專利名稱：：一種用于蓼科植物來源藥材的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及天然藥物的質(zhì)量控制領(lǐng)域，具體涉及基于高效液相色譜-可變波長檢測器(HPLC-VWD)的分段檢測技術(shù)用于蓼科植物來源藥材(如大黃、虎杖、何首烏等)中多類成分的同時(shí)檢測。
背景技術(shù)：
：蓼科植物，多草本或灌木，莖節(jié)常膨大。托葉包于莖節(jié)形成托葉鞘?；▋尚曰騿涡援愔辏粏伪?，花被3-6，?；ò?duì)?；子房上位。瘦果或小?jiān)果，常包于宿存花被內(nèi)。本科約有30屬1200種，全球分布。我國15屬200余種，其中藥用種類約120種，全國均有分布。主要的屬有蓼屬(Polygonum)、大黃屬(liheum)、酸模屬(Rumex)等。主要的生藥有大黃、何首烏、虎杖、拳參、篇蓄、金蕎麥、辣蓼、杠板歸、蓼大青等。蓼科植物普遍含有蒽醌類、黃酮類、鞣質(zhì)及各種苷類。蓼科植物來源藥材，如大黃、虎杖、何首烏等臨床應(yīng)用相當(dāng)廣泛，國內(nèi)外關(guān)注度亦較高。近年來，針對(duì)蓼科植物的抗腫瘤活性有廣泛的研究。然而，關(guān)于蓼科植物的肝毒性報(bào)道也逐漸增多。因此，建立簡單適用的分析方法用于蓼科植物所含化學(xué)成分的定量檢測顯得尤為重要。建立簡單、快速、適用的檢測方法將有利于對(duì)蓼科植物的安全性及有效性評(píng)價(jià)。2010版藥典中針對(duì)蓼科植物來源藥材的含量測定多為利用高效液相色譜串聯(lián)紫外檢測器(HPLC-UV)用于藥材的定量檢測，這種方法只檢測一類或兩類成分，很難反映出藥材的整體特點(diǎn)，難以達(dá)到對(duì)藥材安全性及有效性的全面評(píng)價(jià)。目前，對(duì)藥材進(jìn)行多類成分同時(shí)檢測已成為藥材質(zhì)量控制的重要手段。Komatsu等建立一種HPLC-UV方法，在^Onm波長下定量檢測大黃藥材中30個(gè)化學(xué)成分，然而在280nm波長下很多化合物未達(dá)最大吸收，且在此方法中很多化合物未能基線分離，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確。Lin等利用HPLC-UV方法用于大黃的定量檢測，該方法分別在^Onm下檢測二苯乙烯類和沒食子酰葡萄糖，在254nm下檢測蒽醌類化合物，然而不同吸收波長下需要分別檢測，加大了工作量。因此，同時(shí)定量蓼科植物中多種類型化合物，用于蓼科植物的質(zhì)量控制成為亟待解決的問題。正因?yàn)檗た浦参锼瘜W(xué)成分種類較多，且各類化合物紫外吸收特征不同，利用HPLC-VffD用于蓼科植物的質(zhì)量控制一直難以實(shí)現(xiàn)。這制約了蓼科植物的活性及毒性研究。因此，建立合適的定量檢測技術(shù)對(duì)蓼科植物的藥效及毒效物質(zhì)基礎(chǔ)研究具有重要的意義。以HPLC-VWD為基礎(chǔ)，應(yīng)用分段檢測技術(shù)，研究一種可用于同時(shí)定量蓼科植物中酚酸類、黃酮類、二苯乙烯類和蒽醌類的方法，是本
技術(shù)領(lǐng)域：
面臨的主要問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于建立一種基于HPLC-VWD的分段檢測技術(shù)，用于同時(shí)定量檢測蓼科植物中4種不同類型化合物的定量檢測，并應(yīng)用于蓼科藥材的質(zhì)量控制。本發(fā)明通過如下方法實(shí)現(xiàn)我們建立基于HPLC-VWD的分段檢測技術(shù)首先用HPLC將待檢測的各個(gè)化合物很好的分離開來，其次VWD可在不同時(shí)間段檢測不同的吸收波長，使得每一類化合物都能在其最大吸收處被檢測，從而大大提高了檢測的靈敏度，用于同時(shí)檢測和定量蓼科藥材中四種不同類型化合物，最后我們通過色譜條件選擇、方法學(xué)考察等研究，優(yōu)化和確證建立方法的適用性，并將此方法用于蓼科藥材的質(zhì)量控制。本發(fā)明的具體方案如下使用高效液相色譜儀，可變波長檢測器，色譜工作站，將混合標(biāo)準(zhǔn)品液或蓼科藥材提取液，采用如下色譜條件分析色譜柱安捷倫ZorbaxStableBond-C18柱(50mmX4.6mmI.D.，1·8μm)；柱溫20-35°C;流動(dòng)相A相為0.05-0.5%甲酸水溶液，B相為乙腈；梯度洗脫程序:0-2min,5-10%(ν/ν)B；2_4min，10-15%B；4-lOmin，15-15%B；10-llmin,15-21%B；ll_14min，21-21%B；14_21min，21-29%B；21_23min，29-40%B；23-25min,40-50%B；25-26min,50-50%B；26-28min,50-80%B；28-30min,80-100%B；30-32min,100-100%B。流速0.8ml/min；檢測波長0-9min和17_25min為280nm;6_12min和15_19min為320nm；12-14.5min和21_32min為254nm。優(yōu)選的柱溫為25°C。優(yōu)選的甲酸水濃度為0.1%，為體積百分比。優(yōu)選的檢測波長0-6min和18_24min為^Onm；6_12min和14.5_18min為320nm；12-14.5min和24_32min為254nm。上述液相色譜儀進(jìn)樣量優(yōu)選為5μ1。本發(fā)明利用四類13種不同的化合物用于方法的建立及方法學(xué)的考察。這些標(biāo)準(zhǔn)品分別為酚酸類(1沒食子酸)、黃酮類O兒茶素)、二苯乙烯類(3虎杖苷、4二苯乙烯苷和7白藜蘆醇)和蒽醌類(5番瀉苷Β、6番瀉苷Α、8大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷、9蘆薈大黃素、10大黃酸、11大黃素、12大黃酚和13大黃素甲醚)。本發(fā)明利用HPLC偶聯(lián)短柱來分析待測樣品，可以有效的縮短分析時(shí)間，提高分析效率。不同蓼科藥材，如虎杖、大黃、何首烏，以及13個(gè)混標(biāo)，均能在32min內(nèi)明顯的分離開來，為后面分段檢測技術(shù)提供基礎(chǔ)。圖1為混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液在傳統(tǒng)HPLC-VWD方法和基于HPLC-VWD的分段檢測技術(shù)下的色譜圖對(duì)比，其中(A)、(B)和(C)分別為傳統(tǒng)HPLC-VWD方法在不同波長下分次、分別檢測所得色譜圖，⑶為基于HPLC-VWD的分段檢測技術(shù)下色譜圖，圖中各編號(hào)所指引標(biāo)準(zhǔn)品，如前所標(biāo)示。由圖可見，分段檢測技術(shù)可在一次進(jìn)樣中同時(shí)檢測具有不同吸收波長的多種類型化合物，相比傳統(tǒng)方法，該方法更加省時(shí)高效，且能保持各類化合物均在其最大吸收處被檢測，提高了檢測的精密度。本發(fā)明，以四類13種混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液為研究對(duì)象，對(duì)所建立的HPLC-VWD的分段檢測技術(shù)進(jìn)行方法學(xué)考察，包括線性、檢測限、定量限、精密度，并且對(duì)比其與傳統(tǒng)方法的區(qū)別。表1.基于HPLC-VWD分段檢測技術(shù)與傳統(tǒng)HPLC-VWD下13個(gè)化合物的線性、檢測4限和定量限c權(quán)利要求1.一種基于高效液相色譜串聯(lián)可變波長檢測器(HPLC-VWD)，用于蓼科植物來源藥材的檢測方法包括色譜分析方法的建立與優(yōu)化、用建立的方法用于對(duì)蓼科來源藥材的定量檢測，其特征采用如下方法獲得使用高效液相色譜儀，可變波長檢測器，色譜工作站，將混合標(biāo)準(zhǔn)品液或蓼科藥材提取液，采用如下色譜條件分析色譜柱鍵合硅膠填料色譜柱；柱溫:25°C；流動(dòng)相A相為0.甲酸水溶液，B相為乙腈；梯度洗脫程序:0-2min,5-10%(ν/ν)B；2_4min，10-15%B；4-lOmin，15-15%B；10-llmin，15-21%B;ll_14min，21-21%B；14_21min，21-29%B;21_23min，29-40%B；23-25min,40-50%B；25-26min,50-50%B；26-28min,50-80%B；28-30min,80-100%B；30-32min,100-100%B。流速:0.8ml/min；檢測波長0_6min和18_24min為^Onm；6_12min和14.5_18min為320nm；12-14.5min和24-32min為254nm。2.權(quán)利要求1的分析方法，其中柱溫是20-40°C。3.權(quán)利要求1的分析方法，其中色譜柱是碳八或十八烷基鍵合硅膠填料色譜柱。4.權(quán)利要求1的分析方法，其中甲酸水濃度為0.05-0.5%，為體積百分比。5.權(quán)利要求1的分析方法，其中流速為0.3-1.3ml/min。6.權(quán)利要求1的分析方法，其中液相色譜儀進(jìn)樣量為1-15μ1。7.權(quán)利要求1的分析方法，其中檢測波長為0-9min和17_25min為^Onm；6-ianin和15-19min為320nm；12-14.5min和21_32min為254nm。全文摘要本發(fā)明涉及天然藥物的質(zhì)量控制領(lǐng)域，具體涉及基于高效液相色譜-可變波長檢測器(HPLC-VWD)的分段檢測技術(shù)，用于蓼科植物來源藥材(如大黃、虎杖、何首烏等)中多類成分的同時(shí)檢測。本發(fā)明首先使用HPLC將待檢測的各個(gè)化合物很好的分離開來，其次設(shè)定VWD在不同時(shí)間段檢測不同的吸收波長，使得每一類化合物都能在其最大吸收處被檢測，從而達(dá)到同時(shí)檢測和定量蓼科藥材中四種不同類型化合物的目的。文檔編號(hào)G01N30/02GK102539574SQ20121000936公開日2012年7月4日申請(qǐng)日期2012年1月13日優(yōu)先權(quán)日2012年1月13日發(fā)明者李會(huì)軍,李萍,鄧婷,馬江申請(qǐng)人:中國藥科大學(xué)