專利名稱：檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微 球及其制備方法。
背景技術(shù)：
蛋白酶抑制劑廣泛存在于植物體內(nèi)，尤其在植物的貯藏器官內(nèi)含量相當(dāng)高。在植 物體內(nèi)蛋白酶抑制劑的生物學(xué)功能主要有兩個(gè)方面①通過與內(nèi)源蛋白酶相互作用，調(diào)控 組織細(xì)胞內(nèi)的有關(guān)生理生化過程；②防止細(xì)胞、組織內(nèi)的蛋白質(zhì)成分被外源蛋白酶所降解。 其更重要的作用在于作為一種抵御外界植食性昆蟲和微生物攻擊的化學(xué)防衛(wèi)因子。研究證 實(shí)，大多數(shù)植物來源的蛋白酶抑制劑對(duì)植物內(nèi)源性蛋白酶沒有抑制作用，但對(duì)外源蛋白酶 有特異的抑制活性，這就為通過基因工程提高農(nóng)作物防衛(wèi)系統(tǒng)的效能提供了自然進(jìn)化上的 ■石出。豇豆胰蛋白酶抑制劑(cowpea trypsin inhibitor，CpTI)屬絲氨酸蛋白酶抑制 劑。與Bt毒蛋白相比，其殺蟲機(jī)理完全不同且具有殺蟲廣譜，對(duì)人畜安全，昆蟲不易產(chǎn)生抗 性的優(yōu)點(diǎn)而受到人們的重視。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將CpTI基因?qū)胱魑锒@得的轉(zhuǎn)基因植株 已在我國(guó)部分地區(qū)得到了大規(guī)模的應(yīng)用，但迄今對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物中豇豆胰蛋白酶抑制劑的 檢測(cè)方法不多，且檢測(cè)靈敏度、檢測(cè)限和抗干擾能力等亟待提高。目前，有關(guān)CpTI抑制劑免 疫檢測(cè)技術(shù)的研究報(bào)告和相關(guān)專利技術(shù)國(guó)內(nèi)外報(bào)道很少，迫切需要開發(fā)高效、準(zhǔn)確、快速的 新型免疫檢測(cè)技術(shù)和產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球及其制備方 法，進(jìn)一步填補(bǔ)CpTI抑制劑免疫檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)空白；取材簡(jiǎn)單、操作方便；制備方法細(xì) 致嚴(yán)謹(jǐn)，重復(fù)性高；所制備的免疫膠乳微球顆粒小，粒徑均勻，能檢測(cè)CpTI融合蛋白最低限 0.2yg/ml，其相關(guān)系數(shù) R2=O. 67。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)
一種檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球，免疫微球由抗CpTI蛋白多克隆抗體 包被，微球顆粒大小為200nm，最低檢測(cè)限為CpTI融合蛋白0. 2 μ g/ml，相關(guān)系數(shù)R2=O. 67?！N檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的制備方法，包括以下步驟
1)設(shè)計(jì)全長(zhǎng)CpTI基因序列，根據(jù)原核細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)先密碼子重新修飾并采用全基因 合成技術(shù)構(gòu)建全長(zhǎng)CpTI基因表達(dá)序列；
2)將步驟1)得到的CpTI基因片段通過限制酶切割插入谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基 因融合表達(dá)載體中，構(gòu)建細(xì)菌融合表達(dá)載體；
3)通過步驟2)對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行細(xì)菌表達(dá)后，利用親合層析柱純化獲得GST-CpTI融合蛋白；
4)將經(jīng)過步驟3)得到的GST-CpTI融合蛋白抗原溶合弗氏佐劑后免疫小鼠，經(jīng)分離純 化得到鼠抗CpTI多克隆抗體；
5)將經(jīng)過步驟4)得到的鼠抗CpTI多克隆抗體通過羧基-氨基化學(xué)偶聯(lián)法偶聯(lián)活化微 球，得到檢測(cè)CpTI蛋白的免疫膠乳微球。在上述所述的檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的制備方法中，在步驟2) 中的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因融合表達(dá)載體是pGEX-4T-2，構(gòu)建完成后的融合表達(dá)載 體是 pGEX-4T-2-CpTI。在上述所述的檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的制備方法中，在步驟3) 中的親合層析柱為谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathione Sepharose) 4B。在上述所述的檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的制備方法中，在步驟5) 中采用單分散羧基化聚苯乙烯微球?yàn)榛|(zhì)材料，羧基化聚苯乙烯微球大小200nm，表面載基 團(tuán)為羧基，羧基化聚苯乙烯的分子式如下
該微球的活化是首先用活化劑EDC (碳化二亞胺)活化微球，然后加入保護(hù)劑N-羥 基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)使微球形成穩(wěn)定的活潑酯中間體，以備連接抗體分子之用。本發(fā)明的有益效果為采用單分散羧基化聚苯乙烯微球?yàn)榛|(zhì)材料，用化學(xué)偶聯(lián) 方法偶聯(lián)抗CpTI多克隆抗體獲得，取材簡(jiǎn)單、操作方便；制備方法細(xì)致嚴(yán)謹(jǐn)，重復(fù)性高；所 制備的免疫膠乳微球顆粒小，粒徑均勻，能檢測(cè)CpTI融合蛋白最低限0. 2 μ g/ml，其相關(guān) 系數(shù) R2=O. 67。


下面根據(jù)附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1是本發(fā)明實(shí)施例所述的羧基化聚苯乙烯微球的掃描電鏡圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例所述的檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的制備方法中 CpTI基因的原序列全長(zhǎng)圖譜；
圖3是本發(fā)明實(shí)施例所述的檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的制備方法中 經(jīng)優(yōu)化后的CpTI基因序列圖譜；
圖4是本發(fā)明實(shí)施例所述的檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的制備方法中 菌落PCR驗(yàn)證CpTI基因插入片段電泳圖譜；
圖5是本發(fā)明實(shí)施例所述的檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的制備方法中 質(zhì)粒)(ba I酶切電泳圖譜；
圖6是本發(fā)明實(shí)施例所述的檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的制備方法中 CpTI表達(dá)載體的測(cè)序圖譜；
圖7是本發(fā)明實(shí)施例所述的檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的制備方法中 GST-CpTI融合蛋白SDS-PAGE的檢測(cè)圖譜；
圖8是本發(fā)明實(shí)施例所述的檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的制備方法中 GST-CpTI融合蛋白Wfestern Blotting的檢測(cè)圖譜；
圖9是本發(fā)明實(shí)施例所述的檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的制備方法中 抗血清效價(jià)測(cè)定圖10是本發(fā)明實(shí)施例所述的檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的制備方法中 采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法檢測(cè)CpTI融合蛋白結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施例所述的檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球，免疫微球由抗 CpTI蛋白多克隆抗體包被，微球顆粒大小為200nm (圖1)，最低檢測(cè)限為CpTI融合蛋白 0. 2μ g/ml，相關(guān)系數(shù) R2=O. 67。本發(fā)明實(shí)施例所述的檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的制備方法，包括 以下步驟
1)設(shè)計(jì)全長(zhǎng)CpTI基因序列，根據(jù)原核細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)先密碼子重新修飾并采用全基因 合成技術(shù)構(gòu)建全長(zhǎng)CpTI基因表達(dá)序列；
2)將步驟1)得到的CpTI基因片段通過限制酶切割插入谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基 因融合表達(dá)載體中，構(gòu)建細(xì)菌融合表達(dá)載體；
3)通過步驟2)對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行細(xì)菌表達(dá)后，利用親合層析柱純化獲得GST-CpTI融合 蛋白；
4)將經(jīng)過步驟3)得到的GST-CpTI融合蛋白抗原溶合弗氏佐劑后免疫小鼠，經(jīng)分離純 化得到鼠抗CpTI多克隆抗體；
5)將經(jīng)過步驟4)得到的鼠抗CpTI多克隆抗體通過羧基-氨基化學(xué)偶聯(lián)法偶聯(lián)活化微 球，得到檢測(cè)CpTI蛋白的免疫膠乳微球。在上述所述的檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的制備方法中，在步驟2) 中的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因融合表達(dá)載體是pGEX-4T-2，構(gòu)建完成后的融合表達(dá)載 體是 pGEX-4T-2-CpTI。在上述所述的檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的制備方法中，在步驟3)中的親合層析柱為谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathione Sepharose ) 4B。在上述所述的檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的制備方法中，在步驟 5)中的微球是單分散羧基化聚苯乙烯微球，大小200nm，表面載基團(tuán)為羧基；該微球的活 化是首先用活化劑EDC (碳化二亞胺)活化微球，然后加入保護(hù)劑N-羥基硫代琥珀酰亞胺 (Sulfo-NHS)使微球形成穩(wěn)定的活潑酯中間體，以備連接抗體分子之用。實(shí)例
本發(fā)明在具體實(shí)施時(shí)，包括以下步驟 1)構(gòu)建全長(zhǎng)CpTI基因表達(dá)序列
(a)設(shè)計(jì)全長(zhǎng)CpTI基因序列，結(jié)果如圖2所示；
(b)根據(jù)原核細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)先密碼子重新修飾，采用全基因合成技術(shù)構(gòu)建全長(zhǎng)CpTI基 因，共333對(duì)堿基，克隆至載體pGEM-T Easy,結(jié)果如圖3所示；
(c)通過菌落PCR驗(yàn)證CpTI基因片斷插入的正確性，結(jié)果如圖4所示；
(d)將克隆CpTI基因菌實(shí)施擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切和瓊脂糖電泳分析，結(jié)果 如圖5所示；
(e)DNA測(cè)序，保證基因的全部序列100%準(zhǔn)確，結(jié)果如圖6所示。2)表達(dá)和純化提取GST-CpTI融合蛋白
(a)將CpTI基因片段通過限制酶切割插入PGEX-4T-2載體中，構(gòu)建細(xì)菌融合表達(dá)載體 pGEX-4T-2-CpTI ；
(b)將融合表達(dá)載體pGEX-4T-2-CpTI轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)條件為 230轉(zhuǎn)/分，溫度37° C;
(c)當(dāng)菌體生長(zhǎng)OD595值為0.5-0. 8時(shí)，加入1. OmM的誘導(dǎo)劑IPTG，在25° C誘導(dǎo)3小 時(shí)；在4° C時(shí)，以5，000X g離心5分鐘，收集菌體；
(d)菌體經(jīng)PBS緩沖液清洗3次后，超聲破碎；破碎細(xì)胞在4°C時(shí)，以14，000' g離 心1小時(shí)，收集上清；
(e)將上清循環(huán)通過谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(GlutathioneSepharose )4B親合層析柱， 4° C過夜；未結(jié)合蛋白用10倍床體積的IX PBS沖洗；
(f)將結(jié)合的GST-CpTI融合蛋白用洗脫液洗脫并收集、保存；并對(duì)表達(dá)和純化提取的 GST-CpTI融合蛋白做SDS-PAGE和^festern Blotting分析，結(jié)果如圖7和8所示。3)制備抗CpTI多克隆抗體
(a)將GST-CpTI融合蛋白抗原與弗氏佐劑混合后，充分乳化；采用背部多點(diǎn)注射法免 疫BALB/c小鼠；每次免疫的抗原量約10 μ g，免疫三次；每次免疫兩周后經(jīng)尾動(dòng)脈取血檢 測(cè)抗體效價(jià)；
(b)以適宜濃度的抗原包被酶標(biāo)板，100μ 1/孔，4° C過夜；
(c)洗滌后，加入待檢的血清樣品，ΙΟΟμΙ/孔，37°C 1小時(shí)；設(shè)陰性對(duì)照孔；
(d)洗滌后，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG的抗體試劑，100μ 1/孔，37° C避光顯色15 分鐘；用2Μ H2SO4終止反應(yīng)后，閱讀各孔的Α490值；并對(duì)制備的抗GST-CpTI融合蛋白抗體， 經(jīng)ELISA法檢測(cè)，抗體能與GST-CpTI，GST蛋白特異性結(jié)合，其相關(guān)系數(shù)達(dá)到顯著水平，效價(jià) >1:8000，結(jié)果如圖9所示。4)制備用于檢測(cè)CpTI蛋白的免疫膠乳微球(a)將單分散羧基化聚苯乙烯微球用活化劑EDC(碳化二亞胺)活化，然后加入保護(hù)劑 N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)使微球形成穩(wěn)定的活潑酯中間體；
(b)加入抗CpTI蛋白多克隆抗體，溫育1-2小時(shí)；
(c)洗滌后，收集免疫微球；
(d)通過CA-1680型生化分析儀，采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法，檢測(cè)CpTI融合蛋白樣品。
采用本發(fā)明所述的檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的制備方法，制備 出的免疫膠乳微球經(jīng)生化分析儀檢測(cè)，用于檢測(cè)CpTI蛋白的免疫膠乳微球最低檢測(cè)限為 CpTI融合蛋白0.248/!111，其相關(guān)系數(shù)1 2=0.67，結(jié)果如圖10所示。由此可見，本發(fā)明所制 備的用于檢測(cè)CpTI蛋白的免疫膠乳微球檢測(cè)靈敏度較高，且操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性強(qiáng)，顯示了 良好的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球，其特征在于免疫膠乳微球由抗 CpTI蛋白多克隆抗體包被，微球顆粒大小為200nm，最低檢測(cè)限為CpTI融合蛋白0. 2 μ g/ ml，相關(guān)系數(shù)R2=O. 67。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球，其特征在于，所 述免疫膠乳微球是單分散羧基化聚苯乙烯微球，顆粒大小為200nm，表面載基團(tuán)為羧基。
3.—種檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的制備方法，其特征在于，包括以下 步驟1)設(shè)計(jì)全長(zhǎng)CpTI基因序列，根據(jù)原核細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)先密碼子重新修飾并采用全基因 合成技術(shù)構(gòu)建全長(zhǎng)CpTI基因表達(dá)序列；2)將步驟1)得到的CpTI基因片段通過限制酶切割插入谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基 因融合表達(dá)載體中，構(gòu)建細(xì)菌融合表達(dá)載體；3)通過步驟2)對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行細(xì)菌表達(dá)后，利用親合層析柱純化獲得GST-CpTI融合 蛋白；4)將經(jīng)過步驟3)得到的GST-CpTI融合蛋白抗原溶合弗氏佐劑后免疫小鼠，經(jīng)分離純 化得到鼠抗CpTI多克隆抗體；5)將經(jīng)過步驟4)得到的鼠抗CpTI多克隆抗體通過羧基-氨基化學(xué)偶聯(lián)法偶聯(lián)活化微 球，得到檢測(cè)CpTI蛋白的免疫膠乳微球。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的制備方法，其特 征在于，在步驟2)中所述谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因融合表達(dá)載體是pGEX-4T-2，構(gòu) 建完成后的融合表達(dá)載體是pGEX-4T-2-CpTI。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的制備方法，其特 征在于，在步驟3)中所述親合層析柱為谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的制備 方法，其特征在于，在步驟5)中所述免疫膠乳微球是單分散羧基化聚苯乙烯微球，顆粒大 小為200nm，表面載基團(tuán)為羧基；所述免疫膠乳微球的活化是首先用碳化二亞胺活化微球， 然后加入N-羥基硫代琥珀酰亞胺使微球形成穩(wěn)定的活潑酯中間體，以備連接抗體分子之 用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球及其制備方法，該免疫微球由抗CpTI蛋白多克隆抗體包被，微球顆粒大小200nm；所述免疫膠乳微球的制備方法包括以下步驟設(shè)計(jì)全長(zhǎng)CpTI基因序列；將CpTI基因片段通過限制酶切割插入谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因融合表達(dá)載體中，構(gòu)建細(xì)菌融合表達(dá)載體；利用親合層析柱純化獲得GST-CpTI融合蛋白；將GST-CpTI融合蛋白抗原溶合弗氏佐劑后免疫小鼠，經(jīng)分離純化得到鼠抗CpTI多克隆抗體；將抗體通過化學(xué)偶聯(lián)法偶聯(lián)活化后的微球，得到檢測(cè)CpTI蛋白的免疫膠乳微球。本發(fā)明的有益效果為靈敏度較高，且操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性強(qiáng)；所制備的免疫膠乳微球顆粒小，粒徑均勻，能檢測(cè)CpTI融合蛋白最低限0.2μg/ml，其相關(guān)系數(shù)R2=0.67。
文檔編號(hào)G01N33/531GK102109521SQ201010591728
公開日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月16日
發(fā)明者李俊生, 潘衛(wèi)東, 王學(xué)霞, 肖能文 申請(qǐng)人:中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院