氯霉素半抗原和抗原的制備方法及其在化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種半抗原、抗原及其制備方法，具體涉及一種氯霉素半抗原和抗原 的制備方法及其在化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 氯霉素（化loramphenicol，CAP)是一種對革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌都有很好的抑 制作用的廉價(jià)高效廣譜抗生素，一度被廣泛應(yīng)用于農(nóng)牧業(yè)中。但是動(dòng)物源性食品隨著食物 鏈被人體長期攝入，可引發(fā)多種疾病。輕者破壞人體內(nèi)正常菌群的平衡狀態(tài)，菌群失調(diào)，使 人體產(chǎn)生耐藥菌珠，給今后患病使用抗生素治療帶來不良影響；抗生素過敏體質(zhì)的人會出 現(xiàn)過敏反應(yīng)，危及健康。嚴(yán)重時(shí)可干擾骨髓細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，并抑制幼稚細(xì)胞DNA合成， 導(dǎo)致粒細(xì)胞減少，引發(fā)再生障礙性貧血、溶血、紫痛等惡性疾病。
[0003] 鑒于氯霉素的毒副作用，國際食品學(xué)界將其列為禁藥，歐盟、美國等均在法規(guī)中規(guī) 定氯霉素殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為"零容許量"狂erotolerance)，即不得檢出，根據(jù)歐盟"2002/657/ EC"標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，動(dòng)物源性食物中氯霉素的最大要求檢出極限是0.3yg/kg。不久美國抑A也 做出相應(yīng)的規(guī)定。我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定了CAP在所有食品動(dòng)物的可食用組織中不得檢出，并將 其從《中國獸藥典》中刪除，列為禁藥。并相應(yīng)制定了SN0219-93和SCT3018-2004行業(yè)標(biāo) 準(zhǔn)，與國際接軌。
[0004] 氯霉素的檢測方法分為物理化學(xué)法和免疫化學(xué)法，前者有液相色譜法（LC)、高效 液相色譜法（HPLC)、質(zhì)譜法（M巧等，后者主要是酶免法巧LISA)，檢測的靈敏度均達(dá)到 ppb(yg/kg)級別。近幾年，國內(nèi)外學(xué)者又研發(fā)出液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/M巧、液相色 譜電噴霧電離質(zhì)譜法（LC-EITM巧、微生物分析等物理檢測新方法，對化ISA方法的應(yīng)用也 有了進(jìn)一步研究。
[0005] 化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定快速、檢測范圍寬、操作簡單自動(dòng)化程 度高、試劑穩(wěn)定且有效期長（6^18個(gè)月）等優(yōu)點(diǎn)，其檢測限比化ISA和理化檢測方法高幾個(gè) 數(shù)量級。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種氯霉素半抗原及其制備方法和在化學(xué)發(fā)光試劑盒中的 應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明提供的氯霉素半抗原，為式1所示的化合物；
[0008] 本發(fā)明還公開了式1所示化合物的制備方法，包括如下步驟： ① 取氯霉素644mg溶于10血1M鹽酸，加入鋒粉300mg，于80°C水浴中反應(yīng)15min; ② 再次加入鋒粉300mg，繼續(xù)反應(yīng)15min; ③ 將反應(yīng)后的溶液過濾，調(diào)整濾液抑至8. 5,用10血己酸己醋萃取2次，合并有機(jī)相， 用無水硫酸軸干燥，真空干燥； ④ 將得到的固體產(chǎn)物溶于lOmL二甲基甲醜胺（DMF)，加氨氧化軸150mg，4-漠下酸 501mg，于80°C水浴中攬拌反應(yīng)化； ⑥冷卻至室溫，加蒸觸水50血，調(diào)整抑至5. 0,用50血己酸己醋萃取2次，合并有機(jī)相， 無水硫酸軸干燥，真空干燥，即可得到氯霉素半抗原。
[0009] 本發(fā)明提供的氯霉素抗原，是將式1所示化合物和載體蛋白偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物。
[0010] 常用載體蛋白均可采用，如牛血清白蛋白炬SA)，卵清蛋白（0VA)，人血清白蛋白 (HSA)，鼠血清白蛋白（MSA)，甲狀腺蛋白（TG)或血藍(lán)蛋白（KLH)等。
[0011] 所述式1所示化合物與BSA偶聯(lián)得到的氯霉素抗原的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。
[0012] 本發(fā)明還公開了所述氯霉素抗原的制備方法，包括如下步驟： ① 稱取氯霉素半抗原8. 5mg溶于2mLDMF，加入1-(3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亞 胺（EDC) 4. 3mg，N-羥基下二醜亞胺（N服）5. 2mg，室溫?cái)埌璺磻?yīng)化； ② 稱取載體蛋白50mg，溶于5mL0. 1M碳酸氨軸緩沖液； ③ 將氯霉素半抗原反應(yīng)液逐滴加入到載體蛋白溶液中，室溫?cái)埌璺磻?yīng)過夜； ④ 用PBS在4°C條件透析72h，期間換透析液6次； ⑥將透析液在無菌條件下用0. 22ym孔徑的濾膜過濾，分裝于安培瓶中，-2(TC保存。
[0013] 所述氯霉素抗原可W作為免疫原制備氯霉素特異性抗體，也可W作為包被原制備 化學(xué)發(fā)光微孔板。
[0014]應(yīng)用氯霉素抗原制備得到的特異性抗體具體可為單克隆抗體或多克隆抗體。
[0015] 所述氯霉素抗原、所述特異性抗體均可應(yīng)用于檢測氯霉素。
[0016] 本發(fā)明還公開了應(yīng)用氯霉素抗原和氯霉素特異性抗體制備得到的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián) 免疫試劑盒。
[0017] 所述化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括：包被有氯霉素抗原的化學(xué)發(fā)光微孔板、 酶標(biāo)抗體工作液、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液、發(fā)光底物液、濃縮復(fù)溶液、濃縮洗涂液。
[0018] 本發(fā)明依靠免疫學(xué)、免疫化學(xué)基本原理和殘留分析技術(shù)手段，設(shè)計(jì)、合成小分子目 標(biāo)分析物半抗原，并與載體蛋白偶聯(lián)，制備有效人工抗原，免疫動(dòng)物制備針對小分子分析物 的特異性抗體。利用抗原抗體的特異性免疫學(xué)反應(yīng)，定量的檢測樣品中微量小分子目標(biāo)分 析物。本發(fā)明制備方法簡便可行、成本較低，半抗原產(chǎn)率較高。本發(fā)明克服了現(xiàn)有檢測技術(shù) 中對氯霉素樣品預(yù)處理復(fù)雜、耗時(shí)、且需要大量有機(jī)溶劑萃取，W及在檢測過程中要用到精 密昂貴的檢測儀器而不適于推廣使用等缺點(diǎn)。本發(fā)明的氯霉素抗原，通過免疫動(dòng)物可產(chǎn)生 了針對氯霉素的特異性抗體，用于快速檢測食品中的氯霉素殘留，具有操作簡單、快速，處 理樣品量大，靈敏度高，特異性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0019] 圖1為氯霉素抗原的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0020] 圖2為氯霉素化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0021] W下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0022] 實(shí)施例1、氯霉素半抗原的制備 氯霉素半抗原的制備方法，具體操作步驟包括： ① 取氯霉素644mg溶于10血1M鹽酸，加入鋒粉300mg，于8(TC水浴中反應(yīng)15min; ② 再次加入鋒粉300mg，繼續(xù)反應(yīng)15min; ③ 將反應(yīng)后的溶液過濾，調(diào)整濾液pH至8. 5,用lOmL己酸己醋萃取2次，合并有機(jī)相， 用無水硫酸軸干燥，真空干燥； ④ 將得到的固體產(chǎn)物溶于lOmL二甲基甲醜胺（DMF)，加氨氧化軸150mg，4-漠下酸 501mg，于8(TC水浴中攬拌反應(yīng)化； ⑥冷卻至室溫，加蒸觸水50血，調(diào)整抑至5. 0,用50血己酸己醋萃取2次，合并有機(jī)相， 無水硫酸軸干燥，真空干燥，即可得到氯霉素半抗原。
[0023] 半抗原的結(jié)構(gòu)式見式1 :
[0024] 實(shí)施例2、氯霉素人工抗原的制備 一、氯霉素免疫抗原（CAP-BSA)的合成 ① 稱取氯霉素半抗原8. 5mg溶于2mLDMF，加入1-(3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亞 胺（EDC) 4. 3mg，N-羥基下二醜亞胺（N服）5. 2mg，室溫?cái)埌璺磻?yīng)化； ② 稱取BSA50mg，溶于5mL0. 1M碳酸氨軸緩沖液； ③ 將氯霉素半抗原反應(yīng)液逐滴加入到BSA溶液中，室溫?cái)埌璺磻?yīng)過夜； ④ 用PBS在4C條件透析72h，期間換透析液6次； ⑥將透析液在無菌條件下用0. 22ym孔徑的濾膜過濾，分裝于安培瓶中，-2(TC保存。 [00巧]免疫原的結(jié)構(gòu)式見圖1。
[0026] 二、氯霉素包被抗原（CAP-OVA)的合成 ① 稱取氯霉素半抗原8. 5mg溶于2mLDMF，加入1-(3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亞 胺（EDC) 4. 3mg，N-羥基下二醜亞胺（N服）5. 2mg，室溫?cái)埌璺磻?yīng)化； ② 稱取0VA50mg，溶于5mL0. 1M碳酸氨軸緩沖液； ③ 將氯霉素半抗原反應(yīng)液逐滴