專利名稱：：應用生物傳感器檢測與固定化靶標分子直接結合的小分子的方法應用生物傳感器檢測與固定化靶標分子直接結合的小分子的方法優(yōu)先權本申請要求2007年4月19日申請的美國專利申請?zhí)?0/912，725的權益，該申請通過引用全部結合到本文中。
背景技術：
：鑒定針對藥物性蛋白質靶的高品質的先導化合物是一項復雜的任務。產生新的可優(yōu)化的先導化合物是十分困難的。最近，人們探索出基于碎片的篩選法(fragment-basedscreening)作為產生高品質先導化合物的方法。分子量約為lOODa至約300Da的化合物(即"碎片")似乎比分子量約為300Da至約600Da的化合物可提供更好的先導化合物，這種觀點一直用來制備先導化合物。雖然碎片常常是弱結合分子，但是篩選與治療靶蛋白結合的低分子量弱結合分子可用于確定小的構建模塊，它們可用來通過化學結合提供略高分子量的緊密結合的化合物。這些分子可具有針對靶蛋白的治療作用。盡管低分子量化合物可引導開發(fā)出有效的藥物，鑒定弱結合但是極低分子量化合物的進展極緩并困難重重。尋找與蛋白質或靶分子結合的各種大小的化合物的現有方法均涉及需要化合物以一定能量進行結合，這種能量通常不能通過碎片化合物獲得。用于鑒定與蛋白質結合的碎片化合物的現有鑒定方法需要大量蛋白質，耗費勞力，還需要非常熟練的人員來操作的昂貴儀器，而且篩選很少幾種化合物要花上許多天或者許多周的時間。典型的方法應用經典生物物理學技術，例如多維核磁共振波譜法(NMR)、x-射線晶體學檢測法或等溫滴定量熱法(isothermaltitrationcalorimetry)。本領域需要使用少量試驗化合物以高通量方式篩選基于碎片的約lOODa至約300Da的化合物文庫的方法。發(fā)明概述在一個實施方案中，本發(fā)明提供測定小分子對靶分子的親和力的方法。該方法包括使靶分子固定在比色共振反射生物傳感器(colorimetricresonantreflectancebiosensor)表面上并測定第一峰波長值；將小分子按3種以上不同濃度加到比色共振反射生物傳感器表面并測定3種以上不同濃度的峰波長值，對峰值波長進行比較以確定小分子對于靶分子的親和力。小分子可大約為300Da以下?？梢詼y定小分子的解離常數(Kd)。小分子的解離常數可約為2，000iiM至約750iiM。小分子的濃度可約為0.5mM至約0.OlmM。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供測定小分子樣品的等級親和力(rankaffinity)的方法，該方法包括檢測比色共振反射生物傳感器表面的第一峰波長值；使已知分子量的靶分子固定在比色共振反射生物傳感器表面上并測定第二峰波長值；使用第一峰波長值和第二峰波長值確定與比色共振反射生物傳感器結合的靶分子的摩爾量；將特定濃度的已知分子量的小分子樣品加到比色共振反射生物傳感器上并測定第三峰波長值；第二峰波長值和第三峰波長值之間的差值給出了與比色共振反射生物傳感器表面結合的小分子的量；使用第一峰波長值和第二峰波長值之間的差值與第二峰波長值和第三峰波長值之間的差值的比率，確定小分子樣品的等級親和力。小分子樣品可包含大約300Da以下的小分子。小分子樣品中小分子的解離常數可約為2，000M至約750M。小分子樣品中小分子的濃度可約為0.5mM至約0.OlmM。本發(fā)明的又一個實施方案提供測定小分子是否與靶分子的特定位點結合或者與已知的靶位點封阻劑竟爭性結合靶分子的靶位點的方法，該方法包括使靶分子固定在第一比色共振反射生物傳感器上；使靶分子固定在第二比色共振反射生物傳感器上，其中靶分子的靶位點用已知的靶位點封阻劑封閉；將小分子加到第一比色共振反射生物傳感器和第二比色共振反射生物傳感器上并測定第一比色共振反射生物傳感器和第二比色共振反射生物傳感器的峰波長值，如果第一比色共振反射生物傳感器的峰波長值與第二比色共振反射生物傳感器的峰波長值相比發(fā)生位移，則小分子與已知封阻劑竟爭性結合靶分子的靶位點或與靶分子的特定位點結合。小分子可約為300Da以下。小分子的解離常數可約為2，000iiM至約750iiM。小分子的濃度可約為0.5mM至約0.OlmM。本發(fā)明再一個實施方案提供測定300Da以下的小分子是否與靶分子結合的方法，該方法包括使靶分子固定在比色共振反射生物傳感器表面上并測定第一峰波長值；將小分子加到比色共振反射生物傳感器表面上并測定第二峰波長值；對第一峰波長和第二峰波長進行比較，如果第二峰波長值與第一峰波長值相比發(fā)生位移，則小分子與靶分子結合。可測出小分子的解離常數(Kd)。小分子的解離常數可約為2，000iiM至約750iiM。小分子的濃度可約為0.5mM至約0.OlmM。因此，本發(fā)明可以測定與靶生物分子結合的、本領域技術人員稱之為碎片的極低分子量化合物。本發(fā)明方法較之用于定量測定和定性測定碎片分子與靶生物分子相互作用以及用于測定碎片分子其它性質的典型生物化學試驗法的精確性更高。比起通常相同應用的傳統(tǒng)方法(例如NMR波譜法、x-射線晶體學檢測法或熱量法)，本發(fā)明方法更經濟，耗時更少，需要的試劑更少。附圖詳述圖1顯示用于靈敏檢測小分子與靶表面弱締合的生物傳感器的再現性。圖2顯示當以相同濃度加到對照表面或封閉表面(x軸)和靶表面(y軸)上時，與靶表面(y軸)相比，聚集化合物和miso錯配化合物在兩種表面上提供顯著不同的信號。圖3顯示可應用本發(fā)明的方法進行滴定獲得已知結合化合物的理想的親和力結合曲線，該結合化合物通過其它生物物理方法獲得。圖4表明本發(fā)明的方法能夠測定弱締合碎片與不同結合位點的結合。圖5顯示用于確定特異性的結合時程實驗。發(fā)明詳述本發(fā)明的一個實施方案可供在不需要摻入放射性標記、比色標記或熒光標記的情況下，甚至在結合性相互作用非常弱的情況下，應用生物傳感器(例如比色共振反射生物傳感器)直接測定小分子(亦稱碎片)與靶分子的結合?？刹捎酶咚俑叻直鎯x器，例如BINDScanner(即比色共振反射生物傳感器系統(tǒng))，并應用量化數據的相應算法，對結合進行實時檢測。參見例如美國專利申請?zhí)?，951，715和美國專利公開文本2004/0151626。將這樣的方法、儀器和計算分析結合起來，可以無標記的方式、甚至在結合非常弱情況下，方便地實時監(jiān)測小分子與靶分子的結合。生物傳感器本發(fā)明的生物傳感器可以是比色共振反射生物傳感器。參見例如Cu皿ingham等，"Colorimetricresonantreflectionasadirectbiochemicalassaytechnique(用作直接生化實驗技術的比色共振反射)"，SensorsandActuatorsB，第81巻，第316-328頁，2002年1月5日；美國專利公開號2004/0091397。比色共振生物傳感器并非表面等離振子共振(SPR)生物傳感器。SPR生物傳感器有一層薄的金屬層，例如銀、金、銅、鋁、鈉和銦。金屬必須具有能夠與合適波長的光共振的導帶電子。暴露于光的SPR生物傳感器表面必須為純金屬。氧化物、硫化物和其它薄膜干擾SPR。比色共振生物傳感器不必有金屬層，相反它們具有高折射率材料(例如Ti0》的介電涂層?；诠鈻诺牟▽飩鞲衅骺蓞⒁娎缑绹鴮＠暾?zhí)?，738，825?；诠鈻诺牟▽飩鞲衅靼ú▽?waveguidingfilm)和衍射光柵，衍射光柵將入射光場投射(incouple)到波導膜上產生衍射光場，檢測出波導膜有效折射率的變化。光必須在其中傳播相當距離的裝置，例如基于光柵的波導生物傳感器，缺乏本發(fā)明的空間分辨率。在不需使用熒光標簽、比色標記或任何其它類型的檢測標簽或檢測標記的情況下，比色共振反射生物傳感器允許在生物傳感器的表面測定生化相互作用。生物傳感器表面含有光學結構，該光學結構被設計成當用平行光和/或白光照射時，只反射波長窄帶("共振光柵效應(resonantgratingeffect)")。波長窄帶被稱為波長"峰"。當材料(例如生物材料)沉積到生物傳感器表面或從生物傳感器表面去除時，"峰波長值"(peakwavelengthvalue,PWV)發(fā)生改變。使用讀出儀器用平行光和/或白光照射生物傳感器表面特定位置，收集反射光。使采集到的光聚集到波長分光計以測定PWV。可以通過將該生物傳感器面結構(生物傳感器面向上)結合到無底微量滴定板柱體底部，將生物傳感器整合成標準的一次性實驗器材，例如微量滴定板。最好將生物傳感器與常用實驗室形式柱體整合，因為這樣的常用實驗室形式柱體與現有的微量滴定板處理設備(例如混合器、培養(yǎng)箱和液體分配裝置)相兼容。比色共振反射生物傳感器還可被整合到例如微型流體設備、大型流體設備或微陣列設備中(參見例如美國專利申請?zhí)?，033，819、美國專利申請?zhí)?，033，821)。比色共振反射生物傳感器可與本領域眾所周知的方法(參見例如MethodsofMolecularBiology,Jun_LinGuan主編，第294巻，HumanaPress,Totowa，NewJersey)—起使用以監(jiān)測分子與生物傳感器表面的共價結合或非共價結合。比色共振反射生物傳感器包括各種分波長的結構表面(subwave1engthstructuredsurfaces,SWS)，并且是可模擬薄膜涂層作用的非傳統(tǒng)型的衍射鏡片(Peng禾口Morris,"Resonantscatteringfromtwo-dimensionalgratings(二維光柵的共振散射)"，J.Opt.Soc.Am.A，第13巻，第5期，第993頁，1996年5月；Mag皿sson和Wang，"Newprincipleforopticalfilters(濾光片的新原理)"，Appl.Phys丄ett.，61，第9期，第1022頁，1992年8月；Peng禾口Morris,"Experimentaldemonstrationofresonantanomaliesindiffractionfromtwo-dimensionalgratings(二維光柵衍身寸中共振異常的實驗證明)"，OpticsLetters，第21巻，第8期，第549頁，1996年4月)。SWS結構含有一維光柵、二維光柵或三維光柵，其中與入射光波長相比，光柵周期較短，致使不是衍射級次而是反射或透射零級次得到傳播。不支持導模橫向傳播。相反，導模共振效應發(fā)生在距任何光子進入生物傳感器結構某點約3微米的非常有限的區(qū)域內。將分子例如特異性結合物質、耙分子或小分子或其組合加到生物傳感器的上表面，可調節(jié)比色共振反射生物傳感器的反射光或透射光。所加入的分子增加通過該結構的6在一個實施方案中，比色共振反射生物傳感器被設計成用白光和/或平行光照射時，反射出單波長或窄帶波長("共振光柵效應")。當物質沉積在生物傳感器表面上時，由于在生物傳感器上出現的光的光程發(fā)生改變，使得反射波長發(fā)生位移。檢測系統(tǒng)例如由光源和分光計組成，光源通過例如光纖探頭以正入射照射到生物傳感器小點上，分光計則通過例如第二光纖探頭同樣以正入射采集反射光。由于在激發(fā)/檢測系統(tǒng)和生物傳感器表面之間沒有發(fā)生實物接觸，所以不需要特定的耦合棱鏡，可輕易地將生物傳感器裝配到包括例如微量滴定板在內的任何常用實驗平臺中。可在數毫秒內進行一次分光計讀數，因此很可能快速測定平行發(fā)生在生物傳感器表面的大量分子間的相互作用并實時監(jiān)測反應動力學。選擇層厚度(即覆蓋層、生物材料或光柵)以實現對最上面所加入分子的共振波長靈敏度。選擇光柵周期以在所需波長下達到共振。比色共振反射生物傳感器包括例如光柵、基底層和任選一種或多種特異性結合物質或接頭，光柵由高折射率材料組成，基底層支撐著光柵，特異性結合物質或接頭則固定在基底層對側的光柵表面上。高折射率材料具有比基底層高的折射率。參見例如美國專利申請?zhí)?，094，595、美國專利申請?zhí)?，070，987。基底層可為聚合物、塑料、玻璃或納米多孔材料。參見美國專利公開文本2007/0009380。任選覆蓋層覆蓋了光柵表面。光柵涂有高折射率介電薄膜，該薄膜可由例如以下材料組成硫化鋅、二氧化鈦、氧化鉭、四氮化三硅和二氧化硅。具有光學特性的光柵的截面可包括任何周期性重復函數，例如"方波"。光柵還可包括選自以下形狀的重復形式線形(一維)、正方形、圓形、橢圓形、三角形、梯形、正弦波、卵形、矩形和六角形。本發(fā)明的比色共振反射生物傳感器還可包括由涂有高折射率材料的例如塑料或環(huán)氧樹脂組成的光柵。線形光柵(即一維光柵)具有共振性質，其中照射光偏振化的方向垂直于光柵周期。比色共振反射生物傳感器還可包括例如二維光柵，例如圓孔或正方形的六角陣列。也可以使用其它的形狀。線形光柵具有與六角陣列光柵相同的間距(即高折射率和低折射率區(qū)間的距離)、周期、層厚度和材料性質。然而，為了共振偶聯到光學結構上，必須使光垂直于光柵線偏振。因此，照射源和生物傳感器表面之間必須插入其偏振軸垂直于線形光柵方向的偏振片。因為照射光源中只少部分被正確偏振，所以與六角形光柵相比，需要較長的積分時間(integrationtime)以收集等量的共振反射光。光柵還可包括例如"階形(st印ped)"剖面，其中單一固定高度的高折射率區(qū)被嵌入較低折射率的覆蓋層內。高折射率和低折射率區(qū)的交替提供平行于生物傳感器頂面的光波導。本發(fā)明的比色共振反射生物傳感器可進一步包括在基底層對側的光柵表面上的覆蓋層。如果存在覆蓋層，則將一種或多種特異性結合物質固定在光柵另一側的覆蓋層表面上。優(yōu)選覆蓋層包含的材料具有比構成光柵的材料低的折射率。覆蓋層可由例如玻璃(包括旋壓玻璃(S0G))、環(huán)氧樹脂或塑料組成。例如，符合生物傳感器折射率要求的各種聚合物可用于覆蓋層。由于SOG的折射率適當，易于處理，并且采用多種玻璃表面活化技術時易于被特異性結合物質激活，所以可以使用S0G。當生物傳感器表面的平直度對于具體系統(tǒng)設置不成問題時，SiN/玻璃的光柵7結構可被直接用作傳感表面，傳感表面的活化可以采用與玻璃表面相同的方法進行。無需使光柵上面的覆蓋層偏振同樣可獲得共振反射。例如，生物傳感器可僅含有涂有高折射率材料的結構化薄膜層的基底。無需使用平坦化覆蓋層，周圍的介質(例如空氣或水)便充滿了光柵。因此，將特異性結合物質固定在暴露于特異性結合物質的所有光柵表面的生物傳感器上，而不是僅固定于上表面?！愣?，本發(fā)明的比色共振反射生物傳感器使用可包括每個偏振角的光線的白光和/或平行光照射。生物傳感器光柵重復特征的偏振角方向將決定共振波長。例如，由一套重復的直線和間隔組成的"線形光柵"(即一維光柵)生物傳感器將具有可產生各自共振反射的兩種光偏振。垂直于直線偏振的光稱為"s偏振"，而平行于直線偏振的光稱為"p偏振"。入射光的這兩個s和P組成在未過濾的照射光束中同時存在，各自產生獨立的共振信號。生物傳感器一般可設計成只使一種偏振(s偏振)的性質最優(yōu)化，非優(yōu)化偏振易用偏振片消除。為了消除偏振依賴，以使得每個偏振角都產生相同的共振反射譜，可以使用由一套同心環(huán)組成的替代生物傳感器結構。在這個結構中，各同心環(huán)內徑與外徑之間的差值大致相當于光柵周期的1/2。各鄰接環(huán)的內徑比前一環(huán)的內徑大約l光柵周期。同心環(huán)模式延伸以覆蓋單個傳感器位置一例如一個陣列點(arrayspot)或一個微量滴定板孔。每個單獨的微陣列點或微量滴定板孔在其中心都具有單獨的同心環(huán)。這類結構的所有偏振方向都具有相同的截面。同心環(huán)結構必須精確地照射到中心以保持偏振獨立。同心環(huán)結構的光柵周期不超過共振反射光波長。光柵周期約為0.01微米至約1微米。光柵深約為0.01微米至約1微米。在另一個實施方案中，孔或柱的陣列被排列得十分接近上述同心圓結構，無需將照射光束集中在格柵的任何特定位置上。通過3條激光束以相同角度從三個方向入射到表面上的光波干涉，自動生成這類陣列模式。在該模式中，孔(或柱)集中在一批緊密堆積的六角形的邊角處。孔或柱也出現在各六角形中心。這類六角形格柵的孔或柱具有3個"看見"同一截面的偏振方向。因此，該六角形格柵結構使用任何偏振角的光都提供等同的共振反射譜。因此，不需要偏振片以消除不需要的反射信號組成?？谆蛑闹芷诳杉s為0.01微米至約1微米，深或高可約為0.01微米至約1微米。檢測系統(tǒng)可包括比色共振反射生物傳感器、將光直射到比色共振反射生物傳感器的光源和從生物傳感器檢測光反射的檢測器。在一個實施方案中，可應用濾波器來簡化讀出儀器，以便只有超過測定閾值的陽性結果才引起檢測。通過測量共振波長在本發(fā)明的比色共振反射生物傳感器的各個不同位置上的位移，便可確定在哪一個獨特位置上有例如生物材料沉積。位移程度可用來測定例如試驗樣品中結合配偶體(bindingpartner)的量，以及一種或多種特異性結合物質和試驗樣品中的結合配偶體之間的化學親和力。比色共振反射生物傳感器可被照射兩次。第一次測量測定生物傳感器(例如生物傳感器上無靶分子)一個或多個特定位置的反射光譜。第二次測量測定在例如一種或多種分子應用到生物傳感器上后的反射光譜。這兩次測量間峰值波長的差異是生物傳感器上分子存在或含量的量度。這種照射方法可以控制生物傳感器表面的小缺點，該缺點可導致具有峰共振波長微小變化的區(qū)域。該方法還可控制生物傳感器上分子的濃度或密度變化。生物傳感器表面通過例如物理吸附或化學結合，可將一種或多種特異性結合物質或靶分子固定在生物傳感器上。靶分子可以通過特異性結合物質與生物傳感器表面特異性結合，特異性結合物質例如核酸、肽、蛋白質溶液、肽溶液、得自以下化合物的溶液組合化學品文庫(combinatorialchemicallibrary)、抗原、多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體(scFv)、F(ab)片段、F(ab')2片段、Fv片段、有機小分子、病毒、聚合物或生物樣品，其中靶分子被固定在生物傳感器表面上。靶分子可與生物傳感器非共價或共價地連接。靶分子可被排列在生物傳感器表面的一個或多個獨特位置的陣列上，所述表面可位于多孔板的一個或多個孔內，并包括多孔板或微陣列的一個或多個表面。靶分子陣列在微孔板內的生物傳感器表面上包含一種或多種靶分子，使得表面含有一個或多個獨特位置，各具有不同的靶分子或不同量的靶分子。例如，陣列可包括1、10、100、1，000、10，000或100，000個以上的獨特位置。因此，多孔板或微陣列的每孔內可具有與多孔板其它孔分隔開的一個或多個特定位置的陣列，這可供在一塊多孔板上對多種不同的樣品進行處理。任一孔內的一個或多個陣列可與存在于同一微量滴定板的任何其它微量滴定板孔的一個或多個陣列相同或不同。還可通過與例如下列官能接頭(functionallinker)結合實現將靶分子固定到生物傳感器表面上鎳基、胺基、醛基、酸基、烷基、烯基、炔基、芳基、醇基、醚基、酮基、酯基、酰胺基、氨基酸基、硝基、腈基、糖基、巰基、有機磷酸酯基、脂質基(lipidgroup)、磷脂基或類固醇基。此外，還可通過物理吸附、化學結合、電化學結合、靜電結合、疏水結合或親水結合及免疫捕捉方法，使靶分子固定在生物傳感器表面上。在本發(fā)明的一個實施方案中，生物傳感器可用例如以下接頭涂敷例如鎳基、胺基、醛基、酸基、烷基、烯基、炔基、芳基、醇基、醚基、酮基、酯基、酰胺基、氨基酸基、硝基、腈基、糖基、巰基、有機磷酸酯基、脂質基、磷脂基或類固醇基。例如，胺表面可用來連接若干類型的接頭分子，而醛表面可用來直接結合蛋白質而無需額外的接頭。鎳表面與具有摻入了組氨酸("his")標簽的分子結合。用鎳活化表面檢測"his標簽"化分子是本領域眾所周知的(Whitesides，Anal.Chem.68,490，(1996))。接頭和特異性結合物質可被固定在生物傳感器表面，使得每孔都有相同的固定于此的接頭和/或特異性結合物質?；蛘撸靠卓珊薪宇^和/或特異性結合物質的不同組合。靶分子可與固定在生物傳感器表面的接頭或特異性結合物質特異性或非特異性結合?；蛘?，生物傳感器表面可能沒有接頭或特異性結合物質，靶分子可與生物傳感器表面非特異性結合。使一種或多種特異性結合物質或接頭固定在生物傳感器上，使得特異性結合物質或接頭不會在漂洗過程沖被沖洗掉，并使得其與試驗樣品中的靶分子的結合不受生物傳感器表面阻礙。已實施了若干類型的表面化學策略用于特異性結合物質與例如用于不同類型微陣列和生物傳感器的玻璃、塑料或納米多孔材料的共價連接。使生物傳感器表面含有結合一種或多種特異性結合物質的適當官能團的生物傳感器的表面制備，這是生物傳感器制造方法的有機組成部分之一。通過物理吸附(即無需使用化學接頭)或通過化學結合(即需要使用化學接頭)以及電化學結合、靜電結合、疏水結合和親水結合，可將一種或多種特異性靶分子與生物傳感器表面連接?；瘜W結合可使特異性結合物質較強地連接在生物傳感器表面上，并提供規(guī)定方向和構象的表面結合分子?；旧习凑展潭ǖ讲Ａ系姆椒?，可以將特異性結合物質固定在塑料、環(huán)氧樹脂或高折射率材料上。然而，可以取消酸洗滌步驟，此處理可能損害特異性結合物質所固定的材料。使用生物傳感器的方法本發(fā)明的一個實施方案提供鑒定結合靶分子的一種或多種"小分子"(即低于約300Da的分子)的方法。靶分子可以是例如核酸分子、多肽、蛋白質、抗原、多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體(scFv)、F(ab)片段、F(ab')2片段、Fv片段、有機小分子、無機小分子、細胞、病毒、細菌或生物樣品。小分子可以是例如核酸分子、多肽、抗原、抗體碎片、有機小分子或無機小分子。小分子可以小于約1Da、5Da、10Da、50Da、75Da、100Da、125Da、150Da、175Da、200Da、225Da、250Da、275Da或300Da。小分子可約為0.1Da至約500Da、約1Da至約300Da、約1Da至約200Da、約1Da至約100Da、約1Da至約50Da、約1Da至約25Da或介于約0.1Da至約500Da之間的任何范圍。具有適當靈敏度的基于平板的無標記方法可供快速篩選在靶分子任何位置上進行結合的非常小(小于約300Da)的化合物的整個文庫。小分子文庫可包括約5、10、25、50、100、500、1，000、5，000、10，000種以上不同的小分子?；蛘?，小分子文庫可只包括一種類型的小分子。可將靶分子涂在生物傳感器表面的第一位置。測定第一位置的比色共振反射光的第一峰波長值(PWV)或折射率。將小分子樣品(例如小分子文庫)應用到第一位置上。必要時，可將靶分子和小分子樣品保溫一段時間。測定第一位置的第二PWV或折射率。計算出第一個數值，其中第一個數值是第一PWV和第二PWV(或第一折射率和第二折射率)之間的差值。如果第二PWV(或折射率)與第一PWV相比發(fā)生了位移，則小分子樣品與靶分子結合。任選將第一個數值與對照試驗進行比較。對照試驗可包括將靶分子涂在生物傳感器表面的第二位置?？稍诘谝慌蟹肿討玫降谝晃恢玫耐瑫r或在稍后時間將這些靶分子涂在第二位置。這些靶分子可以是與涂在第一位置的那批靶分子相同類型的靶分子或不同類型的靶分子。檢測第二位置的第三PWV(或折射率)。將已知的靶分子結合劑(targetmoleculebinder)涂在第二位置。必要時，可將靶分子保溫一段時間。檢測第二位置的第四PWV(或折射率)。確定第二個數值，其中第二個數值是第二位置的第三PWV(或折射率)和第四PWV(折射率)之間的差值。如果第一個數值和第二個數值相同或相似，則小分子樣品與靶分子結合。如果第一個數值和第二個數值彼此在約lnm范圍內，則它們相同或相似。因為探查靶分子的無標記生物傳感器方法不會破壞靶分子，所以可對靶分子處理一次以上以找出隨時間變化的差異。生物傳感器表面上的第一位置和第二位置可以是選自以下容器的內表面微量滴定板孔、微量滴定板、試管、培養(yǎng)皿、微流體通道和微陣列。在本發(fā)明的實驗中，小分子樣品和試驗分子不必包含檢測標記；然而，必要時，它們可包含標記。可將一種或多種耙分子涂在某一位置，例如生物傳感器表面的微量滴定板孔上。容器是指一個容器，而不是指一批容器，例如多孔板。檢測該位置的比色共振反射光峰波長10種或多種靶分子保溫一段時間(例如1秒鐘、30秒鐘、1分鐘、2分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、5小時、10小時以上)。在保溫之前，或在保溫之后，或在保溫之前以及在保溫之后，可將一種或多種小分子應用于一種或多種靶分子上?？梢缘诙螜z測該位置的比色共振反射光PWV。如果一種或多種小分子與靶分子結合，則與未發(fā)生結合的情況相比，光的反射波長發(fā)生位移。可將第一PWV與第二PWV進行比較。PWV的變化表明發(fā)生了結合?？蓽y定若干時段的PWV并進行比較。還可以實時監(jiān)測結合(參見例如圖5)。在本發(fā)明的一個實施方案中，可以測定與靶分子結合的小分子的數量或濃度。參見例如圖1。在生物傳感器位置上的結合可通過生物傳感器表面的PWV檢測，或者更常見的是使用顯微鏡、數碼相機、傳統(tǒng)相機或其它可視化儀器，利用基于透鏡的光學裝置或基于電子的電荷耦合裝置(CCD)技術放大或不放大信號來進行監(jiān)測。優(yōu)選測定PWV的掃描儀的透鏡的分辨率約為2至約200、約2至約50或約2至約15微米像素大小。本發(fā)明的實驗可以在約1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘或60分鐘以內完成。也就是說以省時的方式測定結合。在開發(fā)和設計藥物時，使第一分子與小分子連接可能是有利的，其中第一分子與靶分子的靶位點結合，小分子與靶分子的靶位點或相鄰位點結合。這樣可將特異性附加在與靶位點結合的第一分子上。例如，對于具有類似功能的靶分子來說，許多靶標活性位點十分相似。然而，耙分子很可能具有鄰近活性位點的獨特位點。通過一部分鄰接分子使靶位點封閉以及通過鄰接分子的結合部分對更為獨特的相鄰靶位點的特異性，來獲得鄰接分子的優(yōu)勢。因此，鑒定在特定靶位點以外與靶分子結合的小分子可能是有利的。另外，因為本發(fā)明提供能夠測定多個連續(xù)相互反應的靜態(tài)系統(tǒng)，所以能用來測定多個小分子連接(在不同位點上，包括同一靶分子內的不同位點)事件。可以用例如在靶位點結合(共價或非共價)靶分子的分子("封阻劑分子")"封閉"靶分子。靶位點可以是例如這樣一個位點如果其被封閉，則失活或激活靶分子。因此可用小分子文庫探測封閉和未封閉的靶分子傳感器表面，以便從在靶分子未封閉位點上與靶分子結合的文庫中找出小分子。本發(fā)明的方法還提供通過競爭實驗測定在相同結合位點上或接近相同結合位點與靶分子相互作用/結合的分子。本發(fā)明的方法還提供通過滴定實驗測定親合力(avidity)及親和力(affinity)或平衡結合常數。親合力是多個鍵合作用的綜合強度。因此，親合力是化學鍵親和力的綜合協同強度而不是化學鍵的總和。親和力是指單鍵的強度。親和力指標包括但不限于平衡結合常數、解離常數、結合速率和解離速率。解離常數(Kd)是小分子與靶分子之間的親和力，因此表明小分子如何緊密地與特定靶分子結合。親和力可受例如兩個小分子和靶分子之間的以下共價相互作用和非共價分子間相互作用的影響例如氫鍵結合、靜電相互作用、疏水力和范德華力。本發(fā)明的方法可檢測用其它方法無法檢測到的小分子和靶分子之間的極弱結合。例如，可在下列Kd下，檢測到小分子和靶分子間的結合大于約2，000iiM、1，500iiM、1，000iiM、750iiM、500iiM、250iiM、100iiM、50iiM、25iiM、10iiM、5iiM、1iiM以上?？稍谙铝蠯d下檢測到小分子和耙分子間的結合約2，000iiM至約0.001yM、約2，000yM至約0.01iiM、約2，000iiM至約1，000iiM、約2，000iiM至約1，500iiM、約2，000iiM至約750iiM、11約1，500iiM至約0.01iiM、約1，000iiM至約0.01iiM、約750iiM至約0.01iiM、約500iiM至約0.01iiM、約250iiM至約0.01iiM或者約2，000yM至約0.001yM之間的任何范圍。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法可用于測定小分子對靶分子的親和力。可使靶分子固定在比色共振反射生物傳感器表面上。測定第一峰波長值?？蓪⑿》肿影蠢?、5、10、12、15、24或36以上(2和1，000之間的任何范圍)的不同濃度，加到比色共振反射生物傳感器表面上。實質上是為了繪出滴定曲線。檢測各個不同濃度的峰波長值。對峰值波長進行比較，以確定小分子對于靶分子的親和力。在一個實施方案中，耙分子或小分子或兩者的分子量是已知的。本發(fā)明的另一個實施方案提供測定小分子等級親和力值的方法。測定比色共振反射生物傳感器表面的第一峰波長值。使已知分子量的靶分子固定在比色共振反射生物傳感器表面上。測定第二峰波長值。使用第一峰波長值和第二峰波長值的差值確定與比色共振反射生物傳感器結合的靶分子的摩爾量。將特定濃度的已知分子量的小分子加到比色共振反射生物傳感器上。不需要確切的分子量。例如，可采用分子量近似值。例如使用450Da與30，OOODa耙標結合，可估計小分子文庫的分子量范圍為300-600，對于耙標300-600之間的差異在比值上可忽略不計。測定第三峰波長值。第二峰波長值和第三峰波長值之間的差值提供了與比色共振反射生物傳感器表面結合的小分子的量。用第二峰波長值和第三峰波長值之間的差值與第一峰波長值和第二峰波長值之間差值的比率，確定小分子的等級親和力。本發(fā)明還提供用于測定小分子是否與靶分子的特定位點結合或者與已知靶位點封阻劑竟爭性結合靶分子的靶位點的方法?？墒拱蟹肿庸潭ㄔ诘谝槐壬舱穹瓷渖飩鞲衅魃?。同樣使靶分子固定在第二比色共振反射生物傳感器上，其中靶分子的靶位點用已知的靶位點封阻劑封閉。將小分子加到第一比色共振反射生物傳感器和第二比色共振反射生物傳感器上并測定第一比色共振反射生物傳感器和第二比色共振反射生物傳感器的峰波長值。如果第一比色共振反射生物傳感器的峰波長值與第二比色共振反射生物傳感器的峰波長值相比發(fā)生位移，則小分子與已知封阻劑競爭性結合靶分子靶位點或與靶分子的特定位點結合。本發(fā)明還可測定固定化靶分子與所加入的小分子的化學計量比。此外，可用本發(fā)明方法測量的超化學計量相互作用(s卯erstoichiometricinteraction)，來測定小分子的相互作用或"粘性(stickiness)"的特異性。一般而言，在藥物設計中，理想的是避免超化學計量或"粘性"小分子，也就是說與靶分子超過一個的結合位點結合的小分子，因為它們對特定靶標缺乏特異性，且最終導致不良毒性。在一個實施例中，隨時間變化定量測定固定在傳感器上的耙分子的量。例如于0.1分鐘至1小時(或之間的任何范圍)測定PWV?？刹捎?、5、10、20、30、50、100、200個以上(或之間的任何范圍)的時間點。如果利用本發(fā)明的一種形式提供PWV位移約為2ng/mm2，且具有固定化靶標分子量值，則可計算出固定在傳感器上靶標分子的摩爾數(2ng/m^乘以傳感器讀數面積大小(單位為mm2)乘以1摩爾/分子量靶標)。運用下列等式，使用該值計算出可結合靶標的小分子的相應量靶標固定PWV位移乘以(配體分子量/耙標分子量)。應用本發(fā)明，得到超過這個數值的PWV位移值表示超化學計量結合。如果數值是2-5倍的倍數，則該值很可能是與靶標實際結合。如果該值大于此值數倍，則可表示聚集化合物。參見例如圖5。12通常當測定分子和靶分子間的解離常數時，與靶分子結合的分子濃度適宜約為預期Kd的10倍以上。然而，由于分子在少量非水溶劑(例如可能與敏感生物系統(tǒng)一起使用)中的固有溶解度，因此可能難以在如此高的濃度下篩選出小分子。本發(fā)明提供測定在低濃度小分子下小分子和耙分子的親和力的方法(例如約2mM、約lmM、約0.5mM、約0.25mM或約2mM至約0.5mM、約2mM至約0.25mM、約0.5mM至約0.OlmM或者2mM和0.OlmM之間的任何范圍)。在小分子濃度低于Kd的情況下，如果確能檢測出，則大多數實驗的結合信號顯著減弱。結合信號將隨濃度增加而升至濃度點等于Kd時的最大信號l/2的點上。由于本發(fā)明可供預測最大信號(見上文)，開始發(fā)出結合信號的任何較低濃度的小分子便從一條斜線開始，延伸到預期的平臺期。本領域從業(yè)人員應當了解的是，可由所述斜率和所述最大信號確定小分子對靶標的親和力。本發(fā)明的方法還可通過在抑制型實驗中置換已知的結合配偶體，從而用來測定生物活性的降低。將已知的結合配偶體和一種或多種小分子兩者同時加到已封閉或未封閉靶位點的生物傳感器表面上。對照實驗包括僅一種或多種小分子、僅已知的結合配偶體或者無分子被加到封閉和未封閉的表面上。本發(fā)明的方法還可鑒定和校正在測試封閉(用已知的靶分子結合劑)和未封閉的靶分子之間可能出現的差異。例如，如果將已知的緊密結合分子加到涂有靶分子的生物傳感器表面，然后將小分子文庫(溶于匿SO緩沖液或鹽緩沖液)加到表面上，則可檢測出信號。該信號可表示結合?；蛘?，該信號可表示由鹽緩沖液或匿SO緩沖液所引起的假信號。例如，小分子文庫溶液中的匿S0可能引起的信號變化高達25%以上。本發(fā)明的一個實施方案通過對耙位點封閉和未封閉的生物傳感器表面上的匿SO進行滴定以提供"錯配"校正。靶位點封閉表面是這樣的表面其中靶分子被固定在生物傳感器表面上且將已知與靶分子靶位點結合的一種分子(即"封阻劑分子")加到生物傳感器表面上。未封閉表面是這樣的表面其中靶分子被固定在生物傳感器表面上。將一種或多種類型的小分子加到封閉的和未封閉的表面上。如果在封閉的生物傳感器表面上觀察到陰性PWV位移，則匿S0或鹽緩沖液引起變化。如果在封閉的表面上及在未封閉的表面均觀察到陽性位移，則小分子在非已知的結合分子的位點上與靶標分子結合。如果在未封閉的表面觀察到陽性位移，且在封閉的表面上觀察到較弱的陽性位移，則已知的結合分子和小分子在同一靶位點上結合。參見例如圖4。為了校正由匿SO或鹽緩沖液引起的變化，可將在參照表面或對照表面上測量的PWV陰性位移加到靶表面的結合信號中。本發(fā)明方法可檢測的相互作用的類型的實例見表1。表l特異性相互作用其它相互作用化學計量i:i超化學計量劑量反應曲線與結合等溫線匹配良好劑量反應曲線與結合等溫線匹配差13<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>在本文中任何部分提及的所有專利、專利申請和其它科技文獻通過引用將其整體結合到本文中。本文對本發(fā)明作了示例性描述，可在不存在本文未具體公開的任何要素或限制時，適當地實施本發(fā)明。因此，例如，在本文任何情況下，術語"包含(含)"、"基本上由......組成"和"由......組成"中的任一個可被其它兩個術語中的任一個替換，而又保持它們的通用含義。所使用的術語和表達方式是描述性的而非限制性的，而且在使用這些術語和表達方式時，并不排除所寫明和記載的特征或特征部分的任何等同特征或特征部分，但是要了解的是，各種修改都可能落入本發(fā)明要求保護的范圍內。因此，應當了解的是，雖然通過實施方案、任選特征具體地公開了本發(fā)明，但是本領域技術人員可借助本文所公開的構思作出修改和變動，這些修改和變動也被認為屬于本發(fā)明說明書和所附權利要求書限定的范圍內。另外，在以馬庫什要素組或其它可選擇要素組描述了本發(fā)明的特征或方面的情況下，本領域技術人員應了解，本發(fā)明因此也已經通過馬庫什要素組或其它要素組的各單一成員或成員亞組的形式得以說明了。實施例使具有腺苷三磷酸酶結合域的靶分子即蛋白質X(26kDa)固定在比色共振反射生物傳感器上。將文庫成員平均分子量〈300Da的化合物文庫加到生物傳感器上。檢測到文庫組分與生物傳感器直接結合。用生物物理學方法，包括NMR和X-射線晶體學檢測法，還獲得了化合物文庫的結合數據。對約500種分子的2%匿SO緩沖液進行了篩選。讀數時間少于10分鐘。配體篩選濃度為250iiM和lmM。結果如下200Da配體的動態(tài)量程為1:l化學計量，完全結合60pm，S/N=12;陽性對照和陰性對照的正確鑒定；檢測/滴定的親和力范圍為lnM至約lmM;與較低通量的生物物理學方法呈強命中相關(stronghitcorrelation)。對下列化合物進行了鑒定(參見圖2和圖3):碎片A(Mr=265Da，Kd--0.OluM)碎片B(Mr=263Da，Kd--luM)'碎片c(Mr=249Da，Kd--luM)碎片D(Mr=168Da，Kd--IOOuM)碎片E(Mr=215Da，Kd--IOuM)碎片F(Mr=265Da，Kd--0.luM)碎片G(Mr=283Da，Kd—-0.OOluM)圖1表示用于靈敏檢測與蛋白質X弱締合的小分子的生物傳感器的再現性，蛋白質X被固定在傳感器表面上。以lmM或0.25mM的濃度，將小分子加到傳感器板表面。結果證實是高度可再現的定量結果。該實驗在標準96孔板和384孔板中進行。圖2表示當將聚集化合物和匿S0錯配化合物以相同濃度加到對照表面或封閉表面(x軸)上時，與靶表面(y軸)相比，聚集化合物和匿SO錯配化合物在對照表面或封閉表面(x軸)產生顯著不同的信號。該圖在圓圈區(qū)域內突出顯示了用來獲得實驗穩(wěn)健性統(tǒng)計評估的陽性對照(已知結合)化合物。由于聚集分子所致，該實驗鑒定出假陽性(陰影框以外的分子)。本實驗強相關性地證實了結合化合物，正如用以下其它生物物理實驗所測定的一樣核磁共振波譜法、x-射線晶體學檢測法和等溫滴定熱量法。圖2表示得自5塊96-孔傳感器板之一的代表性數據。圖3"標準"曲線圖顯示可應用本發(fā)明的方法進行滴定，獲得已知結合化合物的理想的親和力結合曲線，該結合化合物通過其它生物物理方法獲得。"BINDHits"曲線圖表示可以通過繪出擬合到用于親和力等級評定的平衡結合常數的滴定曲線，從而通過本發(fā)明的方法作進一步的生物化學表征，以證實由本發(fā)明方法"發(fā)現的"化合物為結合化合物。因此，本發(fā)明的方法可用來確定各結合化合物如何緊密地與靶分子結合，以確定化學計量，并采用例如競爭實驗確定各個結合位點。圖4表明本發(fā)明的方法能夠測定弱締合碎片與不同結合位點的結合。給出大于零的信號以及當在靶表面測試和在封閉靶表面測定時信號大致接近的化合物，對靶標無特異性且不大可能與靶標的單一位點實際結合。比起它們在封閉靶表面顯示的信號，在突出顯示的圓形區(qū)域中的化合物在靶標上顯示出顯著較強的信號，因此被確定為具有結合特異性且有適當比率，與由PWV位移信號提供的摩爾計算值一樣。圖5表示用于特異性測定的結合時程實驗。較慢的結合可表示較低的特異性，尤其當PWV位移超過1:l化學計量時?；衔锟譌11和孔F4表示"粘性"或超化學計量的化合物。正常的l:l結合表明發(fā)生在混合時間的穩(wěn)定平臺信號(化合物孔G7)。權利要求一種測定小分子對靶分子的親和力的方法，其中該方法包括(a)使靶分子固定在比色共振反射生物傳感器表面上并測定第一峰波長值；(b)將小分子以3種以上不同的濃度加到比色共振反射生物傳感器表面并測定所述3種以上不同濃度的峰波長值；對峰值波長進行比較以確定小分子對于靶分子的親和力。2.權利要求1的方法，其中所述小分子小于約300Da。3.權利要求1的方法，其中測定所述小分子的解離常數(Kd)。4權利要求3的方法，其中所述小分子的解離常數約為2，000iiM至約750yM。5.權利要求1的方法，其中所述小分子的濃度約為0.5mM至約0.OlmM。6.—種測定小分子樣品的等級親和力的方法，該方法包括(a)檢測比色共振反射生物傳感器表面的第一峰波長值；(b)使已知分子量的靶分子固定在比色共振反射生物傳感器表面上并測定第二峰波長值；(c)利用第一峰波長值和第二峰波長值確定與比色共振反射生物傳感器結合的靶分子的摩爾量；(d)將特定濃度的已知分子量的小分子樣品加到比色共振反射生物傳感器上并測定第三峰波長值；其中第二峰波長值和第三峰波長值之間的差值給出了與比色共振反射生物傳感器表面結合的小分子的量；(e)利用第一峰波長值和第二峰波長值之間的差值與第二峰波長值和第三峰波長值之間的差值的比率確定小分子樣品的等級親和力。7.權利要求6的方法，其中所述小分子樣品包含小于約300Da的小分子。8.權利要求6的方法，其中所述小分子樣品中的小分子的解離常數約為2，000M至約750iiM。9.權利要求6的方法，其中所述小分子樣品中的小分子濃度約為0.5mM至約0.OlmM。10.—種測定小分子是否與靶分子的特定位點結合或者是否與已知封阻劑競爭性靶向結合靶分子的靶位點的方法，該方法包括(a)使靶分子固定在第一比色共振反射生物傳感器上；(b)使靶分子固定在第二比色共振反射生物傳感器上，其中所述靶分子的靶位點用所述耙位點的已知封阻劑封閉；(c)將小分子加到第一比色共振反射生物傳感器和第二比色共振反射生物傳感器上并測定第一比色共振反射生物傳感器的峰波長值和第二比色共振反射生物傳感器的峰波長值；其中，如果對第一比色共振反射生物傳感器的峰波長值與第二比色共振反射生物傳感器的峰波長值相比發(fā)生位移，則小分子與已知封阻劑競爭性結合靶分子上的靶位點或者小分子與靶分子的特定位點結合。11.權利要求10的方法，其中所述小分子小于約300Da。12.權利要求10的方法，其中所述小分子的解離常數約為2，000iiM至約750yM。13.權利要求10的方法，其中所述小分子的濃度約為0.5mM至約0.OlmM。14.一種測定300Da以下的小分子是否與靶分子結合的方法，其中該方法包括(a)使靶分子固定在比色共振反射生物傳感器表面上并測定第一峰波長值；(b)將小分子加到比色共振反射生物傳感器表面上并測定第二峰波長值；對第一峰波長值和第二峰波長值進行比較，其中如果第二峰波長值與第一峰波長值相比發(fā)生位移，則小分子與靶分子結合。15.權利要求14的方法，其中測定所述小分子的解離常數(Kd)。16.權利要求15的方法，其中所述小分子的解離常數約為2，000iiM至約750yM。17.權利要求14的方法，其中所述小分子的濃度約為0.5mM至約0.OlmM。全文摘要本發(fā)明提供應用生物傳感器檢測與固定化靶標直接結合的小分子的方法。本發(fā)明提供檢測小分子與靶分子相互作用的方法。文檔編號G01N33/50GK101743465SQ200880021272公開日2010年6月16日申請日期2008年4月19日優(yōu)先權日2007年4月19日發(fā)明者L·萊恩,R·沃納申請人:Sru生物系統(tǒng)公司