專利名稱：：一種檢測伏馬菌毒素b1的時間分辨熒光免疫分析試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：—種檢測伏馬菌毒素Bl(FBI)的時間分辨熒光免疫分析試劑盒及其檢測方法，屬于時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)
技術(shù)領(lǐng)域：
，用于對糧食，飼料以及食品中FBl含量的檢
背景技術(shù)：
：伏馬菌素(Fumonisins)是國際上于1988年首次報道的主要由串珠鐮刀菌產(chǎn)生的一組新的真菌毒素，主要污染谷物，并在生長基質(zhì)中繁殖代謝，產(chǎn)生多種真菌毒素。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)有II種結(jié)構(gòu)類似物，其中伏馬毒素BJFB》是伏馬菌毒素的主要組分，約占毒素總量的70%，是導(dǎo)致伏馬菌素毒性作用的主要原因。霉變玉米中總伏馬菌毒素含量可高達52.670mg/kg。此外，大米、小麥、啤酒、牛奶等食品和飼料中也存在污染情況。伏馬毒素可導(dǎo)致馬腦白質(zhì)軟化癥，豬肺水腫綜合癥，對其他多種動物也會造成毒性作用及誘發(fā)腫瘤；流行病學(xué)資料顯示，人類膳食中FB工污染與食管癌高發(fā)有一定的關(guān)聯(lián)。國際癌癥研究中心已把FB劃分到2B組，即人類可能致癌物。因此為了保障人們的健康，開展食品中FB工的衛(wèi)生檢測研究是很有必要的。人類接觸伏馬毒素是相當(dāng)普遍的，但是在不同的玉米種植區(qū)有不同的接觸程度。例如，盡管在美國、加拿大和西歐伏馬毒素在玉米中同樣發(fā)生，但在這些國家人們的消耗是適度的。在非洲的部分地區(qū)，中南美洲和亞洲，一些人消耗大量的玉米面作為能量來源，而這些地區(qū)的玉米污染伏馬毒素是最高的。到目前為止，伏馬毒素還沒有一個廣泛的限量標(biāo)準(zhǔn)。2001年，美國食品與藥物管理局(FDA)發(fā)布了食品(2mg/kg)、動物飼料(150mg/kg)的FB1最高限量的指導(dǎo)性公告。歐盟相關(guān)的限量標(biāo)準(zhǔn)正在制定中。所以有必要積極開展高靈敏FBI的檢測手段的研究，以保障我國人民的食品安全。目前伏馬菌毒素Bl的測定方法有多種，如薄層色譜法TLC(靈敏度為500ng/g)，高效液相色譜法HPLC(靈敏度為80ng/g)，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(靈敏度100ng/g)，但由于費時、靈敏度低、儀器設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜且不適用于大批量樣品檢測等缺點，限制了其的推廣應(yīng)用。酶聯(lián)免疫測定法ELISA(靈敏度為5ng/g)，由于特異性強靈敏度高、操作簡便、不需直接接觸毒素，且特別適于大批量樣品的檢測等優(yōu)點而越來越被人們所重視和采用，但檢測的靈敏度和試劑的穩(wěn)定性還難以達到要求。時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)是上世紀(jì)八十年代初發(fā)展起來的新的免疫測定技術(shù)。TRFIA原理是利用具有雙功能基團結(jié)構(gòu)的螯合劑，其一端和鑭系元素結(jié)合，另一端和抗體分子上的自由氨基聯(lián)接，制成Eu3+標(biāo)記抗體，它與待測樣品中的抗原結(jié)合成免疫復(fù)合物。理想情況下，測定復(fù)合物中鑭系元素的熒光強度就能確定樣品中抗原的量，但實際上這種復(fù)合物的熒光強度相當(dāng)弱，只有再加入一種增強溶液(Enhancementsolution)，使鑭系元素從復(fù)合物中解離下來，并與增強液中所含的e-萘甲酰三氟丙酮(e-NTA)重新形成微膠囊，在紫外等光的激發(fā)下發(fā)射很強的熒光，增強效果上百萬倍。用時間分辨熒光儀測定其熒光強度cps，即可確定樣品中抗原的量。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種檢測FBI的時間分辨熒光免疫分析試劑盒及其檢測方法，用于對糧食，飼料以及食品中FBI含量的檢測。本發(fā)明的技術(shù)方案一種檢測伏馬菌毒素Bl，簡稱FB1，的時間分辨熒光免疫分析試劑盒，該試劑盒是由1、包被有FB1-BSA的96或48孔包被板，2、緩沖液，3、FBI標(biāo)準(zhǔn)，4、FB1單克隆抗體凍干品，5、銪標(biāo)記的羊抗鼠抗體，6、洗滌液，7、增強液所組成。緩沖液(2):含8mmol/LNaC1、0.1%BSA、0.2%牛IgG、50iimol/L二乙烯三胺五乙酸、0.lmL/LTween-80禾P0.1%NaN3的pH7.8、50mmol/LTris—HCl溶液；6XFB1標(biāo)準(zhǔn)液(3):1.OmL/瓶，標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0，1.0，10，100，500，1000ng/mL。洗滌液(6):含14.5mmol/LNaC1、0.2mL/LTween-80和0.2%NaN3的pH7.8、50mmol/LTris-HCl溶液。增強液(7):每升pH3.2鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液含15iimoll3-萘甲酰三氟丙酮，50iimol三正辛基氧化膦和lmL曲拉通X-IOO。本發(fā)明主要采用時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)來檢測FB1。采用TRFIA的技術(shù)有FBl-BSA活性包被板的制備、Eu3+標(biāo)記抗體的制備、FBl標(biāo)準(zhǔn)品的制備、增強液的制備。FB1-BSA活性包被板(1)的制備包被板包被固相抗原用pH9.6、50mmo1/LNa2C03_NaHC03緩沖液將OTA-BSA稀釋至10mg/L做為包被液，96或48孔微孔板各孔加100iiL，4t:放置過夜，棄去包被液，沖洗三次，加150iiL含3g/LBSA的上述緩沖液封閉，4t:放置過夜，棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-2(TC冷凍保存。銪標(biāo)記的羊抗鼠抗體(5)的制備取溶解于pH7.0、50mmol/LPBS的5g/L羊抗鼠抗體l-2mL，經(jīng)PD-10柱轉(zhuǎn)換緩沖條件，洗脫液為pH8.5-9.0、含0.155mol麵Cl的50mmol/LNa2C03-NaHC03緩沖液，收集蛋白峰，經(jīng)紫外吸收分析定量，用上述洗脫液稀釋羊抗鼠抗體至2g/L，取500-1000yL稀釋后的羊抗鼠抗體加入含O.2_0.4mg的Eu"-N2-[p-異氰酸_芐基]_二乙烯三胺四乙酸的小瓶中，28-30°C磁力攪拌反應(yīng)16h，反應(yīng)液經(jīng)用pH7.8、80mmol/LTris-HCl緩沖液平衡的1X40cm的S印hadex-G50柱層析，收集蛋白峰，稀釋、分裝備用。測定方法測定的基礎(chǔ)是標(biāo)記免疫反應(yīng)。包被有FB1-BSA的微孔板，加入FBI標(biāo)準(zhǔn)或已處理好的樣品到各自的微孔中、再加入FB1單克隆抗體，振蕩反應(yīng)，游離的FB1與微孔板上的FB1-BSA競爭FB1單克隆抗體，洗滌液洗滌，沒有連接的FB1單克隆抗體在洗滌步驟中被除去。加入Eu3+-羊抗鼠抗體，進行標(biāo)記免疫反應(yīng)，再用洗滌液洗滌，反應(yīng)后沒有連接的￡113+-羊抗鼠抗體在洗滌步驟中被除去。加增強液振蕩后，在紫外光的激發(fā)下發(fā)射很強的熒光，用時間分辨熒光儀測定其熒光強度cps，熒光強度與樣品中的FBI濃度成反比，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定樣品中FBI的量。本發(fā)明的有益效果該試劑盒結(jié)構(gòu)簡單，使用方便、廉價、靈敏度高，可以達到0.05ng/mL以上。圖1:檢測伏馬菌毒素B1的時間分辨熒光免疫分析試劑盒示意圖。1、包被有FB1-BSA的96或48孔包被板，2、緩沖液，3、FBI標(biāo)準(zhǔn)，4、FBI單克隆抗體凍干品，5、銪標(biāo)記的羊抗鼠抗體，6、洗滌液，7、增強液。圖2:FB1-TRFIA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實施例方式實施例l制備試劑盒和檢測玉米樣品試劑盒提供的試劑足夠進行96個測量，盒中的材料如下(1).1X96孔板(8條X12孔，可以拆分為單孔)包被有FB1-BSA。(2).6XFB1標(biāo)準(zhǔn)液，1.0mL/瓶，標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0，1.0，10，100，500，1000ng/mL。(3).IXFBI單克隆抗體凍干品，用時0.5mL蒸餾水溶解。(4).1XEu3+_羊抗鼠抗體凍干品，用時0.5mL蒸餾水溶解。(5).IX增強液15mL。(6).IX洗滌液30mL，用時以蒸餾水1:25稀釋。(7).IX緩沖液30mL。實驗室應(yīng)自備的試劑甲醇。70%甲醇溶液30mL蒸餾水或去離子水和70mL純甲醇混合制備70%甲醇溶液。蒸餾水或去離子水。測定之前注意事項1.使用之前將所有試劑回升至室溫(18-30°C)。2.使用之后立即將所有試劑放回2-8t:。3.如果樣品量大建議使用多通道移液器。4.在所有恒溫孵育過程中避免光線照射，用蓋子蓋住微孔。5.取出需用數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放進原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于2-8°C。具體檢測步驟如下先將樣品進行處理將玉米樣品粉碎至20目，取5克粉碎后玉米樣品放在試管中，加入提取液25mL(甲醇水=7:3)。加塞振蕩3分鐘，過濾，濾紙采用新華1號紙。取lmL濾液用9mL蒸餾水或去離子水進行稀釋，備用。取FB1-BSA板條，加入50yL的FBI標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中，加緩沖液l:20稀釋的FBl單克隆抗體50iiL，25t:振蕩1小時，洗滌液洗3次，加緩沖液1:20稀釋的Eu3+-羊抗鼠抗體100i！L，25t:振蕩1小時，用洗滌液洗6次，加200yL增強液振蕩5分鐘后測量。從標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的FBI含量，見表l，該例的樣品濃度為51.7ng/m"2585ng/g)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例2試劑盒提供的試劑足夠進行48個測量，其中盒中的包被板為1X48孔板(4條X12孔，可以拆分為單孔)包被有FB1-BSA。試劑盒提供的其余試劑與實施例l相同，用于檢測小麥樣品。具體檢測步驟如下先將小麥樣品進行處理將小麥樣品粉碎至20目，取5克粉碎的小麥樣品放在試管中，加入提取液25mL(甲醇水二7:3)。加塞振蕩3分鐘，過濾，濾紙采用新華1號紙。取lmL濾液用9mL蒸餾水或去離子水進行稀釋，備用。取FB1-BSA板條，加入50yL的FBI標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中，加緩沖液l:20稀釋的FBl單克隆抗體50iiL，25t:振蕩1小時，洗滌液洗3次，加緩沖液1:20稀釋的Eu3+-羊抗兔抗體100i！L，25t:振蕩1小時，用洗滌液洗6次，加200yL增強液振蕩5分鐘后測量。從標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的FBI含量，見表2，該例的樣品濃度為6.2ng/mL(310ng/g)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求一種檢測伏馬菌毒素B1，簡稱FB1，的時間分辨熒光免疫分析試劑盒，其特征是試劑盒由以下幾個部分包被有FB1-BSA的96或48孔包被板(1)，緩沖液(2)，伏馬菌毒素B1標(biāo)準(zhǔn)(3)，伏馬菌毒素B1單克隆抗體凍干品(4)，銪標(biāo)記的羊抗鼠抗體(5)，洗滌液(6)和增強液(7)所組成；FB1-BSA活性包被板(1)的制備包被板(1)包被固相抗原用pH9.6、50mmol/LNa2CO3-NaHCO3緩沖液將OTA-BSA稀釋至10mg/L做為包被液，96或48孔微孔板各孔加100μL，4℃放置過夜，棄去包被液，沖洗三次，加150μL含3g/LBSA的上述緩沖液封閉，4℃放置過夜，棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-20℃冷凍保存；緩沖液(2)含8mmol/LNaCl、0.1％BSA、0.2％牛IgG、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1mL/LTween-80和0.1％NaN3的pH7.8、50mmol/LTris-HCl溶液；6×FB1標(biāo)準(zhǔn)液(3)1.0mL/瓶，標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0，1.0，10，100，500，1000ng/mL；銪標(biāo)記的羊抗鼠抗體(5)的制備取溶解于pH7.0、50mmol/LPBS的5g/L羊抗鼠抗體1-2mL，經(jīng)PD-10柱轉(zhuǎn)換緩沖條件，洗脫液為pH8.5-9.0、含0.155mol/LNaCl的50mmol/LNa2CO3-NaHCO3緩沖液，收集蛋白峰，經(jīng)紫外吸收分析定量，用上述洗脫液稀釋羊抗鼠抗體至2g/L，取500-1000μL稀釋后的羊抗鼠抗體加入含0.2-0.4mg的Eu3+-N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸的小瓶中，28-30℃磁力攪拌反應(yīng)16h，反應(yīng)液經(jīng)用pH7.8、80mmol/LTris-HCl緩沖液平衡的1×40cm的Sephadex-G50柱層析，收集蛋白峰，稀釋、分裝備用；洗滌液(6)含14.5mmol/LNaCl、0.2mL/LTween-80和0.2％NaN3的pH7.8、50mmol/LTris-HCl溶液；增強液(7)每升pH3.2鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液含15μmolβ-萘甲酰三氟丙酮，50μmol三正辛基氧化膦和1mL曲拉通X-100。2.—種用權(quán)利要求1所述的試劑盒檢測伏馬菌毒素B1的方法，其特征在于在包被有FB1-BSA的微孔包被板上，加入伏馬菌毒素B1標(biāo)準(zhǔn)或處理好的待測樣品到各自的微孔中，再加入伏馬菌毒素B1單克隆抗體，振蕩反應(yīng)，洗滌液洗滌，加銪標(biāo)記的羊抗鼠抗體，進行標(biāo)記免疫反應(yīng)，洗滌液洗滌，加增強液振蕩后測量熒光強度cps，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的伏馬菌毒素B1含量。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測伏馬菌毒素Bl的方法，其特征在于(1)谷物樣品處理將谷物樣品粉碎至20目，取5克粉碎后的谷物樣品放在試管中，加入提取液25mL，提取液為甲醇水體積比7:3的溶液，加塞振蕩3min，過濾，濾紙采用新華1號紙，取lmL濾液用9mL蒸餾水或去離子水進行稀釋，備用；(2)檢測操作取包被有FB1-BSA的微孔包被板，加入50iiL的伏馬菌毒素Bl標(biāo)準(zhǔn)或處理好的待測樣品到各自的微孔中，伏馬菌毒素B1單克隆抗體以緩沖液(2)作稀釋劑進行1:20稀釋，微孔中再加入50iiL稀釋后的伏馬菌毒素Bl單克隆抗體溶液，25t:振蕩lh，洗滌液洗3次，加以緩沖液(2)進行l(wèi):20稀釋的Eu"-羊抗鼠抗體100i!L，25t:振蕩lh，用洗滌液洗6次，加200iiL增強液振蕩5分鐘后測量熒光強度cps，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品中的伏馬菌毒素B1含量。全文摘要一種檢測伏馬菌毒素B1(FB1)的時間分辨熒光免疫分析試劑盒及其檢測方法，屬于時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)
技術(shù)領(lǐng)域：
，用于對糧食，飼料以及食品中FB1含量的檢測。本發(fā)明配制的試劑盒，采用TRFIA檢測FB1。微孔板包被有FB1-BSA，加FB1標(biāo)準(zhǔn)或樣品，再加FB1單克隆抗體。游離的FB1與微孔板上的FB1-BSA競爭FB1單克隆抗體，沒有連接的FB1單克隆抗體洗滌除去，加Eu3+-羊抗鼠抗體，標(biāo)記免疫反應(yīng)后沒有連接的Eu3+-羊抗鼠抗體被洗滌除去。加增強液后，用時間分辨熒光儀測定其熒光強度cps，熒光強度與樣品中的FB1濃度成反比，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定被測樣品中FB1的含量。本發(fā)明提供的試劑盒結(jié)構(gòu)簡單，使用方便、廉價、靈敏度高，可以達到0.05ng/mL以上。文檔編號G01N33/577GK101699293SQ20091021281公開日2010年4月28日申請日期2009年10月28日優(yōu)先權(quán)日2009年10月28日發(fā)明者周彬,張玨,王柯,金堅,陳蘊,黃飚申請人:江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所