本發(fā)明公開了一種基于量子點(diǎn)均相免疫檢測cea的方法，屬于納米免疫分析技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fret）是指在兩個不同的熒光基團(tuán)中，若一個熒光基團(tuán)（供體donor）的發(fā)射光譜與另一個基團(tuán)（受體acceptor）的吸收光譜有一定的重疊，兩個熒光基團(tuán)間的距離合適時（一般小于10nm），即可觀察到熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。

量子點(diǎn)（qds）是直徑約為2~20nm，能夠接受激發(fā)光產(chǎn)生熒光的半導(dǎo)體納米顆粒。傳統(tǒng)的fret研究的主要集中于有機(jī)熒光分子數(shù)，作為一種新型fret試劑，qds具有許多有機(jī)熒光分子不具備的優(yōu)點(diǎn)，如有可調(diào)諧的激發(fā)波、抗漂白性、多個染料分子同時連接、狹窄的發(fā)射波長和遠(yuǎn)離發(fā)射峰激發(fā)等優(yōu)良的光學(xué)性質(zhì)。因此，qds可以成為比有機(jī)熒光分子更好的fret的供體或受體。

熒光能量轉(zhuǎn)移體系發(fā)光強(qiáng)度大，靈敏度高，方法簡單。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于量子點(diǎn)均相免疫檢測cea的方法，利用熒光配對染料之間熒光共振能量轉(zhuǎn)移快速均相檢測廣譜腫瘤標(biāo)記物cea。該方法可以在均相中實現(xiàn)對cea的檢測，且對cea的檢測具有靈敏度高和選擇性好的特點(diǎn)。

本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種基于量子點(diǎn)均相免疫檢測cea的方法，包括以下步驟：

一、探針1和探針2的制備；

a、cds的制備

在合成過程保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)的體系中，將0.1mol/l的cdcl2溶液2~8ml注入到100ml去離子水中，加入0.2~2.0mmol的巰基乙酸作為修飾劑，2~5min后用1mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系ph值至9~11，溶液體系呈無色透明，隨后加入0.5~4ml濃度為0.1mol/l的na2s水溶液，即得cds量子點(diǎn)（其激發(fā)波長364nm，發(fā)射波長530nm）。

b、取cds量子點(diǎn)分別用0.05m的mes緩沖溶液稀釋后，加入edc和nhs（qds:edc的摩爾比為1:50～1:200；edc:nhs的摩爾比為1:1～1:5），渦旋振蕩均勻，室溫活化15～60min；將活化的量子點(diǎn)用30kd超濾管在8000r/min，4℃條件下離心10min，超濾純化后，加入pbs7.4稀釋，加入相對應(yīng)單克隆cea抗體溶液（qds和抗體的摩爾比為1:1～10:1），4℃反應(yīng)過夜，即得探針1。

c、取熒光物質(zhì)（羅丹明b或紅色熒光微球）分別用0.05m的mes緩沖溶液稀釋后，加入edc和nhs（熒光物質(zhì):edc的質(zhì)量比為1:50～1:200；edc:nhs的摩爾比為1:1～1:5），渦旋振蕩均勻，室溫活化15～60min；將活化的熒光物質(zhì)用30kd超濾管在8000r/min，4℃條件下離心10min，超濾純化后，加入pbs7.4稀釋，加入相對應(yīng)單克隆cea抗體溶液（熒光物質(zhì)和抗體的質(zhì)量比為100:1～10:1），4℃反應(yīng)過夜，即得探針2。

其中，羅丹明激發(fā)波長525~550nm，發(fā)射波長580nm；紅色熒光微球激發(fā)波長520~535nm，發(fā)射波長600nm。羅丹明b購于sigma；紅色熒光微球購于蘇州為度生物。

二、探針1-cea-探針2熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系制備

探針1-cea-探針2熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系為：

樣本（標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本）2μl

0.05mg/ml探針120μl

0.05mg/ml探針210μl

pbs7.4緩沖液50μl

ddh2o補(bǔ)足至100μl。

三、cea工作曲線

先將濃度為0.05~20ng/ml的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品樣本分別與探針1、pbs緩沖液接觸混勻后，分別加入探針2，超純水定容到100μl。然后常溫旋轉(zhuǎn)30~60min后，將該體系置于多功能酶標(biāo)儀上檢測熒光強(qiáng)度。記錄混合液在探針2最大發(fā)射波長（580nm或600nm處）的熒光強(qiáng)度，存在cea時f，不存在cea時f0，以（f-f0）對cea濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

通過探針1-cea-探針2熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系檢測待測樣本的熒光信號，將待測樣品的熒光信號值代入cea標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出待測樣品中cea的含量。

該方法操作簡單，不需要對雜交體系中未連接的抗體進(jìn)行分離，實現(xiàn)均相檢測；由于羅丹明b、紅色熒光微球在364nm光激發(fā)下不會直接產(chǎn)生熒光信號，因此背景干擾小，信號強(qiáng)。該方法還具有特異、快速、高選擇性和高通量的特點(diǎn)，可用于臨床醫(yī)學(xué)中腫瘤的廣譜篩查。

附圖說明

圖1為不同體系的cea（0,0.05,0.1,0.5,1,5,10,15,20）對fret體系熒光強(qiáng)度的影響(量子點(diǎn)-羅丹明b配對熒光染料)。

圖2為cea的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，以（f-f0）與cea的濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖3為不同體系的cea（0,0.05,0.1,0.5,1,5,10,20,30）對fret體系熒光強(qiáng)度的影響(量子點(diǎn)-紅色熒光微球配對熒光染料)。

圖4為cea的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，以（f-f0）與cea的濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例用以對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明不限于此。

實施例1均相檢測cea的免疫熒光法

以cds和rhb為配對染料，分別標(biāo)記cea配對抗體，制備探針1和探針2，用于cea檢測。

一種基于量子點(diǎn)均相免疫檢測cea的方法，包括以下步驟：

一、探針1和探針2的制備

a、cds的制備

在合成過程保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)的體系中，將0.1mol/l的cdcl2溶液5ml注入到100ml去離子水中，加入1.0mmol的巰基乙酸作為修飾劑，2~5min后用1mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系ph值至9~11，溶液體系呈無色透明，隨后加入1ml濃度為0.1mol/l的na2s水溶液，即得cds量子點(diǎn)（其激發(fā)波長364nm，發(fā)射波長530nm）。

b、取cds量子點(diǎn)分別用0.05m的mes緩沖溶液稀釋后，加入edc和nhs（qds:edc的摩爾比為1:50；edc:nhs的摩爾比為1:2.5），渦旋振蕩均勻，室溫活化20min；將活化的量子點(diǎn)用30kd超濾管在8000r/min，4℃條件下離心10min，超濾純化后，加入pbs7.4稀釋，加入相對應(yīng)單克隆cea抗體溶液（qds和抗體的摩爾比為4:1），4℃反應(yīng)過夜，即得探針1。

c、取羅丹明b分別用0.05m的mes緩沖溶液稀釋后，加入edc和nhs（羅丹明b:edc的質(zhì)量比為1:50；edc:nhs的摩爾比為1:2.5），渦旋振蕩均勻，室溫活化20min；將活化的熒光物質(zhì)用30kd超濾管在8000r/min，4℃條件下離心10min，超濾純化后，加入pbs7.4稀釋，加入相對應(yīng)單克隆cea抗體溶液（熒光物質(zhì)和抗體的質(zhì)量比為10:1），4℃反應(yīng)過夜，即得探針2。

其中，羅丹明激發(fā)波長525~550nm，發(fā)射波長580nm。

二、cea標(biāo)準(zhǔn)曲線

先將濃度為0.05~20ng/ml的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品樣本各2μl分別與20μl濃度為0.05mg/ml探針1、50μlpbs7.4緩沖液接觸混勻后，分別加入10μl濃度為0.05mg/ml探針2，超純水定容到100μl，然后常溫旋轉(zhuǎn)30~60min后，最后將該體系置于多功能酶標(biāo)儀上檢測熒光強(qiáng)度。記錄混合液在探針2最大發(fā)射波長（580nm或600nm處）的熒光強(qiáng)度，存在cea時f，不存在cea時f0，以f-f0對cea濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖3、圖4）。

通過探針1-cea-探針2熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系檢測待測樣本的熒光信號，將待測樣品的熒光信號值代入cea標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出待測樣品中cea的含量。

實施例2均相檢測cea的免疫熒光法

以cds和紅色熒光微球為配對染料，分別標(biāo)記cea配對抗體，制備探針1和探針2，用于cea檢測。

一種基于量子點(diǎn)均相免疫檢測cea的方法，包括以下步驟：

一、探針1和探針2的制備

a、cds的制備

在合成過程保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)的體系中，將0.1mol/l的cdcl2溶液5ml注入到100ml去離子水中，加入1.0mmol的巰基乙酸作為修飾劑，2~5min后用1mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系ph值至9~11，溶液體系呈無色透明，隨后加入1ml濃度為0.1mol/l的na2s水溶液，即得cds量子點(diǎn)（其激發(fā)波長364nm，發(fā)射波長530nm）。

b、取cds量子點(diǎn)分別用0.05m的mes緩沖溶液稀釋后，加入edc和nhs（qds:edc的摩爾比為1:50；edc:nhs的摩爾比為1:2.5），渦旋振蕩均勻，室溫活化20min；將活化的量子點(diǎn)用30kd超濾管在8000r/min，4℃條件下離心10min，超濾純化后，加入pbs7.4稀釋，加入相對應(yīng)單克隆cea抗體溶液（qds和抗體的摩爾比為4:1），4℃反應(yīng)過夜，即得探針1。

c、取紅色熒光微球分別用0.05m的mes緩沖溶液稀釋后，加入edc和nhs（紅色熒光微球:edc的質(zhì)量比為1:50～1:200；edc:nhs的摩爾比為1:1～1:5），渦旋振蕩均勻，室溫活化15～60min；將活化的紅色熒光微球用30kd超濾管在8000r/min，4℃條件下離心10min，超濾純化后，加入pbs7.4稀釋，加入相對應(yīng)單克隆cea抗體溶液（紅色熒光微球和抗體的質(zhì)量比為10:1），4℃反應(yīng)過夜，即得探針2。

其中，紅色熒光微球激發(fā)波長520~535nm，發(fā)射波長600nm。

二、cea標(biāo)準(zhǔn)曲線

先將濃度為0.05~30ng/ml的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品樣本各2μl分別與20μl濃度為0.05mg/ml探針1、50μlpbs7.4緩沖液接觸混勻后，分別加入10μl濃度為0.05mg/ml探針2，超純水定容到100μl，然后常溫旋轉(zhuǎn)30~60min后，最后將該體系置于多功能酶標(biāo)儀上檢測熒光強(qiáng)度。記錄混合液在探針2最大發(fā)射波長（600nm處）的熒光強(qiáng)度，存在cea時f，不存在cea時f0，以(f-f0)對cea濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖3、圖4）。

通過探針1-cea-探針2熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系檢測待測樣本的熒光信號，將待測樣品的熒光信號值代入cea標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出待測樣品中cea的含量。