專利名稱：工程化微生態(tài)系統(tǒng)運(yùn)行狀態(tài)的診斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種診斷工程化微生態(tài)系統(tǒng)運(yùn)行狀態(tài)的技術(shù)方法，可以用于工程化微生態(tài)系統(tǒng)中故障的診斷和排除，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
工程化微生態(tài)系統(tǒng)在許多國(guó)民經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)部門中都具有重要地位，微生物群落在食品發(fā)酵、菌肥生產(chǎn)、飼料生產(chǎn)、生物冶金以及環(huán)境工程等多個(gè)工業(yè)部門之中都具有重要的用途。這些工業(yè)部門或者利用微生物群落來(lái)獲得有價(jià)值的產(chǎn)品，比如食品、菌肥、飼料和金屬，或者用于環(huán)境的治理，比如廢水的生物處理。這些工業(yè)部門所采用的工藝往往都是非常復(fù)雜的，需要包括若干個(gè)工藝階段或者若干個(gè)工藝組成部分。比如說(shuō)陳醋的發(fā)酵工藝中就經(jīng)常分為產(chǎn)品的發(fā)酵階段和產(chǎn)品的后熟階段。而在廢水處理中，因?yàn)橛袡C(jī)物的去除，脫氮和除磷很難在一個(gè)反應(yīng)器中同時(shí)完成，所以整個(gè)處理工藝需要多個(gè)不同的反應(yīng)器的協(xié)同參加。系統(tǒng)中一個(gè)反應(yīng)器中微生物群落的活動(dòng)會(huì)改變環(huán)境中的物理、化學(xué)參數(shù)以及營(yíng)養(yǎng)的組成，從而影響同一反應(yīng)器中下一階段或者同一工藝中下一個(gè)反應(yīng)器的群落結(jié)構(gòu)組成，因此微生物群落的時(shí)空演替廣泛地存在于工程化的微生態(tài)系統(tǒng)之中。在一個(gè)設(shè)計(jì)合理的工程化微生態(tài)系統(tǒng)中，微生物群落結(jié)構(gòu)的時(shí)空演替往往是必須的，群落的演替是實(shí)現(xiàn)群落之間功能互補(bǔ)進(jìn)而高效地協(xié)同完成工藝設(shè)定目標(biāo)的前提條件。因?yàn)楣に囋O(shè)計(jì)的不同和用途的不一致，不同的工程化微生態(tài)系統(tǒng)中具有不同的時(shí)空演替模式，所以微生物群落的時(shí)空演替模式是工程化生態(tài)系統(tǒng)的重要特征。而在工程化微生態(tài)系統(tǒng)遇到故障時(shí)，其固有的時(shí)空演替模式也會(huì)遭到破壞，因此對(duì)于工程化微生態(tài)系統(tǒng)群落時(shí)空演替的分析能夠使我們?cè)谙到y(tǒng)的水平上對(duì)整個(gè)工藝進(jìn)行優(yōu)化和調(diào)控，并在系統(tǒng)出現(xiàn)故障時(shí)發(fā)現(xiàn)故障產(chǎn)生的位置并對(duì)故障發(fā)生的原因進(jìn)行分析。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，僅有部分研究涉及對(duì)于工程化生態(tài)系統(tǒng)中群落時(shí)間演替的研究，但是并未將其用于工程化生態(tài)系統(tǒng)中故障的診斷和排除。如Guieysse等人2001年在《Applied Microbiology and Biotechnology》(應(yīng)用微生物與生物技術(shù))56卷，780-787頁(yè)上報(bào)道，在一個(gè)批次流加硝酸和苯酚的厭氧反應(yīng)器中，使用主成份分析(principal component analysis，PCA)結(jié)合RAPD和T-RFLP兩種指紋圖譜技術(shù)對(duì)馴化階段反應(yīng)器微生物群落的時(shí)間演替進(jìn)行了描述。首先，該文獻(xiàn)研究?jī)H涉及群落的時(shí)間演替，而沒(méi)有涉及群落的空間演替。其次，該文獻(xiàn)僅針對(duì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)裝置在馴化階段的群落演替，不涉及群落時(shí)空演替在實(shí)際工程系統(tǒng)中的應(yīng)用。最后，該文獻(xiàn)提出的方法并不完善，不能根據(jù)對(duì)群落演替模式的分析尋找到排除故障的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出了一種工程化微生態(tài)系統(tǒng)運(yùn)行狀態(tài)的診斷方法。使其通過(guò)正常系統(tǒng)和故障系統(tǒng)之間微生物群落時(shí)空演替的差別來(lái)對(duì)工程化生態(tài)系統(tǒng)中出現(xiàn)的故障進(jìn)行診斷和排除，解決了現(xiàn)有技術(shù)中的難題。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。包括以下步驟(1)提取樣品的基因組DNA；所述的樣品的基因組DNA，具體為正常系統(tǒng)和故障系統(tǒng)中不同反應(yīng)器的樣品或者同一反應(yīng)器中不同時(shí)間點(diǎn)的樣品。
所述的從樣品的基因組DNA進(jìn)行16S rDNA V3區(qū)PCR，并通過(guò)TGGE/DGGE指紋圖譜分析所有樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)；進(jìn)而通過(guò)對(duì)系統(tǒng)軌跡進(jìn)行PCA分析，比較正常系統(tǒng)和故障系統(tǒng)之間群落演替模式的差別，并通過(guò)PCA載量分析找到在群落演替中起著重要作用的DGGE條帶并對(duì)DGGE條帶所代表的微生物種群進(jìn)行鑒定。
(2)16S rDNA V3區(qū)PCR-TGGE/DGGE指紋圖譜分析；所述的16S rDNA V3區(qū)PCR-TGGE/DGGE指紋圖譜，用其分析同一工業(yè)裝置不同反應(yīng)器或者同一反應(yīng)器中不同時(shí)間點(diǎn)之間微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，25μl的16S rDNA V3區(qū)PCR體系包括引物P2和P3各6.25pmol，其序列分別為5’-ATTACCgCggCTgCTgg-3’，5’-cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggCC TACgggA ggCAgCAg-3’，dNTP各5mmol，模板DNA 10ng，Taq DNA聚合酶1U以及配套1×buffer及50mmol MgCl2。
所述的16S rDNA V3區(qū)PCR，其擴(kuò)增程序如下94℃預(yù)變性3分鐘，然后94℃變性1分鐘，65℃退火1分鐘，每?jī)蓚€(gè)循環(huán)退火溫度降低1℃直到55℃，然后55℃退火保持到循環(huán)結(jié)束，72℃延伸1分鐘，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘；采用UVI band/map軟件對(duì)條帶的遷移位置和亮度進(jìn)行分析。
(3)對(duì)系統(tǒng)軌跡進(jìn)行PCA分析，比較正常系統(tǒng)和故障系統(tǒng)之間群落演替模式的差別；對(duì)系統(tǒng)軌跡進(jìn)行PCA分析，比較正常系統(tǒng)和故障系統(tǒng)之間群落演替模式的差別，具體為每一個(gè)反應(yīng)器或者每一時(shí)間點(diǎn)上的DGGE指紋圖譜可以轉(zhuǎn)換為一組多維向量，不同的遷移位置代表不同的維度，而條帶的亮度作為每一維度的數(shù)值。
所述的DGGE指紋圖譜，每一個(gè)樣品的DGGE指紋圖譜就對(duì)應(yīng)了多維空間的一個(gè)點(diǎn)，把每個(gè)反應(yīng)器或者每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的點(diǎn)在多維空間中連接起來(lái)就組成了一條系統(tǒng)軌跡。
所述的系統(tǒng)軌跡代表系統(tǒng)的空間或者時(shí)間的群落演替，再使用PCA分析對(duì)多維空間里的系統(tǒng)軌跡進(jìn)行降維，然后可以直觀地在一個(gè)二維平面或者三維空間里比較正常系統(tǒng)和故障系統(tǒng)之間群落演替模式的差別。
(4)通過(guò)PCA載量分析找到在群落演替中起著重要作用的DGGE條帶；所述的通過(guò)PCA載量分析找到在群落演替中起著重要作用的DGGE條帶，具體為對(duì)一正常系統(tǒng)中的微生物群落時(shí)空演替軌跡進(jìn)行PCA載量分析，在主成份上載量大的條帶即代表了對(duì)于群落時(shí)空演替貢獻(xiàn)較大的種群。
(5)對(duì)DGGE條帶所代表的微生物種群進(jìn)行鑒定。
本發(fā)明通過(guò)比較故障系統(tǒng)和正常系統(tǒng)的群落演替模式，找到故障出現(xiàn)的位置。并進(jìn)一步通過(guò)對(duì)正常系統(tǒng)群落演替模式的分析，為解決系統(tǒng)的故障提供指導(dǎo)和幫助。


圖1A1-A2-O固定生物膜工藝流程示意圖。
圖中1為A1反應(yīng)器，2為A2反應(yīng)器，3-6為01、02、03、04反應(yīng)器，7為進(jìn)水泵，8為回流泵，9為曝氣裝置，10為擋板。
圖2各個(gè)反應(yīng)器的微生物群落PCR-DGGE指紋圖譜示意中所標(biāo)記的是在系統(tǒng)空間演替中起重要作用的條帶圖3LNR，LR和I三個(gè)系統(tǒng)的微生物群落空間演替軌跡的PCA分析示意4LR系統(tǒng)A2池到O4池的微生物群落空間演替軌跡的PCA分析圖。
圖5工業(yè)系統(tǒng)恢復(fù)前(I)和工業(yè)系統(tǒng)恢復(fù)后(IRe)中各個(gè)反應(yīng)器的微生物群落PCR-DGGE指紋圖譜示意6對(duì)工業(yè)系統(tǒng)恢復(fù)前后微生物群落空間演替軌跡的PCA分析圖。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。
實(shí)施例1焦化廢水處理裝置中微生物群落結(jié)構(gòu)空間演替模式的比較焦化廢水含有高濃度的氨氮和以酚類化合物、多環(huán)芳烴和雜環(huán)化合物為主的有機(jī)物污染，直接排放將對(duì)環(huán)境產(chǎn)生極大的危害。A1(厭氧)-A2(缺氧)-O(好氧)固定膜法被廣泛應(yīng)用于焦化廢水的生物處理中(如圖1所示)，其構(gòu)建編號(hào)如下A1反應(yīng)器1，A2反應(yīng)器2，01、02、03、04反應(yīng)器的編號(hào)依次為3，4，5，6，進(jìn)水泵7，回流泵8，曝氣裝置9，擋板10。
在本實(shí)施例中，一個(gè)按照此工藝設(shè)計(jì)的工業(yè)裝置(I系統(tǒng))從其投入運(yùn)行之始就出現(xiàn)COD和NH3-N去除效率低的故障，該故障持續(xù)了三年都未能找到出現(xiàn)故障的原因。
為了得到該工藝條件下正常的微生物群落空間演替模式，本實(shí)施例按照相同的工藝構(gòu)建了一套實(shí)驗(yàn)室模擬裝置作為參照系統(tǒng)(LR系統(tǒng))。同時(shí)，還切斷實(shí)驗(yàn)裝置的回流裝置，形成一個(gè)帶有人為故障的實(shí)驗(yàn)室裝置(LNR系統(tǒng))。我們首先使用16S rDNA V3區(qū)PCR-DGGE指紋圖譜分析分析了I，LR和LNR三個(gè)系統(tǒng)中A1，A2，01，02，03和04六個(gè)反應(yīng)器中微生物群落的組成(如圖2所示)。在三個(gè)系統(tǒng)的所有反應(yīng)器中總共有402條條帶分布在62個(gè)不同的遷移位置上。因此，每一個(gè)反應(yīng)器的DGGE指紋圖譜可以轉(zhuǎn)換為一個(gè)62維向量，其中62個(gè)不同的遷移位置分別代表不同的維度，而條帶的亮度作為每一維度的數(shù)值(如果沒(méi)有條帶則相應(yīng)維度上的值為0)。這樣每一個(gè)反應(yīng)器的DGGE指紋圖譜就對(duì)應(yīng)了這個(gè)62維空間里的一個(gè)點(diǎn)，把系統(tǒng)中每個(gè)反應(yīng)器所對(duì)應(yīng)的點(diǎn)沿著群落演替的順序分別連接起來(lái)就組成了一條系統(tǒng)軌跡。這樣的一條軌跡就代表了系統(tǒng)的空間群落演替模式。因此I，LR和LNR三個(gè)系統(tǒng)的微生物群落空間演替的模式可以分別用三條62維空間中的系統(tǒng)軌跡來(lái)代表?？梢赃M(jìn)一步使用PCA分析對(duì)這些復(fù)雜的多維系統(tǒng)軌跡進(jìn)行降維，這樣就可以在一個(gè)二維平面或者三維的空間里對(duì)這三個(gè)系統(tǒng)的微生物群落空間演替模式進(jìn)行直觀地比較(圖3)。
參照系統(tǒng)(LR)的系統(tǒng)軌跡首先是沿著右上方從A1延伸到A2，然后沿著右下方從A2延伸到O4。與參照系統(tǒng)相比，工業(yè)裝置(I)的系統(tǒng)軌跡在A2以后就停止了延伸，這說(shuō)明從工業(yè)裝置中A2池到O4池的空間演替沒(méi)有被建立起來(lái)。與參照系統(tǒng)相比，帶有故障的實(shí)驗(yàn)室裝置(LNR)的空間演替模式與參照系統(tǒng)總體相似，但是A2緊挨著A1而與到O的距離變遠(yuǎn)。這意味著在LNR系統(tǒng)中，從A1到A2的空間群落演替受到明顯的遲滯。通過(guò)以上分析可以看到，出現(xiàn)故障的系統(tǒng)，其微生物群落的空間演替模式就會(huì)受到延遲或者破壞(如圖3所示)。
對(duì)空間演替的比較分析，可以幫助找到故障出現(xiàn)的位置和原因。對(duì)于帶有故障的實(shí)驗(yàn)室裝置(LNR)來(lái)說(shuō)，其故障在于沒(méi)有回流液進(jìn)入到A2池，而其空間演替模式中最明顯的的遲滯發(fā)生在A2池，這正好反映出LNR系統(tǒng)的出現(xiàn)故障的位置。而對(duì)于出現(xiàn)故障的工業(yè)裝置中來(lái)說(shuō)，A2到O4的空間群落演替遭到了破壞正好說(shuō)明故障應(yīng)該發(fā)生在A2池到O4池。A2池與O池最大的差別在于氧的供應(yīng)。O池中應(yīng)該充分曝氣而A2池中僅僅因?yàn)榛亓鞫鴰?lái)極少量的氧氣。工業(yè)裝置中的群落演替軌跡在A2池到O4池就幾乎停止了延伸了，這是因?yàn)檫@四個(gè)反應(yīng)器幾乎有著幾乎完全一樣的群落結(jié)構(gòu)。好氧池中曝氣裝置的故障是引起A2到O4群落演替停滯最有可能的原因。
對(duì)代表正常空間演替模式的系統(tǒng)軌跡進(jìn)行PCA分析可以幫助我們找到群落演替過(guò)程中重要的種群。對(duì)參照系統(tǒng)中A2池到O4池的空間演替模式進(jìn)行了單獨(dú)分析(如圖4所示)。PC1和PC2分別能夠解釋80.3％和14.2％的數(shù)據(jù)差異。條帶8，33，34，35，38，52和53具有相對(duì)較大的PC1載量。條帶13具有最大的PC2載量(如圖2、表1所示，)。這些條帶代表了從A2到O4池群落演替中最重要的

種群。條帶53和38的亮度都逐漸增加，條帶8，33，34，35，38和52都逐漸降低，而條帶13首先升高(A2到O1)然后再降低(O1到O4)。這些不同種群的動(dòng)態(tài)變化是這些種群在群落演替的過(guò)程中相互協(xié)作和競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果。通過(guò)構(gòu)建克隆文庫(kù)或者直接割膠對(duì)這些條帶進(jìn)行鑒定(如表1所示，)。Band53代表了Nitrospira屬的種群，它具有最大的PC1正載量，而band34和35則代表了Thauera屬的種群，它們分別具有第一和第二大的PC1負(fù)載量。所以這些Thauera屬和Nitrospira屬的種群都是A2池到O4池群落空間演替中最重要的種群。
在工業(yè)裝置的故障被排除以后，使用16S rDNA V3 PCR-DGGE分析了工業(yè)裝置在修復(fù)前(I系統(tǒng))和修復(fù)后(IRe系統(tǒng))每個(gè)反應(yīng)器的群落結(jié)構(gòu)(如圖5所示)，并用PCA對(duì)工業(yè)裝置在修復(fù)前和修復(fù)后的空間群落演替的系統(tǒng)軌跡進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從A2池到O4池的空間群落演替在修復(fù)后的工業(yè)裝置中得到了恢復(fù)(如圖6所示)。
權(quán)利要求
1.一種工程化微生態(tài)系統(tǒng)運(yùn)行狀態(tài)的診斷方法，其特征在于，包括以下步驟(1)提取樣品的基因組DNA；(2)16S rDNA V3區(qū)PCR-TGGE/DGGE指紋圖譜分析；(3)對(duì)系統(tǒng)軌跡進(jìn)行PCA分析，比較正常系統(tǒng)和故障系統(tǒng)之間群落演替模式的差別；(4)通過(guò)PCA載量分析找到在群落演替中起著重要作用的DGGE條帶；(5)對(duì)DGGE條帶所代表的微生物種群進(jìn)行鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化微生態(tài)系統(tǒng)運(yùn)行狀態(tài)的診斷方法，其特征是，所述的樣品的基因組DNA，具體為正常系統(tǒng)和故障系統(tǒng)中不同反應(yīng)器的樣品或者同一反應(yīng)器中不同時(shí)間點(diǎn)的樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的工程化微生態(tài)系統(tǒng)運(yùn)行狀態(tài)的診斷方法，其特征是，從所述的樣品的基因組DNA進(jìn)行16S rDNA V3區(qū)PCR，并通過(guò)TGGE/DGGE指紋圖譜分析所有樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)；進(jìn)而通過(guò)對(duì)系統(tǒng)軌跡進(jìn)行PCA分析，比較正常系統(tǒng)和故障系統(tǒng)之間群落演替模式的差別，并通過(guò)PCA載量分析找到在群落演替中起著重要作用的DGGE條帶，對(duì)DGGE條帶所代表的微生物種群進(jìn)行鑒定。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化微生態(tài)系統(tǒng)運(yùn)行狀態(tài)的診斷方法，其特征是，所述的16S rDNA V3區(qū)PCR-TGGE/DGGE指紋圖譜，用其分析同一工業(yè)裝置不同反應(yīng)器或者同一反應(yīng)器中不同時(shí)間點(diǎn)之間微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，25μl的16S rDNA V3區(qū)PCR體系包括引物P2和P3各6.25pmol，其序列分別為5’-ATTACCgCggCTgCTgg-3’，5’-cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggCC TACgggA ggCAgCAg-3’，dNTP各5mmol，模板DNA 10ng，Taq DNA聚合酶1U以及配套1×buffer及50mmol MgCl2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化微生態(tài)系統(tǒng)運(yùn)行狀態(tài)的診斷方法，其特征是，所述的16S rDNA V3區(qū)PCR，其擴(kuò)增程序如下94℃預(yù)變性3分鐘，然后94℃變性1分鐘，65℃退火1分鐘，每?jī)蓚€(gè)循環(huán)退火溫度降低1℃直到55℃，然后55℃退火保持到循環(huán)結(jié)束，72℃延伸1分鐘，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘；采用UVI band/map軟件對(duì)條帶的遷移位置和亮度進(jìn)行分析。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化微生態(tài)系統(tǒng)運(yùn)行狀態(tài)的診斷方法，其特征是，對(duì)系統(tǒng)軌跡進(jìn)行PCA分析，比較正常系統(tǒng)和故障系統(tǒng)之間群落演替模式的差別，具體為每一個(gè)反應(yīng)器或者每一時(shí)間點(diǎn)上的DGGE指紋圖譜可以轉(zhuǎn)換為一組多維向量，不同的遷移位置代表不同的維度，而條帶的亮度作為每一維度的數(shù)值。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化微生態(tài)系統(tǒng)運(yùn)行狀態(tài)的診斷方法，其特征是，所述的DGGE指紋圖譜，每一個(gè)樣品的DGGE指紋圖譜對(duì)應(yīng)了多維空間的一個(gè)點(diǎn)，把每個(gè)反應(yīng)器或者每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的點(diǎn)在多維空間中連接起來(lái)就組成了一條系統(tǒng)軌跡。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化微生態(tài)系統(tǒng)運(yùn)行狀態(tài)的診斷方法，其特征是，所述的系統(tǒng)軌跡代表系統(tǒng)的空間或者時(shí)間群落演替，再使用PCA分析對(duì)多維空間里的系統(tǒng)軌跡進(jìn)行降維，然后能直觀地在一個(gè)二維平面或者三維空間里比較正常系統(tǒng)和故障系統(tǒng)之間群落演替模式的差別。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化微生態(tài)系統(tǒng)運(yùn)行狀態(tài)的診斷方法，其特征是，所述的通過(guò)PCA載量分析找到在群落演替中起著重要作用的DGGE條帶，具體為對(duì)一正常系統(tǒng)中微生物群落的時(shí)空演替軌跡進(jìn)行PCA載量分析，在主成份上載量大的條帶即代表了對(duì)于群落時(shí)空演替貢獻(xiàn)較大的種群。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微生物技術(shù)領(lǐng)域的工程化微生態(tài)系統(tǒng)運(yùn)行狀態(tài)的診斷方法。包括以下步驟(1)提取樣品的基因組DNA；(2)16S rDNA V3區(qū)PCR－TGGE/DGGE指紋圖譜分析；(3)對(duì)系統(tǒng)軌跡進(jìn)行PCA分析，比較正常系統(tǒng)和故障系統(tǒng)之間群落演替模式的差別；(4)通過(guò)PCA載量分析找到在群落演替中起著重要作用的DGGE條帶；(5)對(duì)DGGE條帶所代表的微生物種群進(jìn)行鑒定。本發(fā)明可以應(yīng)用于工程化微生態(tài)系統(tǒng)的時(shí)空演替分析。通過(guò)分析微生物群落時(shí)空演替出現(xiàn)的問(wèn)題，診斷故障出現(xiàn)的位置和產(chǎn)生的原因，同時(shí)為解決工業(yè)裝置出現(xiàn)的故障提供線索，為調(diào)控和優(yōu)化工程化微生態(tài)系統(tǒng)的功能提供指導(dǎo)。并且該方法還可以用來(lái)鑒定微生物群落時(shí)空演替過(guò)程中重要的微生物種群。
文檔編號(hào)G01N33/48GK1932504SQ20061011662
公開日2007年3月21日 申請(qǐng)日期2006年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月28日
發(fā)明者趙立平, 嚴(yán)興, 馮曉西, 毛躍建, 劉彬彬, 朱晨光 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)