚A+RNA用來構(gòu)建cDNA文庫。初級文庫的分析揭示了大約2.5×106-1×107pfu。利用IPTG和X-gal通過互補測定完成文庫質(zhì)量背景測試，其中重組斑以高于背景反應的超過100倍進行表達。
通過隨機PCR進行的更加定量的文庫分析顯示插入cDNA的平均大小為大約1.2kb。該方法使用兩步PCR法。對于第一步，基于獲自p450片段的初步序列信息設計反向引物。利用設計的反向引物和T3(正向)引物由cDNA文庫擴增相應的基因。將PCR反應進行瓊脂糖電泳并切除相應的高分子量條帶，將其純化，克隆和測序。在第二步中，由5′UTR或p450的起始編碼區(qū)設計作為正向引物的新引物與反向引物(由p450的3′UTR設計)一起用于隨后的PCR中來獲得全長p450克隆。
除了反向引物之外，如實施例3中所述，通過PCR擴增由構(gòu)建的cDNA文庫生成p450片段。將位于cDNA插入片段質(zhì)粒下游的T7引物用作反向引物。如實施例4中所述對PCR片段進行分離，克隆和測序。
通過這種PCR方法由構(gòu)建的的cDNA文庫分離全長p450基因。使用基因特異性反向引物(由p450片段下游序列設計)和正向引物(在文庫質(zhì)粒上的T3)克隆全長基因。對PCR片段進行分離，克隆和測序。如果必要的話，應用第二個PCR步驟。在第二個步驟中，由克隆的p450s的5′UTR設計的新的正向引物與由p450克隆的3′UTR設計的反向引物一起用于隨后的PCR反應中來獲得全長p450克隆。隨后對克隆進行測序。
實施例6克隆片段的表征-反向DNA印跡分析對于在以上實施例中鑒定的所有p450克隆進行非放射性大規(guī)模反向DNA印跡測定以檢測差異表達。觀察到在不同p450簇之間的表達水平非常不同。對于具有高度表達的那些進行進一步的實時檢測。
如下進行非放射性DNA印跡操作。
1)如實施例2中所述使用Qiagen Rnaeasy試劑盒由乙烯處理的和未處理的轉(zhuǎn)化體(58-33)和非轉(zhuǎn)化體(58-25)的葉子抽提總RNA。
2)通過生物素尾端標記單鏈cDNA產(chǎn)生探針，所述單鏈cDNA衍生自以上步驟中生成的富含聚A+的RNA。如實施例3中所述通過轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體總RNA(Invitrogen)的RT-PCR生成這種經(jīng)標記的單鏈cDNA，除了使用生物素化的寡dT作為引物(Promega)。這些被用作與克隆DNA雜交的探針。
3)用限制性酶EcoRI消化質(zhì)粒DNA并在瓊脂糖凝膠上進行電泳。同時將凝膠干燥并轉(zhuǎn)移到兩個尼龍膜上(Biodyne B)。將一個膜與轉(zhuǎn)化體探針雜交而另一個與非轉(zhuǎn)化體探針雜交。雜交前將膜進行UV-交聯(lián)(自動交聯(lián)裝置，254nm，Stratagene，Stratalinker)。
或者，利用位于p-GEM質(zhì)粒兩條臂上的序列T3和SP6作為引物，由每個質(zhì)粒進行PCR擴增插入片段。通過在96孔預運行(Ready-to-run)瓊脂糖凝膠上進行電泳來分析PCR產(chǎn)物。將確認的插入片段點在兩個尼龍膜上。將一個膜與轉(zhuǎn)化體探針雜交而另一個與非轉(zhuǎn)化體探針雜交。
4)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書(Enzo MaxSence kit，Enzo Diagnostics，Inc，F(xiàn)armingdale，NY)，對洗滌嚴格性進行改進，對膜進行雜交和洗滌。將膜于42℃與雜交緩沖液(2xSSC緩沖的甲酰胺，含有去污劑和雜交增強劑)預雜交30min并與10μl變性探針于42℃過夜雜交。隨后將膜在室溫于1X雜交洗滌緩沖液中洗滌1次持續(xù)10min，并于68℃洗滌4次持續(xù)15min。所述膜可以用于檢測操作。
5)如生產(chǎn)商的檢測方法(Enzo Diagnostics，Inc.)中所述通過堿性磷酸酶標記隨后進行NBT/BCIP colometric檢測對經(jīng)洗滌的膜進行檢測。用1x封閉溶液于室溫將膜封閉1小時，用1X檢測試劑洗滌3次達10min，用1X預顯色反應緩沖液洗滌2次達5min，并且隨后在顯色溶液中將斑點顯色30-45min直到斑點顯現(xiàn)。所有試劑都由生產(chǎn)商提供(Enzo Diagnostics，Inc)。此外，還利用KPL DNA雜交和檢測試劑盒根據(jù)生產(chǎn)商的說明書(KPL，Gaithersburg，Maryland)進行大規(guī)模反向DNA測定。
實施例7克隆的表征-RNA印跡分析作為DNA印跡分析的備選，如在RNA印跡測定的實施例中所述對一些膜進行雜交和檢測。如下利用RNA雜交來檢測在煙草屬中差異表達的mRNA。
利用一種隨機引導方法來由克隆的p450制備探針(Megaprime DNALabelling Systems，Amersham Biosciences)?；旌舷铝薪M分25ng變性的DNA模板；4μl每種未標記的dTTP，dGTP和dCTP；5μl的反應緩沖液；P32-標記的dATP和2μl的KlenowI；和H2O，使反應達到50μl。將混合物于37℃溫育1-4小時，并以2μl的0.5M EDTA終止。使用前通過于95℃溫育5分鐘將探針變性。
由乙烯處理和未處理的數(shù)對煙草品系的新鮮葉制備RNA樣品。在一些情況下使用富含聚A+的RNA。用DEPC H2O(5-10μl)將大約15μg總RNA或1.8μg mRNA(如實施例5中所述的RNA和mRNA抽提方法)達到等同體積。加入相同體積的加樣緩沖液(1xMOPS；18.5％甲醛；50％甲酰胺；4％Ficoll400；溴酚藍)和0.5μl EtBr(0.5μg/μl)。隨后將樣品在制備物中變性用來通過電泳分離RNA。
用1X MOP緩沖液(0.4M嗎啉代丙烷磺酸；0.1M醋酸鈉-3 xH2O；10mM EDTA；用NaOH調(diào)節(jié)至pH 7.2)將樣品在甲醛凝膠(1％瓊脂糖，1xMOPS，0.6M甲醛)上進行電泳。通過毛細管法在10XSSC緩沖液(1.5M NaCl；0.15M檸檬酸鈉)中將RNA轉(zhuǎn)移到Hybond-N+膜上(Nylon，Amersham Pharmacia Biotech)達24小時。在雜交前將具有RNA樣品的膜進行UV交聯(lián)(自動交聯(lián)裝置，254nm，Stratagene，Stratalinker)。
將膜在42℃與5-10ml預雜交緩沖液(5xSSC；50％甲酰胺；5xDenhardt′s-溶液；1％SDS；100μg/ml熱變性剪切的非同源性DNA)預雜交1-4小時。棄去舊的預雜交緩沖液，加入新的預雜交緩沖液和探針。于42℃過夜進行雜交。用2xSSC于室溫洗滌膜達15分鐘，隨后用2xSSC洗滌。
如在下面的表1中所舉例說明，RNA印跡法和反向DNA印跡法在確定相對于未被誘導的植物，哪個基因被乙烯處理所誘導中是有用的。有趣的是，不是所有的片段在轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體中都受到類似的影響。對細胞色素p450片段中的一些進行部分測序以確定它們的結(jié)構(gòu)相關(guān)性。將該信息隨后用于分離和表征目標全長基因克隆。
表1乙烯處理對mRNA誘導的作用
在獲自轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體白萊煙品系的煙草組織上利用全長克隆進行Northern分析，所述轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體白萊煙品系都通過乙烯處理進行誘導。該分析用于鑒定相對于乙烯誘導的轉(zhuǎn)化體品系相對于乙烯誘導的非轉(zhuǎn)化體白萊煙品系在乙烯誘導的轉(zhuǎn)化體品系中顯示表達升高的全長克隆。通過這樣做，全長克隆的功能性關(guān)系可以通過比較轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體品系之間葉組分的生化差異進行確定。
如在下面的表2中顯示，與被指示為+的非轉(zhuǎn)化體處理的組織相比，在轉(zhuǎn)化體乙烯處理的組織中，被指示為++和+++的6個克隆顯示明顯更高的表達。在未被乙烯處理的轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體品系中，所有的這些克隆顯示極少的表達或沒有任何表達。
表2在轉(zhuǎn)化體乙烯處理的組織中具有升高的表達的克隆
實施例8
由克隆的基因編碼的多肽的免疫檢測由三個p450克隆選擇對應于20-22個氨基酸長的肽區(qū)，其1)與其它克隆具有較低的或沒有同源性和2)具有良好的親水性和抗原性。下面列出選自各個p450克隆的肽區(qū)的氨基酸序列。將合成的肽與KHL(匙孔血藍蛋白)綴合并隨后注射入兔體內(nèi)。第4次注射后2和4周收集抗血清(AlphaDiagnostic Intl.Inc.San Antonio，TX)。
D234-AD1 DIDGSKSKLVKAHRKIDEILG(SEQ ID NO2266)D90a-BB3 RDAFREKETFDENDVEELNY(SEQ ID NO163)D89-AB1 FKNNGDEDRHFSQKLGDLADKY(SEQ ID NO2267)通過蛋白質(zhì)印跡分析對抗血清檢查與來自煙草植物組織的目標蛋白的交叉反應性。粗制蛋白提取物獲自乙烯處理的(0-40小時)轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體品系的中葉。根據(jù)生產(chǎn)商的方案使用RC DC蛋白質(zhì)測定試劑盒(BIO-RAD)測定提取物的蛋白質(zhì)濃度。
將兩毫克蛋白質(zhì)加載到每個泳道上并利用Laemmli SDS-PAGE系統(tǒng)在10％-20％的梯度凝膠上分離蛋白質(zhì)。用Trans-Blot Semi-Dry細胞(BIO-RAD)將蛋白質(zhì)由凝膠轉(zhuǎn)移到PROTRAN硝化纖維素轉(zhuǎn)移膜(Schleicher & Schuell)上。用ECL Advance Western Blotting檢測試劑盒(Amersham Biosciences)檢測并顯現(xiàn)目標p450蛋白。在兔體內(nèi)制備抗合成性KLH綴合物的一抗。與過氧化物酶偶聯(lián)的抗兔IgG的二抗購自Sigma。一抗和二抗都以1∶1000稀釋使用。抗體顯示對于蛋白質(zhì)印跡上單一條帶的強烈反應性，提示抗血清對于目標靶肽是單特異性的?？寡暹€與綴合到KLH上的合成肽具有交叉反應性。
實施例9分離的核酸片段的核酸同一性，結(jié)構(gòu)相關(guān)性和GeneChip雜交結(jié)合RNA印跡分析對超過100個克隆的p450片段進行測序以確定它們的結(jié)構(gòu)相關(guān)性。該方法使用基于位于p450基因羧基末端附近的兩個共同p450基序中任一個的正向引物。所述正向引物對應于細胞色素p450基序FXPERF(SEQ ID NO2268)或GRRXCP(A/G)(SEQ ID NO2269)。反向引物使用來自質(zhì)粒的標準引物，位于pGEM質(zhì)粒兩臂上的SP6或T7，或者來自聚腺苷酸尾巴的標準引物。下面描述所用的方法。
根據(jù)生產(chǎn)商的方案(Beckman Coulter)利用分光光度法評估起始雙鏈DNA的濃度。將模板用水稀釋到合適的濃度，通過于95℃加熱2分鐘進行變性，隨后將其置于冰上。利用0.5-10μl的變性DNA模板，2μl的1.6pmol的正向引物，8μl的DTCS Quick Start Master Mix在冰上制備測序反應物并用水使總體積達到20μl。熱循環(huán)程序由30個循環(huán)的下列循環(huán)組成96℃ 20秒，50℃ 20秒，和60℃ 4分鐘，隨后保持于4℃。
通過加入5μl的終止緩沖液(等體積的3M NaOAc和100mM EDTA和1μl的20mg/ml糖原)終止測序反應。用60μl的冷95％ 乙醇沉淀樣品并于6000xg離心6分鐘。棄去乙醇。用200μl的冷70％乙醇洗滌沉淀物兩次。在沉淀干燥后，加入40μl的SLS溶液并重懸沉淀。覆蓋一層礦物油，并將樣品置于CEQ 8000自動測序儀上作進一步分析。
為了確證核酸序列，使用p450基因的FXPERF(SEQ ID NO2268)或GRRXCP(A/G)(SEQ IDNO2269)區(qū)的正向引物或質(zhì)?；蚓巯佘账嵛舶偷姆聪蛞镌趦蓚€方向上對核酸序列進行重新測序。所有的測序都在兩個方向上至少進行兩次。
將細胞色素p450片段的核酸序列彼此相比較，從對應于編碼GRRXCP(A/G)(SEQ ID NO2269)基序區(qū)之后的第一個核酸的編碼區(qū)一直到終止密碼子。將此區(qū)選作p450蛋白之間遺傳多樣性的指征。在70個過量基因中，觀察到大量遺傳上不同的p450基因，類似于其它植物物種的情況。在比較核酸序列之后，發(fā)現(xiàn)可以將基因基于它們的序列同一性插入不同的序列組。發(fā)現(xiàn)p450成員的最佳獨特組被確定為具有75％或更大核酸同一性的那些序列。(見例如，US 2004/0162420專利申請出版物中的表1，將其并入本文作為參考)。減少百分比同一性導致明顯更大的組。觀察到優(yōu)選的分組為具有81％或更大核酸同一性的那些序列，更加優(yōu)選的分組具有91％或更大核酸同一性，且最優(yōu)選的分組具有99％或更大核酸同一性的那些序列。大多數(shù)分組包含至少兩個成員并經(jīng)常包含三個或更多的成員。未反復發(fā)現(xiàn)其它的，提示所采用的方法能夠在所用的組織中分離低和高表達的mRNA。
基于75％或更大的核酸同一性，發(fā)現(xiàn)兩個細胞色素p450組包含與以前的煙草細胞色素基因具有同一性的核酸序列，所述以前的煙草細胞色素基因在遺傳上與在所述組中的那些不同。組23在用于表3A的參數(shù)中顯示與GenBank序列GI1171579(SEQ ID NO2270)(CAA64635)和GI14423327(SEQ ID NO2271)(或AAK62346)具有核酸同一性。GI1171579(SEQ ID NO2270)與組23成員具有核酸同一性，與組23的成員的同一性范圍在96.9％到99.5％，而GI14423327(SEQ ID NO2271)與該組具有95.4％到96.9％范圍的同一性。組31的成員與GenBank報道的GI14423319序列(SEQ ID NO2272)(AAK62342)具有76.7％到97.8％范圍的同一性的核酸同一性。如用于表3A中時，在表3A的其它p450同一性組中不包含與以前報道的煙草p450s基因的參數(shù)同一性。
具有適合的核酸簡并探針的共有序列對于組可以用于優(yōu)先鑒定和分離來自煙草屬植物的每個組中的另外的成員。
表3A煙草屬p450核酸序列同一性組組片段1D58-BG7(SEQ ID NO10)，D58-AB1(SEQ ID NO12)；D58-BE4(SEQ ID NO16)2D56-AH7(SEQ ID NO18)；D13a-5(SEQ ID NO20)3D56-AG10(SEQ ID NO22)；D35-33(SEQ ID NO24)；D34-62(SEQID NO26)4D56-AA7(SEQ ID NO28)；D56-AE1(SEQ ID NO30)；185-BD3(SEQ ID NO152)5D35-BB7(SEQ ID NO32)；D177-BA7(SEQ ID NO34)；D56A-AB6(SEQ ID NO36)；D144-AE2(SEQ ID NO38)
6D56-AG11(SEQ ID NO40)；D179-AA1(SEQ ID NO42)7D56-AC7(SEQ ID NO44)；D144-AD1(SEQ ID NO46)8D144-AB5(SEQ ID NO48)9D181-AB5(SEQ ID NO50)；D73-AC9(SEQ ID NO52)10 D56-AC12(SEQ ID NO54)11 D58-AB9(SEQ ID NO56)；D56-AG9(SEQ ID NO58)；D56-AG6(SEQ ID NO60)；D35-BG11(SEQ ID NO62)；D35-42(SEQ ID NO64)；D35-BA3(SEQ ID NO66)；D34-57(SEQ ID NO68)；D34-52(SEQ IDNO70)；D34-25(SEQ ID NO72)12 D56-AD10(SEQ ID NO74)13 56-AA11(SEQ ID NO76)14 D177-BD5(SEQ ID NO78)；D177-BD7(SEQ ID NO92)15 D56A-AG10(SEQ ID NO80)；D58-BC5(SEQ ID NO82)；D58-AD12(SEQ ID NO84)16 D56-AC11(SEQ ID NO86)；D35-39(SEQ ID NO88)；D58-BH4(SEQ ID NO90)；D56-AD6(SEQ ID NO96)17 D73A-AD6(SEQ ID NO98)；D70A-BA11(SEQ ID NO100)18 D70A-AB5(SEQ ID NO104)；D70A-AA8(SEQ ID NO106)19 D70A-AB8(SEQ ID NO108)；D70A-BH2(SEQ ID NO110)；D70A-AA4(SEQ ID NO112)20 D70A-BA1(SEQ ID NO114)；D70A-BA9(SEQ ID NO116)21 D70A-BD4(SEQ ID NO118)22 D181-AC5(SEQ ID NO120)；D144-AH1(SEQ ID NO122)；D34-65(SEQ ID NO124)23 D35-BG2(SEQ ID NO126)24 D73A-AH7(SEQ ID NO128)25 D58-AA1(SEQ ID NO130)；D185-BC1(SEQ ID NO142)；D185-BG2(SEQ ID NO144)26 D73-AE10(SEQ ID NO132)27 D56-AC12(SEQ ID NO134)28 D177-BF7(SEQ ID NO136)；D185-BE1(SEQ ID NO146)；D185-BD2(SEQ ID NO148)29 D73A-AG3(SEQ ID NO138)30 D70A-AA12(SEQ ID NO140)；D176-BF2(SEQ ID NO94)31 D176-BC3(SEQ ID NO154)32 D176-BB3(SEQ ID NO156)33 D186-AH4(SEQ ID NO14)在乙烯活化后，將GeneChip微陣列雜交(Affymetrix Inc.；Santa Clara，CA)用于鑒定在接近純合系的轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體之間具有差異表達模式的基因。芯片大小是18微米并且陣列格式是100-2187，容納528個探針組(11,628個探針)。將7對雜交用于獲得微陣列結(jié)果的單獨的證實。這些由下列各項組成一對(轉(zhuǎn)化體/非轉(zhuǎn)化體)4407-33/4407-25未處理的白萊煙煙草樣品，四對乙烯處理的4407-33/4407-25樣品，一對乙烯處理的深色煙草NL Madole/181，另一對對于煙草轉(zhuǎn)化接近純合的品系，和一對自然衰老的葉子4407＝33/25(表3B)。
表3B.來自GeneChip雜交的轉(zhuǎn)化體∶非轉(zhuǎn)化體標準化信號比率
如使用Genome Explorations，Inc(Memphis，TN)的檢測工具產(chǎn)生的表達報告所證實，所有的14組雜交是成功的。主要報告包括噪音的分析、標度因子、背景、總探針組、存在和不存在的探針組的數(shù)量和百分比、持家對照的信號強度。使用軟件GCOS組合以其它軟件來進一步分析和呈現(xiàn)所述數(shù)據(jù)。進行處理對之間的信號比較，并且編輯對于所有的雜交的所有的各個探針的總數(shù)據(jù)，并且還分析了表達數(shù)據(jù)。基于信號強度的結(jié)果顯示僅有兩個基因，D121-AA8和D120-AH4，和一個片段，即作為D121-AA8的部分片段的D35-BG11，當與非轉(zhuǎn)化體品系相比時，在乙烯處理的轉(zhuǎn)化體品系中具有可再現(xiàn)的誘導。將在轉(zhuǎn)化體品系，例如白萊煙煙草種類4407-33中基因的信號，測定為與在相關(guān)的非轉(zhuǎn)化體純化系，4407-25中的基因信號的比率。在沒有乙烯處理的情況下，對于所有的基因，轉(zhuǎn)化體與非轉(zhuǎn)化體信號的比率達到1.00。為了消除背景差異的影響，還計算了標準化的信號比率。通過用相應的不成對比率除處理的成對比率獲得標準化的信號比率。在乙烯處理和分析后，如通過四次獨立的分析所確定，相對于非轉(zhuǎn)化體品系，在轉(zhuǎn)化體品系中，兩個基因，D121-AA8和D120-AH4被誘導。這兩個基因具有99.8％的相對同源性并且它們在轉(zhuǎn)化體種類中的相對雜交信號范圍比它們的非轉(zhuǎn)化體對應物中的信號高約2-22倍?；跇藴驶谋嚷剩瑑蓚€肌動蛋白樣，內(nèi)對照克隆在轉(zhuǎn)化體品系中沒有被誘導。此外，其編碼區(qū)完整地被包含在D121-AA8和D120-AH4基因中的片段(D35-BG11)，在成對純合轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體品系中的相同樣品中被高度誘導。此外，D121-AA8和D120-AH4基因在純合的深色煙草對，NL Madole和181的轉(zhuǎn)化體品系中被強誘導(8到28倍)，因此證實了在轉(zhuǎn)化體品系中的這些基因的乙烯誘導是在植物中的反應。同樣，在通過自然衰老的樣品4407-33/25的雜交進行的比較中鑒定相同的基因。使用特異于D121-AA8的引物進行的這些材料的RT-PCR測定證實了該基因的微陣列結(jié)果。
基于這些結(jié)果，將所述D121-AA8基因(其cDNA序列是SEQ ID NO5的序列；圖4)鑒定為目標煙草煙堿脫甲基酶基因。鑒于p450命名規(guī)則，確定D121-AA8最類似于CYP82E家族中的p450s(The ArabidopsisGenome Initiative(AGI)and The Arabidopsis Information Resource(TAIR)；Frank，Plant Physiol.1101035-1046，1996；Whitbred et al.，Plant Physiol.12447-58，2000)；Schopfer和Ebel，Mol.Gen.Genet.258315-322，1998；和Takemoto等，Plant Cell Physiol.401232-1242，1999)。
實施例10酶活性的生化分析生化分析，例如，如并入本文作為參考的先前提交的申請中所述，確定了SEQ ID NO5的序列編碼煙草煙堿脫甲基酶(SEQ ID NO3；圖3和4)。
特別地，通過如下測定酵母細胞中異源表達的p450的酶活性，確定候選克隆D121-AA8的功能為煙堿脫甲基酶的編碼基因。
1.酵母表達載體的構(gòu)建將煙草煙堿脫甲基酶編碼cDNA(D121-AA8)的推定蛋白質(zhì)編碼序列D120-AH4，D121-AA8，208-AC-8和D208-AD9克隆入酵母表達載體pYeDP60。通過包含這些序列的PCR引物在翻譯起始密碼子(ATG)的上游或終止密碼子(TAA)的下游引入合適的BamHI和MfeI位點(下面下劃線的)。擴增的PCR產(chǎn)物上的MfeI與載體上的EcoRI位點相容。用來擴增D121-AA8 cDNA的引物是5′-TAGCTACGCGGATCCATGCTTTCTCCCATAGAAGCC-3′(SEQ IDNO2194)和5′-CTGGATCACAATTGTTAGTGATGGTGATGGTGATGCGATCCTCTATAAAGCTCAGGTGCCAGGC-3′(SEQ ID NO2297)。將編碼蛋白質(zhì)C末端九個額外氨基酸，包括六個組氨酸的序列片段，結(jié)合到反向引物中以利于誘導后6-His標記的p450的表達。酶消化后在參照GAL10-CYC1啟動子的有義方向上將PCR產(chǎn)物連接入pYeDP60載體中。另外，通過限制性酶切分析和DNA測序確認酵母表達載體的正確構(gòu)建。通過對于酵母微粒體的去垢劑相的SDS-PAGE凝膠電泳來觀察p450蛋白質(zhì)的表達。基于基因序列，p450蛋白質(zhì)的預期大小是59kD，通過凝膠分析來證實該結(jié)果。
2.酵母轉(zhuǎn)化將改進來表達擬南芥NADPH-細胞色素p450還原酶ATR1的WAT11酵母品系用pYeDP60-p450cDNA質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)化。將50微升的WAT11酵母細胞混懸液與～1μg質(zhì)粒DNA在具有0.2cm電極隙的比色杯中混合。Eppendorf電穿孔儀(Model 2510)應用2.0kV的脈沖。將細胞鋪到SGI板上(5g/L bactocasamino acids，6.7g/L無氨基酸的酵母氮堿(nitrogen base)，20g/L葡萄糖，40mg/L DL-色氨酸，20g/L瓊脂)。通過直接在隨機選擇的菌落上進行的PCR分析確認轉(zhuǎn)化體。
3.在轉(zhuǎn)化的酵母細胞中的p450的表達利用單一酵母菌落接種30mL SGI培養(yǎng)基(5g/L bactocasamino acids，6.7g/L無氨基酸的酵母氮堿，20g/L葡萄糖，40mg/L DL-色氨酸)并于30℃培養(yǎng)大約24小時。將等分試樣的這種培養(yǎng)物以1∶50稀釋到1000mL的YPGE培養(yǎng)基中(10g/L酵母提取物，20g/L細菌培養(yǎng)用蛋白胨，5g/L葡萄糖，30ml/L乙醇)并培養(yǎng)直到葡萄糖被完全耗盡，如通過Diastix尿分析試劑條(Bayer，Elkhart，IN)的比色變化所示。通過加入DL-半乳糖到終濃度2％來起始克隆P450的誘導。在使用前將培養(yǎng)物再培養(yǎng)20小時進行體內(nèi)活性測定或進行微粒體制備。
使用表達pYeDP60-CYP71D20(催化煙草(Nicotiana tabacum)中5-表-aristolochene和1-deoxycapsidiol的羥基化作用的p450)的WAT11酵母細胞作為p450表達和酶活性測定的對照。
為了更加詳細地評估p450的酵母表達的有效性，進行簡化的CO差異光譜分析。簡化的CO光譜在450nm上顯現(xiàn)來自所有四種p450轉(zhuǎn)化的酵母品系的蛋白質(zhì)的峰。在來自對照，未轉(zhuǎn)化的酵母細胞或空白，載體對照酵母細胞的對照微粒體中沒有觀察到類似的峰。所述結(jié)果顯示p450蛋白在具有pYeDP60-CYP 450的酵母品系中得以有效表達。酵母微粒體中表達的p450蛋白的濃度為從45到68nmole/mg總蛋白。
4.體內(nèi)酶測定通過對酵母培養(yǎng)物飼以DL-煙堿(吡咯烷-2-14C)來測定轉(zhuǎn)化的酵母細胞中煙堿脫甲基酶的活性。將14C標記的煙堿(54mCi/mmol)加入到75μl的半乳糖誘導的培養(yǎng)物中達到最終濃度55μM。在14ml聚丙烯試管中以搖動將測定培養(yǎng)物溫育6小時并以900μl甲醇進行抽提。離心后，以rp-HPLC分離20μl的甲醇提取物并通過LSC對去甲煙堿級分進行量化。
WAT11(pYeDP60-CYP71D20)的對照培養(yǎng)物并未將煙堿轉(zhuǎn)變成去甲煙堿，顯示W(wǎng)AT11酵母株并不包含能夠催化煙堿生物轉(zhuǎn)化成去甲煙堿步驟的內(nèi)源酶活性。相反，表達煙草煙堿脫甲基酶基因的酵母生產(chǎn)出可檢測量的去甲煙堿，顯示SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的翻譯產(chǎn)物的煙堿脫甲基酶活性。
5.酵母微粒體制備半乳糖誘導20小時后，通過離心收集酵母細胞并用TES-M緩沖液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA，0.6M山梨糖醇，10mM 2-巰基乙醇)洗滌兩次。將沉淀物重懸于抽提緩沖液中(50mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA，0.6M山梨糖醇，2mM 2-巰基乙醇，1％牛血清白蛋白，1片/50ml的蛋白酶抑制劑混合物(Roche))。隨后用玻璃珠(直徑0.5mm，Sigma)破裂細胞并將細胞提取物以20,000xg離心20min以除去細胞碎片。將上清液于100,000xg進行超速離心60min，得到的沉淀物包含微粒體級分。將所述微粒體級分以1mg/mL的蛋白質(zhì)濃度懸浮于TEG-M緩沖液中(50mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA，20％甘油和1.5mM 2-巰基乙醇)。將微粒體制劑保存于液氮冷凍庫中待用。
6.酵母微粒體制備物中的酶活性測定用酵母微粒體制備物進行煙堿脫甲基酶活性的測定。特別地，DL-煙堿(吡咯烷-2-14C)獲自Moravek Biochemicals并具有54mCi/mmol的特異性活性。氯丙嗪(CPZ)和氧化的細胞色素C(cyt.C)，二者都是P450抑制劑，購自Sigma。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)是細胞色素P450通過NADPH細胞色素P450還原酶的典型電子供體。在對照溫育中不存在NADPH。常規(guī)酶測定包括微粒體蛋白(約1mg/ml)，6mMNADPH，和55μM14C標記的煙堿。在使用時，CPZ和Cyt.C的濃度分別為1mM和100μM。反應在25℃進行1小時并通過加入300μl甲醇到每個25μl反應混合物中進行終止。離心后，使用來自Varian的InertsilODS-33μ(150×4.6mm)色譜柱以反相高效液相色譜(HPLC)系統(tǒng)(Agilent)分離20μl的甲醇提取物。恒溶劑流動相是甲醇和50mM磷酸鉀緩沖液，pH 6.25的混合物，比率是60∶40(v/v)并且流速是1ml/min。收集去甲煙堿峰并以2900tri-carb液體閃爍計數(shù)器(LSC)(Perkin Elmer)進行量化，所述去甲煙堿峰是通過與真實可信的未標記去甲煙堿相比較而確定的。在1小時溫育后基于14C標記的去甲煙堿的產(chǎn)生來計算煙堿脫甲基酶的活性。
在來自表達CYP71D20的對照酵母細胞和三個用基因D120-AH4，D208-AC8，和D208-AD9轉(zhuǎn)化的測試p450酵母培養(yǎng)物的微粒體制備物中觀察到p450樣的活性。然而，對照和三個測試p450s沒有顯示任何去甲煙堿轉(zhuǎn)化的形成，顯示它們不包含能夠催化煙堿脫甲基的內(nèi)源或誘導酶。相反，來自HPLC和LSC分析的結(jié)果顯示使用獲自表達煙草煙堿脫甲基酶基因(D121-AA8)的酵母細胞的微粒體樣品，產(chǎn)生自煙堿脫甲基作用的可檢測的去甲煙堿的量。這些結(jié)果顯示煙堿脫甲基酶活性得自D121-AA8基因產(chǎn)物。所述煙堿脫甲基酶活性需要NADPH，并且顯示被p450特異性抑制劑所抑制，與煙草煙堿脫甲基酶作為p450一致。煙草煙堿脫甲基酶(D121-AA8)的酶活性是約10.8pKat/mg蛋白質(zhì)，如通過放射性強度和蛋白質(zhì)濃度所計算。將獲得的酵母細胞的典型的酶測定結(jié)果組顯示于下面的表中(表4)。
表4在表達D121-AA8和對照P450基因的酵母細胞的微粒體中的脫甲基酶活性
*n＝12，其它的n＝3使用來自D121-AA8酵母細胞的微粒體，從所述測定中去除NADPH導致煙堿脫甲基酶活性的消失；因此沒有形成去甲煙堿(表4)。當將兩種已知的P450抑制劑，氯丙嗪(CPZ，1mM)和氧化的細胞色素c(cyt C，100μM，)單獨加入酶測定混合物中并在加入甲醇終止溶液之前溫育1小時，煙堿脫甲基酶活性明顯減少(表4)。綜上所述，這些實驗證實D121-AA8編碼細胞色素p450蛋白質(zhì)，當其在酵母中表達時，催化煙堿轉(zhuǎn)化為去甲煙堿。
實施例11分離的核酸片段的相關(guān)氨基酸序列同一性推斷由實施例8獲得的細胞色素p450片段的核酸序列的氨基酸序列。推斷區(qū)對應于緊接GXRXCP(A/G)(SEQ ID NO2273)序列基序之后到羧基末端，或終止密碼子的氨基酸。在比較片段的序列同一性之后，觀察到具有70％或更大氨基酸同一性的那些序列的獨特組。觀察到優(yōu)選的分組為具有80％或更大氨基酸同一性的那些序列，更加優(yōu)選的分組具有90％或更大氨基酸同一性，且最優(yōu)選的分組具有99％或更大氨基酸同一性的那些序列。發(fā)現(xiàn)幾個獨特的核酸序列與其它片段具有完全的氨基酸同一性，所以只報道了具有相同氨基酸的一個成員。
表5的組19的氨基酸同一性對應于基于它們的核酸序列的三個獨特的組。組成員的氨基酸序列和它們的同一性顯示在圖159H中。指示出氨基酸差異。
對于使用植物的基因克隆和功能性研究，選擇了每個氨基酸同一性組的至少一個成員。此外，對于基因克隆和功能性研究選擇了組成員，所述成員通過如RNA和DNA分析評估，受乙烯處理或其它生物學差異的不同影響。為了有助于基因克隆，表達研究和整體植物評估，可以基于基因序列同一性和不同序列制備肽特異性抗體。
表5煙草屬p450氨基酸序列同一性組組 片段1D58-BG7(SEQ ID NO11)，D58-AB1(SEQ ID NO13)2D58-BE4(SEQ ID NO17)3D56-AH7(SEQ ID NO19)；D13a-5(SEQ ID NO21)4D56-AG10(SEQ ID NO23)；D34-62(SEQ ID NO27)5D56-AA7(SEQ ID NO29)；D56-AE1(SEQ ID NO31)；185-BD3(SEQ IDNO153)6D35-BB7(SEQ ID NO33)；D177-BA7(SEQ ID NO35)；D56A-AB6(SEQID NO37)；D144-AE2(SEQ ID NO39)7D56-AG11(SEQ ID NO41)；D179-AA1(SEQ ID NO43)8D56-AC7(SEQ ID NO45)；D144-AD1(SEQ ID NO47)9D144-AB5(SEQ ID NO49)10 D181-AB5(SEQ ID NO51)；D73-AC9(SEQ ID NO53)11 D56-AC12(SEQ ID NO55)12 D58-AB9(SEQ ID NO57)；D56-AG9(SEQ ID NO59)；D56-AG6(SEQ IDNO61)；D35-BG11(SEQ ID NO63)；D35-42(SEQ ID NO65)；D35-BA3(SEQ IDNO67)；D34-57(SEQ ID NO69)；D34-52(SEQ ID NO71)13 D56AD10(SEQ ID NO75)14 D56-AA11(SEQ ID NO77)15 D177-BD5(SEQ ID NO79)；D177-BD7(SEQ ID NO93)16 D56A-AG10(SEQ ID NO81)；D58-BC5(SEQ ID NO83)；D58-AD12(SEQID NO85)17 D56-AC11(SEQ ID NO87)；D56-AD6(SEQ ID NO97)18 D73A-AD6(SEQ ID NO99)19 D70A-AB5(SEQ ID NO105)；D70A-AB8(SEQ ID NO109)；D70A-BH2(SEQ ID NO111)；D70A-AA4(SEQ ID NO113)；D70A-BA1(SEQ ID NO115)；D70A-BA9(SEQ ID NO117)20 D70A-BD4(SEQ ID NO119)21 D181-AC5(SEQ ID NO121)；D144-AH1(SEQ ID NO123)；D34-65(SEQID NO125)22 D35-BG2(SEQ ID NO127)23 D73A-AH7(SEQ ID NO129)24 D58-AA1(SEQ ID NO131)；D185-BC1(SEQ ID NO143)；D185-BG2(SEQID NO145)25 D73-AE10(SEQ ID NO133)26 D56-AC12(SEQ ID NO135)27 D177-BF7(SEQ ID NO137)；185-BD2(SEQ ID NO149)28 D73A-AG3(SEQ ID NO139)29 D70A-AA12(SEQ ID NO141)；D176-BF2(SEQ ID NO95)30 D176-BC3(SEQ ID NO155)31 D176-BB3(SEQ ID NO157)32 D186-AH4(SEQ ID NO15)實施例12全長克隆的相關(guān)氨基酸序列同一性對實施例5中克隆的全長煙草屬基因的核酸序列推斷它們完整的氨基酸序列。通過三個保守的p450結(jié)構(gòu)域基序的存在鑒定細胞色素p450基因，所述三個保守的p450結(jié)構(gòu)域基序?qū)隰然┒松系腢XXRXXZ(SEQ ID NO2274)，PXRFXF(SEQ ID NO2275)或GXRXC(SEQ ID NO2276)，其中U是E或K，X是任何氨基酸而Z是P，T，S或M。利用BLAST程序?qū)⑺鼈兊娜L序列彼此和與已知的煙草基因相比較來對所有的p450基因的氨基酸同一性進行表征。所述程序使用NCBI特別的BLAST工具(比對兩種序列(bl2seq)，http//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html)。在沒有對于核酸序列的濾器的BLASTN和對于氨基酸序列的BLASTP之下比對兩種序列?；谒鼈兊陌俜直劝被嵬恍?，將每種序列歸類到同一性組中，其中所述組包含與另一成員共有至少85％同一性的成員。觀察到優(yōu)選的分組為具有90％或更大氨基酸同一性的那些序列，更加優(yōu)選的組具有95％或更大氨基酸同一性，且最優(yōu)選的分組具有99％或更大氨基酸同一性的那些序列。使用這些標準，鑒定了25個獨特的組并且將其描述在表6中。推斷全長煙堿脫甲基酶基因的氨基酸序列具有在SEQ ID NO5中提供的序列(圖4)。
在用于表6的氨基酸同一性的參數(shù)中，發(fā)現(xiàn)三組包含與已知煙草基因的超過85％或更大的同一性。對于全長序列，組5的成員與GenBank序列GI14423327(SEQ ID NO2271)(或AAK62346)具有多達96％的氨基酸同一性。組23與GI14423328(SEQ ID NO2277)(或AAK62347)具有多達93％的氨基酸同一性，并且組24與GI14423318(SEQ ID NO2278)(或AAK62343)具有92％的同一性。
表6全長煙草屬p450基因的氨基酸序列同一性組1D208-AD9(SEQ ID NO233)；D120-AH4(SEQ ID NO189)；D121-AA8(SEQ ID NO191)，D122-AF10(SEQ ID NO193)；D103-AH3(SEQ ID NO231)；D208-AC8(SEQ ID NO227)；D235-AB1(SEQ ID NO255)2D244-AD4(SEQ ID NO259)；D244-AB6(SEQ ID NO283)；D285-AA8(SEQ ID NO2205)；D285-AB9(SEQ ID NO2206)；D268-AE2(SEQ ID NO279)3D100A-AC3(SEQ ID NO177)；D100A-BE2(SEQ ID NO2209)4D205-BE9(SEQ ID NO285)；D205-BG9(SEQ ID NO211)；D205-AH4(SEQ ID NO303)
5D259-AB9(SEQ ID NO269)；D257-AE4(SEQ ID NO277)；D147-AD3(SEQ ID NO203)6D249-AE8(SEQ ID NO265)；D-248-AA6(SEQ ID NO263)7D233-AG7(SEQ ID NO275)；D224-BD11(SEQ ID NO249)；DAF108D105-AD6(SEQ ID NO181)；D215-AB5(SEQ ID NO229)；D135-AE1(SEQ ID NO199)9D87A-AF3(SEQ ID NO225)，D210-BD4(SEQ ID NO273)10 D89-AB1(SEQ ID NO159)；D89-AD2(SEQ ID NO161)；D163-AG11(SEQID NO207)；D163-AF12(SEQ ID NO205)11 D267-AF10(SEQ ID NO305)；D96-AC2(SEQ ID NO169)；D96-AB6(SEQID NO167)；D207-AA5(SEQ ID NO213)；D207-AB4(SEQ ID NO215)；D207-AC4(SEQ ID NO217)12 D98-AG1(SEQ ID NO173)；D98-AA1(SEQ ID NO171)13 D209-AA12(SEQ ID NO221)；D209-AA11；D209-AH10(SEQ ID NO223)；D209-AH12(SEQ ID NO241)；D90A-BB3(SEQ ID NO163)14 D129-AD10(SEQ ID NO197)；D104A-AE8(SEQ ID NO179)15 D228-AH8(SEQ ID NO253)；D228-AD7(SEQ ID NO251)，D250-AC11(SEQ ID NO267)；D247-AH1(SEQ ID NO261)16 D128-AB7(SEQ ID NO195)；D243-AA2(SEQ ID NO257)；D125-AF11(SEQ ID NO237)17 D284-AH5(SEQ ID NO307)；D110-AF12(SEQ ID NO185)18 D221-BB8(SEQ ID NO243)19 D222-BH4(SEQ ID NO245)20 D134-AE11(SEQ ID NO239)21 D109-AH8(SEQ ID NO183)22 D136-AF4(SEQ ID NO287)23 D237-AD1(SEQ ID NO235)24 D112-AA5(SEQ ID NO187)25 D283-AC1(SEQ ID NO281)
基于靠近羧基端的介于UXXRXXZ p450結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO2274)和GXRXC p450結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO2276)之間的高度保守氨基酸同源性，來對全長基因進行進一步分組。如在圖160A到160E中所顯示，基于保守結(jié)構(gòu)域之間的序列同源性對各個克隆進行比對，并將其置于獨特的同一性組中。在數(shù)種情況下盡管所述克隆的核酸序列是獨特的，對于所述區(qū)域的氨基酸序列是相同的。觀察到優(yōu)選的分組具有90％或更大的氨基酸同一性的那些序列，更優(yōu)選的分組具有95％或更大的氨基酸同一性，并且最優(yōu)選的分組具有99％或更大的氨基酸同一性的那些序列。最終的分組類似于基于除了組17(表6的)之外的克隆的完整氨基酸序列的百分比同一性的分組，將所述組17分成兩個獨特的組。
在用于表7的氨基酸同一性的參數(shù)中，發(fā)現(xiàn)三個組包含與已知煙草基因的90％或更大的同一性。對于全長序列，組5的成員與GenBank序列GI14423326(SEQ ID NO2279)(或AAK62346)具有高達93.4％的氨基酸同一性。組23與GI14423328(SEQ ID NO2277)(或AAK62347)具有高達91.8％的氨基酸同一性，并且組24與GI14423318(SEQ ID NO2278)(或AAK62342)具有98.8％的同一性。
表7在煙草屬p450基因的保守結(jié)構(gòu)域之間的區(qū)域的氨基酸序列同一性組1D208-AD9(SEQ ID NO233)；D120-AH4(SEQ ID NO189)；D121-AA8(SEQ ID NO191)，D122-AF10(SEQ ID NO193)；D103-AH3(SEQ ID NO231)；D208-AC8(SEQ ID NO227)；D23 5-AB1(SEQ ID NO255)2D244-AD4(SEQ ID NO259)；D244-AB6(SEQ ID NO283)；D285-AA8(SEQ ID NO2205)；D285-AB9(SEQ ID NO2206)；D268-AE2(SEQ ID NO279)3D100A-AC3(SEQ ID NO177)；D100A-BE2(SEQ ID NO2209)4D205-BE9(SEQ ID NO285)；D205-BG9(SEQ ID NO211)；D205-AH4(SEQ ID NO303)5D259-AB9(SEQ ID NO269)；D257-AE4(SEQ ID NO277)；D147-AD3(SEQ ID NO203)
6D249-AE8(SEQ ID NO265)；D-248-AA6(SEQ ID NO263)7D233-AG7(SEQ ID NO275)；D224-BD11(SEQ ID NO249)；DAF108D105-AD6(SEQ ID NO181)；D215-AB5(SEQ ID NO229)；D135-AE1(SEQ ID NO199)9D87A-AF3(SEQ ID NO225)，D210-BD4(SEQ ID NO273)10 D89-AB1(SEQ ID NO159)；D89-AD2(SEQ ID NO161)；D163-AG11(SEQID NO207)；D163-AF12(SEQ ID NO205)11 D267-AF10(SEQ ID NO305)；D96-AC2(SEQ ID NO169)；D96-AB6(SEQID NO167)；D207-AA5(SEQ ID NO213)；D207-AB4(SEQ ID NO215)；D207-AC4(SEQ ID NO217)12 D98-AG1(SEQ ID NO173)；D98-AA1(SEQ ID NO171)13 D209-AA12(SEQ ID NO221)；D209-AA11；D209-AH10(SEQ IDNO223)；D209-AH12(SEQ ID NO241)；D90A-BB3(SEQ ID NO163)14 D129-AD10(SEQ ID NO197)；D104A-AE8(SEQ ID NO179)15 D228-AH8(SEQ ID NO253)；D228-AD7(SEQ ID NO251)，D250-AC11(SEQ ID NO267)；D247-AH1(SEQ ID NO261)16 D128-AB7(SEQ ID NO195)；D243-AA2(SEQ ID NO257)；D125-AF11(SEQ ID NO237)17 D284-AH5(SEQ ID NO307)；D110-AF12(SEQ ID NO185)18 D221-BB8(SEQ ID NO243)19 D222-BH4(SEQ ID NO245)20 D134-AE11(SEQ ID NO239)21 D109-AH8(SEQ ID NO183)22 D136-AF4(SEQ ID NO285)23 D237-AD1(SEQ ID NO235)24 D112-AA5(SEQ ID NO187)25 D283-AC1(SEQ ID NO281)26 D110-AF12(SEQ ID NO185)
實施例13缺乏一種或多種煙草P450特異性結(jié)構(gòu)域的煙草屬細胞色素P450克隆四個克隆與在表6中報道的其它煙草細胞色素基因具有高度核酸同源性，范圍從90％到99％的核酸同源性。所述四個克隆包括D136-AD5(SEQID NO292)，D138-AD12(SEQ ID NO294)，D243-AB3(SEQ ID NO298)和D250-AC11(SEQ ID NO300)。不過，由于核苷酸移碼，這些基因并不包含三個C-末端細胞色素p450結(jié)構(gòu)域的其中一個或多個并且被排除在表6或表7中出現(xiàn)的同一性組之外。
一個克隆D95-AG1的氨基酸同一性不包含用于將在表6或表7中的p450煙草基因進行分組的第三個結(jié)構(gòu)域，GXRXC(SEQ ID NO2276)。該克隆的核酸序列與其它煙草細胞色素基因具有低同源性，并且因此，該克隆代表在煙草屬中的細胞色素p450基因的新的組。
實施例14煙草屬細胞色素P450片段和克隆在煙草質(zhì)量的變化調(diào)控中的應用煙草p450核酸片段或完整基因的應用在鑒定和選擇那些具有變化的煙草表型或煙草組分，更重要的是，變化的代謝物的植物中是有用的。通過多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)生成轉(zhuǎn)基因煙草植物，所述轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在下調(diào)方向，例如反義方向，或過量表達例如有義方向上等結(jié)合了選自本文所報告的那些的核酸片段或全長基因。對于全長基因的過量表達，任何編碼本發(fā)明中所述全長基因的完整或功能性部分或氨基酸序列的核酸序列都是有利的。這些核酸序列理想地對于提高某種酶的表達是有效的并且因此導致煙草屬內(nèi)的表型效應。通過一系列回交獲得純合的煙草屬品系并評估表型變化，包括但不限于，利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員常規(guī)可獲得的技術(shù)進行內(nèi)源性p450RNA，轉(zhuǎn)錄物，p450表達肽和植物代謝物濃度的分析。煙草植物中呈現(xiàn)的變化提供了對于目標選定基因的功能性作用的信息或者用作優(yōu)選的煙草屬植物物種的信息。
實施例15來自轉(zhuǎn)化體白萊煙煙草的基因組煙草煙堿脫甲基酶的克隆如以上實施例中所述(還見生產(chǎn)商的方法)利用Qiagen Plant Easy試劑盒由轉(zhuǎn)化體白萊煙煙草植物品系4407-33(煙草(Nicotiana tabacum)品種4407品系)提取基因組DNA。
基于在前述實施例中克隆的5′啟動子和3′UTR區(qū)設計引物。正向引物為5′-GGC TCT AGA TAA ATC TCT TAA GTT ACT AGG TTC TAA-3′(SEQ ID NO2280)和5′-TCT CTA AAG TCC CCT TCC-3′(SEQ IDNO2288)而反向引物為5′-GGC TCT AGA AGT CAA TTA TCT TCT ACAAAC CTT TAT ATA TTA GC-3′(SEQ ID NO2281)，和5′-CCA GCA TTCCTC AAT TTC-3′(SEQ ID NO2289)。用100μl反應混合物將PCR應用于4407-33基因組DNA。使用Pfx高保真酶進行PCR擴增。在電泳后將PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上進行觀察。觀察到分子量大約為3.5kb的單一條帶并從凝膠上將其切下。利用凝膠純化試劑盒(Qiagen；基于生產(chǎn)商的方法)純化得到的條帶。通過酶XbaI(NEB；根據(jù)生產(chǎn)商的說明書使用)消化純化的DNA。利用相同方法通過XbaI消化pBluescript質(zhì)粒。將片段進行凝膠純化并連接入pBluescript質(zhì)粒中。將連接混合物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞GM109中并接種到包含100mg/l氨芐青霉素的LB平板上，伴隨以藍/白篩選。挑取白色菌落并培養(yǎng)在包含氨芐青霉素的10ml LB液體培養(yǎng)基中。通過小量制備提取DNA。利用CEQ 2000測序儀(Beckman，F(xiàn)ullerton，California)基于生產(chǎn)商的方法對包含插入片段的質(zhì)粒DNA進行測序。使用T3和T7引物以及8種其它內(nèi)部引物進行測序。對序列進行組合和分析，由此提供基因組序列(SEQ ID NO4；圖3)。基于基因組序列，確定在轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體煙草品系中的煙堿脫甲基酶基因都不包含轉(zhuǎn)座元件。
將SEQ ID NO5的序列與SEQ ID NO4的序列相比較能夠確定基因編碼部分內(nèi)的單一內(nèi)含子(鑒定為SEQ ID NO7的序列；圖5)。如圖2中所示，煙草煙堿脫甲基酶的基因組結(jié)構(gòu)包括在單一內(nèi)含子側(cè)面的兩個外顯子。第一個外顯子跨越SEQ ID NO4的核苷酸2010-2949，其編碼SEQ IDNO3的氨基酸1-313，第二個外顯子跨越SEQ ID NO4的核苷酸3947-4562，其編碼SEQ ID NO3的氨基酸314-517。因此，所述內(nèi)含子跨越SEQ ID NO4的核苷酸2950-3946。內(nèi)含子序列提供在圖5中并且是SEQ ID NO7的序列。基因組DNA序列的翻譯產(chǎn)物作為SEQ ID NO3的序列提供在圖3中。煙草煙堿脫甲基酶氨基酸序列包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜錨定基序。
實施例16由轉(zhuǎn)化體煙草克隆5′側(cè)翼序列(SEO ID NO8)和3′UTR(SEO ID NO9)A.來自轉(zhuǎn)化體煙草葉組織的總DNA的分離從轉(zhuǎn)化體煙草4407-33的葉中分離基因組DNA。根據(jù)生產(chǎn)商的方案使用來自Qiagen，Inc.(Valencia，Ca)公司的DNeasy Plant Mini試劑盒進行DNA的分離。在此將生產(chǎn)商的手冊Dneasy′Plant Mini and DNeasy PlantMaxi Handbook，Qiagen January 2004并入作為參考。DNA制備方法包括下列步驟在液氮下，將煙草葉組織(大約20mg干重)研磨成精細粉末，進行1分鐘。將組織粉末轉(zhuǎn)移入1.5ml管中。將緩沖液AP1(400μl)和4μl的RNA酶貯存溶液(100mg/ml)加入到最大100mg的研磨葉組織中并進行劇烈渦旋。將混合物于65℃溫育10min并在溫育期間通過倒位試管將其混合2-3次。隨后將緩沖液AP2(130μl)加入到裂解物中。將混合物混合并在冰上溫育5min。將裂解物應用到QIAshredder Mini離心柱上并離心2min(14,000rpm)。將流過物級分轉(zhuǎn)移到新的管中，不擾動細胞碎片沉淀。隨后將緩沖液AP3/E(1.5體積)加入到澄清的裂解物中并通過抽吸進行混合。將來自在前步驟的包括任何沉淀物的混合物(650μl)應用到DNeasy Mini離心柱上。將混合物于＞6000xg(＞8000rpm)離心1min并棄去流過物。用剩余樣品對此進行重復并棄去流過物和收集管。將DNeasyMini離心柱置于新的2ml收集管中。隨后將緩沖液AW(500μl)加入到DNeasy柱上并離心1min(＞8000rpm)。棄去流過物。在接下來的步驟中重新使用該收集管。隨后將緩沖液AW(500μl)加到DNeasy柱上并離心2min(＞14,000rpm)以便干燥膜。將DNeasy柱轉(zhuǎn)移到1.5ml管中。隨后將緩沖液AE(100μl)吸取到DNeasy膜上。將混合物于室溫(15-25℃)溫育5min并隨后離心1min(＞8000rpm)來洗脫。
通過在瓊脂糖凝膠上將樣品進行電泳來評估DNA的質(zhì)與量。
B.結(jié)構(gòu)基因5′側(cè)翼序列的克隆使用改進的反向PCR方法克隆來自SEQ ID NO5的結(jié)構(gòu)基因的5’側(cè)翼序列的750個核苷酸。首先，基于已知序列片段中的限制性位點和5’側(cè)翼序列下游的限制性位點間距來選擇合適的限制性酶?；谶@種已知的片段設計兩條引物。正向引物位于反向引物的下游。反向引物位于已知片段的3’部分。
克隆方法包括下列步驟用20-40個單位的合適的限制性酶(EcoRI和SpeI)在50μl反應混合物中消化純化的基因組DNA(5μg)。用1/10體積的反應混合物進行瓊脂糖凝膠電泳以確定DNA是否消化完全。在完全消化后通過于4℃過夜連接進行直接連接。將200μl包含10μl消化DNA和0.2μl T4 DNA連接酶(NEB)的反應混合物于4℃過夜連接。在獲得人工小環(huán)狀基因組之后進行連接反應物的PCR。用10μl連接反應物和來自已知片段的2條引物在兩個不同方向上于50μl反應混合物中進行PCR。應用梯度PCR程序，退火溫度為45-56℃。
進行瓊脂糖凝膠電泳以檢查PCR反應。從凝膠上切下的所需的條帶并使用來自QIAGEN的QIAquick凝膠純化試劑盒來純化所述條帶。按照生產(chǎn)商的說明書將純化的PCR片段連接入pGEM-T Easy載體(Promega，Madison，WI)中。按照生產(chǎn)商的說明書利用SV小量制備試劑盒(Promega，Madison，WI)通過小量制備來抽提轉(zhuǎn)化的DNA質(zhì)粒。利用CEQ 2000測序儀(Beckman，F(xiàn)ullerton，CA)對包含插入片段的質(zhì)粒DNA進行測序。通過上述方法克隆5’側(cè)翼序列的大約758nt(SEQ ID NO4的核苷酸1241-2009)。
C.結(jié)構(gòu)基因的較長5′側(cè)翼序列(SEQ ID NO8；圖6)的克隆根據(jù)生產(chǎn)商的用戶手冊，使用BD基因組步移(genome walker)通用試劑盒(Clontech laboratories，Inc.，PaloAlto，CA)來克隆結(jié)構(gòu)基因D121-AA8，另外的5′側(cè)翼序列。在此將生產(chǎn)商的手冊BD Genome Walker August，2004并入作為參考。通過將樣品在0.5％瓊脂糖凝膠上進行電泳來測試煙草基因組DNA的大小和純度。對煙草33文庫基因組步移構(gòu)建設立總共4次平端反應(DRA I，STU I，ECOR V，PVUII)。在消化DNAs的純化之后，將消化的基因組DNAs連接到基因組步移接頭上。通過利用接頭引物AP1和來自D121-AA8的基因特異性引物(CTCTATTGATACTAGCTGGTTTTGGAC；SEQ ID NO22 82)對四種消化的DNA’s進行初步PCR反應。將初步PCR產(chǎn)物直接用作模板進行嵌套PCR。在PCR反應中使用試劑盒提供的接頭嵌套引物和來自已知克隆D121-AA8(SEQ ID NO5)的嵌套引物(GGAGGGAGAGTATAACTTACGGATTC；SEQ ID NO2283)。通過進行凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。從凝膠上切下所需的條帶，利用來自QIAGEN的QIAquick凝膠純化試劑盒純化PCR片段。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書將純化的PCR片段連接入pGEM-T Easy載體(Promega，Madison，WI)中。利用SV小量制備試劑盒(Promega，Madison，WI)并按照生產(chǎn)商的說明書通過小量制備抽提轉(zhuǎn)化的DNA質(zhì)粒。利用CEQ 2000測序儀(Beckman，F(xiàn)ullerton，CA)對包含插入片段的質(zhì)粒DNA進行測序。通過上述方法克隆另一種大約853nt的5’側(cè)翼序列，包括SEQ ID NO4的核苷酸399-1240。
按照相同的方法進行第二輪的基因組步移，其中不同在于使用下列引物GWR1A(5′-AGTAACCGATTGCTCACGTTATCCTC-3′)(SEQ IDNO2284)和GWR2A(5′-CTCTATTCAACCCCACACGTAACTG-3′)(SEQID NO2285)。通過該方法克隆另外的約398nt的側(cè)翼序列，包括SEQ IDNO4的核苷酸1-398。
對調(diào)節(jié)元件的搜索揭示，除了“TATA”盒，“CAAT”盒，和“GAGA”盒之外，數(shù)種MYB-樣識別位點和器官特異性元件存在于煙草煙堿脫甲基酶啟動子區(qū)。使用標準的方法鑒定的推定導出(elicitor)反應性元件和氮調(diào)節(jié)的元件也出現(xiàn)在啟動子區(qū)中。
D.結(jié)構(gòu)基因的3′側(cè)翼序列的克隆按照生產(chǎn)商的使用手冊，將BD基因組步移通用試劑盒(Clontechlaboratories，Inc.，PaloAlto，CA)用于克隆結(jié)構(gòu)基因，D121-AA8的3′側(cè)翼序列?？寺〉姆椒ㄅc本實施例前述部分C所述相同，除了所用的基因特異性引物之外。設計的第一條引物接近D121-AA8結(jié)構(gòu)基因的末端(5′-CTAAAC TCT GGT CTG ATC CTG ATA CTT-3′)(SEQ ID NO2286)。進一步設計的嵌套引物在D121-AA8結(jié)構(gòu)基因的引物1的下游(CTA TAC GTA AGGTAA ATC CTG TGG AAC)(SEQ ID NO2287)。通過凝膠電泳來檢查最終PCR產(chǎn)物。從凝膠上切除需要的帶。使用來自QIAGEN的QIAquick凝膠純化試劑盒來純化PCR片段。按照生產(chǎn)商的說明書，將純化的PCR片段連接到pGEM-T Easy載體(Promega，Madison，WI)中。按照生產(chǎn)商的說明書，使用SV小量制備試劑盒(Promega，Madison，WI)通過小量制備來提取轉(zhuǎn)化的DNA質(zhì)粒。使用CEQ 2000測序儀(Beckman，F(xiàn)ullerton，CA)來對包含插入片段的質(zhì)粒DNA進行測序。通過上述方法來克隆約1617個核苷酸的另外的3′側(cè)翼序列(SEQ ID NO4的核苷酸4731-6347)。將3′UTR區(qū)的核酸序列顯示于圖7中。
實施例17篩選煙草屬的煙堿脫甲基酶基因的存在或不存在如下面的表8所示，將43個煙草屬物種，49個黃花煙草品系，和約600個煙草(Nicotiana tabacum)品系接種在花盆中，并將得到的植物培養(yǎng)在溫室中。
表8
葉子樣品取自6周齡的植物。按照生產(chǎn)商的說明書，使用Dneasy植物最少試劑盒(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)進行來自葉子的DNA提取。
基于本文所述的5′啟動子和3′UTR區(qū)來設計引物。正向引物是5′-GGCTCT AGA TAA ATC TCT TAA GTT ACT AGG TTC TAA-3′(SEQ IDNO2290)，反向引物是5′-GGC TCT AGA AGT CAA TTA TCT TCT ACAAAC CTT TAT ATA TTA GC-3′(SEQ ID NO2291)(來自5′側(cè)翼區(qū)的-750到180nt 3′UTR)。將提取自所有上述煙草屬品系中的基因組DNA用于PCR分析。將100μl的反應混合物和Pfx高保真酶用于PCR擴增。由于在物種之間的較少的同源性，所用的退火溫度是54℃(該溫度低于上述用于從4407轉(zhuǎn)化體煙草中克隆基因組序列的溫度2℃)。將該PCR產(chǎn)物在電泳后，在0.8％的瓊脂糖凝膠上進行觀察。具有約3.5kb分子量的單一條帶在凝膠上存在或不存在。將具有陽性條帶的品系認為是具有目標基因。對于缺乏陽性條帶的品系而言，使用4組另外的引物來進行4個另外的PCR反應。這些引物組選自基因的不同的區(qū)域。所述4組引物是(1)從起始密碼子(5′-GCC CAT CCT ACA GTT ACC TAT AAA AAGGAA G-3′)(SEQ ID NO2292)到終止密碼子(5′-ACC AAG ATG AAA GATCTT AGG TTT TAA-3′)(SEQ ID NO2293)，(2)從起始密碼子的上游570nt(5′-CTG ATC GTG AAG ATG A-3′)(SEQ ID NO2294)到內(nèi)含子的末端(5′-TGC TGC ATC CAA GAC CA-3′)(SEQ ID NO2295)，(3)從內(nèi)含子的起始的300nt的下游(5′-GGG CTA TAT GGA TTCGC-3′)(SEQ ID NO2296)到內(nèi)含子的末端(5′-TGC TGC ATC CAA GACCA-3′)(SEQ ID NO2295)，和(4)從內(nèi)含子的起始的300nt下游(5′-GGG CTA TAT GGA TTC GC-3′)(SEQ ID NO2296)到3′UTR(5′-AGT CAA TTA TCT TCT ACA AAC CTTTAT ATA TTA GC-3′)(SEQ ID NO2195)。
如果5個上述PCR反應都顯示沒有正確的條帶，認為所述品系缺乏目標基因。基因組DNA的量和目標煙堿脫甲基酶基因的PCR產(chǎn)物的實例描述在圖8和9中。
將被鑒定為缺乏煙堿脫甲基酶基因的生殖質(zhì)用作用栽培的煙草育種的來源材料。然而，在圖1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19和173-1到173-294中顯示的任何核酸序列，或其片段可以以類似方式進行使用。物種間或物種內(nèi)雜交方法組合以標準育種方法，諸如回交或譜系法可以用于將異?；虿淮嬖诘臒焿A脫甲基酶基因或在圖1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19和173-1到173-294中顯示的任何核酸序列或其片段，從供體來源傳遞到栽培的煙草中。對于煙堿脫甲基酶的篩選實驗的結(jié)果顯示在下面的表9中?？梢杂闷浔旧砘蛄硪环N陰性品系(例如，Nicotiana africana x Nicotiana africana或Nicotiana africana x Nicotianaamplexicaulis或任何適合的育種組合)來培育對于煙堿脫甲基酶是陰性的品系。還按照本領(lǐng)域已知的標準煙草育種技術(shù)來用任何商購品種的煙草來培育陰性品系?？梢园凑毡绢I(lǐng)域標準的方法來用任何其它相容性植物培育煙草品系。
表9來自篩選煙草屬的煙堿脫甲基酶基因的示例性結(jié)果
實施例18在煙堿脫甲基酶基因中產(chǎn)生或造成突變并篩選遺傳性變異使用分子技術(shù)包括在基因組中靶向誘導的局部病灶(TILLING)，DNA指紋法諸如擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)，和單核苷酸多態(tài)性(SNP)，來篩選在編碼煙堿脫甲基酶的序列或由圖1、3-7、10-158、162到170、172-1到172-19，和173-1到173-294中顯示的核酸序列所代表的任何其它基因中的先存在的遺傳性變異或突變。在實踐中，使用代表先存在的遺傳變異的植物群體諸如轉(zhuǎn)基因植物(例如，本文所述的那些的任一種)或通過使生殖組織、種子或其它植物組織與化學誘變劑諸如烷化劑、例如乙烷磺酸甲酯(EMS)，或輻射諸如X-射線或γ-射線接觸產(chǎn)生的那些。對于誘變處理的種群，對于每種類型的植物組織，通過實驗確定誘變的化學品或輻射的劑量從而使獲得的突變頻率低于由致死率或生殖不育性表征的閾值水平。基于突變的預期頻率，估計得自誘變處理的M1代種子的數(shù)量或M1植物種群的大小。M1植物的子代，M2代表示這樣的種群，其理想地對于基因，例如煙堿脫甲基酶基因中的突變進行評估。
可以將Tilling，DNA指紋法，SNP或類似的技術(shù)用于在需要的基因諸如煙堿脫甲基酶基因中檢測誘導的或天然存在的遺傳變異。所述變異可以得自缺失、置換、點突變、易位、倒位、復制、插入或完全的無效突變。這些技術(shù)可以用在標記輔助的選擇(MA育種程序)以將煙堿脫甲基酶基因或在圖1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19，和173-1到173-294顯示的任何核酸序列或其片段中的無效或不相似的等位基因傳遞或培育到其它的煙草中。育種者可以通過使包含無效或不相似的等位基因的基因型與農(nóng)藝上理想的基因型雜交來產(chǎn)生分離的種群。使用來自煙堿脫甲基酶序列或在圖1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19，和173-1到173-294中顯示的核酸序列，或其片段的標記，使用前面列出的技術(shù)之一，可以篩選在F2或回交代的植物。可以使被鑒定具有無效或不相似的等位基因的植物進行回交或自花傳粉來產(chǎn)生可以被篩選的下一代。根據(jù)所用的預期遺傳模式或MAS技術(shù)，可能必須的是，在回交的每個周期前給選定的植物進行自花傳粉從而輔助需要的個體植物的鑒定?？梢灾貜突亟换蚱渌挠N方法直到回收回歸親本的需要的表型。
實施例19將不同的煙堿脫甲基酶基因表達培育或傳遞到栽培的煙草中A.親代品系的選擇將供體煙草品系鑒定為具有不同煙堿脫甲基酶基因表達的那些(例如，使用基于PCR的策略被鑒定為缺乏煙堿脫甲基酶基因的煙草品系或?qū)τ跓焿A脫甲基酶是無效的煙草品系或表達具有改變的酶活性的煙堿脫甲基酶的煙草品系；或表達轉(zhuǎn)基因的煙草品系也被認為對于煙堿脫甲基酶基因的表達是不同的，所述轉(zhuǎn)基因改變或使基因表達沉默)或具有在圖1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19，和173-1到173-294中顯示的任何核酸序列或其片段的變體的那些，并且選擇所述供體煙草品系作為供體親本。按照本領(lǐng)域已知的標準方法，例如本文所述的那些來產(chǎn)生這些植物。其它的供體植物包括已經(jīng)經(jīng)過誘變處理并且隨后被鑒定為具有不同的煙堿脫甲基酶基因活性或基因產(chǎn)物的不同的活性的煙草植物，所述基因產(chǎn)物由在圖1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19，和173-1到173-294所顯示的任何核酸序列，或其片段編碼。一個示范性的供體親代是煙草品系，黃花煙草。
所述受體煙草品系典型地是任何商業(yè)煙草品種諸如煙草(Nicotianatabacum)TN 90。其它有用的煙草(Nicotiana tabacum)品種包括BU 64，CC101，CC 200，CC 27，CC 301，CC 400，CC 500，CC 600，CC 700，CC 800，CC900，Coker 176，Coker 319，Coker 371 Gold，Coker 48，CU 263，DF911，Galpao煙草，GL 26H，GL 350，GL 737，GL 939，GL 973，HB 04P，K 149，K326，K 346，K 358，K 394，K 399，K 730，KT 200，KY 10，KY 14，KY 160，KY17，KY 171，KY 907，KY 160，Little Crittenden，McNair 373，McNair 944，msKY 14xL8，Narrow Leaf Madole，NC 100，NC 102，NC 2000，NC 291，NC297，NC 299，NC 3，NC 4，NC 5，NC 6，NC 606，NC 71，NC 72，NC 810，NCBH 129，OXFORD 207，′Perique′煙草，PVH03，PVH09，PVH19，PVH50，PVH51，R 610，R 630，R 7-11，R 7-12，RG 17，RG 81，RG H4，RG H51，RGH4，RGH 51，RS 1410，SP 168，SP 172，SP 179，SP 210，SP 220，SP G-28，SPG-70，SP H20，SP NF3，TN 86，TN 97，TN D94，TN D950，TR(Tom Rosson)Madole，VA 309，VA 309，或VA 359。來自這些品種的種子還可以來自通過使用標準化學或分子方法篩選煙堿轉(zhuǎn)化的缺乏或存在得到的來源。這些商業(yè)物種還提供按照本文所述方法改變煙堿脫甲基酶活性的材料。本領(lǐng)域已知的其它無效品系和受體或供體品系也是有用的，并且被鑒定與本文所述的煙堿脫甲基酶基因不相似的品系也充當供體親本。受體品系還可以選自用于煙熏煙、白萊煙、深色煙草、弗吉尼亞煙或東方型煙草的任何煙草種類。表10顯示示范性煙草屬物種，其顯示與煙草(Nicotiana tabacum)的育種相容性(還見，例如，由APS公開的Compendium of Tobacco Diseases由Japan Tobacco Inc.公開的The Genus Nicotiana Illustrated。
表10可與煙草(Nicotiana tabacum)相容的示范性煙草(Nicotiana)物種
B.基因傳遞按照標準育種方法，供體親本與供體親本以相互的方式進行雜交(cross)或雜交(hybridize)。按照標準方法鑒定的成功的雜交產(chǎn)生能育的F1植物，或如果需要，與受體親本回交的F1植物。對來自F1植物的F2代的植物種群，關(guān)于不同的煙堿脫甲基酶基因表達(例如，按照標準方法，例如通過使用基于本文所述的煙堿脫甲基酶的核苷酸序列信息的引物的PCR方法，鑒定由于缺乏煙堿脫甲基酶基因，不能表達煙堿脫甲基酶的植物)或在圖1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19和173-1到173-294顯示的任何核酸序列，或其片段的不同表達，來進行篩選?；蛘?，將用于評估植物生物堿含量的本領(lǐng)域的已知的任何標準篩選方法用于鑒定不能將煙堿轉(zhuǎn)化為去甲煙堿的植物。接著，將選定的植物與受體親本進行雜交，并且給第一代回交(BC1)植物進行自花傳粉以產(chǎn)生BC1F2種群，又對所述BC1F2種群進行關(guān)于不同的煙堿脫甲基酶基因表達的篩選(例如，煙堿脫甲基酶基因的無效形式)。重復回交、自花傳粉和篩選的過程，例如至少4次，直到最終的篩選產(chǎn)生能育的并且與受體親本相當相似的植物。如果需要，給這種植物進行自花傳粉，并且隨后，再次對子代進行篩選以證實所述植物顯示不同的煙堿脫甲基酶基因表達(例如，顯示關(guān)于煙堿脫甲基酶的無效條件的植物)或在圖1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19和173-1到173-294中顯示的任何核酸序列，或其片段的不同表達。任選地進行選定植物的細胞遺傳學分析以證實染色體組與染色體配對的相互關(guān)系。使用標準方法來產(chǎn)生選定植物的培育種子，所述方法包括，例如田間測試，確證對于煙堿脫甲基酶的無效條件，或由在圖1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19和173-1到173-294中顯示的任何核酸序列或其片段編碼的多肽的無效或增加的條件，和對加工處理的葉子進行化學分析以證實生物堿的水平，特別地去甲煙堿含量和去甲煙堿/煙堿+去甲煙堿的比率或其它的由那些基因序列提供的這些理想性質(zhì)，所述基因序列見于在圖1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19，和173-1到173-294中顯示的任何核酸序列，或其片段。
在通過在受體(例如，黃花煙草)和供體親本(例如，TN 90)之間雜交得到的原始F1雜種與供體(例如，TN 90)雜交或回交的情形中，給這種回交的子代進行自花傳粉以產(chǎn)生BC1F2代，對所述BC1F2代關(guān)于煙堿脫甲基酶的無效或不相似的形式，或由在圖1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19，和173-1到173-294中顯示的任何核酸序列，或其片段編碼的多肽的無效或增加的條件，進行篩選。關(guān)于育種嘗試的剩下的內(nèi)容在上述段落中進行描述。
C.農(nóng)學性能測試和表型的確證使用標準田間方法，在田間，對通過育種和篩選產(chǎn)生的品系進行評估，所述育種和篩選關(guān)于不同的煙堿脫甲基酶基因表達(例如，關(guān)于煙堿脫甲基酶的無效條件)或在圖1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19和173-1到173-294中顯示的任何核酸序列，或其片段的表達進行。將包括原始受體親本(例如，TN 90)的對照基因型包括在內(nèi)，并將選中項目(entries)以完全隨機的分組設計或其它適合的田間設計排列在田間。使用煙草的標準農(nóng)學實踐，例如，將煙草進行收獲，稱重，在加工處理之前和過程中取樣進行化學以及其它常規(guī)的測試。進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析以證實選定的品系與受體，例如親本品系TN 90的相似性。
實施例20將改變的特性培育或傳遞到栽培的煙草中還可以將本文所述的基因的任一個，例如在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的那些核酸序列的任一個的表達按照本文所述的方法進行改變。這些基因提供改變植物表型，例如改善香味，或香氣或兩者，改善器官感覺性質(zhì)，或改善可保存性的基礎(chǔ)。接著，按照本領(lǐng)域已知的標準方法，例如本文所述的那些，將被鑒定具有改變的表型的植物用在育種方法中。
實施例21雜種植物產(chǎn)生被開發(fā)用于使用原生質(zhì)體融合產(chǎn)生雜種植物的標準原生質(zhì)體培養(yǎng)方法的應用對于產(chǎn)生具有不同基因表達(例如，不同煙堿脫甲基酶基因表達)的植物也是有用的。因此，從具有不同基因表達的第一和第二煙草植物產(chǎn)生原生質(zhì)體。通過成功的原生質(zhì)體融合培養(yǎng)胼胝體并接著再生植物。鑒定得到的子代雜種植物并按照標準方法將其對于不同的基因表達進行選擇，并且如果需要，可以將其用在任何標準育種方法中。
WO 03/078577，WO 2004/035745，PCT/US/2004/034218，和PCT/US/2004/034065和所有本文參考的其它參考文獻、專利、專利申請出版物、和專利申請結(jié)合入本文作為參考，其程度如同這些參考文獻、專利、專利申請出版物和專利申請的每一個單獨并入本文作為參考。
預期本領(lǐng)域那些技術(shù)人員在考慮本發(fā)明的前述詳細的描述后，在本發(fā)明的實踐上作出各種修改和改進。因此，意欲將這些修改和改進包括在下列權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生具有減少的煙堿脫甲基酶基因的表達的煙草植物的育種方法，所述方法包括下列步驟(a)提供具有不同煙堿脫甲基酶基因表達的第一煙草植物；(b)提供包含至少一個表型性狀的第二煙草植物；(c)使所述第一煙草植物與所述第二煙草植物雜交以產(chǎn)生F1子代植物；(d)收集具有所述不同的煙堿脫甲基酶基因的表達的所述F1子代的種子；和(e)萌發(fā)所述種子以產(chǎn)生具有減少的煙堿脫甲基酶基因的表達的煙草植物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一煙草植物包括具有突變的內(nèi)源煙堿脫甲基酶基因。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述第一煙草植物包括的突變是缺失、置換、點突變、易位、倒位、復制或插入。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一煙草植物包括具有無效突變的煙堿脫甲基酶基因。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一煙草植物包括使內(nèi)源煙堿脫甲基酶基因沉默的重組基因。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一煙草植物包括具有減少或改變的酶活性的煙堿脫甲基酶。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一煙草植物是轉(zhuǎn)基因植物。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一煙草植物包括Nicotianaafricana，Nicotiana amplexicaulis，Nicotiana arentsii，Nicotianabenthamiana，Nicotiana bigelovii，Nicotiana corymbosa，Nicotiana debneyi，Nicotiana excelsior，Nicotiana exigua，Nicotiana glutinosa，Nicotianagoodspeedii，Nicotiana gossei，Nicotiana hesperis，Nicotiana ingulba，Nicotiana knightiana，Nicotiana maritima，Nicotiana megalosiphon，Nicotianamiersii，Nicotiana nesophila，Nicotiana noctiflora，Nicotiana nudicaulis，Nicotiana otophora，Nicotiana palmeri，Nicotiana paniculata，Nicotianapetunioides，Nicotiana plumbaginifolia，Nicotiana repanda，Nicotianarosulata，Nicotiana rotundifolia，黃花煙草(Nicotiana rustica)，Nicotianasetchelli，Nicotiana stocktonii，Nicotiana eastii，Nicotiana suaveolens或Nicotiana trigonophylla。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述第一煙草植物包括Nicotianaamplexicaulis，Nicotiana benthamiana，Nicotiana bigelovii，Nicotianadebneyi，Nicotiana excelsior，Nicotiana glutinosa，Nicotiana goodspeedii，Nicotiana gossei，Nicotiana hesperis，Nicotiana knightiana，Nicotianamaritima，Nicotiana megalosiphon，Nicotiana nudicaulis，Nicotianapaniculata，Nicotiana plumbaginifolia，Nicotiana repanda，黃花煙草，Nicotiana suaveolens或Nicotiana trigonophylla。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一煙草植物是煙草(Nicotianatabacum)。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一煙草植物是東方型煙草、深色煙草、煙熏煙或晾煙，弗吉尼亞煙或白萊煙煙草植物。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二煙草植物是煙草(Nicotianatabacum)。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述煙草是BU 64，CC 101，CC 200，CC27，CC 301，CC 400，CC 500，CC 600，CC 700，CC 800，CC 900，Coker 176，Coker 319，Coker 371 Gold，Coker 48，CU 263，DF911，Galpao煙草，GL 26H，GL 350，GL 737，GL 939，GL 973，HB 04P，K 149，K 326，K 346，K 358，K394，K 399，K 730，KT 200，KY 10，KY 14，KY 160，KY 17，KY 171，KY 907，KY 160，Little Crittenden，McNair 373，McNair 944，msKY 14xL8，NarrowLeaf Madole，NC 100，NC 102，NC 2000，NC 291，NC 297，NC 299，NC 3，NC 4，NC 5，NC 6，NC 606，NC 71，NC 72，NC 810，NC BH 129，OXFORD207，′Perique′煙草，PVH03，PVH09，PVH19，PVH50，PVH51，R 610，R 630，R 7-11，R 7-12，RG 17，RG 81，RG H4，RG H51，RGH 4，RGH 51，RS 1410，SP 168，SP 172，SP 179，SP 210，SP 220，SP G-28，SP G-70，SP H20，SP NF3，TN 86，TN 90，TN 97，TN D94，TN D950，TR(Tom Rosson)Madole，VA 309，VA 309，或VA 359。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二煙草植物是東方型煙草、深色煙草、煙熏煙或晾煙，弗吉尼亞煙或白萊煙煙草植物。
15.權(quán)利要求1的任一項的方法，其中所述表型性狀包括疾病抗性；高產(chǎn)率；高級指數(shù)；可保存性；熟化品質(zhì)；可機械收割性；保持能力；葉子品質(zhì)；高度；成熟；莖長；或每株植物的葉子數(shù)量。
16.權(quán)利要求1的方法，其還包括用步驟(b)的植物給雄性不育或雄性不育雜種傳粉。
17.權(quán)利要求1的方法，其還包括使產(chǎn)生自步驟(e)的萌發(fā)的種子的植物回交或傳粉。
18.一種將煙堿脫甲基酶缺陷性狀培育到煙草植物中的方法，所述方法包括下列步驟a)使具有不同煙堿脫甲基酶基因表達的第一煙草植物與第二煙草植物雜交；b)產(chǎn)生所述雜交的子代煙草植物；c)從子代煙草植物中提取DNA樣品；d)使所述DNA樣品與標記核酸分子接觸，所述標記核酸分子與煙堿脫甲基酶基因或其片段雜交；和e)進行用于不同煙堿脫甲基酶基因表達性狀的標記輔助的育種方法。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述標記輔助的育種方法包括使用擴增片段長度多態(tài)性，限制性片段長度多態(tài)性，隨機擴增多態(tài)性展示，單核苷酸多態(tài)性，微衛(wèi)星標記，或在煙草基因組中靶向誘導的局部病灶。
20.一種產(chǎn)生煙草種子的方法，其包括將選自由下列各項組成的組的任何一種煙草植物與其本身或與第二種獨特的煙草進行雜交Nicotianaafricana，Nicotiana amplexicaulis，Nicotiana arentsii，Nicotianabenthamiana，Nicotiana bigelovii，Nicotiana corymbosa，Nicotiana debneyi，Nicotiana excelsior，Nicotiana exigua，Nicotiana glutinosa，Nicotianagoodspeedii，Nicotiana gossei，Nicotiana hesperis，Nicotiana ingulba，Nicotiana knightiana，Nicotiana maritima，Nicotiana megalosiphon，Nicotianamiersii，Nicotiana nesophila，Nicotiana noctiflora，Nicotiana nudicaulis，Nicotiana otophora，Nicotiana palmeri，Nicotiana paniculata，Nicotianapetunioides，Nicotiana plumbaginifolia，Nicotiana repanda，Nicotianarosulata，Nicotiana rotundifolia，黃花煙草，Nicotiana setchelli，Nicotianastocktonii，Nicotiana eastii，Nicotiana suaveolens或Nicotianatrigonophylla。
21.權(quán)利要求20的方法，其包括制備雜交的煙草種子的方法，所述方法包括將具有不同煙堿脫甲基酶基因表達的第一煙草植物與第二種獨特的煙草植物進行雜交。
22.權(quán)利要求21的方法，其中雜交包括下列步驟(a)種植種子，所述種子來自具有不同煙堿脫甲基酶基因表達的煙草植物和第二種獨特的煙草植物的雜交；(b)從所述種子生長煙草植物直到所述植物開花；(c)用來自所述第二煙草植物的花粉給具有不同煙堿脫甲基酶基因表達的煙草植物的花進行傳粉或用來自具有不同煙堿脫甲基酶基因表達的煙草植物的植物的花粉給所述第二煙草植物的花進行傳粉；和(d)收獲得自所述傳粉的種子。
23.一種在煙草育種程序中開發(fā)煙草植物的方法，其包括(a)提供具有不同的煙堿脫甲基酶基因表達的煙草植物，或其組分；和(b)將所述植物或組分作為使用煙草植物育種技術(shù)的育種原料的來源。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述植物育種技術(shù)包括集團選擇，回交，自花傳粉，漸滲現(xiàn)象，譜系選擇，純系選擇，單倍體/二倍體育種，或單種譜系。
25.一種煙草植物或其組分，其中所述植物按照權(quán)利要求1，18，20或23的任一項產(chǎn)生。
26.一種獲自按照權(quán)利要求1，18，20或23的任一項產(chǎn)生的植物的任一種的可再生煙草細胞的組織培養(yǎng)物，其中所述組織培養(yǎng)物再生這樣的煙草植物，所述煙草植物能夠表達具有不同煙堿脫甲基酶基因表達的煙草植物的所有生理和形態(tài)學特征。
27.權(quán)利要求26的組織培養(yǎng)物，其中所述可再生的細胞是胚、分生細胞、種子、花粉、葉、根、根端、或花或是來自其中的原生質(zhì)體或胼胝體。
28.一種產(chǎn)生煙草產(chǎn)品的方法，其包括(a)提供按照權(quán)利要求1，18，20或23的任一項產(chǎn)生的煙草植物；和(b)從所述煙草植物中制備煙草產(chǎn)品。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述煙草產(chǎn)品是加工處理的葉子或莖。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所述煙草產(chǎn)品是無煙的煙草產(chǎn)品。
31.權(quán)利要求28的煙草產(chǎn)品，其中所述煙草產(chǎn)品是濕或干鼻煙，嚼煙，卷煙，雪茄煙，小雪茄煙，pipe tobacco或bidis。
32.一種產(chǎn)生具有改變的特性的煙草植物的育種方法，所述方法包括下列步驟(a)提供具有改變的特性的第一煙草植物，其包含核酸分子的不同的基因表達，所述核酸分子選自由下列各項組成的組中在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列；(b)提供包含至少一種表型性狀的第二煙草植物；(c)使所述第一煙草植物與所述第二煙草植物雜交以產(chǎn)生F1子代植物；(d)收集具有所述改變的特性的所述F1子代的種子；和(e)使種子萌發(fā)以產(chǎn)生具有所述改變的特性的煙草植物。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述第一煙草植物包括內(nèi)源核酸分子，所述內(nèi)源核酸分子選自由下列各項組成的組在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列，其中所述核酸包括突變。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述第一煙草植物包括的突變是缺失、置換、點突變、易位、倒位、復制或插入。
35.權(quán)利要求32的方法，其中所述第一煙草植物包括內(nèi)源核酸分子，所述內(nèi)源核酸分子選自由下列各項組成的組在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列，所述核酸包括無效突變。
36.權(quán)利要求32的方法，其中所述第一煙草植物包含重組基因，所述重組基因使內(nèi)源核酸分子，選自由下列各項組成的組的內(nèi)源核酸分子在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列的表達沉默。
37.權(quán)利要求32的方法，其中所述第一煙草植物包含內(nèi)源核酸分子，所述內(nèi)源核酸分子選自由下列各項組成的組在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列，其中所述核酸分子編碼具有減少的或改變的酶活性的多肽。
38.權(quán)利要求32的方法，其中所述第一煙草植物是轉(zhuǎn)基因植物。
39.權(quán)利要求32的方法，其中所述第一煙草植物包括Nicotianaafricana，Nicotiana amplexicaulis，Nicotiana arentsii，Nicotiana benthamiana，Nicotiana bigelovii，Nicotiana corymbosa，Nicotiana debneyi，Nicotianaexcelsior，Nicotiana exigua，Nicotiana glutinosa，Nicotiana goodspeedii，Nicotiana gossei，Nicotiana hesperis，Nicotiana ingulba，Nicotianaknightiana，Nicotiana maritima，Nicotiana megalosiphon，Nicotiana miersii，Nicotiana nesophila，Nicotiana noctiflora，Nicotiana nudicaulis，Nicotianaotophora，Nicotiana palmeri，Nicotiana paniculata，Nicotiana petunioides，Nicotiana plumbaginifolia，Nicotiana repanda，Nicotiana rosulata，Nicotianarotundifolia，Nicotiana rustica，Nicotiana setchelli，Nicotiana stocktonii，Nicotiana eastii，Nicotiana suaveolens或Nicotiana trigonophylla。
40.權(quán)利要求32的方法，其中所述第一煙草植物是煙草。
41.權(quán)利要求32的方法，其中所述第一煙草植物是東方型煙草、深色煙草、煙熏煙或晾煙、弗吉尼亞煙或白萊煙煙草植物。
42.權(quán)利要求32的方法，其中所述第二煙草植物是煙草。
43.權(quán)利要求32的方法，其中所述煙草是BU 64，CC 101，CC 200，CC27，CC 301，CC 400，CC 500，CC 600，CC 700，CC 800，CC 900，Coker 176，Coker 319，Coker 371 Gold，Coker 48，CU 263，DF911，Galpao煙草，GL 26H，GL 350，GL 737，GL 939，GL 973，HB 04P，K 149，K 326，K 346，K 358，K394，K 399，K 730，KT 200，KY 10，KY 14，KY 160，KY 17，KY 171，KY 907，KY 160，Little Crittenden，McNair 373，McNair 944，msKY 14xL8，NarrowLeaf Madole，NC 100，NC 102，NC 2000，NC 291，NC 297，NC 299，NC 3，NC 4，NC 5，NC 6，NC 606，NC 71，NC 72，NC 810，NC BH 129，OXFORD207，′Perique′煙草，PVH03，PVH09，PVH19，PVH50，PVH51，R 610，R 630，R 7-11，R 7-12，RG 17，RG 81，RG H4，RG H51，RGH 4，RGH 51，RS 1410，SP 168，SP 172，SP 179，SP 210，SP 220，SP G-28，SP G-70，SP H20，SP NF3，TN 86，TN 90，TN 97，TN D94，TN D950，TR(Tom Rosson)Madole，VA 309，VA 309，或VA 359。
44.權(quán)利要求32的方法，其中所述第一煙草植物是東方型煙草、深色煙草、煙熏煙或晾煙、弗吉尼亞煙或白萊煙煙草植物。
45.權(quán)利要求32的任一項方法，其中所述表型性狀包括疾病抗性；高產(chǎn)率；高級指數(shù)；可保存性；熟化品質(zhì)；可機械收割性；保持能力；葉子品質(zhì)；高度；植物成熟；莖長；或每株植物的葉子數(shù)量。
46.權(quán)利要求32的方法，其還包括用步驟(b)的植物給雄性不育或雄性不育雜種傳粉。
47.權(quán)利要求32的方法，其還包括使步驟(e)的萌發(fā)的種子產(chǎn)生的植物回交或傳粉。
48.將一種特性培育到煙草植物中的方法，所述方法包括下列步驟a)使第一煙草植物與第二煙草植物進行雜交，所述第一煙草植物具有改變的特性，其包含選自由在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列組成的組的核酸分子的不同的基因表達；b)產(chǎn)生所述雜交的子代煙草植物；c)從子代煙草植物中提取DNA樣品；d)使DNA樣品與標記核酸分子接觸，所述標記核酸分子與在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列或其片段雜交；和e)進行改變的特性的標記輔助的育種方法。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述標記輔助的育種方法包括使用擴增片段長度多態(tài)性，限制性片段長度多態(tài)性，隨機擴增多態(tài)性展示，單核苷酸多態(tài)性，微衛(wèi)星標記，或在煙草基因組中的靶向誘導的局部病灶。
50.一種產(chǎn)生煙草種子的方法，其包括使得選自由Nicotiana africana，Nicotiana amplexicaulis，Nicotiana arentsii，Nicotiana benthamiana，Nicotianabigelovii，Nicotiana corymbosa，Nicotiana debneyi，Nicotiana excelsior，Nicotiana exigua，Nicotiana glutinosa，Nicotiana goodspeedii，Nicotianagossei，Nicotiana hesperis，Nicotiana ingulba，Nicotiana knightiana，Nicotianamaritima，Nicotiana megalosiphon，Nicotiana miersii，Nicotiana nesophila，Nicotiana noctiflora，Nicotiana nudicaulis，Nicotiana otophora，Nicotianapalmeri，Nicotiana paniculata，Nicotiana petunioides，Nicotianaplumbaginifolia，Nicotiana repanda，Nicotiana rosulata，Nicotianarotundifolia，Nicotiana rustica，Nicotiana setchelli，Nicotiana stocktonii，Nicotiana eastii和Nicotiana suaveolens組成的組的第一煙草植物與具有改變的特性的第二煙草植物進行雜交，所述改變的特性包括選自由在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列組成的組的核酸分子的不同的基因表達。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述第二煙草植物是煙草。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述煙草是BU 64，CC 101，CC 200，CC27，CC 301，CC 400，CC 500，CC 600，CC 700，CC 800，CC 900，Coker 176，Coker 319，Coker 371 Gold，Coker 48，CU 263，DF911，Galpao煙草，GL 26H，GL 350，GL 737，GL 939，GL 973，HB 04P，K 149，K 326，K 346，K 358，K394，K 399，K 730，KT 200，KY 10，KY 14，KY 160，KY 17，KY 171，KY 907，KY 160，Little Crittenden，McNair 373，McNair 944，msKY 14x L8，NarrowLeaf Madole，NC 100，NC 102，NC 2000，NC 291，NC 297，NC 299，NC 3，NC 4，NC 5，NC 6，NC 606，NC 71，NC 72，NC 810，NC BH 129，OXFORD207，′Perique′煙草，PVH03，PVH09，PVH19，PVH50，PVH51，R 610，R 630，R 7-11，R 7-12，RG 17，RG 81，RG H4，RG H51，RGH 4，RGH 51，RS 1410，SP 168，SP 172，SP 179，SP 210，SP 220，SP G-28，SP G-70，SP H20，SP NF3，TN 86，TN 90，TN 97，TN D94，TN D950，TR(Tom Rosson)Madole，VA 309，VA 309，或VA 359。
53.權(quán)利要求51的方法，其中雜交包括下列步驟(a)種植種子，所述種子來自具有改變的特性的煙草植物和第二種，獨特的煙草植物的雜交；(b)從所述種子生長煙草植物直到所述植物開花；(c)用來自所述第二煙草植物的花粉給具有改變的特性的煙草植物的花進行傳粉或用來自具有所述改變的特性的煙草植物的植物的花粉給所述第二煙草植物的花進行傳粉；和(d)收獲得自所述傳粉的種子。
54.一種在煙草育種程序中開發(fā)煙草植物的方法，其包括(a)提供具有改變的特性的煙草植物，或其組分，所述改變的特性包括選自由在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列組成的組的核酸分子的不同的基因表達；和(b)將所述植物或組分作為使用煙草植物育種技術(shù)的育種原料的來源。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述植物育種技術(shù)包括集團選擇，回交，自花傳粉，漸滲現(xiàn)象，譜系選擇，純系選擇，單倍體/二倍體育種，或單種譜系。
56.一種煙草植物或其組分，其中所述植物按照權(quán)利要求32，48或54的任一項產(chǎn)生。
57.一種獲自按照權(quán)利要求32，48，50或54的任一項產(chǎn)生的植物的任一種的可再生煙草細胞的組織培養(yǎng)物，其中所述組織培養(yǎng)物再生這樣的煙草植物，所述煙草植物能夠表達具有改變的特性的煙草植物的所有生理和形態(tài)學特征。
58.權(quán)利要求57的組織培養(yǎng)物，其中所述可再生的細胞是胚、分生細胞、種子、花粉、葉、根、根端、或花或是來自其中的原生質(zhì)體或胼胝體。
59.一種產(chǎn)生煙草產(chǎn)品的方法，所述方法包括(a)提供按照權(quán)利要求32，48，50或54的任一項產(chǎn)生的煙草植物；和(b)從所述煙草植物產(chǎn)生煙草產(chǎn)品。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述煙草產(chǎn)品是加工處理的葉子或莖。
61.權(quán)利要求59的方法，其中所述煙草產(chǎn)品是無煙煙草產(chǎn)品。
62.權(quán)利要求59的煙草產(chǎn)品，其中所述煙草產(chǎn)品是濕或干鼻煙，嚼煙，卷煙，雪茄煙，小雪茄煙，pipe tobacco或bidis。
63.一種分離的遺傳標記，其包括的核酸序列與選自由在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列組成的組中的核酸序列基本上相同。
64.權(quán)利要求63的分離的遺傳標記，其中所述核酸序列與選自由在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列組成的組中的核酸序列是至少70％相同的。
65.權(quán)利要求63的分離的遺傳標記，其中所述核酸序列包括的序列在嚴格條件下與選自由在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列組成的組中的核酸序列的互補序列雜交。
66.權(quán)利要求63的分離的遺傳標記，其中所述核酸序列是組成性的，或乙烯或衰老誘導的。
67.權(quán)利要求63的分離的遺傳標記，其中所述核酸序列編碼多肽，所述多肽與選自由在圖1，圖3和4，圖10-158，圖160A到160E，圖162-170，和圖172-1到172-19中顯示的氨基酸序列組成的組的氨基酸序列基本上相同。
68.權(quán)利要求63的分離的遺傳標記，其中所述核酸序列與異源基因可操縱地連接。
69.權(quán)利要求63的分離的遺傳標記，其中所述核酸序列與可誘導，組成性的，病原體或傷口誘導的，環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)的，或細胞或組織特異性啟動子可操縱地連接。
70.一種表達載體，所述表達載體包括核酸序列，所述核酸序列選自由在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162到170，圖172-1到172-19，和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列組成的組，所述載體能夠指導由所述核酸序列編碼的多肽的表達。
71.一種植物或植物組分，其包括由在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162-170，圖172-1到圖172-19和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列組成的組的分離的核酸序列，其中所述核酸序列在所述植物或所述植物組分中表達。
72.權(quán)利要求71的植物或植物組分，其中所述植物或植物組分是煙草屬物種。
73.權(quán)利要求72的植物或植物組分，其中所述煙草屬的物種選自在表8中顯示的煙草屬物種的組。
74.權(quán)利要求71的植物或植物組分，其中所述植物組分是葉、莖或種子。
75.權(quán)利要求74的植物或植物組分，其中所述葉子是加工處理的煙草葉子。
76.一種煙草產(chǎn)品，其包括權(quán)利要求71的植物或植物組分。
77.權(quán)利要求76的煙草產(chǎn)品，其中所述煙草產(chǎn)品是無煙煙草產(chǎn)品。
78.權(quán)利要求76的煙草產(chǎn)品，其中所述煙草產(chǎn)品是濕或干鼻煙、嚼煙、卷煙、雪茄煙、小雪茄煙、pipe tobacco或bidis。
79.一種從權(quán)利要求74的萌發(fā)的種子產(chǎn)生的植物。
80.一種在植物細胞中減少組成性、或乙烯誘導或衰老誘導的煙草多肽的表達或酶活性的方法，所述方法包括在所述植物細胞中減少內(nèi)源組成性、或乙烯或衰老誘導的煙草多肽的水平或酶活性。
81.權(quán)利要求80的方法，其中所述煙草多肽是p450。
82.權(quán)利要求80的方法，其中所述植物細胞來自煙草屬的物種。
83.權(quán)利要求82的方法，其中所述煙草屬的物種選自在表8中顯示的煙草屬物種的組。
84.權(quán)利要求80的方法，其中減少所述內(nèi)源組成性，或乙烯或衰老誘導的煙草多肽的水平包括在所述植物細胞中表達轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因編碼選自由下列各項組成的組的核酸序列的反義核酸分子在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162到170，圖172-1到172-19，和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列。
85.權(quán)利要求80的方法，其中減少所述組成性、或乙烯或衰老誘導的煙草多肽的水平包括表達在所述植物細胞中表達轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因包括選自由下列各項組成的組的核酸序列在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162到170，圖172-1到172-19，和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列，所述轉(zhuǎn)基因編碼組成性，或乙烯或衰老誘導的煙草多肽的雙鏈RNA分子。
86.權(quán)利要求80的方法，其中減少所述內(nèi)源組成性，或乙烯或衰老誘導的煙草多肽的水平包括在所述植物細胞中共抑制所述組成性，或乙烯或衰老誘導的煙草多肽。
87.權(quán)利要求80的方法，其中減少所述內(nèi)源組成性，或乙烯或衰老誘導的煙草多肽的水平包括在所述植物細胞中表達顯性失活基因產(chǎn)物。
88.權(quán)利要求87的方法，其中所述內(nèi)源組成性，或乙烯或衰老誘導的煙草多肽包含在基因中的突變，所述基因編碼選自由在圖1，圖3和4，圖10-158，圖160A到160E，圖162-170，和圖172-1到172-19中顯示的氨基酸序列組成的組的氨基酸序列。
89.權(quán)利要求80的方法，其中所述減少的表達在轉(zhuǎn)錄水平、在翻譯水平或在翻譯后水平發(fā)生。
90.一種在植物細胞中增加組成性，或乙烯或衰老誘導的煙草多肽的表達或酶活性的方法，所述方法包括在所述植物細胞中增加內(nèi)源組成性，或乙烯或衰老誘導的煙草多肽的水平或酶活性。
91.權(quán)利要求90的方法，其中所述植物細胞來自煙草屬物種。
92.權(quán)利要求91的方法，其中所述煙草屬的物種選自在表8中顯示的煙草屬物種的組。
93.權(quán)利要求90的方法，其中增加所述組成性、或乙烯或衰老誘導的煙草多肽的水平包括在所述植物細胞中表達轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因包括選自由下列各項組成的組的核酸序列在圖1，圖3-7，圖10-158，圖162到170，圖172-1到172-19，和圖173-1到173-294中顯示的核酸序列。
94.權(quán)利要求90的方法，其中所述增加的表達在轉(zhuǎn)錄水平、在翻譯水平，或在翻譯后水平發(fā)生。
全文摘要
本發(fā)明的特征是煙草屬(Nicotiana)核酸序列諸如在煙草屬植物中編碼組成性，或乙烯或衰老誘導的多肽，特別是細胞色素p450酶的序列，以及使用這些核酸序列的方法，和例如通過使用育種方法改變理想性狀的植物。
文檔編號C12N15/82GK101065481SQ200580022050
公開日2007年10月31日 申請日期2005年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月29日
發(fā)明者許冬梅, M·T·尼爾森 申請人:美國無煙煙草公司