本發(fā)明屬于農(nóng)藥殘留領(lǐng)域的檢測(cè)方法，具體涉及一種同時(shí)測(cè)定石斛鮮條中有機(jī)氯類(lèi)和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留的方法。

背景技術(shù)：

石斛味甘、性微寒，具有益胃生津、滋陰清熱的功效，作為名貴的中藥材和保健品，越來(lái)越受到消費(fèi)者的青睞和追捧。為了增加產(chǎn)量，農(nóng)藥已廣泛應(yīng)用于石斛生產(chǎn)中，有機(jī)氯類(lèi)和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥因廣譜、高效、價(jià)廉而被廣泛使用。但這兩類(lèi)農(nóng)藥對(duì)人體神經(jīng)中樞和消化系統(tǒng)毒害較大，并且會(huì)在人體肝臟中蓄積，長(zhǎng)期過(guò)量使用后對(duì)人體健康危害較大，因此，對(duì)石斛中有機(jī)氯類(lèi)和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測(cè)并有效控制具有十分重要的意義。

針對(duì)農(nóng)藥殘留，歐盟、美國(guó)、日本等國(guó)家都制定了嚴(yán)格的農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)主要施行GB 2763《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》標(biāo)準(zhǔn)，目前也有一些嚴(yán)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的石斛地方標(biāo)準(zhǔn)限量發(fā)布實(shí)施，如：DB53/T 683《地理標(biāo)志產(chǎn)品 芒市石斛》、DB53/T 589《地理標(biāo)志產(chǎn)品 龍陵紫皮石斛》、DB34/T 486《霍山石斛》等，這就意味著對(duì)石斛產(chǎn)品的質(zhì)量安全指標(biāo)要求更高、更嚴(yán)。

查閱相關(guān)文獻(xiàn)，目前對(duì)石斛鮮條農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法還沒(méi)有系統(tǒng)的研究報(bào)道。現(xiàn)有的研究主要集中在對(duì)茶葉、中草藥、保健食品等方面。閻正、封棣等采用固相萃取-毛細(xì)管氣相色譜法開(kāi)展了中草藥中13種有機(jī)氯農(nóng)藥的殘留量的研究；訾偉旗，杜斌采用毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定了中藥材中擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥等，這些方法均采用石油醚、丙酮或其兩者的混合溶劑來(lái)進(jìn)行農(nóng)殘的提取，對(duì)于干燥和顏色淺的物質(zhì)來(lái)說(shuō)，這種方法還是可行有效，但對(duì)于水分和多糖含量高、粘度大及顏色深的石斛鮮條來(lái)說(shuō)，這種方法不能很好的把殘留在其上面的農(nóng)藥充分提取出來(lái)。

為了解決以上問(wèn)題，本發(fā)明的目的是建立一種同時(shí)測(cè)定石斛鮮條中有機(jī)氯類(lèi)和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留的方法。經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)確證，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速、實(shí)用，各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)滿足檢測(cè)要求，能夠很好的應(yīng)用于石斛鮮條農(nóng)藥殘留的測(cè)定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種測(cè)定石斛鮮條中有機(jī)氯和擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥殘留的方法，目的是解決目前石斛鮮條農(nóng)殘測(cè)定前處理繁瑣、種類(lèi)單一、操作復(fù)雜、結(jié)果不準(zhǔn)確等問(wèn)題。石斛鮮條經(jīng)切碎、乙腈提取、Florisil 固相萃取柱凈化后，采用氣相色譜ECD檢測(cè)檢測(cè)，外標(biāo)法定量。該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確，能夠滿足石斛鮮條中有機(jī)氯類(lèi)和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留的定性和定量分析。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，通過(guò)大量研究，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：

一種同時(shí)測(cè)定石斛鮮條中有機(jī)氯類(lèi)和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留的方法，該檢測(cè)方法由兩部分組成：

第一部分是標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。即用已知濃度的有機(jī)氯類(lèi)和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥進(jìn)氣相色譜儀檢測(cè)分析，以溶液質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)（x），峰面積（A）為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行定量分析。具體實(shí)施步驟為：

1、依次吸取濃度均為100 ug/ml的六六六和滴滴涕混標(biāo)、三氯殺螨醇、聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯菊酯、高效氯氰菊酯、氯氰菊酯、順式氰戊菊酯、氟氰戊菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液各500μl于50 ml棕色容量瓶中，用色譜純的正己烷定容至刻度，配制成濃度為1.0μg/ml的有機(jī)氯類(lèi)和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

2、用吸量管吸取步驟1中的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用正己烷逐級(jí)稀釋?zhuān)渲瞥蓾舛葹?.008μg/ml、0.02μg/ml、0.08μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

3、色譜條件設(shè)置：色譜柱：30 m×0.32mm×0.25μm的 HP-5毛細(xì)管色譜柱；進(jìn)樣口溫度：200℃；ECD檢測(cè)器溫度：320℃；升溫程序：150℃，保持2min，以6℃/min升至250℃，保持4 min，以1℃/min升至270℃，保持3 min；進(jìn)樣量：1μl，分流比10：1。

4、按照步驟3所述色譜條件，準(zhǔn)確吸取1.0μl 步驟2所述有機(jī)氯類(lèi)和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，以各農(nóng)藥組分的色譜峰保留時(shí)間定性，以溶液質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)（x），峰面積（A）為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

第二部分是石斛鮮條中有機(jī)氯類(lèi)和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留的提取和檢測(cè)

1、石斛鮮條農(nóng)殘的提取：將石斛鮮條切碎成長(zhǎng)度不超過(guò)2mm的小塊狀，制成試樣。稱(chēng)取10.0 g置于100ml具塞比色管中，加入50 ml乙腈，蓋緊塞子，超聲提取30分鐘，迅速用濾紙將濾液過(guò)濾到50ml具塞量筒中，收集濾液40ml，加入5g氯化鈉，蓋上塞子，激烈震蕩1分鐘，靜置，使乙腈和水相分層，然后吸取10.0ml乙腈溶液于10ml比色管中，在氮吹儀上通氮?dú)庹舭l(fā)近干，加入2.0ml正己烷，超聲溶解，待凈化。

2、試樣的凈化：取規(guī)格為500mg、6ml的Florisil固相萃取柱一支，裝入1g碳粉，用5.0ml丙酮與正己烷體積比1:4的混合溶液淋洗，再用5.0ml正己烷淋洗，當(dāng)溶劑液面到達(dá)柱吸附層表面時(shí)，立即倒入步驟（1）所得的樣品溶液，用10ml比色管接收洗脫液，用5ml丙酮與正己烷體積比1:4的混合溶液清洗樣品管，洗液倒入固相萃取柱上，重復(fù)一次；待固相萃取柱上的洗液滴干時(shí)將盛有淋洗液的比色管置于氮吹儀上，在水浴溫度50℃下，氮吹濃縮至1~2 ml，最后用正已烷準(zhǔn)確定容至5.0ml，旋渦混合器上混勻，用0.22μm的濾膜過(guò)濾后供氣相色譜檢測(cè)。

3、測(cè)定：待儀器穩(wěn)定后，按照第一部分3所述色譜操作條件，準(zhǔn)確吸取1.0μl步驟2所述試樣凈化液注入色譜儀中，以色譜峰保留時(shí)間定性，峰面積代入第一部分步驟4中相應(yīng)的校準(zhǔn)曲線，計(jì)算含量。

4、計(jì)算公式：

W：樣品中某種農(nóng)藥殘留含量，單位：mg/kg；

C：待測(cè)試樣中某種農(nóng)藥濃度，單位：ug/ml，

m：稱(chēng)取樣品質(zhì)量，單位：g。

測(cè)定石斛鮮條中有機(jī)氯類(lèi)和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留的色譜條件與第一部分步驟（3）中的條件相同。

5、方法驗(yàn)證

（1）線性范圍：測(cè)定結(jié)果表明，在上述色譜分離條件下，18種有機(jī)氯類(lèi)和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥得到很好的分離，在0.008～0.4μg/ml濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)均大于0.996，可以作為定量分析的依據(jù)，詳見(jiàn)表1。

（2）方法的檢出限、精密度和加標(biāo)回收率

取不含農(nóng)藥的石斛樣品，精確添加0.05mg/kg和0.5mg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按3的步驟處理，在同一分析條件下重復(fù)測(cè)定5次，獲得的色譜圖按信噪比3倍（S/N=3）條件計(jì)算方法的檢出限，結(jié)果：18種農(nóng)殘的回收率在75.3%~109.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.9%~8.6%之間，檢出限在0.001mg/kg~0.01mg/kg之間（見(jiàn)表2），符合石斛鮮條多農(nóng)藥殘留分析的相關(guān)技術(shù)要求。

表2 18種農(nóng)藥精密度和回收率試驗(yàn)結(jié)果

6、上述方案中有關(guān)內(nèi)容解釋

（1）所用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)六六六和滴滴涕混標(biāo)、三氯殺螨醇、聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯菊酯、高效氯氰菊酯、氯氰菊酯、順式氰戊菊酯、氟氰戊菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯均購(gòu)于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所，濃度均為100 ug/ml。

（2）所用試劑乙腈、丙酮、正己烷均為色譜純，購(gòu)于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，氯化鈉為分析純購(gòu)于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

（3）所用材料500mg/6ml的弗羅里硅土florisil固相萃取柱購(gòu)于美國(guó)安捷倫科技有限公司，石斛鮮條由本地石斛協(xié)會(huì)提供。

（4）所用儀器設(shè)備：配有ECD電子捕獲檢測(cè)器的GC-2010Plus氣相色譜儀購(gòu)于日本島津公司，MTN-2800W氮吹濃縮裝置購(gòu)于天津奧特賽恩斯儀器有限公司，KYT-JT-B均質(zhì)器購(gòu)于北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

（5）對(duì)于含2個(gè)及2個(gè)以上異構(gòu)體的農(nóng)藥，以各異構(gòu)體的峰面積之和計(jì)算該農(nóng)藥的測(cè)定值。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果

雖然液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀具有較高的準(zhǔn)確性和較低的檢出限，在農(nóng)殘檢測(cè)領(lǐng)域已有廣泛運(yùn)用，但是其價(jià)格昂貴、操作要求高，而氣相色譜儀相對(duì)其價(jià)格適中、操作簡(jiǎn)便，作為實(shí)驗(yàn)室農(nóng)殘檢測(cè)常用儀器，目前許多縣級(jí)檢測(cè)部門(mén)都有配置。

本發(fā)明提出的石斛鮮條中有機(jī)氯類(lèi)和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留的測(cè)定方法，在上述條件下各農(nóng)藥組分間分離效果好、經(jīng)加標(biāo)回收和精密度計(jì)算，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，各項(xiàng)指標(biāo)均滿足農(nóng)藥多殘留分析的要求，能夠很好的運(yùn)用于石斛鮮條中多組分有機(jī)氯類(lèi)和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留的定性、定量分析。

與現(xiàn)行許多國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法相比，本發(fā)明前處理操作簡(jiǎn)單，提取效率高，凈化過(guò)程使用的洗脫劑少，對(duì)環(huán)境污染小，農(nóng)藥損失率低，實(shí)用性強(qiáng)，具有很好的推廣使用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施實(shí)例中18種有機(jī)氯類(lèi)和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖；

圖中，濃度均為0.2ug/ml，編號(hào)依次為：1為α-六六六；2為β-六六六；3為γ-六六六；4為δ-六六六；5為三氯殺螨醇；6為p，p'-DDE ；7為p，p'-DDD；8為o，p'-DDT；9為p，p'-DDT；10為聯(lián)苯菊酯；11為甲氰菊酯；12、13為氯菊酯；.14、15、16為高效氯氰菊酯；17、18為氯氰菊酯；19、20為順式氰戊菊酯；21為氟氰戊菊酯；22、23為氰戊菊酯；24為溴氰菊酯。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明不僅僅局限于以下實(shí)施實(shí)例。

所述方法由兩部分組成，第一部分是建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：

依次吸取濃度均為100 ug/ml的六六六和滴滴涕混標(biāo)、三氯殺螨醇、聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯菊酯、高效氯氰菊酯、氯氰菊酯、順式氰戊菊酯、氟氰戊菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液各500μl于50 ml棕色容量瓶中，用色譜純的正己烷定容至刻度，配制成濃度為1.0μg/ml的有機(jī)氯類(lèi)和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，放于2-4℃的冰箱中備用。用吸量管吸取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用正己烷逐級(jí)稀釋?zhuān)渲瞥蓾舛葹?.008μg/ml、0.02μg/ml、0.08μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（現(xiàn)用現(xiàn)配）。在下述色譜條件下，色譜柱：30 m×0.32mm×0.25μm的 HP-5毛細(xì)管色譜柱；進(jìn)樣口溫度：200℃；ECD檢測(cè)器溫度：320℃；升溫程序：150℃，保持2min，以6℃/min升至250℃，保持4 min，以1℃/min升至270℃，保持3 min；進(jìn)樣量：1μl，分流比10：1，載氣為高純氮?dú)?。?zhǔn)確吸取1.0μl 農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)氣相色譜分析檢測(cè)，以溶液質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)（x），峰面積（A）為縱坐標(biāo)（y）繪制各農(nóng)藥組分標(biāo)準(zhǔn)曲線。

第二部分石斛鮮條中有機(jī)氯類(lèi)和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)殘的提取和檢測(cè)：

稱(chēng)取切碎長(zhǎng)度不超過(guò)2mm的石斛鮮條10.0 g于100ml具塞比色管中，加入50 ml乙腈，蓋緊塞子，超聲提取30分鐘，迅速用濾紙將濾液過(guò)濾到50ml具塞量筒中，收集濾液40ml，加入5g氯化鈉，蓋上塞子，激烈震蕩1分鐘，靜置，使乙腈和水相分層，然后吸取10.0ml乙腈溶液于10ml比色管中，在氮吹儀上通氮?dú)庹舭l(fā)近干，加入2.0ml正己烷，超聲溶解，將溶解液倒入事先用5.0ml丙酮與正己烷體積比為1:4的混合溶液淋洗，再用5.0ml正己烷淋洗過(guò)的Florisil固相萃取柱上，下面用10ml比色管接收洗脫液，當(dāng)樣液快到達(dá)柱吸附層表面時(shí)，用5ml丙酮與正己烷體積比1:4的混合溶液清洗樣品管，洗液倒入固相萃取柱上，重復(fù)一次；待固相萃取柱上的洗液滴干時(shí)將盛有淋洗液的比色管置于氮吹儀上，在水浴溫度50℃下，氮吹濃縮至1~2 ml，用正已烷準(zhǔn)確定容至5.0ml，旋渦混合器上混勻，用0.22μm的濾膜過(guò)濾后制成待測(cè)樣。

在上述色譜條件下，準(zhǔn)確吸取1.0μl待測(cè)液注入氣相色譜儀分析，得到樣品色譜圖，通過(guò)保留時(shí)間定性后，將峰面積代入第一部分相應(yīng)農(nóng)藥校準(zhǔn)曲線，計(jì)算出農(nóng)藥濃度值（對(duì)于含2個(gè)及2個(gè)以上異構(gòu)體的農(nóng)藥，以各異構(gòu)體的峰面積之和計(jì)算該農(nóng)藥的測(cè)定值），再將濃度值代入定量計(jì)算公式，求出石斛鮮條農(nóng)殘含量。

計(jì)算公式：

W：樣品中某種農(nóng)藥殘留含量（單位：mg/kg）；C：待測(cè)試樣中某種農(nóng)藥濃度（單位：ug/ml）；m：稱(chēng)取樣品質(zhì)量（單位：g）。

5、方法驗(yàn)證

（1）線性范圍：測(cè)定結(jié)果表明，在上述色譜分離條件下，18種農(nóng)藥得到很好的分離，在0.008～0.4μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)均大于0.996，可以作為定量分析的依據(jù)，詳見(jiàn)表1。

表1 18種農(nóng)藥保留時(shí)間、回歸方程和相關(guān)系數(shù)

（2）方法的檢出限、精密度和加標(biāo)回收率

取不含農(nóng)藥的石斛樣品，精確添加0.05mg/kg和0.5mg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按3的步驟處理，在同一分析條件下重復(fù)測(cè)定5次，獲得的色譜圖按信噪比3倍（S/N=3）條件計(jì)算方法的檢出限，結(jié)果：18種農(nóng)殘的回收率在75.3%~109.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.9%~8.6%之間，檢出限在0.001mg/kg~0.01mg/kg之間（見(jiàn)表2），符合石斛鮮條多農(nóng)藥殘留分析的相關(guān)技術(shù)要求。

表2 18種農(nóng)藥精密度和回收率試驗(yàn)結(jié)果

上述實(shí)施實(shí)例中所用農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度均為100 ug/ml，購(gòu)于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所；所用試劑色譜純乙腈、色譜純丙酮、色譜純正己烷購(gòu)于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，分析純氯化鈉購(gòu)于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，所用材料500mg/6ml的 florisil固相萃取柱購(gòu)于美國(guó)安捷倫科技有限公司；石斛鮮條由當(dāng)?shù)厥鷧f(xié)會(huì)提供；所用儀器設(shè)備配有ECD電子捕獲檢測(cè)器的GC-2010Plus氣相色譜儀購(gòu)于日本島津公司，MTN-2800W氮吹濃縮裝置購(gòu)于天津奧特賽恩斯儀器有限公司，KYT-JT-B均質(zhì)器購(gòu)于北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司。