專(zhuān)利名稱(chēng)：：興奮劑化合物的分析的制作方法興奮劑化合物的分析本發(fā)明涉及在(機(jī)體)流體或組織/樣品萃取物中測(cè)定藥品或藥物或其代謝產(chǎn)物的方法，所述方法包括固相萃取和/或固相微萃取和/或衍生化和全多維氣相色譜的組合。在很多情況下，人們想要了解關(guān)于藥品或藥物在活生物體中的任何使用。例如，可能對(duì)藥物的代謝或監(jiān)測(cè)生化途徑感興趣(例如在毒物學(xué)研究中)。此外，在很多領(lǐng)域，使用藥品或藥物，以增強(qiáng)或增加任何預(yù)期的結(jié)果，特別是運(yùn)動(dòng)和育種的領(lǐng)域。此類(lèi)藥品或藥物例如可用于改善(人或動(dòng)物)運(yùn)動(dòng)員的體能或耐久性或者支持任何育種過(guò)程(例如，動(dòng)物更快生長(zhǎng))。為測(cè)定任何藥物或藥品的使用(或?yàn)E用)，需要快速、可靠且可行的用于在任何(機(jī)體)樣品中測(cè)定藥物或藥品或其代謝產(chǎn)物的方法。因此，通過(guò)本發(fā)明，提供了一種方法，用于在來(lái)自生物體的(機(jī)體)流體或組織或其它樣品中測(cè)定藥品或藥物或其代謝產(chǎn)物，所述方法可在兩或三小時(shí)內(nèi)進(jìn)行(整個(gè)方法)，并且高度靈敏，因此能在短時(shí)間內(nèi)提供優(yōu)異的結(jié)果。本發(fā)明的方法包括下述步驟(i)任選地，用至少一種酶處理(機(jī)體)流體或(機(jī)體)樣品或(機(jī)體)組織的萃取物，和/或任選地，進(jìn)行衍生化以增強(qiáng)樣品制備，例如，用鹵代甲酸烷基酯，例如ECF(氯甲酸乙酯)進(jìn)行衍生化。(ii)將所述流體或萃取物的至少第一部分與能從該流體或萃取物中吸附出有機(jī)化合物的至少一種第一固相接觸，和/或(iii)將所述流體或萃取物的至少第二部分與能從該流體或萃取物中萃取或吸附出有機(jī)化合物的至少一種第二相接觸，和/或(iv)任選地，將所述流體或萃取物的至少第三部分與能從該流體或萃取物中萃取出有機(jī)化合物的液相接觸(v)通過(guò)對(duì)第一固相應(yīng)用熱處理和/或通過(guò)溶劑萃取，解吸附與第一固相結(jié)合的化合物，任選地，接著至少部分蒸發(fā)溶劑，(vi)任選地，通過(guò)應(yīng)用熱處理和/或通過(guò)溶劑萃取，萃取或解吸附第二相中的或與第二相結(jié)合的化合物，任選地，接著至少部分蒸發(fā)溶劑(vii)通過(guò)多維氣相色譜(GC)，優(yōu)選通過(guò)優(yōu)選與質(zhì)譜偶連的全多維GC(GOGC)，來(lái)分析步驟(v)和(vi)解吸附的化合物以及任選的步驟(iv)中萃取的化合物。本文所用的化合物是任何藥品或藥物或者其生化途徑(優(yōu)選是哺乳動(dòng)物生化途徑)之后的代謝產(chǎn)物，所述化合物在攝入(包括注射或藥膏應(yīng)用)后被包含于任何(機(jī)體)流體或組織中。可根據(jù)本發(fā)明的方法加以分析的(機(jī)體)流體可以例如是血液、尿液、糞便、來(lái)自淚道的液體、脊髓液、腦液、來(lái)自淋巴腺的液體或任何其它可獲得的體液。因?yàn)橐子讷@得，機(jī)體液體優(yōu)選是血液或尿液。還可在下述液體中測(cè)定藥品或藥物的可能攝入，所述液體來(lái)自用合適溶劑對(duì)其中存在藥品或其代謝產(chǎn)物的組織或物質(zhì)進(jìn)行的萃取。在這種情況下，例如可對(duì)毛發(fā)或指甲、機(jī)體組織和來(lái)自活體(剩余部分)的其它材料進(jìn)行測(cè)定。在該情況下，4"流體"是來(lái)自所述組織的萃取物。此外，可對(duì)固體樣品進(jìn)行直接分析，例如，在熱解吸附或熱解之后。使用多維氣相色譜分析化合物是本領(lǐng)域已知的。特別地，可使用全二維氣相色譜，通過(guò)兩種不同參數(shù)來(lái)分析任何化合物。就這些目的而言，可使用兩種不同的分離柱，例如，第一種柱包含非極性材料，第二種柱包含更具極性的材料，或者反過(guò)來(lái)。但是，也可使用其它組合，例如，對(duì)映異構(gòu)分離。全二維氣相色譜以及全二維氣相色譜和飛行時(shí)間質(zhì)譜(T0F-MS)的組合是已知技術(shù)，例如Lu，X.etalinJournalofChromatographyA，1043(2004)，265-273頁(yè)對(duì)其進(jìn)行了描述，Adahchour，M.etal.，inTrendsinAnalyticalChemistry,Vol.25，No.8，2006，821-840頁(yè)描述了全二維氣相色譜近來(lái)的發(fā)展。使用全二維氣相色譜(GCxGC)在反興奮劑中用于藥品分析，可從Kuchetal.，inJournalofChromatographyA，1000(2003)，109-124頁(yè)的文章已知。但是，該文描述的方法是實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的，并且耗時(shí)。此外，進(jìn)行的樣品制備排除了大量化合物，例如，利尿劑。術(shù)語(yǔ)"全"在本文中使用時(shí)表示從第一色譜柱洗脫的幾乎所有成分都作為不同級(jí)分引入第二色譜柱。此外，可檢測(cè)從該第二柱洗脫的所有組分，優(yōu)選通過(guò)質(zhì)譜，更優(yōu)選通過(guò)T0F-MS來(lái)進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)任選步驟，即步驟(i)中，在酶能提供其活性的條件下，向"原樣"濃縮、稀釋或不管怎樣處理過(guò)的形式的(機(jī)體)流體中，加入至少一種酶。酶展示出最佳活性的條件(例如溫度或緩沖系統(tǒng))取決于所使用的酶，其通常由供應(yīng)商給出。酶優(yōu)選選自葡糖苷酸酶、乙二醇酯酶和/或硫酸酯酶/脫硫酸酯酶。加入酶使得化合物的衍生物(例如生化途徑的代謝產(chǎn)物)分解，其典型被糖基化或磺化。如果合適的話(huà)，可向(機(jī)體)流體中加入任何其它酶，用于分解途徑代謝產(chǎn)物。在根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，任何(機(jī)體)流體或萃取物被分為若干部分，其中，根據(jù)步驟(ii)將流體或萃取物的至少一部分與至少一種第一固相相接觸。所述第一固相優(yōu)選是有機(jī)材料，更優(yōu)選選自聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚丙烯酸酯、聚乙二醇(Carbowax)-二乙烯基苯(聚乙二醇/DVB)、PDMS-DVB、Carboxen/PDMS、二乙烯基苯-Carboxene-聚二甲基硅氧烷(DVB/Carboxen/PDMS)、聚(甲基氫硅氧烷)(PMHS)或其它通常已知和使用的相。Carbowax和Carboxen是商業(yè)可獲得的固相，其由Supelco(Sigma-Aldrich)提供。在一種特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，第一固相是有機(jī)纖維，其優(yōu)選具有5至200ym的厚度，優(yōu)選10至200iim，更優(yōu)選30至150iim，或者其是攪拌棒。此類(lèi)纖維可通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)得，并可用于固相微萃取工藝(SPME)。在使用之前，優(yōu)選對(duì)纖維加以調(diào)理(condition)，例如，令其被加熱至至少200。C，優(yōu)選至至少220。C，進(jìn)行至少20分鐘，優(yōu)選至少30分鐘，更優(yōu)選至少1小時(shí)，這取決于所使用的材料。使用之前調(diào)理纖維的溫度由廠商說(shuō)明書(shū)提供。可應(yīng)用任何其它調(diào)理，以對(duì)固相進(jìn)行想要的處理，例如，用有機(jī)溶劑對(duì)其加以沖洗或者任何其它合適的處理(包括其它溫度或其它解吸附時(shí)間)。優(yōu)選地，根據(jù)步驟(iii)將流體或萃取物的第二部分與第二相接觸，第二相可以是液相、氣相或固相。因此，所述第二相被用于液相萃取(例如通過(guò)有機(jī)溶劑來(lái)進(jìn)行)、氣相萃取(用于揮發(fā)性有機(jī)化合物)或固相萃取(SPE)。如果第二相是固相，所述第二固相可以是已知用于SPE工藝的任何材料，例如，基于氧化硅的材料、氧化鋯或其它例如經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾的聚合材料(例如，聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物PS-DVB或聚丙烯酸酯)。如果經(jīng)過(guò)修飾的話(huà)，使用的材料典型地經(jīng)十八烷基修飾，但是也可應(yīng)用其它修飾(例如苯基、辛基或者甚至官能化或未官能化的材料)?？捎糜赟PE的材料是公知的?？蓪⒑谢衔锏牧黧w或萃取物放到經(jīng)預(yù)清潔或預(yù)沖洗(僅通過(guò)將液體樣品經(jīng)柱洗脫來(lái)進(jìn)行)的SPE柱的頂端，之后，可解吸附留下的化合物，例如通過(guò)用溶劑洗脫來(lái)進(jìn)行。為進(jìn)行洗脫，可使用0.1至20ml溶劑，優(yōu)選1至20ml，更優(yōu)選2_10ml，典型地，使用5ml，但是這強(qiáng)烈取決于SPE柱、其大小、應(yīng)用、目的等。將第一固相與流體或萃取物的第一部分接觸和/或?qū)⒌诙嗯c流體或萃取物的第二部分接觸之后，每種相中萃取的或與每種相結(jié)合的化合物被回收，優(yōu)選地，被解吸附或被萃取。因此，根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(v)，通過(guò)熱解吸附，例如向固相應(yīng)用熱處理，或通過(guò)液體萃取，或同時(shí)通過(guò)這兩種技術(shù)，來(lái)解吸附與第一固相結(jié)合的化合物。被吸收或吸附到第一固相上的化合物被解吸附/萃取之后，立即通過(guò)(多維)氣相色譜來(lái)分析這個(gè)/這些化合物。任選地，解吸附之前或期間可對(duì)化合物進(jìn)行衍生化。使用固相作為第二相的情況下，根據(jù)步驟(vi)，通過(guò)熱解吸附或溶劑萃取，從所述第二固相解吸附/萃取出與第二固相吸附的化合物。任選地，解吸附之前或期間可對(duì)化合物進(jìn)行衍生化。在分析化合物之前，任選地，用于步驟(iv)至(vi)的溶劑被至少部分蒸發(fā)?？捎糜谳腿?解吸附與第一和/或第二固相結(jié)合的化合物的溶劑主要取決于所用的第一和/或第二固相的材料的性質(zhì)和與所述固相結(jié)合的化合物的性質(zhì)。在步驟(iv)、(v)和(vi)中，可使用相同或不同的溶劑。適用于萃取步驟的溶劑可以例如是丙酮、甲醇、乙醇、乙酸甲酯等。萃取或解吸附之后，立即將化合物應(yīng)用于氣相色譜。第二相是液體的情況下，特別是有機(jī)溶劑的情況下，可將萃取物立即應(yīng)用于氣相色譜。作為任選步驟，但是作為根據(jù)本發(fā)明的方法的一種優(yōu)選實(shí)施方式，在從第一和/或第二固相對(duì)化合物加以萃取或解吸附之后或通過(guò)液體萃取回收化合物之后，對(duì)溶劑進(jìn)行至少部分蒸發(fā)。對(duì)于進(jìn)一步加工而言，無(wú)須溶劑完全蒸發(fā)，但是優(yōu)選蒸發(fā)溶劑的至少50%，優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少90%。蒸發(fā)可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)進(jìn)行，例如通過(guò)加熱、減壓(真空)、冷凍干燥、凍干和其它更多方法來(lái)進(jìn)行。此外，在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地，步驟(vi)之后，特別優(yōu)選是在蒸發(fā)溶劑組分之前，進(jìn)行對(duì)有機(jī)化合物的衍生化，優(yōu)選通過(guò)用烷基化和/或硅烷化和/或乙?；噭┻M(jìn)行處理來(lái)實(shí)現(xiàn)。此類(lèi)試劑優(yōu)選是甲基碘和/或151八(^甲基-N-(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺)、BSTFA(N，0-雙_(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺)、BSA(N，0-雙[三甲基甲硅烷基]乙酰胺)、MTBSTFA(N-甲基-N-[叔丁基二甲基甲硅烷基]三氟乙酰胺)和類(lèi)似的化合物/試劑。此類(lèi)化合物/試劑是技術(shù)人員已知的。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，衍生化的步驟在任何之前的階段中進(jìn)行，例如，在步驟(i)之前或之后，步驟(iii)之前或之后或者步驟(vi)之前。上文解釋的根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟是用于"樣品制備"的步驟，其中，之后，通過(guò)氣相色譜，按照步驟(vii)，對(duì)(機(jī)體)流體或萃取物的含有化合物的樣品加以分析。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)多維氣相色譜，例如二維氣相色譜，更優(yōu)選地，通過(guò)全多維氣相色譜，來(lái)分析化合物，其中，所述全多維氣相色譜可與質(zhì)譜(優(yōu)選地，所謂的飛行時(shí)間質(zhì)譜)偶聯(lián)，和/或與火焰電離檢測(cè)儀(FID)或其它檢測(cè)技術(shù)偶聯(lián)。根據(jù)本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的實(shí)施方式，(機(jī)體)流體或萃取物可被分為若干部分，其中，可根據(jù)步驟(ii)將第一部分與第一固相(優(yōu)選是有機(jī)纖維)接觸，根據(jù)步驟(v)從所述固相解吸附，產(chǎn)生樣品1。可根據(jù)步驟(iii)將(機(jī)體)流體或萃取物的第二部分與第二固相相接觸，優(yōu)選地，用溶劑對(duì)吸附至第二固相的化合物進(jìn)行解吸附，溶劑優(yōu)選之后被蒸發(fā)，用烷基化試劑(優(yōu)選地，甲基碘)處理從第二固相解吸附的化合物，之后根據(jù)步驟(vi)從第二固相解吸附化合物的衍生物，產(chǎn)生樣品2。可將(機(jī)體)流體/樣品萃取物的第三部分與另外的固相或液相(單獨(dú))接觸，所述固相或液相可與上文所述的第二相相同，但并非必須相同。對(duì)吸附或吸收到該后一種固相上的化合物進(jìn)行熱解吸附，或用溶劑解吸附，所述溶劑之后優(yōu)選被蒸發(fā)，可用衍生化試劑(例如硅烷化試齊U，例如用MSTFA，但其它試劑也可應(yīng)用)處理從后一固相解吸附的化合物，產(chǎn)生樣品3。事實(shí)上可通過(guò)將(機(jī)體)流體分為至少兩部分來(lái)獲得相同的結(jié)果，其中，按照上文所述用SPME(約等于第一固相)來(lái)處理流體的第一部分，用第二固相來(lái)處理第二部分，洗脫化合物，之后將含有洗脫的化合物的樣品分為至少兩部分，用于不同的衍生化。因此也獲得了三種不同的樣品。因此，根據(jù)本發(fā)明的上述特別優(yōu)選的實(shí)施方式，將(機(jī)體)流體或萃取物中含有的化合物分為(至少)三部分，產(chǎn)生(至少)三種樣品，它們?nèi)慷急徊煌幚?，用SPME處理樣品2，用SPE處理樣品2(其中，用烷基化試劑處理化合物，以提供化合物的烷基化衍生物)，用SPE處理樣品3，并用硅烷化試劑加以處理，其中，獲得(機(jī)體)流體或萃取物中含有的化合物的硅烷化衍生物。通過(guò)將最初的(機(jī)體)流體或萃取物分為超過(guò)三部分，可應(yīng)用其它衍生物，導(dǎo)致產(chǎn)生化合物的不同衍生物。在一種特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)全多維氣相色譜，對(duì)通過(guò)上文所述的實(shí)施方式獲得的至少一種，優(yōu)選兩種，更優(yōu)選全部三種樣品加以分析，其中，順序使用至少兩種不同類(lèi)型的色譜柱，例如，第一非極性柱和第二更具極性的柱。優(yōu)選地，第一柱是若干米的大柱，例如，可長(zhǎng)至20至100米，其具有相對(duì)較大的直徑，例如，50-500iim，而第二柱則是較小的柱，例如，1至5米，優(yōu)選1至2米，其具有較小的直徑，例如50-150iim。因此，在第一柱中，例如主要通過(guò)化合物的沸點(diǎn)來(lái)分離化合物，而在第二柱中，根據(jù)其極性對(duì)離開(kāi)第一柱的化合物加以分離。根據(jù)本發(fā)明的這種特別優(yōu)選的實(shí)施方式，還將全氣相色譜與質(zhì)譜偶聯(lián)。因此，在第三個(gè)步驟中，可通過(guò)其質(zhì)量，對(duì)首先主要通過(guò)沸點(diǎn)分離再通過(guò)極性分離的化合物加以測(cè)定。一種優(yōu)選的質(zhì)譜類(lèi)型是飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOF-MS)，其是公知技術(shù)。但是，無(wú)須以單獨(dú)的色譜輪次來(lái)分析不同步驟制備的級(jí)分，可在一輪色譜實(shí)驗(yàn)中對(duì)它們一起加以分析。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，將所有樣品(一起)注射進(jìn)色譜系統(tǒng)。如果使用不同的注射，那么可平行(使用不止一個(gè)注射器)和/或順序進(jìn)行不同的注射?？墒褂貌煌?lèi)型的注射技術(shù)，優(yōu)選PTV注射技術(shù)(程序升溫汽化)，但是也可使用其它注射技術(shù)，如熱分流注射(hot-split)、不分流注射(splitless)、柱上注射(oncolumn)等?？舍槍?duì)注射的類(lèi)型對(duì)注射條件加以?xún)?yōu)化(SPME、襯管(liner)、溫度、體積，包括大體積注射，以及引入不同級(jí)分的順序等)。所有級(jí)分注射之后，開(kāi)始?xì)庀嗌V分析，當(dāng)使用2D-GCT0F-MS系統(tǒng)時(shí)，產(chǎn)生一種"多維"色譜。色譜和質(zhì)譜之后獲得的(多維)數(shù)據(jù)被收集并被評(píng)估。數(shù)據(jù)評(píng)估優(yōu)選通過(guò)數(shù)據(jù)評(píng)估軟件(可商業(yè)獲得)進(jìn)行。對(duì)最初的(機(jī)體)流體或組織/樣品萃取物中存在的化合物進(jìn)行分析之后，可對(duì)該/這些化合物加以測(cè)定，例如通過(guò)與從比較工藝已知的藥品或藥物或其代謝產(chǎn)物的數(shù)據(jù)加以比較。優(yōu)選地，并且為了協(xié)助這種比較的目的，分析人員可參考以數(shù)據(jù)庫(kù)形式存在的針對(duì)已知藥品或藥物的分析數(shù)據(jù)。優(yōu)選地，此類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)是計(jì)算機(jī)，其中存儲(chǔ)有參考數(shù)據(jù)，用其來(lái)協(xié)助對(duì)藥物或藥品或其代謝產(chǎn)物的存在或性質(zhì)的測(cè)定。但是，也可無(wú)需任何數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)進(jìn)行分析。MS提供了獨(dú)特的m/z模式，這包括了化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。通過(guò)本發(fā)明的方法，可測(cè)定WADA(藥品分析的世界組織)描述的S1至S9類(lèi)興奮劑的藥物和藥品，只是S2類(lèi)(肽)例外，使用基于氣相色譜的方法無(wú)法對(duì)S2類(lèi)(肽)加以檢測(cè)。因此，本發(fā)明提供了非常快速的獲取信息的可能性，例如，在官方比賽，如世錦賽或奧運(yùn)會(huì)期間，其中，反興奮劑委員會(huì)必須確定一名或多名參與者使用興奮劑材料/濫用藥物。使用的組分，特別是在多維氣相色譜的樣品制備中使用的組分，可被提供于含有至少若干用于制備樣品的組分的試劑盒中。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，此類(lèi)試劑盒包含能吸附有機(jī)化合物的至少一種固相(優(yōu)選以柱或纖維形式或攪拌棒的形式存在的有機(jī)固相)，不同于所述第一固相的至少第二固相，任選至少一種酶或含酶液體，任選至少一種烷基化和/或硅烷化和/或乙?；噭┗蚝兴鼈兊囊后w，任選任何有機(jī)溶劑以及任選用于樣品制備的容器。此類(lèi)試劑盒可用于制備樣品，之后可通過(guò)多維氣相色譜對(duì)樣品加以分析。還根據(jù)本發(fā)明，提供了可用于自動(dòng)進(jìn)行本發(fā)明方法的至少多個(gè)步驟的設(shè)備，優(yōu)選地，至少自動(dòng)進(jìn)行上述方法的樣品制備步驟(ii)、(iii)、(v)和(vii)。本發(fā)明還包括用于進(jìn)行具有本發(fā)明所述的全部步驟的整個(gè)方法的設(shè)備，例如，自動(dòng)設(shè)備，其中，僅(機(jī)體)流體樣品或萃取物被引入合適的容器或輸入設(shè)備，方法的所有步驟都在設(shè)備內(nèi)自動(dòng)進(jìn)行。附圖圖1顯示了通過(guò)根據(jù)實(shí)施例1的流程獲得的典型的GOGC/MS色譜。通過(guò)極性和沸點(diǎn)分離化合物，x和y軸代表色譜中的駐留時(shí)間(x軸為以秒表示的第一駐留時(shí)間，y軸是以秒表示的第二駐留時(shí)間)。圖2顯示了通過(guò)根據(jù)實(shí)施例2的流程獲得的典型的GOGC/MS色譜。通過(guò)極性和沸點(diǎn)分離化合物，x和y軸代表色譜中的駐留時(shí)間(x軸為以秒表示的第一駐留時(shí)間，y軸是以秒表示的第二駐留時(shí)間)。實(shí)施例提供下述實(shí)施例來(lái)闡述本發(fā)明，但并非將本發(fā)明限制為實(shí)施例的實(shí)施方式。實(shí)施例1樣品=具有來(lái)自Sl、S3-S9類(lèi)的化合物的"加標(biāo)的尿液(spikedurine)"="加標(biāo)的尿液"?？偣?7.5ml尿液。用25ml進(jìn)行酶處理，接著是SPE和衍生物，另外12.5ml用于SPME。加標(biāo)化合物(表1):<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>特布他林(terbutaline)S3-515.1THC-COOH(溶液中1000)(="canabis")S8-10.5曲安奈德(triamcinoloneacetonide)S9-111.9氨苯喋啶(triamterene)S5-516.7DHEA3-硫酸鈉鹽Sl-5711.0嗎啡-3-葡糖苷酸S7-511.4酶處理樣品1—12.5ml加標(biāo)尿液+850y12MNaCl+1.65ml乙酸鈉(1MpH5)+1.65ml溶液中的葡糖苷酸酶(947個(gè)單位/ml)。樣品2—12.5ml加標(biāo)尿液+850u12MNaCl+1.65ml乙酸鈉(1MpH5)+1.65ml溶液中的硫酸酯酶(140個(gè)單位/ml)。在55。C處理。SPE和衍生化18小時(shí)后，混合樣品1和樣品2(合并的樣品)，接著進(jìn)行SPE(SPEWaters(C18)SEP-PakWAT020515)。通過(guò)用5mlMe0H和5ml水(Milli-Q)洗脫來(lái)調(diào)理SPE材料。將樣品(25ml)放到SPE材料上，接著加入1.5ml水。將SPE材料放進(jìn)真空(20秒)以除去水。用4.5mlMeOH洗脫結(jié)合的化合物，其中棄去最初0.5ml的部分，收集4.Oml。含有洗脫的化合物的4mlMeOH收集物被分開(kāi)(級(jí)分1和級(jí)分2)。將級(jí)分1蒸發(fā)至干燥，加入1mlMSTFA和lml吡啶。將級(jí)分2蒸發(fā)至干燥，加入2ml丙酮中10%的甲基碘(Mel)+K2C03±50-100mg。級(jí)分2(具有Mel、丙酮和K2C03)于8(TC儲(chǔ)存過(guò)夜。SPME:與樣品接觸之前，在220。C對(duì)SPME材料(Carbowax)進(jìn)行半小時(shí)調(diào)理。用12.5ml具有10%(w/w)NaCl的加標(biāo)尿液來(lái)進(jìn)行1小時(shí)的SPME萃取。GC*GC-TOF-MS分析在250。C注射SPME纖維、1u1Mel溶液(級(jí)分2)禾P1u1MSTFA-溶液(級(jí)分1)。注射之后，開(kāi)始GOGC分析。使用的條件為柱1=30m(L)*0.25mm(ID)*0.25um(df)VF-1MS，柱2=1.0m(L)*0.10mm(ID)*0.10ym(df)VF-23MS。He氣，恒定為lml/分鐘。烘箱40。C(1分鐘)-l(TC/分鐘-280°C(15分鐘);烘箱2:40。C(1分鐘)-l(TC/分鐘_260°C(16分鐘)；調(diào)制器補(bǔ)償+30°C(熱風(fēng)溫度)；第二維時(shí)間4秒；熱脈沖時(shí)間0.4秒；MS掃描率150Hz;掃描:20-550。圖1顯示了典型的GC*GC-MS色譜(加標(biāo)化合物示為圓圈)。實(shí)施例2樣品=具有來(lái)自Sl、S3-S9類(lèi)的化合物的"加標(biāo)的(spiked)尿液"="加標(biāo)的尿液"。總共30ml尿液。用25ml進(jìn)行酶處理，接著是SPE和衍生物，另外5ml用于SPME。加標(biāo)化合物為10(mg/kg)卯m的水平(表2):編號(hào)名稱(chēng)類(lèi)別1氨魯米特S42氯噻酮S53呋噻米(furosemide)S54氫氯噻嗪S55康力龍Sl6氨苯喋啶S57沙丁胺醇S38克羅米芬S49去氫表雄酮(DHEA)Sl10特布他林S311芬氟拉明S612來(lái)曲唑(letrozole)S413麻黃堿S614苯丁胺S615士的寧S616布地奈德S917曲安奈德S918麻黃素S619表睪酮(epitestosteron)Sl酶處理樣品3—12.5ml加標(biāo)尿液+850y12MNaCl+3.3ml溶液中的葡糖苷酸酶(947個(gè)單位/ml，lM乙酸鈉(pH5))。樣品4—12.5ml加標(biāo)尿液+850y12MNaCl+3.3ml溶液中的硫酸酯酶(140個(gè)單位/ml，lM乙酸鈉(pH5))。11SPE和衍生化18小時(shí)后，混合樣品3和樣品4(合并的樣品)，接著進(jìn)行固相萃取(SPE，Waters(C18)SEP-PakWAT020515)。通過(guò)用5ml甲醇(MeOH)和5ml水(超純水，Milli-Q)洗脫來(lái)調(diào)理SPE材料。將樣品(總體積大約33ml)放到SPE材料上，接著用1.5ml水洗脫。使用真空(20秒)，以除去SPE材料的水。用4.5mlMeOH洗脫結(jié)合的化合物，其中棄去最初0.5ml的部分，收集4.Oml。收集的4ml液體含有洗脫的化合物，將其分開(kāi)(級(jí)分1和級(jí)分2)。將級(jí)分l蒸發(fā)至干燥，加入0.5mlN-甲基-N-(三甲基甲硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA)和0.5ml吡啶。甲硅烷化反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1小時(shí)。將級(jí)分2蒸發(fā)至干燥，加入lml丙酮中10%的甲基碘(Mel)和大約50-100mgK2C03。級(jí)分2(含有Mel、丙酮和K2C03)于80。C儲(chǔ)存過(guò)夜，以進(jìn)行甲基化反應(yīng)。SPME:與樣品接觸之前，在220。C對(duì)SPME材料(Carbowax，膜厚65iim，Supleco)進(jìn)行半小時(shí)調(diào)理。向5ml加標(biāo)尿液中加入0.5gNaCl(10%，w/w)，進(jìn)行1小時(shí)的SPME萃取。GOGC-TOF-MS分析使用優(yōu)化的順序注射流程(無(wú)分流模式)，在25(TC注射SPME纖維、1iUMel溶液(級(jí)分2)和1illMSTFA-溶液(級(jí)分1)。注射SPME和不同級(jí)分之后，開(kāi)始GC*GC分析。使用的GOGC-TOF-MS條件為柱1=30m(長(zhǎng)度)*0.25mm(內(nèi)徑)*0.25ym(膜厚)VF-lMS(Varian)，柱2=1.0m(長(zhǎng)度)柳.10mm(內(nèi)徑)*0.10iim(膜厚)VF-17MS(Varian)。He氣，lml/分鐘的恒定流速。第一烘箱(第一維分離)4(TC(等溫1分鐘)-l(TC/分鐘-28(TC(15分鐘等溫)；第二烘箱(第二維分離)4(TC(1分鐘等溫)-l(TC/分鐘-26(TC(15分鐘等溫)；調(diào)制器補(bǔ)償+3(TC(熱風(fēng)溫度)；第二維時(shí)間4秒；熱脈沖時(shí)間0.4秒;MS掃描率150Hz;掃描范圍MS:20-550。圖2顯示了典型的GOGC-MS色譜(加標(biāo)化合物示為圓圈)。權(quán)利要求用于在(機(jī)體)流體或(機(jī)體)樣品或(機(jī)體)組織的萃取物中測(cè)定藥品或藥物或其代謝產(chǎn)物的方法，所述方法包括下述步驟(i)任選地，用至少一種酶處理所述流體或萃取物，(ii)將所述流體或萃取物的至少第一部分與能從所述流體或萃取物中吸附或吸收出有機(jī)化合物的至少一種第一固相接觸，(iii)將所述流體或萃取物的至少第二部分與能從所述流體或萃取物中萃取或吸附出有機(jī)化合物的至少一種第二相接觸，(iv)任選地，將所述流體或萃取物的至少第三部分與能從所述流體或萃取物中萃取出有機(jī)化合物的液相接觸，(v)通過(guò)對(duì)第一固相應(yīng)用熱處理和/或通過(guò)溶劑萃取，解吸附與所述第一固相結(jié)合的化合物，任選地，接著至少部分蒸發(fā)所述溶劑，(vi)通過(guò)應(yīng)用熱處理和/或通過(guò)溶劑萃取，萃取或解吸附所述第二相中的或與所述第二相結(jié)合的化合物，任選地，接著至少部分蒸發(fā)所述溶劑，(vii)通過(guò)多維氣相色譜(GC)，優(yōu)選通過(guò)優(yōu)選與質(zhì)譜偶連的全多維GC(GC*GC)，來(lái)分析步驟(v)和(vi)解吸附的化合物以及任選的步驟(iv)中萃取的化合物。2.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中步驟(ii)中的所述第一固相是有機(jī)材料。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中步驟(ii)中的所述第一固相選自聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚丙烯酸酯、聚乙二醇-二乙烯基苯(Carbowax/DVB)、PDMS-DVB、Carboxen/PDMS、二乙烯基苯-Carboxene-聚二甲基硅氧烷(DVB/Carboxen/PDMS)、聚(甲基氫硅氧烷)(PMHS)4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的方法，其中所述第一固相是纖維形式或攪拌棒。5.根據(jù)權(quán)利要求l至4中任意一項(xiàng)的方法，其中步驟(iii)的所述第二相是固相，優(yōu)選是含有氧化硅的材料或經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾的聚合材料，或是液相。6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中步驟(iii)的所述第二相的材料選自基于氧化硅的固定相、或氧化鋯、PS-DVB共聚物或聚丙烯酸酯，或者所述液相是不與所述樣品溶液或樣品流體混溶的溶劑。7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任意一項(xiàng)的方法，其還包括對(duì)所述有機(jī)化合物進(jìn)行衍生化的步驟。8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述衍生化通過(guò)用烷基化和/或硅烷化和/或乙酰化試劑處理來(lái)獲得。9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項(xiàng)的方法，其中所述機(jī)體流體是哺乳動(dòng)物的血液或尿液。10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任意一項(xiàng)的方法，其中任選步驟(i)中所述的酶選自葡糖苷酸酶、乙二醇酯酶和/或脫硫酸酯酶。11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任意一項(xiàng)的方法，其中步驟(i)至(vii)中的至少若干步自動(dòng)進(jìn)行。12.用于至少自動(dòng)進(jìn)行權(quán)利要求1至10中任意一項(xiàng)所述方法的步驟(ii)、(iii)、(v)和(vii)的設(shè)備。13.用于進(jìn)行權(quán)利要求1至10中任意一項(xiàng)所述方法的樣品制備步驟(i)至(vi)的試劑盒或設(shè)備，其包含能吸附有機(jī)化合物的至少第一固相，不同于所述第一固相的至少第二固相，任選地，至少一種酶或含有酶的溶液，所述酶選自葡糖苷酸酶、乙二醇酯酶和/或脫硫酸酯酶任選地，任何有機(jī)溶劑任選地，至少一種烷基化、硅烷化和/或乙酰化試劑，或含有它們的溶液，任選地，用于樣品制備的容器。全文摘要本發(fā)明提供了在(機(jī)體)流體或(機(jī)體)樣品或(機(jī)體)組織的萃取物中測(cè)定藥品或藥物或其代謝產(chǎn)物的方法，所述方法包括下述步驟(i)任選地，用至少一種酶處理所述流體或樣品萃取物，(ii)將所述流體或萃取物的至少第一部分與能從該流體或萃取物吸附或吸收出有機(jī)化合物的至少第一固相接觸，和/或(iii)將所述流體或萃取物的至少第二部分與能從該流體或萃取物萃取或吸附出有機(jī)化合物的至少第二相接觸，和/或(iv)任選地，將所述流體或萃取物的至少第三部分與能從該流體或萃取物萃取出有機(jī)化合物的液相接觸，和/或(v)通過(guò)對(duì)第一固相應(yīng)用熱處理和/或通過(guò)溶劑萃取，解吸附與第一固相結(jié)合的化合物，任選地，接著至少部分蒸發(fā)溶劑，(vi)任選地，通過(guò)應(yīng)用熱處理和/或通過(guò)溶劑萃取，萃取或解吸附第二相中的或與第二相結(jié)合的化合物，任選地，接著至少部分蒸發(fā)溶劑，以及(vii)通過(guò)多維氣相色譜(GC)，優(yōu)選通過(guò)優(yōu)選與質(zhì)譜偶連的全多維GC(GC*GC)，來(lái)分析步驟(v)和(vi)解吸附的化合物以及任選的步驟(iv)中萃取的化合物。文檔編號(hào)G01N33/50GK101743471SQ200880024638公開(kāi)日2010年6月16日申請(qǐng)日期2008年7月11日優(yōu)先權(quán)日2007年7月13日發(fā)明者伯特·基普,尼科爾·萊姆卡斯,恩澤·門(mén)格因克,杜威·德布爾,約翰·默梅爾斯,羅蘭·彼得斯申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司