一種基于化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)ca125和sp17含量的試劑盒及方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫分析領(lǐng)域，具體地涉及一種基于化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)CA125和SP17含 量的試劑盒及方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 卵巢惡性腫瘤又稱卵巢癌，是女性生殖器官常見的腫瘤之一，在女性常見惡性腫 瘤中占2. 4%~6. 5%，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第三位。但因卵巢癌致死 者卻占各類婦科腫瘤的首位，對(duì)婦女生命造成嚴(yán)重威脅。近幾年來(lái)，對(duì)宮頸癌及宮體癌的防 治，取得了一定的成效，而有關(guān)卵巢癌的防治方面收效相對(duì)較小。因此，在婦女生殖系統(tǒng)癌 瘤中，卵巢癌是造成死亡原因最高的一種腫瘤。北京市8個(gè)醫(yī)院的材料中，卵巢惡性腫瘤占 女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的22. 9%。造成其病死率居高不下的原因是由于卵巢惡性腫瘤生長(zhǎng) 部位隱蔽，無(wú)法直接看到，早期卵巢惡性腫瘤癥狀不明顯，仍缺乏簡(jiǎn)便實(shí)用的診斷方法。
[0003] 目前，常見的卵巢癌的免疫學(xué)診斷指標(biāo)包括：①甲胎蛋白（AFP)，是卵黃囊瘤診斷 和治療監(jiān)護(hù)的重要指標(biāo)；②絨毛膜促性腺激素（HCG)，可作為觀察抗癌治療效果的指標(biāo)；③ 腫瘤相關(guān)抗原（TAA):國(guó)外報(bào)道正發(fā)現(xiàn)人類卵巢癌存在腫瘤相關(guān)抗原，這是存在于腫瘤細(xì) 胞膜上的一種表面膜蛋白，特別是源液性和粘液性囊腺癌中，而在正常卵巢組織，良性卵巢 腫瘤均為陰性。
[0004] 近年來(lái)血清CA125 (上皮性卵巢癌的單克隆抗體）、CA19-9 (結(jié)腸、直腸癌的單克隆 抗體）已被用于監(jiān)測(cè)卵巢癌病人。卵巢癌病人血清CA125高達(dá)lOOU/ml以上（正常在35U/ ml以下）者占71%，CA19-9高達(dá)100U/ml以上（正常在37U/ml以下）者占30%。但這兩 個(gè)指標(biāo)的診斷精確性和靈敏度均不高，目前，尚未發(fā)現(xiàn)一個(gè)能夠?qū)崿F(xiàn)卵巢癌診斷精確性和 特異性較高的生物標(biāo)記物。因此急需發(fā)明一種新的診斷工具來(lái)提高卵巢癌的診斷精確度。
[0005] 血清蛋白17 (SP17)屬于腫瘤/睪丸抗原（CTA)家族成員，是一個(gè)高度保守的哺乳 動(dòng)物蛋白，是卵巢癌早期診斷與篩查的生物標(biāo)記物，它能準(zhǔn)確的區(qū)分正常卵巢細(xì)胞和卵巢 癌細(xì)胞，在外周血中檢測(cè)不到SP17的表達(dá)。本發(fā)明通過(guò)檢測(cè)自由循環(huán)血液中SP17的水平 來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)卵巢癌的預(yù)后和分期的診斷鑒別。在卵巢癌患者體內(nèi)SP17出現(xiàn)異常表達(dá)，而在正 常人體內(nèi)SP17不表達(dá)。由此通過(guò)檢測(cè)SP17的水平，及可實(shí)現(xiàn)卵巢癌的早期診斷和預(yù)后評(píng) 價(jià)分析。
[0006] 通常情況下，CA125和SP17的檢測(cè)方法有RT-PCR和ELISA，但以上兩種檢測(cè)方法 耗時(shí)耗力，不能在普通條件下進(jìn)行簡(jiǎn)捷操作，本發(fā)明通過(guò)化學(xué)發(fā)光的免疫學(xué)檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn) 了 CA125和SP17的快速準(zhǔn)確檢測(cè)，為廣大患者帶來(lái)福音。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是提供一種基于化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)CA125和SP17含量的試 劑盒，該檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、線性范圍寬和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。
[0008] 本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題在于，采用化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)對(duì)人血清中CA125 和SP17兩個(gè)指標(biāo)的水平進(jìn)行定量檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)卵巢癌的早期診斷與預(yù)后評(píng)價(jià)分析。
[0009] 技術(shù)方案：為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種基于化學(xué)發(fā)光法檢測(cè) CA125和SP17含量的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括抗異硫氰酸熒光素多克隆抗體 包被的磁微粒、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的CA125單克隆抗體、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的SP17單 克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記的CA125單克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記的SP17單克隆抗體、堿 性磷酸酶催化發(fā)光的化學(xué)發(fā)光底物液、稀釋液、清洗液、CA125系列校準(zhǔn)品和SP17系列校準(zhǔn) 品，其中，本發(fā)明的試劑盒的反應(yīng)試管的材料選自透明的聚苯乙烯、聚乙烯和聚丙烯中的至 少一種。
[0010] 優(yōu)選地，所述的抗異硫氰酸熒光素多克隆抗體包被的磁微粒由羧基修飾的磁微粒 表面共價(jià)結(jié)合抗異硫氰酸熒光素多克隆抗體制備得到，其中，所述的磁微粒粒徑為0. 7~ 3 ym，內(nèi)核為四氧化三鐵表面包裹有羧基基團(tuán)。在實(shí)際的免疫檢測(cè)中，由于待測(cè)樣品中所含 的雜質(zhì)成分較多，一定程度上影響了檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性，所以從復(fù)雜的待測(cè)樣品基質(zhì)中 快速分離、純化出目的待測(cè)物是臨床檢驗(yàn)工作者面臨的難題之一。磁微粒免疫檢測(cè)技術(shù)是 利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作載體，以物理吸附、化學(xué)偶聯(lián)等方法 包被上具有特異性親和力的抗體或抗原等各種免疫活性物質(zhì)，具有分離速度快、效率高、可 重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單、不影響被分離細(xì)胞或其他生物材料的生物學(xué)性狀和功能等特點(diǎn)，在外 加磁場(chǎng)作用下可定向運(yùn)動(dòng)，使得某些特殊成分得以分離、濃集或純化。
[0011] 優(yōu)選地，所述的抗異硫氰酸熒光素多克隆抗體包被的磁微粒懸浮于所述稀釋液 中，配制成0. 5~2 μ g/mL的磁微粒溶液；所述異硫氰酸熒光素標(biāo)記的CA125單克隆抗體和 異硫氰酸熒光素標(biāo)記的SP17單克隆抗體溶解在所述稀釋液中，分別配制成0. 25~0. 5 μ g/ mL異硫氰酸熒光素標(biāo)記的CA125單克隆抗體溶液和0. 25~0. 5 μ g/mL異硫氰酸熒光素標(biāo) 記的SP17單克隆抗體溶液；所述堿性磷酸酶標(biāo)記的CA125單克隆抗體和堿性磷酸酶標(biāo)記的 SP17單克隆抗體溶解在所述稀釋液中，分別配制成0. 25~0. 5 μ g/mL堿性磷酸酶標(biāo)記的 CA125單克隆抗體溶液和0. 25~0. 5 μ g/mL堿性磷酸酶標(biāo)記的SP17單克隆抗體溶液。
[0012] 優(yōu)選地，所述的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的CA125單克隆抗體溶液和異硫氰酸熒光素 標(biāo)記的SP17單克隆抗體溶液通過(guò)透析法制備得到。
[0013] 所述的堿性磷酸酶標(biāo)記的CA125單克隆抗體和堿性磷酸酶標(biāo)記的SP17單克隆抗 體通過(guò)分別活化CA125單克隆抗體、SP17單克隆抗體以及堿性磷酸酶溶液后，分別將活化 后的CA125單克隆抗體和SP17單克隆抗體與活化后的堿性磷酸酶溶液混合后得到。
[0014] 優(yōu)選地，所述的化學(xué)發(fā)光底物液為0. 1~0. 3M、pH值為8~10的Tris-HCl緩沖 液，所述Tris-HCl緩沖液含有0. 2~0. 4mg/mL的二氧雜環(huán)乙烷，更優(yōu)選地，所述Tris-HCl 緩沖液含有〇. 3mg/mL的二氧雜環(huán)乙烷
[0015] 所述的稀釋液為0. 05~0. 5M、pH值為7. 0~8. 0的Tris-HCl緩沖液且所述稀釋 液含0. 4~0. 6wt%的牛血清白蛋白BSA和0. 05~0. 3wt%的疊氮化鈉；所述的清洗液為 0. 1~0. 2M、pH值為8~9的Tris-HCl緩沖液，所述Tris-HCl緩沖液含有0. 01~0. 04wt % 的吐溫20和15~20wt %的氯化鈉，更優(yōu)選地，所述的清洗液為0. 1Μ、ρΗ值為8的Tris-HCl 緩沖液中加入質(zhì)量百分比為〇. 02%的吐溫20和15%的氯化鈉。
[0016] 所述的CA125系列校準(zhǔn)品和SP17系列校準(zhǔn)品的濃度范圍分別為0~50ng/mL和 O ~lOOng/m L。
[0017] 本發(fā)明進(jìn)一步提出了利用權(quán)利要求1所述的試劑盒來(lái)檢測(cè)CA125和SP17含量的 方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0018] (1)將試劑盒中的所有試劑取出后平衡到室溫；使用前將抗FITC多克隆抗體包 被的磁微粒溶液徹底混勻，確保磁微粒懸浮均勻；用去離子水將清洗液稀釋，混勻；設(shè)定好 37°C水?。皇够瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)儀處于待測(cè)狀態(tài)；
[0019] (2)待測(cè)樣本或校準(zhǔn)品、FITC標(biāo)記的CA125單克隆抗體溶液和ALP標(biāo)記的CA125 單克隆抗體溶液混合溫育，同時(shí)將待測(cè)樣本或校準(zhǔn)品、FITC標(biāo)記的SP17單克隆抗體溶液分 別與和ALP標(biāo)記的SP17單克隆抗體溶液混合溫育，用多管混勻器振蕩混勻，置37 ±0. 5°C水 浴，然后向各個(gè)試管中加入抗異硫氰酸熒光素多克隆抗體包被的磁微粒溶液，用多管混勻 器振蕩混勻，置37±0. 5°C水浴，試管連架放至磁分離器上，確保試管與磁板接觸，沉淀；倒 出上清液，然后加稀釋后的清洗液至每一試管中，置多管混勻器振蕩混勻；重復(fù)上述清洗操 作，共清洗3次；
[0020] (3)加堿性磷酸酶催化發(fā)光的化學(xué)發(fā)光底物液至每一試管中，混勾，在5分鐘內(nèi)用 發(fā)光檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，利用四參數(shù)邏輯擬合得到校準(zhǔn)品劑量-反應(yīng)曲線的回歸方程，再根 據(jù)待測(cè)樣本的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度可以從回歸曲線上返算出樣本中待測(cè)物的濃度。
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