多參數(shù)紙芯片電化學免疫傳感器及肺癌標志物檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種多參數(shù)紙芯片電化學免疫傳感器，包括覆蓋層、過濾膜以及可折疊紙芯片；在覆蓋層上設(shè)置有進樣孔和第一梳齒，第一梳齒用于露出可折疊紙芯片上金屬引線的末端；過濾膜緊貼于進樣孔下方，用于過濾截留樣品中較大的細胞；可折疊紙芯片包括第一濾紙芯片、第二濾紙芯片和位于中間位置的對折線，第一濾紙芯片上設(shè)置的敏感區(qū)、中心引流孔與第二濾紙芯片上設(shè)置的工作電極、銀/氯化銀參比電極沿對折線呈對稱分布；敏感區(qū)修飾有石墨烯-金屬復(fù)合納米材料、電子媒介體和不同抗體，在與不同待測物特異性識別后，該濾紙芯片折疊起來即可用于檢測各敏感區(qū)識別待測物質(zhì)引起的電化學信號變化。本發(fā)明還提供一種多種肺癌標志物檢測方法。
【專利說明】多參數(shù)紙芯片電化學免疫傳感器及肺癌標志物檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及紙芯片制作、納米修飾和免疫檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及一種石墨烯基納米復(fù)合材料修飾的多參數(shù)紙芯片電化學免疫傳感器及其在肺癌檢測中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在各類惡性腫瘤中均居首位，如何快速早期診斷是提高肺癌療效和治愈率的關(guān)鍵。腫瘤標志物是癌細胞分泌或脫落到體液或組織中的物質(zhì)，其檢測與傳統(tǒng)的影像學檢查相比，費用低廉、無損傷、患者易于接受，但單一標志物對肺癌診斷尚缺乏足夠的敏感性和特異性。多種腫瘤標志物聯(lián)合檢測對肺癌的早期診斷及療效檢測更具價值，美國臨床生化學會根據(jù)肺癌病理學特點，推薦將癌胚抗原(CEA)、細胞角蛋白19片斷(CYFRA21-1)聯(lián)合用于腺肺癌和大細胞肺癌的檢測，將神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、胃泌素釋放肽前體(ProGRP)聯(lián)合用于小細胞肺癌的檢測，將CEA、CYFRA21-1和鱗狀細胞癌抗原(SCC)三參數(shù)聯(lián)合用于鱗狀細胞癌的檢測，將CEA、CYFRA21-1、NSE和ProGRP聯(lián)合用于不明原因肺癌的檢測。目前有許多免疫分析法可用于腫瘤標志物的定量檢測，包括放射免疫分析、酶聯(lián)免疫分析、電化學發(fā)光免疫分析、化學發(fā)光免疫分析等，但是這些方法大多涉及煩瑣的溶液處理過程、需配備專用儀器，難以實現(xiàn)多項指標的快速聯(lián)合檢測。
[0003]微型全分析系統(tǒng)是當前世界上最前沿的科技領(lǐng)域之一，其核心技術(shù)即是以微流控技術(shù)為基礎(chǔ)的微流控芯片，它可以將多種單元技術(shù)在整體可控的微小平臺上靈活組合、規(guī)模集成，能簡化操作、增加分析速度和降低試劑消耗，有望實現(xiàn)對多種指標的同時檢測。常見的微流控芯片部件是由玻璃、塑料、硅膠原料等構(gòu)成的微通道、微泵、微閥等，這些部件復(fù)雜且制作成本較高，不適合在發(fā)展中國家大規(guī)模推廣應(yīng)用。為此，2007年初哈佛大學Whitesides小組首次以濾紙為基底構(gòu)建了用于葡萄糖、總蛋白檢測的紙基微流控芯片(紙芯片)，該裝置具有成本低、制作簡單、無需外在驅(qū)動力(如泵)、樣品體積小、易于焚化處理等優(yōu)點。之后，研究者嘗試了多種紙芯片的構(gòu)建和檢測方法，其中，蠟打印是最省時有效、并易于大量制作的方式，電化學免疫傳感器則因為具有電極可以批量生產(chǎn)、特異性好、可結(jié)合小型儀器實現(xiàn)定量檢測等優(yōu)勢，使得開發(fā)出成本低、操作簡單的多參數(shù)紙芯片電化學免疫傳感器成為可能。為了提高電化學免疫檢測的靈敏度，研究者普遍采用修飾納米材料(如金納米粒子、碳納米管、金屬氧化物等)來增強識別電子信號的傳輸，如濟南大學于京華小組基于碳納米管修飾和紙芯片相結(jié)合構(gòu)建了檢測腫瘤標志物的電化學免疫傳感器，需要配備絲網(wǎng)印刷電極和電化學工作站來使用，且修飾材料碳納米管的成本較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004](一 )要解決的技術(shù)問題
[0005]為了解決現(xiàn)有技術(shù)靈敏度低的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種用石墨烯基復(fù)合納米材料修飾的紙芯片電化學免疫傳感器。[0006]( 二)技術(shù)方案
[0007]為了解決現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明的第一方面提供多參數(shù)紙芯片電化學免疫傳感器，該傳感器包括覆蓋層、過濾膜和可折疊紙芯片，其中:
[0008]在覆蓋層上設(shè)置一個進樣孔，在覆蓋層的另一端設(shè)置第一梳齒，第一梳齒用于露出多個金屬引線的末端；
[0009]過濾膜緊貼于進樣孔的下方，過濾膜的尺寸大于進樣孔且與進樣孔的中心重合，用于過濾截留待測樣品中較大的細胞；
[0010]可折疊紙芯片是具有親水和疏水區(qū)域交替出現(xiàn)的蠟圖案化濾紙芯片，包括第一濾紙芯片、第二濾紙芯片和位于中間位置的對折線，第一濾紙芯片與第二濾紙芯片能沿對折線折疊起來；通過覆蓋層自身的粘結(jié)作用將覆蓋層、過濾膜與第一濾紙芯片組裝成一體，而第二濾紙芯片沿對折線與第一濾紙芯片折疊起來，這樣，在敏感區(qū)與不同待測物特異性識別后，第二濾紙芯片與第一濾紙芯片折疊起來即可用于檢測各敏感區(qū)識別待測物質(zhì)引起的電化學信號變化；
[0011]在第一濾紙芯片的一端部設(shè)置第二梳齒，當?shù)谝粸V紙芯片與第二濾紙芯片折疊后，第二梳齒用于露出多個金屬引線的末端；在靠近對折線的一側(cè)和第二梳齒之間設(shè)置疏水蠟區(qū)域、多個敏感區(qū)、分液溝道、中心引流孔和多個分液孔；中心引流孔位于分液溝道的直線段的中心位置且與進樣孔、過濾膜的中心垂直線沿該多參數(shù)紙芯片免疫電化學傳感器的垂直豎向方向重合；多個分液孔位于中心引流孔的兩側(cè)，且多個分液孔分別與分液溝道的多個V型段的一端連接，每個V型段的一端設(shè)置敏感區(qū)，用以引導(dǎo)液體樣品分流進入到敏感區(qū)而不發(fā)生滲漏；
[0012]在第二濾紙芯片的上面設(shè)有中心引流孔、多個引流孔和多個液流溝道；在靠近對折線的另一側(cè)設(shè)有中心引流孔，該中心引流孔與第一濾紙芯片上的中心引流孔沿對折線呈對稱分布；多個引流孔與第一濾紙芯片上的多個敏感區(qū)呈對稱分布；在第二濾紙芯片上且遠離對折線的端部設(shè)有多個液流溝道，該液流溝道一端與引流孔連接，另一端則與第二濾紙芯片的邊緣連接且沿對折線與第一濾紙芯片上的第二梳齒呈對稱分布；
[0013]在第二濾紙芯片的背面設(shè)有銀/氯化銀參比電極、多個工作電極、多個金屬引線；銀/氯化銀參比電極、多個工作電極、多個金屬引線的位置分別與上面的中心引流孔、多個引流孔和多個液流溝道一一對應(yīng)，銀/氯化銀參比電極和各工作電極沿對折線分別與各敏感區(qū)、中心引流孔呈對稱分布，在與不同待測物特異性識別后，該濾紙芯片沿對折線折疊起來即可用于檢測各敏感區(qū)識別待測物質(zhì)引起的電化學信號變化。
[0014]為了解決現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明的第二方面提供使用多參數(shù)紙芯片免疫電化學傳感器的實現(xiàn)對人體液中肺癌標志物的檢測方法，是利用上述多參數(shù)紙芯片免疫電化學傳感器，結(jié)合小型電化學儀表或電化學工作站來自動檢測出多路電信號的變化值，根據(jù)電信號變化值與抗原濃度間的關(guān)系，反算出待測抗原的濃度，從而實現(xiàn)對人體液中肺癌標志物的快速檢測。
[0015](三)有益效果
[0016]該傳感器制作簡單、靈敏度高、成本低且集成度高，使用時無需對人體液樣本進行細胞分離處理，不需要配備復(fù)雜昂貴的設(shè)備，通過結(jié)合類似現(xiàn)有市場上血糖儀的小型儀表，即可實現(xiàn)對多種肺癌標志物乃至其它腫瘤標志物的現(xiàn)場檢測應(yīng)用。[0017]1、本發(fā)明將微流控紙芯片和電化學免疫分析技術(shù)相結(jié)合，可以實現(xiàn)樣本中多種肺癌標志物的高特異性、高靈敏度的同時快速檢測；同時，該技術(shù)還可以拓展應(yīng)用到其它腫瘤的多種標志物的快速檢測。
[0018]2、采用噴蠟打印制作可折疊紙芯片圖形、薄膜濺射/絲網(wǎng)印刷制作檢測電極的方式，可實現(xiàn)紙芯片免疫電化學傳感器各組成單元的批量制作，降低了制作成本，提高了傳感器制備和檢測的重復(fù)性。
[0019]3、將金屬納米粒子與石墨烯復(fù)合更有利于電子傳遞,而在石墨烯-金屬納米復(fù)合材料修飾的可折疊紙芯片上固定電子媒介體，將進一步提高電子傳遞速率，使得所制備的紙芯片免疫電化學傳感器具有更快速的響應(yīng)和更高的靈敏度。
[0020]4、本發(fā)明的紙芯片免疫電化學傳感器檢測肺癌標志物的方法，試劑耗樣量少(幾十微升)、靈敏度高(Pg級)、操作快速簡單(數(shù)分鐘即可完成多種標志物的檢測)、成本低，且檢測結(jié)果由儀器自動讀出，受主觀因素影響小，便于現(xiàn)場檢測應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為多參數(shù)紙芯片電化學免疫傳感器的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0022]圖2為多參數(shù)紙芯片電化學免疫傳感器的俯視圖以及AA’、BB’截面的剖面圖。
[0023]各部件附圖標記說明:
[0024]a_覆蓋層，b_過濾膜，C-可折疊紙芯片；
[0025]Cl-第一濾紙芯片，c2_第二濾紙芯片，
[0026]1_第一梳齒，2-進樣孔，3-第二梳齒，
[0027]4-疏水蠟區(qū)域，5-敏感區(qū)，6-分液溝道，
[0028]7-中心引流孔，8-分液孔，9-對折線，
[0029]10-中心引流孔，11-引流孔，12-液流溝道，
[0030]10’ -銀/氯化銀參比電極，11’-工作電極，12’-金屬引線。
【具體實施方式】
[0031]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合具體實施例，并參照附圖，對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
[0032]圖1為根據(jù)本發(fā)明一實施例的多參數(shù)紙芯片免疫電化學傳感器的結(jié)構(gòu)示意圖，圖2為該多參數(shù)紙芯片電化學免疫傳感器的俯視圖以及AA’、BB’截面的剖面圖。
[0033]如圖1所示，該多參數(shù)紙芯片免疫電化學傳感器包括覆蓋層a、過濾膜b和可折疊紙芯片C，其中包括:
[0034]在覆蓋層a上設(shè)置一個進樣孔2，在覆蓋層a的另一端設(shè)置第一梳齒1，用于露出多個金屬引線12’的末端；
[0035]過濾膜b緊貼于進樣孔2的下方，其尺寸略大于進樣孔2，且與進樣孔2的中心重合，用于過濾截留待測樣品(如人體液)中較大的細胞；
[0036]可折疊紙芯片c是具有親水和疏水區(qū)域交替出現(xiàn)的蠟圖案化濾紙芯片，包括第一濾紙芯片Cl、第二濾紙芯片c2和位于中間位置的對折線9，第一濾紙芯片Cl與第二濾紙芯片c2能沿對折線9折疊起來； 通過覆蓋層a自身的粘結(jié)作用將覆蓋層a、過濾膜b與第一濾紙芯片Cl組裝成一體，而第二濾紙芯片C2可方便地沿對折線9與第一濾紙芯片Cl折疊起來，這樣，在敏感區(qū)5與不同待測物特異性識別后，第二濾紙芯片c2與第一濾紙芯片Cl折疊起來即可用于檢測各敏感區(qū)5識別待測物質(zhì)引起的電化學信號變化。
[0037]在第一濾紙芯片Cl的一端部設(shè)置第二梳齒3，當?shù)谝粸V紙芯片Cl與第二濾紙芯片c2折疊后，第二梳齒3用于露出多個金屬引線12’的末端；在靠近對折線9的一側(cè)和第二梳齒3之間設(shè)置疏水蠟區(qū)域4、多個敏感區(qū)5、分液溝道6、中心引流孔7和多個分液孔8 ；中心引流孔7位于分液溝道6的直線段的中心位置，且與進樣孔2、過濾膜b的中心垂直線沿該多參數(shù)紙芯片免疫電化學傳感器的垂直豎向方向重合；多個分液孔8位于中心引流孔7的兩側(cè)，且多個分液孔8分別與分液溝道6的多個V型段的一端連接，每個V型段的一端設(shè)置敏感區(qū)5，用以引導(dǎo)液體樣品分流進入到敏感區(qū)5而不發(fā)生滲漏；
[0038]在第二濾紙芯片c2的上面設(shè)有中心引流孔10、多個引流孔11和多個液流溝道12 ;在靠近對折線9的一側(cè)設(shè)有中心引流孔10，該中心引流孔10與第一濾紙芯片Cl上的中心引流孔7沿對折線9呈對稱分布；多個引流孔11與第一濾紙芯片Cl上的多個敏感區(qū)5呈對稱分布；在第二濾紙芯片c2遠離對折線9的那端設(shè)有多個液流溝道12，該液流溝道
12一端與引流孔11連接，另一端則與第二濾紙芯片c2的邊緣連接且沿對折線9與第一濾紙芯片Cl上的第二梳齒3呈對稱分布。
[0039]在第二濾紙芯片c2的背面設(shè)有銀/氯化銀參比電極10’、多個工作電極11’、多個金屬引線12’；銀/氯化銀參比電極10’、多個工作電極11’、多個金屬引線12’的位置分別與上面的中心引流孔10、多個引流孔11和多個液流溝道12—一對應(yīng)，銀/氯化銀參比電極10’和各工作電極11’沿對折線9分別與各敏感區(qū)5、中心引流孔7呈對稱分布。
[0040]所述覆蓋層a為常用的醫(yī)用膠帶，用于保護可折疊紙芯片c上敏感區(qū)5的試劑不流失、不受外界污染，同時對過濾膜b和可折疊紙芯片c的組裝起到粘接作用。
[0041]所述過濾膜b是從Pall公司的GR、GX過濾膜中選取一種，主要用于將人體液中的細胞分離截留在膜上，其余物質(zhì)則透過過濾膜b后再經(jīng)分液溝道6分流進入到第一濾紙芯片Cl的敏感區(qū)5，這樣，以保證樣品全部經(jīng)過濾膜b過濾后進入可折疊紙芯片c的分液溝道6而不發(fā)生滲漏。
[0042]所述敏感區(qū)5是連通過濾膜b過濾出樣品和第二濾紙芯片c2上的工作電極的關(guān)鍵單元，表面修飾有石墨烯-金屬復(fù)合納米材料、電子媒介體和不同抗體和輔助試劑，石墨烯-金屬復(fù)合納米材料用以促進對待測物質(zhì)的免疫識別和電子傳遞能力、穩(wěn)定性和固定吸附能力，在敏感區(qū)與不同待測物特異性識別后，結(jié)合第二濾紙芯片上的工作電極和小型電化學儀表或電化學工作站，來實現(xiàn)對人體液中多參數(shù)疾病標志物的快速檢測；所述敏感區(qū)5的通道數(shù)為4-8之間，各敏感區(qū)5呈等間距分布在與對折線9平行的方向上，分液溝道6的數(shù)量和形狀可根據(jù)敏感區(qū)5的通道數(shù)做出適當調(diào)整，以方便實現(xiàn)敏感試劑在各敏感區(qū)5上的批量修飾。
[0043]所述敏感區(qū)5，是通過物理吸附和化學交聯(lián)法固定不同的石墨烯-金屬納米復(fù)合材料、電子媒介體、抗體和輔助試劑。該復(fù)合材料中的金屬可以為鉬、金、銀、IE中的一種或任兩種組合；電子媒介體由從硫瑾、亞甲基藍、鐵氰酸鹽、普魯士藍、二茂鐵及其衍生物和銠/鋨離子聚合物組成的組中選擇出的一種，用于提高電子傳遞速率；抗體包括單抗、多抗等，用于對待測物質(zhì)進行特異識別和響應(yīng)；輔助試劑是由耦聯(lián)試劑、封閉劑、緩沖液和表面活性劑等組成。
[0044]所述抗體為肺癌腫瘤標志物對應(yīng)的單抗或多抗，其肺癌腫瘤標志物是國際上針對肺癌病理學特點推薦的腫瘤標志物組合，是從CEA、NSE、CYFRA21-1、ProGRP, SCC等標志物中選擇出的一種組合。
[0045]所述多參數(shù)紙芯片免疫電化學傳感器的制備，是采用蠟印技術(shù)、薄膜濺射、絲網(wǎng)印刷以及納米修飾技術(shù)批量加工得到，包括如下步驟:
[0046](I)以纖維素濾紙為載體，利用噴蠟打印機批量打印上具有第一濾紙芯片Cl、第二濾紙芯片c2和對折線9的設(shè)計圖案，在電子控溫儀器中加熱熔蠟，以形成親水區(qū)、疏水蠟區(qū)域4交替出現(xiàn)的可折疊紙芯片c ；
[0047](2)按照設(shè)計的圖案，利用刻繪機制作出帶有進樣孔2的雙面膠覆蓋層a、過濾膜b以及帶有電極圖形的薄塑料掩膜；
[0048](3)結(jié)合薄膜濺射和絲網(wǎng)印刷工藝，在第二濾紙芯片c2的背面批量制作若干金屬工作電極11’和金屬引線12’以及銀/氯化銀參比電極10’，以形成參比電極復(fù)用兩電極體系的陣列檢測電極；
[0049](4)以氧化石墨烯為納米襯底，利用溶液反應(yīng)原位負載金屬顆粒，結(jié)合化學還原方法制備得到石墨烯-金屬納米復(fù)合材料；
[0050](5)利用物理吸附和化學交聯(lián)法，在可折疊紙芯片c的敏感區(qū)5上依次固定上石墨烯-金屬納米復(fù)合材料、電子媒介體和不同的抗體，并用牛血清白蛋白對多余的活性位點進行封閉處理，低溫干燥后待用；
[0051](6)利用雙面膠覆蓋層a的粘合作用將覆蓋層a、過濾膜b和可折疊紙芯片c自上而下地組裝起來，并裁剪即得單個的多通道紙芯片免疫電化學傳感器。
[0052]本發(fā)明用一種快速檢測肺癌標志物的方法，其特征在于是利用上述石墨烯基復(fù)合納米材料修飾的多參數(shù)紙芯片免疫電化學傳感器，結(jié)合多道電化學工作站或者自制便攜式多道電化學儀表自動檢測出多路電信號的變化值，根據(jù)電信號變化值與抗原濃度間的關(guān)系，反算出待測抗原的濃度，從而實現(xiàn)對待測樣本(人體液)中肺癌標志物的快速的定量檢測，具體實施例包括如下步驟:
[0053](I)移取4-40U L的待測樣品，加入到紙芯片免疫電化學傳感器的進樣孔2內(nèi)，室溫下靜置2-5分鐘；
[0054](2)將紙芯片免疫電化學傳感器沿對折線9對折，將其多個金屬引線12’末端插入到自制便攜式多道電化學儀表的接口或與多道電化學工作站的導(dǎo)線連接，由儀表自動檢測出多路電信號的變化值，根據(jù)電信號變化值與抗原濃度間的關(guān)系，反算出待測抗原的濃度。
[0055]本發(fā)明中，在毛細作用力的驅(qū)動下，樣品溶液首先自動經(jīng)過濾膜b過濾截留其中較大的細胞，其余物質(zhì)則經(jīng)引流孔7和分液溝道6分流進入到傳感器的敏感區(qū)5 ;當樣品中的待測抗原與敏感區(qū)5上的各抗體發(fā)生特異性識別，引起對應(yīng)工作電極11’的電信號變化；然后結(jié)合儀表完成電化學檢測。
[0056]實施例1:NSE和ProGRP兩參數(shù)的聯(lián)合檢測
[0057]一種應(yīng)用石墨烯基復(fù)合納米材料進行小細胞肺癌檢測的紙芯片電化學免疫傳感器制備和使用方法，包括以下步驟:
[0058](I)根據(jù)美國生化學會推薦的腫瘤標志物組合，選擇NSE和ProGRP兩參數(shù)進行聯(lián)合測定；
[0059](2)制備可折疊紙芯片c:在Whatmanl#濾紙用噴臘打印機打印出帶有四通道敏感區(qū)5和四個工作電極11’的設(shè)計圖形，在電子控溫儀器中加熱熔蠟，得到含有親水區(qū)、疏水蠟區(qū)域4交替出現(xiàn)的蠟圖案化的可折疊紙芯片c ;利用刻繪機制作雙面膠覆蓋層a、過濾膜b和帶有電極圖形的薄塑料掩膜，在可折疊紙紙芯片c上結(jié)合薄膜濺射工藝制備基于金的工作電極11’，并絲網(wǎng)印刷上銀/氯化銀作為復(fù)用的參比電極10’;利用覆蓋層a的雙面膠，與過濾膜b和可折疊紙紙芯片c粘結(jié)組裝起來。
[0060](3)石墨烯-金復(fù)合納米材料的制備:將4ml氧化石墨烯(lmg/mL)和25 y L氯金酸(0.2% )的混合物超聲lh，再逐滴加入0.94mL檸檬酸鈉(I % );然后將混合物轉(zhuǎn)移至80°C反應(yīng)2h，冷至室溫，離心，并用超純水洗滌3次，重懸于2mL殼聚糖溶液(1%)中備用。
[0061](4)可折疊紙芯片c的敏感區(qū)5的修飾:先用六道移液器移取5 u L上述石墨烯-金復(fù)合納米材料滴加到可折疊紙芯片c的四通道敏感區(qū)5上，室溫干燥；進一步滴加
5u L的硫瑾/殼聚糖混合液以及戊二醛對敏感區(qū)5進行修飾；然后，將5 ii L NSE、ProGRP的抗體溶液分別滴加到可折疊紙芯片c的四個敏感區(qū)5上，室溫孵育30min，用PBST緩沖液洗滌3次；最后，用1%牛血清白蛋白溶液封閉可能的活性位點，用PBST緩沖液洗滌3次，室溫干燥，即完成紙芯片電化學免疫傳感器的制備。
[0062](5)紙芯片電化學免疫傳感器的使用:移取15 的臨床樣本，加入到紙芯片免疫電化學傳感器的進樣孔2內(nèi)，室溫下靜置2分鐘；然后，將紙芯片免疫電化學傳感器沿對折線9對折，將其金屬引線12’末端插入到Gamry多道電化學工作站的導(dǎo)線連接，由儀表自動檢測出多路電信號的變 化值，根據(jù)電信號變化值與抗原濃度間的關(guān)系，反算出待測樣本中NSE、ProGRP 的濃度。
[0063]實施例2:CEA、CYFRA21-1和SCC三參數(shù)的聯(lián)合檢測
[0064]一種應(yīng)用石墨烯基復(fù)合納米材料進行鱗狀細胞癌檢測的紙芯片電化學免疫傳感器制備和使用方法，包括以下步驟:
[0065](I)根據(jù)美國生化學會推薦的腫瘤標志物組合，選擇CEA、CYFRA21-1和SCC三參數(shù)進行測定；
[0066](2)制備可折疊紙芯片c:在Whatmanl#濾紙用噴臘打印機打印出帶有六通道敏感區(qū)5和六個工作電極11’的設(shè)計圖形，在電子控溫儀器中加熱熔蠟，得到含有親水區(qū)、疏水蠟區(qū)域4交替出現(xiàn)的可折疊紙芯片c ;利用刻繪機制作雙面膠覆蓋層a、過濾膜b和帶有電極圖形的薄塑料掩膜，在可折疊紙芯片c上結(jié)合薄膜濺射工藝制備基于金電極的多個工作電極11’，并絲網(wǎng)印刷上銀/氯化銀作為復(fù)用的參比電極10’ ；利用雙面膠覆蓋層a將之與過濾膜b和可折疊紙芯片c粘結(jié)組裝起來。
[0067](3)石墨烯-鉬復(fù)合納米材料的制備:將25mL氧化石墨烯(0.2mg/mL)超聲分散Ih ;然后，加入Iml K2PtCl6 ? 6H20(20mM)，攪拌，并用NaOH調(diào)節(jié)pH為10 ;緩慢加入400mgNaBH4,室溫攪拌24h后，對反應(yīng)產(chǎn)物離心洗滌，并重懸于2mL殼聚糖溶液(I % )中備用。
[0068](4)可折疊紙芯片c的敏感區(qū)5的修飾:先用六道移液器移取5 u L上述石墨烯-金復(fù)合納米材料滴加到可折疊紙芯片c的六通道敏感區(qū)5上，室溫干燥；進一步滴加5 ii L的亞甲基藍/殼聚糖混合液以及戊二醛對敏感區(qū)5進行修飾；然后，將5 u L CEA、CYFRA21-1和SCC的抗體溶液分別滴加到可折紙芯片c的六個敏感區(qū)5上，室溫孵育30min，用PBST緩沖液洗滌3次；最后，用1% BSA封閉可能的活性位點，用PBST緩沖液洗滌3次，室溫干燥，即完成紙芯片電化學免疫傳感器的制備。
[0069](5)紙芯片電化學免疫傳感器的使用:移取25 的臨床樣本，加入到紙芯片免疫電化學傳感器的進樣孔2內(nèi)，室溫下靜置3分鐘；然后，將紙芯片免疫電化學傳感器沿對折線9對折，將其金屬引線12’末端插入到自制便攜式多道電化學儀表的接口，由儀表自動檢測出多路電信號的變化值，根據(jù)電信號變化值與抗原濃度間的關(guān)系，反算出待測CEA、CYFRA21-1 和 SCC 的濃度。
[0070]實施例3:CEA、CYFRA21-1、NSE和ProGRP四參數(shù)的聯(lián)合檢測
[0071]一種應(yīng)用石墨烯基復(fù)合納米材料進行不明原因肺癌檢測的紙芯片電化學免疫傳感器制備和使用方法，包括以下步驟:
[0072](I)根據(jù)美國生化學會推薦的腫瘤標志物組合，選擇CEA、CYFRA21_1、NSE和ProGRP四參數(shù)進行測定；
[0073](2)制備可折疊紙芯片c:在Whatmanl#濾紙用噴臘打印機打印出帶有八通道敏感區(qū)5和八個工作電極11’的設(shè)計圖形，在電子控溫儀器中加熱熔蠟，得到含有親水區(qū)、疏水蠟區(qū)域4交替出現(xiàn)的可折疊紙芯片c ;利用刻繪機制作雙面膠覆蓋層a、過濾膜b和帶有電極圖形的薄塑料掩膜，在可折疊紙芯片c上結(jié)合薄膜濺射工藝制備基于鉬電極的陣列檢測電極，并絲網(wǎng)印刷上銀/氯化銀作為復(fù)用的參比電極；利用雙面膠覆蓋層a將之與過濾膜b和可折疊紙芯片c粘結(jié)組裝起來。
[0074](3)石墨烯-金銀復(fù)合納米材料的制備:2mL氧化石墨烯(lmg/mL)超聲分散Ih ；加入2ml AgNO3 (20mM)，緩慢加入ImL抗壞血酸(IOOmM)，快速攪拌30min ;然后，持續(xù)攪拌下逐滴加入ImL HAuCl4 (80mM)并保持攪拌30min ;反應(yīng)產(chǎn)物靜置2天，離心洗洚3_4次后，重懸于2mL殼聚糖溶液(I % )中備用。
[0075](4)可折疊紙芯片c的敏感區(qū)5的修飾:先用八道移液器移取L上述石墨烯-金復(fù)合納米材料滴加到可折疊紙芯片c的八通道敏感區(qū)5上，室溫干燥；進一步滴加5uL的鋨離子聚合物以及戊二醛對敏感區(qū)5進行修飾；然后，將5ul CEA、CYFRA21-1、NSE和ProGRP的抗體溶液分別滴加到可折疊紙芯片c的敏感區(qū)5上，室溫孵育30min，用PBST緩沖液洗洚3次；最后，用IOii L的BSA(1% )封閉可能的活性位點，用PBST緩沖液洗滌3次，室溫干燥，即完成紙芯片電化學免疫傳感器的制備。
[0076](5)紙芯片電化學免疫傳感器的使用:移取40uL的臨床樣本，加入到紙芯片免疫電化學傳感器的進樣孔2內(nèi)，室溫下靜置5分鐘；然后，將紙芯片免疫電化學傳感器沿對折線9對折，將其金屬引線12’末端插入到自制便攜式多道電化學儀表的接口，由儀表自動檢測出多路電信號的變化值，根據(jù)電信號變化值與抗原濃度間的關(guān)系，反算出待測CEA、CYFRA21-1、NSE 和 ProGRP 的濃度。
[0077]以上所述的具體實施例，對本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進行了進一步詳細說明，應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種多參數(shù)紙芯片電化學免疫傳感器，其特征在于，包括覆蓋層、過濾膜和可折疊紙芯片，其中: 在覆蓋層上設(shè)置一個進樣孔，在覆蓋層的另一端設(shè)置第一梳齒，第一梳齒用于露出可折疊紙芯片上多個金屬引線的末端； 過濾膜緊貼于進樣孔的下方，過濾膜的尺寸大于進樣孔且與進樣孔的中心重合，用于過濾截留待測樣品中較大的細胞； 可折疊紙芯片是具有親水和疏水區(qū)域交替出現(xiàn)的蠟圖案化濾紙芯片，包括第一濾紙芯片、第二濾紙芯片和位于中間位置的對折線，第一濾紙芯片與第二濾紙芯片能沿對折線折疊起來；通過覆蓋層自身的粘結(jié)作用將覆蓋層、過濾膜與第一濾紙芯片組裝成一體，而第二濾紙芯片沿對折線與第一濾紙芯片折疊起來，這樣，在敏感區(qū)與不同待測物特異性識別后，第二濾紙芯片與第一濾紙芯片折疊起來即可用于檢測各敏感區(qū)識別待測物質(zhì)引起的電化學信號變化； 在第一濾紙芯片的一端部設(shè)置第二梳齒，當?shù)谝粸V紙芯片與第二濾紙芯片折疊后，第二梳齒用于露出多個金屬引線的末端；在靠近對折線的一側(cè)和第二梳齒之間設(shè)置疏水蠟區(qū)域、多個敏感區(qū)、分液溝道、中心引流孔和多個分液孔；中心引流孔位于分液溝道的直線段的中心位置且與進樣孔、過濾膜的中心垂直線沿該多參數(shù)紙芯片免疫電化學傳感器的垂直豎向方向重合；多個分液孔位于中心引流孔的兩側(cè)，且多個分液孔分別與分液溝道的多個V型段的一端連接，每個V型段的一端設(shè)置敏感區(qū)，用以引導(dǎo)液體樣品分流進入到敏感區(qū)而不發(fā)生滲漏； 在第二濾紙芯片的上面設(shè)有中心引流孔、多個引流孔和多個液流溝道；在靠近對折線的另一側(cè)設(shè)有中心引流孔，該中心引流孔與第一濾紙芯片上的中心引流孔沿對折線呈對稱分布；多個引流孔與第一濾紙芯片上的多個敏感區(qū)呈對稱分布；在第二濾紙芯片上且遠離對折線的端部設(shè)有多個液流溝道，該液流溝道一端與引流孔連接，另一端則與第二濾紙芯片的邊緣連接且沿對折線與第一濾紙芯片上的第二梳齒呈對稱分布； 在第二濾紙芯片的背面設(shè)有銀/氯化銀參比電極、多個工作電極、多個金屬引線；銀/氯化銀參比電極、多個工作電極、多個金屬引線的位置分別與上面的中心引流孔、多個引流孔和多個液流溝道一一對應(yīng)，銀/氯化銀參比電極和各工作電極沿對折線分別與各敏感區(qū)、中心引流孔呈對稱分布。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多參數(shù)紙芯片電化學免疫傳感器，其特征在于，所述覆蓋層為醫(yī)用膠帶，用于保護可折疊紙芯片上敏感區(qū)的試劑不流失、不受外界污染，同時對過濾膜和可折疊紙芯片的組裝起到粘接作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多參數(shù)紙芯片電化學免疫傳感器，其特征在于，所述過濾膜選取GR過濾膜、GX過濾膜中的一種，用于將人體液中的細胞分離截留在過濾膜上，其余物質(zhì)則透過過濾膜后再經(jīng)分液溝道分流進入到第一濾紙芯片的敏感區(qū)，用以保證樣品全部經(jīng)過濾膜過濾后進入可折疊紙芯片的分液溝道而不發(fā)生滲漏。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多參數(shù)紙芯片電化學免疫傳感器，其特征在于，所述敏感區(qū)是連通過濾膜過濾出樣品和第二濾紙芯片上的工作電極的關(guān)鍵單元；敏感區(qū)表面通過物理吸附和化學交聯(lián)法固定不同的石墨烯-金屬復(fù)合納米材料、電子媒介體、不同抗體和輔助試劑，石墨烯-金屬復(fù)合納米材料用以促進對待測物質(zhì)的免疫識別和電子傳遞能力、穩(wěn)定性和固定吸附能力，在敏感區(qū)與不同待測物特異性識別后，結(jié)合第二濾紙芯片上的工作電極和小型電化學儀表或電化學工作站，來實現(xiàn)對人體液中多參數(shù)疾病標志物的快速檢測。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多參數(shù)紙芯片電化學免疫傳感器，其特征在于，所述敏感區(qū)的通道數(shù)為4-8之間，各敏感區(qū)呈等間距分布在與對折線平行的方向上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多參數(shù)紙芯片電化學免疫傳感器，其特征在于，所述分液溝道的數(shù)量和形狀根據(jù)敏感區(qū)的通道數(shù)做出調(diào)整，用以方便實現(xiàn)敏感試劑在各敏感區(qū)的批量修飾。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多參數(shù)紙芯片電化學免疫傳感器，其特征在于，所述石墨烯-金屬復(fù)合納米材料中的金屬為鉬、金、銀、鈀中的一種或任兩種組合。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多參數(shù)紙芯片電化學免疫傳感器，其特征在于，所述電子媒介體是從硫瑾、亞甲基藍、鐵氰酸鹽、普魯士藍、二茂鐵及其衍生物和銠/鋨離子聚合物組成的組中選擇出的一種，用于提高電子傳遞速率。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多參數(shù)紙芯片電化學免疫傳感器，其特征在于，所述抗體包括單抗體、多抗體，用于對待測物質(zhì)進行特異識別和響應(yīng)；輔助試劑是由耦聯(lián)試劑、封閉劑、緩沖液和表面活性劑組成。
10.一種使用權(quán)利要求1所述的多參數(shù)紙芯片電化學免疫傳感器實現(xiàn)對人體液中肺癌標志物檢測的方法，其特征在于，是利用上述多參數(shù)紙芯片免疫電化學傳感器，結(jié)合小型電化學儀表或電化學工作站來自動檢測出多路電信號的變化值，根據(jù)電信號變化值與抗原濃度間的關(guān)系，反算出待測抗原的濃度，從而實現(xiàn)對人體液`中肺癌標志物的快速檢測。
【文檔編號】G01N33/574GK103760209SQ201410039635
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月27日
【發(fā)明者】羅金平, 蔡新霞, 王力, 宋軼琳, 石文韜, 劉軍濤, 徐輝任 申請人:中國科學院電子學研究所