本發(fā)明具體涉及一種鉑-三維石墨烯氣凝膠基酶傳感器件的制備及應(yīng)用，屬于電化學(xué)傳感器領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

基于氧化還原酶直接電子轉(zhuǎn)移的電化學(xué)生物傳感器由于優(yōu)良的選擇性、靈敏度和方便性引起了極大關(guān)注，在藥品質(zhì)控、臨床診斷和食品分析等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。然而，在制備酶傳感器時需要解決兩個關(guān)鍵問題：一是在電極如何有效固定酶且不變性；二是如何加快氧化還原酶和電極之間的電子轉(zhuǎn)移速率。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)的氧化還原中心深深埋在多肽鏈內(nèi)部，直接電化學(xué)通常很難實現(xiàn)。

辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，hrp）是一種典型的血紅素酶，具有比活性高，穩(wěn)定性好，分子量小，純酶容易制備等特點，其直接電化學(xué)行為的研究對于研究生命體內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移過程，了解生命過程的氧化還原機(jī)理及建立高靈敏的檢測方法等具有重要意義。選擇合適的材料應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感界面設(shè)計對于實現(xiàn)蛋白質(zhì)直接電化學(xué)具有重要影響，許多納米材料具有高表面積和良好的生物相容性，如金屬納米粒子，金屬硫化物，金屬氧化物和碳材料，已被用于固定生物酶分子。納米鉑是一種具有較高催化活性的貴金屬納米材料，常用于電化學(xué)、電池等領(lǐng)域。石墨烯是單層石墨緊密排列所形成的蜂窩狀二維空間材料，具有比表面積大、機(jī)械強(qiáng)度高、熱導(dǎo)性高、導(dǎo)電性好等獨特的性質(zhì)，在高性能電子器件、復(fù)合材料、傳感器及能量存儲等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用，但是石墨烯納米片易發(fā)生團(tuán)聚進(jìn)而限制了其應(yīng)用范圍。三維石墨烯是以石墨烯納米片為基本單元構(gòu)建的石墨烯宏觀體，具有比表面積大，孔洞結(jié)構(gòu)明顯，導(dǎo)電性能優(yōu)越等特點，為其制造宏觀器件打下了良好的基礎(chǔ)。開發(fā)一種基于三維石墨烯的三維復(fù)合材料并用于構(gòu)建酶傳感器，對于實現(xiàn)蛋白質(zhì)酶的直接電化學(xué)及其催化應(yīng)用具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對以上現(xiàn)狀，本發(fā)明公開一種鉑-三維石墨烯氣凝膠基酶傳感器件的構(gòu)建方法及應(yīng)用，不僅可以解決二維石墨烯納米片易團(tuán)聚的缺點，還可以增大電極有效面積，提高導(dǎo)電性，增加活性位點，提高蛋白質(zhì)在電極表面的固定量，易于實現(xiàn)蛋白質(zhì)的直接電化學(xué)。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種鉑-三維石墨烯氣凝膠基酶傳感器件的制備及應(yīng)用，包括以下步驟：

（1）將氯鉑酸與氧化石墨烯水溶液進(jìn)行超聲處理得混合液；

（2）將步驟（1）所述的混合液進(jìn)行水熱法處理，得圓柱形鉑-三維石墨烯水凝膠；

（3）將步驟（2）中鉑-三維石墨烯水凝膠進(jìn)行干燥得鉑-三維石墨烯氣凝膠；

（4）獎步驟（3）制得的鉑-三維石墨烯氣凝膠與辣根過氧化物酶水溶液混合均勻，滴涂于電極表面，晾干后再滴涂nafion溶液，自然晾干后即得鉑-三維石墨烯氣凝膠基酶傳感器；

（5）將步驟（4）制得的鉑-三維石墨烯氣凝膠基酶傳感器應(yīng)用于三氯乙酸的電催化性能研究。

步驟（1）所述的氯鉑酸濃度為0.1~2.0mg/ml，氧化石墨烯水溶液濃度為0.5~5.0mg/ml；

優(yōu)選的，所述的氯鉑酸濃度為1.0mg/ml，氧化石墨烯水溶液濃度為2.0mg/ml。

步驟（2）中所述的水熱法中高壓反應(yīng)釜的體積為20~100ml，溫度為120~180℃，反應(yīng)時間為10~12小時；

優(yōu)選的，所述的水熱法為高壓反應(yīng)釜的體積為50ml，溫度為180℃，反應(yīng)時間為12小時。

步驟（3）中所述的干燥方法為冷凍干燥法，具體為-87℃下冷凍干燥8~15小時。

優(yōu)選的，所述冷凍干燥時間為12小時。

步驟（4）所述鉑-三維石墨烯氣凝膠與辣根過氧化物酶水溶液為含有濃度為0.1~2.0mg/ml的鉑-三維石墨烯氣凝膠材料，濃度為10.0~20.0mg/ml辣根過氧化物酶；

優(yōu)選的，所述鉑-三維石墨烯氣凝膠與辣根過氧化物酶水溶液為含有濃度為1.0mg/ml的鉑-三維石墨烯氣凝膠材料，濃度為15.0mg/ml辣根過氧化物酶。

步驟（4）所述的電極為正己基吡啶六氟磷酸鹽（hppf6）為修飾劑和粘合劑制備的碳糊電極（cile），其制備方法為：將石墨粉和正己基吡啶六氟磷酸鹽的質(zhì)量比為2：1混合，放入研缽中研磨均勻，滴加適量液體石蠟，將混合物充分研磨，把研磨好的混合物填入直徑為4毫米的玻璃電極管中，內(nèi)插銅絲作為導(dǎo)線，將玻璃管電極中的固體混合物壓實即得cile，使用前將電極表面打磨成鏡面；

優(yōu)選的，所述的離子液體碳糊電極取石墨粉1.6g和hppf60.8g。

步驟（4）所述的鉑-三維石墨烯氣凝膠與辣根過氧化物酶混合溶液的滴涂用量為6~10μl；

優(yōu)選的，所述的鉑-三維石墨烯氣凝膠與辣根過氧化物酶混合溶液的滴涂用量為8.0μl。

步驟（4）所述的nafion溶液為0.5%nafion無水乙醇溶液，滴涂用量為6.0~10.0μl；

優(yōu)選的，所述的0.5%nafion無水乙醇溶液，滴涂用量為8.0μl。

步驟（5）所述的鉑-三維石墨烯氣凝膠基酶傳感器（nafion/pt-3dgr-hrp/cile）應(yīng)用于三氯乙酸（tca）的電催化性能研究，所用方法為循環(huán)伏安法，掃速為20~800mv/s；電解質(zhì)溶液為ph2.0~8.0的磷酸鹽緩沖溶液（pbs），pbs除氧用氣體為氮氣、氬氣等；樣品測試液為醫(yī)用換膚用35%的tca溶液；

優(yōu)選的，所述的循環(huán)伏安法掃速為100mv/s，電解質(zhì)溶液為ph7.0的磷酸鹽緩沖溶液。

本發(fā)明的有益效果：

1.按照本發(fā)明方法所得鉑-三維石墨烯氣凝膠具有豐富多孔的結(jié)構(gòu)，孔徑范圍為10～20μm，鉑納米粒子尺寸50～100nm；具有比表面積大，導(dǎo)電性優(yōu)良，生物相容性好等優(yōu)點。

2.按照本發(fā)明方法所得nafion/pt-3dgr-hrp/cile具有成本較低，工藝過程簡單，步驟少，操作容易等優(yōu)點；

3.結(jié)果表明所得nafion/pt-3dgr-hrp/cile可用于三氯乙酸的直接電化學(xué)測定，且具有催化活性高，穩(wěn)定性好，靈敏度高，線性范圍寬等優(yōu)點。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明實施例制備鉑-三維石墨烯氣凝膠的sem圖（a、b）；（c）鉑-三維石墨烯氣凝膠tem圖；（d）pt-3dga-hrp的sem圖；

圖2為hrp和pt-3dga-hrp的紅外光譜圖（a）和紫外-可見吸收光譜圖（b）；

圖3（a）為不同修飾電極在10.0mmol/lk3[fe(cn)6]和0.1mol/lkcl混合溶液中的循環(huán)伏安圖；（b）為不同修飾電極在1.0mmol/lk3[fe(cn)6]和0.5mol/lkcl的電化學(xué)交流阻抗譜圖；（a-d曲線對應(yīng)的修飾電極分別為cile，nafion/cile，nafion/hrp/cile，nafion/pt-3dga-hrp/cile）

圖4為不同修飾電極在直接電化學(xué)溶液中的循環(huán)伏安圖；（a-d曲線對應(yīng)的修飾電極分別為nafion/cile，nafion/pt-3dga/cile，nafion/hrp/cile，nafion/pt-3dga-hrp/cile）

圖5（a）為不同掃速下nafion/pt-3dgr-hrp/cile的循環(huán)伏安圖；（b）為氧化峰電流（ipa）和還原峰電流（ipc）與掃速的關(guān)系曲線；（c）為氧化峰電位（epa）和還原峰電位（epc）與掃速的對數(shù)lnυ之間的關(guān)系；（a-m曲線對應(yīng)的掃速分別為100,150,200,250,300,350,400,450,500,600,700,800,900mv/s）

圖6為nafion/pt-3dgr-hrp/cile在不同ph緩沖溶液的循環(huán)伏安圖；（a-f曲線對應(yīng)的ph為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0）

圖7（a）為nafion/pt-3dgr-hrp/cile在存在不同濃度三氯乙酸下的循環(huán)伏安圖（a-k對應(yīng)三氯乙酸濃度分別為0，1，3，5，7，10，14，20，26，32，40mmol/l）；（b）為nafion/pt-3dgr-hrp/cile電催化還原三氯乙酸的工作曲線

具體實施方式：

下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明內(nèi)容作進(jìn)一步說明。

實施例1鉑-三維石墨烯復(fù)合材料氣凝膠的制備

鉑-三維石墨烯氣凝膠（pt-3dga）合成的方法如下：將20mg的氯鉑酸溶于0.2ml蒸餾水，超聲20min后，與20ml2.0mg/ml的氧化石墨烯水溶液混合，超聲1h后轉(zhuǎn)入50ml的高壓反應(yīng)釜中于180℃加熱12h，室溫冷卻得到圓柱形pt-3dgr水凝膠，用水和乙醇清洗三次后在-87℃冷凍干燥12h，即得pt-3dga。

實施例2鉑-三維石墨烯復(fù)合材料氣凝膠的形貌表征

圖1a和b為pt-3dga在不同放大倍數(shù)下的掃描電子顯微鏡圖（sem），可以看出pt-3dga為三維聯(lián)通的多孔結(jié)構(gòu)，孔徑約為10μm，其表面及內(nèi)部孔洞中均勻分散有pt納米粒子（ptnps）。采用透射掃描電鏡技術(shù)對pt-3dga的表征結(jié)果如圖1c所示，可以清晰的看到石墨烯呈薄片立體狀且有很多褶皺，ptnps大小均勻呈面心立方體，ptnps在石墨烯褶皺處分散相對比較多，說明褶皺促進(jìn)了ptnps的附著。

實施例3鉑-三維石墨烯氣凝膠基酶傳感器件的構(gòu)建

將8.0μl15.0mg/mlhrp和0.2mg/mlpt-3dga混合液滴涂到離子液體碳糊電極（cile）表面，在室溫下晾干后將8.0μl0.5%nafion溶液滴涂到上述修飾電極的表面，在室溫下自然晾干后即可得到所要制備的酶傳感器（nafion/pt-3dga-hrp/cile），放在4°c冰箱保存。

實施例4pt-3dga-hrp復(fù)合物的表征

（1）形貌表征

圖1d為pt-3dga-hrp復(fù)合物在電極表面的sem圖，可以看出hrp-pt-3dga在修飾電極表面仍能保持很好的三維孔洞結(jié)構(gòu)，且hrp均勻的覆蓋于pt-3dga表面及內(nèi)部，形成一層膜，這有利于hrp電化學(xué)活性中心血紅素輔基與納米材料的緊密接觸，增加活性中心與電極之間的電子傳遞的機(jī)率，為實現(xiàn)其直接電化學(xué)提供了條件；

（2）光譜表征

圖2為hrp及pt-3dga-hrp復(fù)合膜的傅立葉變換紅外光譜圖，從圖中可以看出hrp結(jié)構(gòu)中酰胺i和酰胺ii的紅外吸收帶分別為1650cm^-1和1540cm^-1與hrp在pt-3dga-hrp復(fù)合膜中（1651cm^-1和1540cm^-1）的位置相同（圖2a），吸收譜帶的一致性表明hrp在復(fù)合膜沒有發(fā)生構(gòu)象變化；

hrp在pt-3dga-hrp混合溶液中紫外可吸收光譜曲線如圖2b所示。從圖中可以看出，hrp在水中的soret吸收帶在401.0nm；與在pt-3dga-hrp混合溶液中hrp的soret吸收帶處于相同位置，表明hrp在pt-3dga-hrp混合溶液中保持了其原始結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化。

實施例5修飾電極的電化學(xué)性質(zhì)

圖3a為不同修飾電極在10.0mmol/l[fe(cn)6]^3-/4-和0.1mol/lkcl混合溶液中循環(huán)伏安圖。在cile（曲線a）上有一對明顯的準(zhǔn)可逆的氧化還原峰；而在nafion/cile（曲線b）上氧化還原峰電流減小，是由于非導(dǎo)電高分子膜nafion的存在阻礙了電子的傳遞。在nafion/hrp/cile（曲線c）上氧化還原電流相比nafion/cile（曲線b）進(jìn)一步減小，這是由于生物大分子hrp的存在進(jìn)一步阻礙了電極表面的電子傳遞速率。在nafion/pt-3dga-hrp/cile（曲線d）上氧化還原電流明顯增大，這是由于pt-3dga的存在增大了電子轉(zhuǎn)移速率。pt-3dga納米復(fù)合材料具有大的比表面積、高的導(dǎo)電性和電子遷移率等獨特的性質(zhì)，其在電極表面的存在增大了電極的比表面積，加快了鐵氰化鉀的電子轉(zhuǎn)移；

圖3b為不同修飾電極在10.0mmol/l[fe(cn)6]^3-/4-和0.1mol/lkcl混合溶液的電化學(xué)交流阻抗譜圖。在cile上（ret）值為80.8ω（曲線a），涂敷nafion后其ret值增大至120.1ω（曲線b），加入hrp后ret值進(jìn)一步增大至184.4ω（曲線c）。因此nafion和hrp分子在電極表面的存在均阻礙了鐵氰化鉀的電子傳遞速率。在nafion/pt-3dga-hrp/cile的ret值降低33.2ω（曲線d），說明電極表面pt-3dga納米材料的存在可以增大表面積和電導(dǎo)率，降低了界面電阻，加快了[fe(cn)6]^3-/4-的電子轉(zhuǎn)移。

實施例6hrp的直接電化學(xué)行為

不同修飾電極在ph7.0pbs緩沖溶液中的電化學(xué)行為如圖4所示。可以觀察到在nafion/cile（曲線a）和nafion/pt-3dga/cile（曲線b）上沒有明顯的氧化還原峰出現(xiàn)。在nafion/hrp/cile（曲線c）出現(xiàn)一對不對稱氧化還原峰，表明hrp和cile之間存在直接電子轉(zhuǎn)移但速率緩慢，這是由于cile已經(jīng)表現(xiàn)出一定的電導(dǎo)率與較好的生物相容性，適用于蛋白質(zhì)直接轉(zhuǎn)移電子過程。hrp修飾電極表面加入pt-3dga后氧化還原峰電流明顯增加，峰形狀變得更加對稱（曲線d）。從曲線d得到還原峰電位（epc）和氧化峰峰電位（epa）分別為-0.307v和-0.229v，峰電位差（δep）為78mv，式電位（e^0′）為-0.268v（vs.sce），為hrp中血紅素輔基fe(iii)/fe(ii)氧化還原電對的特征峰。電極表面的pt-3dga為三維空洞結(jié)構(gòu)，表面積大，可以負(fù)載更多的hrp，并作為hrp和電極之間的直接電子轉(zhuǎn)移提供良好界面與傳遞的橋梁，進(jìn)而加快電子轉(zhuǎn)移速率。

實施例7掃描速度的影響

掃描速度（υ）對hrp修飾電極的電化學(xué)影響如圖5a所示。在不同的循環(huán)伏安掃描速度下均可以出現(xiàn)一對峰形對稱的氧化還原峰，且氧化還原峰電流基本相等。在掃速從100~900mv/s范圍內(nèi)氧化還原峰電流與掃描速度呈好線性關(guān)系（圖5b），線性回歸方程分別為ipc(μa)=4.87+80.83υ(v/s)(γ=0.997)和ipa(μa)=-1.71-64.19υ(v/s)(γ=0.996)，表明為一個典型的表面控制的薄層電化學(xué)行為，說明在該掃速范圍內(nèi)電極反應(yīng)是吸附控制的過程。根據(jù)方程q=nfaγ*，其中γ*為電活性物質(zhì)的表面濃度，f為法拉第常數(shù)，a為電極面積，q為積分電量，基于此方程γ*值計算為8.97×10^-10mol/cm²，而固定在電極表面的總量計算為2.38×10^-8mol/cm²，因此電極表面有3.77%的hrp分子參加了電極反應(yīng)。隨著掃描速度的增加，氧化還原峰電位峰差也逐漸增加的。如圖5c所示，ep和lnυ之間呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程分別為epc(v)=-0.0437lnυ-0.361(γ=0.993)和epa(v)=0.0398lnυ-0.2046(γ=0.991)。根據(jù)laviron方程可以求出電子傳遞系數(shù)（α）為0.52，反應(yīng)速率常數(shù)（ks）為3.35s^-1。

實施例8ph值的影響

nafion/hrp-pt-3dga/cile在ph3.0到8.0范圍內(nèi)的循環(huán)伏安響應(yīng)如圖6a所示。隨ph值的增加，氧化還原峰電位向負(fù)電位的方向移動，表明有質(zhì)子參與電化學(xué)反應(yīng)過程。當(dāng)緩沖溶液ph大于8時峰形開始變形，而在ph值為7.0時氧化還原峰電流最大且峰形最好，因此本實驗所采用的最適ph值為7.0。式電位（e^0′）和ph值之間具有良好的線性回歸關(guān)系（圖6b），方程為e^0′(v)=-0.0501ph+0.0566(γ=0.993)，斜率值-50.1mv/ph接近理論值-59.0mv/ph。

實施例9nafion/pt-3dga-hrp/cile對三氯乙酸的電催化行為

nafion/pt-3dgr-hrp/cile對三氯乙酸（tca）的電催化行為的循環(huán)伏安曲線如圖7a所示。在ph7.0的pbs中加入tca后，在-0.17v附近出現(xiàn)還原峰，且隨著tca加入量的增大，還原峰電流明顯增大而氧化峰逐漸減小。在tca濃度為0.5mmol/l到40.0mmol/l范圍內(nèi)，催化還原峰電流與tca濃度呈良好的線性關(guān)系（圖7b），線性回歸方程為ip（μa）=1.451c（mmol/l）+0.464（n=17,γ=0.998），檢出限為0.17mmol/l（3σ）。

實施例10nafion/hrp-pt-3dgr/cile的分析應(yīng)用

為驗證nafion/hrp-pt-3dgr/cile對tca的檢測應(yīng)用，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對tca藥物溶液（35%）中tca的含量進(jìn)行測定。取0.3ml35%tca用ph7.0pbs稀釋至10ml作為樣品，采用實驗方法進(jìn)行測定，結(jié)果如表1所示，回收率在96.40%~101.75%范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（rsd）小于3%，表明該傳感器件可用于tca的含量分析，在tca實際樣品檢測中具有良好的應(yīng)用前景；

表135%tca藥物溶液中tca的檢測結(jié)果（n=3）

實施例11nafion/pt-3dgr-hrp/cile的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

考察了nafion/pt-3dgr-hrp/cile在ph7.0的pbs緩沖溶液中的循環(huán)伏安曲線，持續(xù)掃描50圈后，峰電流依然能保持起始峰電流的98.54%，持續(xù)掃描200圈后，峰電流與原來相比降低了8.4%，這說明nafion/pt-3dgr-hrp/cile在pbs中的穩(wěn)定性較好。修飾電極在4oc冰箱中存放兩周之后的峰電流能保持起始值的95.28%；存放30天后峰電流仍可保持起始值的87.52%。平行制備5根相同的nafion/pt-3dgr-hrp/cile對重現(xiàn)性進(jìn)行了研究，修飾電極對20.0mmol/l的tca進(jìn)行測定，結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（rsd）為2.35%，表明修飾電極nafion/pt-3dgr-hrp/cile具有較好的制備重現(xiàn)性。