本發(fā)明屬于微加工及生物檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種細(xì)胞釋放物的探測(cè)器及其探測(cè)方法。

背景技術(shù)：

生物傳感器具有靈敏度高，選擇性好，便攜操作性強(qiáng)，成本低，簡(jiǎn)單，快捷等優(yōu)點(diǎn)。隨著生活水平不斷提高，人們對(duì)健康的追求越來(lái)越高，開(kāi)發(fā)新型檢測(cè)裝置成為熱點(diǎn)。微陣列傳感器具有高通量、高選擇性、高靈敏度，微型化，智能化、集成化，低成本，高穩(wěn)定，高壽命等優(yōu)點(diǎn)。

傳統(tǒng)的微電極陣列主要以金屬、玻璃、硅等剛性材料為基底，通過(guò)沉積、光刻、腐蝕等微加工手段在其上形成屏幕或者三維結(jié)構(gòu)的微電極陣列。這些微電極雖然在空間分辨率、耐腐蝕性、靈敏度等方面具有各自的優(yōu)勢(shì)，但是由于幾乎不具有形變能力，在柔軟度匹配、共形貼附、以及動(dòng)態(tài)形變匹配等方面很難滿足植入式要求，因此正在逐步被柔性微電極陣列技術(shù)所取代。

基于可穿戴設(shè)備的研究，具有靶組織接觸良好，減免機(jī)械損傷，降低免疫排斥反應(yīng)的柔性微陣列傳感器，是當(dāng)今電子、機(jī)械、儀器和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，直接關(guān)系到機(jī)器人、醫(yī)療設(shè)備、可穿戴設(shè)備等載體的智能化和多功能化。

石墨烯良好的生物相容性、優(yōu)異的導(dǎo)電性和機(jī)械性能，以及良好的電化學(xué)活性，使其在柔性生物傳感應(yīng)用方面展現(xiàn)出極大的優(yōu)勢(shì)?；谑└呷犴g性和機(jī)械強(qiáng)度，制備的石墨烯柔性電極，可以使電極與靶組織良好接觸，減少電極和生物組織之間的機(jī)械強(qiáng)度的不匹配，可以減少臨床應(yīng)用中產(chǎn)生的機(jī)械損傷和免疫反應(yīng)。此外，在神經(jīng)組織工程中，具有較高電子傳導(dǎo)速率的石墨烯還可以作為細(xì)胞的刺激電極，在沒(méi)有太多的化學(xué)反應(yīng)下，加強(qiáng)與分化神經(jīng)元的電耦合，這使得石墨烯與活細(xì)胞的界面研究成為未來(lái)神經(jīng)假體裝置研發(fā)的熱點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種細(xì)胞釋放物的探測(cè)器及其探測(cè)方法。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：包括柔性基底，所述柔性基底的曲率值為0.18，還包括負(fù)載于柔性基底內(nèi)凹面的石墨烯膜，所述石墨烯膜由go基底和嵌于go基底中的rgo陣列組成，所述rgo陣列由直徑為20μm圓柱狀的rgo單元構(gòu)成，相鄰兩個(gè)單元的間距為60μm(兩個(gè)臨邊之間的距離)。

進(jìn)一步地，所述石墨烯膜通過(guò)以下方法負(fù)載于柔性基底上：

(1)以柔性ito/pet為基底，控制三次旋涂的轉(zhuǎn)速和時(shí)間分別為1000rpm，8000rpm，1000rpm以及5s，10s，5s，旋涂正性光刻膠，然后在60℃烘膠臺(tái)上烘15min，用直徑為20μm，間隔60μm的掩膜曝光20s，后烘10min，顯影液中顯影8s。

(2)在步驟1處理后的基底上繼續(xù)旋涂4mg/ml的氧化石墨烯溶液6次，每次旋涂go過(guò)程為800rpm，5s；3000rpm，30s；1000rpm，5s。使得go浸潤(rùn)到光刻膠凹槽內(nèi)部，旋涂均勻，得到附著go的柔性ito/pet基底。

(3)使用電化學(xué)工作站三電極系統(tǒng)還原附著基底表面的go，恒電位-0.9v，還原溶液體系為0.2mpbs(ph7.4)，還原50s。

(4)最后，將電化學(xué)還原得到的附著有rgo/go微電極陣列的柔性ito/pet基底放在丙酮溶液中沖洗，將光刻膠洗掉，上面的go薄膜落到柔性ito/pet基底，即得到圖案化rgo/go微電極陣列。

一種探測(cè)器檢測(cè)細(xì)胞釋放雙氧水的方法，使得細(xì)胞貼附于石墨烯膜上；然后進(jìn)行循環(huán)伏安特性的測(cè)定，電解液為2.5mmk3fe(cn)6和0.1mkcl的水溶液。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：實(shí)現(xiàn)了不同曲率柔性基底go/rgo陣列的電化學(xué)性能的研究，和傳統(tǒng)的負(fù)載酶和納米催化劑的情況下對(duì)雙氧水的低濃度檢測(cè)相比，顯示了較高的靈敏度，具有很好的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為go/rgo微陣列電極片的制備流程圖；

圖2為石墨烯微陣列的形貌結(jié)構(gòu)；

圖3為不同曲率的伏安特性曲線；

圖4為k<0細(xì)胞對(duì)雙氧水的檢測(cè)曲線；

圖5為內(nèi)凹面和外凸面示意圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了提供一種基于柔性基底go/rgo陣列電極的彎曲曲率對(duì)細(xì)胞釋放物的探測(cè)器的制備方法。包括以下內(nèi)容：

柔性基底上rgo/go微陣列的制備：以柔性ito/pet為基底，控制三次旋涂的轉(zhuǎn)速和時(shí)間分別為1000rpm，8000rpm，1000rpm以及5s，10s，5s，旋涂正性光刻膠，然后在60℃烘膠臺(tái)上烘15min，紫外光刻機(jī)掩膜曝光20s，后烘10min，顯影液中顯影8s，得到光刻膠微陣列。接著，在步驟1得到的光刻膠微陣列的基底上繼續(xù)旋涂4mg/ml的氧化石墨烯溶液6次，每次旋涂go的轉(zhuǎn)速和時(shí)間分別為800rpm，3000rpm，1000rpm以及5s，30s，5s。每次旋涂都將go在光刻膠表面輕輕吹打，使得go浸潤(rùn)到光刻膠凹槽內(nèi)部，旋涂均勻，得到附著go的柔性ito/pet基底。使用電化學(xué)工作站三電極系統(tǒng)還原附著基底表面的go，恒電位-1v，還原溶液體系為0.2mpbs(ph7.4)，還原50s。最后，將電化學(xué)還原得到的附著有rgo/go微電極陣列的柔性ito/pet基底放在丙酮溶液中沖洗，將光刻膠洗掉，上面的go薄膜落到柔性ito/pet基底，即得到圖案化rgo/go微電極陣列。

將電極片置于十二孔板內(nèi)，石墨烯膜所在的活性面朝上，滅菌后，放置到十二孔板內(nèi)，依次用pbs，dmem清洗，然后使用10％含血清培養(yǎng)液37℃孵化30min，最后接種細(xì)胞，接種密度約6000個(gè)/ml，37℃，5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

取電極片兩片進(jìn)行彎曲，彎曲呈曲率0.18，一片的活性面(貼附有細(xì)胞的石墨烯面)位于內(nèi)凹面，另一片位于外凸面。使用藥物pma(15μl0.5μg/l)刺激兩個(gè)微電極的表面細(xì)胞，通過(guò)觀察電流的變化，實(shí)現(xiàn)go/rgo電極對(duì)細(xì)胞釋放物的檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相同刺激條件下，內(nèi)凹面細(xì)胞負(fù)載具有更高的靈敏度，推測(cè)其原因，內(nèi)凹面更傾向于形成三維環(huán)繞，增加接收電信號(hào)的能力。

將負(fù)載有細(xì)胞的電極片彎曲，使得石墨烯膜位于電極片的內(nèi)凹面，曲率分別為0.06、0.08、0.10、0.12、0.18、0.25。分別進(jìn)行電極的循環(huán)伏安特性的測(cè)定，電解質(zhì)為2.5mmk3fe(cn)6和0.1mkcl的混合溶液。圖3為不同曲率的伏安特性曲線。

將負(fù)載有細(xì)胞的電極片彎曲，使得石墨烯膜位于電極片的內(nèi)凹面，曲率分別為0.06、0.1、0.18、0.25，進(jìn)行釋放物檢測(cè)：使用藥物pma(15μl0.5μg/l)刺激不同曲率的微電極表面細(xì)胞，通過(guò)觀察電流的變化，實(shí)現(xiàn)go/rgo電極對(duì)細(xì)胞釋放物的檢測(cè)。測(cè)定結(jié)果表明，k<0.18情況下，曲率增大效果增強(qiáng)，當(dāng)k>0.18時(shí)，檢測(cè)效果減弱。分析其中原因，在彎曲情況下，電極表面電場(chǎng)分部發(fā)生變化，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果差異；圖4為曲率值k為0.06、0.1、0.18、0.25情況下細(xì)胞對(duì)雙氧水的檢測(cè)曲線，檢測(cè)限降低，靈敏度增加，而當(dāng)k>0.18時(shí)，隨著曲率值的增大，靈敏度降低。

上述實(shí)例用來(lái)解釋說(shuō)明本發(fā)明，然而并非限定本發(fā)明。在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。