一種昆蟲體外蛋白質(zhì)相互作用檢測系統(tǒng)的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，其涉及一種昆蟲體外蛋白質(zhì)相互作用檢測系統(tǒng)的 制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在細(xì)胞正常的生理代謝條件下，蛋白質(zhì)是細(xì)胞活性和功能的執(zhí)行者。通過復(fù)雜的 相互作用，蛋白質(zhì)參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖、分化、免疫、凋亡等各個(gè)生命過程。近年來，隨著 大量物種基因組和轉(zhuǎn)錄組信息的獲得，蛋白質(zhì)組學(xué)一系統(tǒng)研宄某一物種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功 能、及其相互作用網(wǎng)絡(luò)已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。其中，解析蛋白質(zhì)相互作用是揭示蛋白 質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)，有助于系統(tǒng)解釋多種生命現(xiàn)象和過程、探索疾病發(fā)生發(fā)展、以及尋找 新的藥物靶標(biāo)。
[0003] 迄今，人們已發(fā)展了多種蛋白質(zhì)相互作用檢測技術(shù)方法，包括經(jīng)典的酵母雙雜 交、免疫共沉淀、GST-pulldown，以及近年來建立的串聯(lián)親和純化（Tandemaffinity purification，TAP)、焚光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescenceresonanceenergytransfer， FRET)和蛋白質(zhì)互補(bǔ)（Proteincomplementationassay，PCA)技術(shù)等D在這些方法中，免 疫共沉淀、GST-pulldown和TAP技術(shù)需要預(yù)先裂解細(xì)胞、在體外通過親和純化獲得較多的 目標(biāo)蛋白才能進(jìn)行下一步的研宄，許多蛋白在分離、純化過程中由于發(fā)生降解或其天然活 性改變而導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能喪失或檢測不到相互作用。同時(shí)，這些方法也不適用于檢測微弱 或瞬時(shí)的蛋白質(zhì)相互作用。酵母雙雜交技術(shù)雖然應(yīng)用較廣泛，由于融合蛋白相互作用激活 報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄是在酵母細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生，該技術(shù)要求相互作用的蛋白必須表達(dá)定位在細(xì)胞核 內(nèi)。對于存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)胞膜上的蛋白，酵母雙雜交技術(shù)不能檢測。此外，酵母屬低 等真核生物，對于一些較高等真核生物的蛋白質(zhì)不能進(jìn)行特定的翻譯后修飾，進(jìn)而影響蛋 白的正確折疊和相互作用。FRET技術(shù)雖適用于細(xì)胞內(nèi)直觀檢測蛋白質(zhì)相互作用的定位和 定量信息，但其靈敏度較低，熒光探針選擇和測試方法復(fù)雜，并且需要昂貴的儀器設(shè)備。如 何將目標(biāo)蛋白還原到其原有的細(xì)胞生理狀態(tài)下，較簡單易行和準(zhǔn)確地研宄蛋白質(zhì)之間的相 互作用是當(dāng)前技術(shù)發(fā)展的重要需求。PCA是近年來基于這種需求發(fā)展起來的一類新的蛋白 質(zhì)相互作用檢測技術(shù)，該技術(shù)是基于將一個(gè)報(bào)告蛋白合理地分割成N-端和C-端兩個(gè)片段 后，單個(gè)片段都沒有活性、報(bào)告蛋白功能喪失，但當(dāng)兩個(gè)片段充分靠近和重新折疊、報(bào)告蛋 白功能恢復(fù)。目前，應(yīng)用于PCA技術(shù)的報(bào)告蛋白有泛素（ubiquitin)、二氫葉酸還原酶、以 及焚光蛋白等。其中，基于焚光蛋白的雙分子焚光互補(bǔ)系統(tǒng)（Bimolecularfluorescence complementation，BIFC)發(fā)展較迅速。
[0004] 雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)是利用熒光蛋白，如GFP、YFP、RFP等從中間分割后，兩個(gè)片 段均不產(chǎn)生熒光，而當(dāng)與這兩個(gè)片段融合的兩個(gè)目標(biāo)蛋白發(fā)生相互作用時(shí)，熒光蛋白的兩 個(gè)片段重新組合，恢復(fù)天然構(gòu)象并發(fā)出熒光，從而形成一個(gè)報(bào)告系統(tǒng)用于檢測目標(biāo)蛋白的 相互作用。相對于其它蛋白質(zhì)相互作用檢測技術(shù)，BIFC的優(yōu)點(diǎn)是：1)不需要裂解細(xì)胞，所研 宄的目標(biāo)蛋白處于其天然的細(xì)胞環(huán)境中；2)復(fù)合物的形成比較穩(wěn)定，可用于研宄蛋白質(zhì)之 間微弱或瞬時(shí)的相互作用，并且能夠直觀反映相互作用蛋白在細(xì)胞中的定位；3)耗時(shí)比較 短，對儀器配置要求低（一般的倒置熒光顯微鏡就可以滿足實(shí)驗(yàn)的需要），數(shù)據(jù)處理相對簡 單。目前，BIFC技術(shù)已在植物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、以及一些較低等的真核生物、如線蟲中廣泛 應(yīng)用。然而，目前廣泛應(yīng)用于其它生物的BIFC技術(shù)主要存在以下幾個(gè)方面的缺點(diǎn)：
[0005] 1)基于GFP、YFP、RFP等建立的雙分子熒光互補(bǔ)系統(tǒng)的背景較高；
[0006] 2)線蟲、植物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等的BIFC技術(shù)均采用各類生物特異的啟動(dòng)子系統(tǒng)， 而這些啟動(dòng)子系統(tǒng)均不能在昆蟲細(xì)胞中被識別和指導(dǎo)目標(biāo)蛋白表達(dá)；
[0007] 3)線蟲和植物的BIFC系統(tǒng)操作復(fù)雜，轉(zhuǎn)化困難、且僅適用于自身相關(guān)的蛋白質(zhì)相 互作用檢測，外源蛋白質(zhì)相互作用（如哺乳動(dòng)物和昆蟲等）不能用該類系統(tǒng)進(jìn)行檢測；
[0008] 4)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的BIFC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率較低，并需要昂貴的轉(zhuǎn)染試劑，不適合大規(guī) 模蛋白質(zhì)相互作用篩選和檢測；
[0009] 5)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)需在C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行且提供CO2、其培養(yǎng)過程較復(fù)雜。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于提供一種便捷、有效的昆蟲體外蛋白質(zhì)相互作用檢測系統(tǒng)，旨 在解決現(xiàn)有的雙分子熒光互補(bǔ)檢測方法中背景較高，啟動(dòng)子系統(tǒng)均不能在昆蟲細(xì)胞中被 識別和指導(dǎo)目標(biāo)蛋白表達(dá)、無法利用該類系統(tǒng)進(jìn)行昆蟲及其病原微生物蛋白質(zhì)相互作用檢 測，哺乳動(dòng)物細(xì)胞BIFC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率較低、不適合大規(guī)模蛋白質(zhì)相互作用篩選和檢測，哺 乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程較復(fù)雜等問題。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：
[0012] 昆蟲體外蛋白質(zhì)相互作用檢測系統(tǒng)的制備方法，所述昆蟲體外蛋白質(zhì)相互作用檢 測系統(tǒng)的制備方法利用雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)，基于紅色熒光蛋白mCherry，具體包括以下步 驟：
[0013] 步驟一，將紅色熒光蛋白mCherry在第159位和160位氨基酸殘基處分割成 NmCherry 1-159位氨基酸和CmCherry 160-236位氨基酸兩個(gè)蛋白序列片段，分別記作NmC 和CmC，構(gòu)成雙分子焚光互補(bǔ)探針；
[0014] 步驟二，將NmC和CmC兩個(gè)蛋白序列片段分別構(gòu)建到兩個(gè)表達(dá)載體中，將待測的兩 個(gè)目標(biāo)蛋白A和B的DNA序列分別與NmC和CmC通過一段連接區(qū)序列融合構(gòu)建用于表達(dá)融 合蛋白；
[0015] 步驟三，利用雙分子熒光互補(bǔ)現(xiàn)象；將融合蛋白表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，使用倒 置熒光顯微鏡觀察是否存在紅色熒光：待測蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)B之間存在相互作用，則被分 割的NmC和CmC會在空間上靠近而重新組合形成完整的焚光蛋白mCherry，在激發(fā)光下能 夠發(fā)射紅色熒光；在共轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞中沒有紅色熒光產(chǎn)生，證明待測蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)B 之間沒有相互作用。
[0016] 進(jìn)一步，將NmC或者CmC與目標(biāo)蛋白連接的Linker的氨基酸序列為：
[0017] GTSGGSG ；
[0018] 基因編碼序列為：
[0019] 5 ' -GGGACGTCGGGTGGAAGCGGT-3 '。
[0020] 進(jìn)一步，指導(dǎo)目標(biāo)蛋白高效表達(dá)的啟動(dòng)子元件為苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒iel 基因的啟動(dòng)子序列599個(gè)堿基，而多聚腺苷酸尾序列為苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒囊膜基 因gp64的poly(A)218個(gè)堿基。
[0021] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種昆蟲體外蛋白質(zhì)相互作用檢測系統(tǒng)在蛋白質(zhì)相 互作用檢測中的應(yīng)用，所述昆蟲體外蛋白質(zhì)相互作用檢測系統(tǒng)在蛋白質(zhì)相互作用檢測中的 應(yīng)用具體包括：
[0022] 步驟一，利用苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒編碼的Acl46，Lef3，GP41，Acl03四個(gè)蛋 白作為兩組組合，Acl46與Lef3, GP41與Acl03驗(yàn)證新構(gòu)建的昆蟲細(xì)胞雙分子熒光互補(bǔ)系 統(tǒng)的有效性；
[0023] 步驟二，通過PCR方法將Acl46與Lef3編碼基因分別克隆到NmCherry-MycpBlue 和 CmCherry-MycpBlue 載體中，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒 NmC-Myc_Acl46pBlue、 CmC-Myc-Acl46pBule、CmC-Myc-Lef3pBlue ;通過 PCR 方法將 GP41 與 Acl03 編碼基因 分別克隆到Myc-NmCherrypBlue和Myc-CmCherrypBlue載體中，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒 GP41-Myc_NmCpBlue、GP41-Myc_CmCpBule、Acl03-Myc_CmCpBlue ;
[0024] 步驟三，按照處理組合 NmC-Myc_Acl46pBlue 和 CmC-Myc_Acl46pBlue、 NmC-Myc_Acl46pBlue 和 CmC-Myc_Lef3pBlue、GP41-Myc_NmCpBlue 和 GP41-Myc_CmCpBlue、 以及GP41-Myc-NmCpBlue和Acl03-Myc-CmCpBlue共轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，在 倒置焚光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)在共轉(zhuǎn)染NmC-Myc_Acl46pBlue和CmC-Myc_Acl46pBlue或 GP41-Myc_NmCpBlue 和 GP41-Myc_CmCpBlue 的 Sf9 細(xì)胞中清晰地產(chǎn)生了 mCherry 的紅色焚 光信號，而在共轉(zhuǎn)染 NmC-Myc_Acl46pBlue 和 CmC-Myc_Lef3pBlue 或 GP41-Myc_NmCpBlue 和 Acl03-Myc_CmCpBlue的Sf9細(xì)胞中沒有任何焚光產(chǎn)生；進(jìn)一步通過計(jì)數(shù)單個(gè)視野下的紅色 熒光細(xì)胞數(shù)比例，表明所構(gòu)建的昆蟲細(xì)胞雙分子熒光互補(bǔ)系統(tǒng)可定性和定量檢測蛋白質(zhì)相 互作用。
[0025] 本發(fā)明提供的昆蟲體外蛋白質(zhì)相互作用檢測系統(tǒng)的制備方法及其應(yīng)用與現(xiàn)有技 術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：
[0026] 1)該系統(tǒng)選用紅色熒光蛋白mCherry，在轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞中，陰性對照背景干凈；
[0027] 2)該系統(tǒng)選用苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒iel基因的啟動(dòng)子序列，該啟動(dòng)子可利 用昆蟲細(xì)胞RNA聚合酶指導(dǎo)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄和尚效表達(dá)；
[0028] 3)該系統(tǒng)可用簡單、廉價(jià)的磷酸鈣沉淀法高效轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染 試劑可自行配置；
[0029] 4)該系統(tǒng)轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞可在密閉條件下培養(yǎng)；
[0030] 5)該系統(tǒng)可用于大規(guī)模蛋白相互作用的篩選與鑒定。
[0031] 本發(fā)明可以在較短時(shí)間內(nèi)（轉(zhuǎn)染后16-36小時(shí)）檢測哺乳動(dòng)物、植物、昆蟲、線蟲 等多種真核生物及其病原微生物蛋白質(zhì)之間相互作用，方法簡單、成本較低、背景干凈。本 發(fā)明的建立不僅拓展了昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用，同時(shí)，也為昆蟲蛋白質(zhì)組學(xué)、以及昆蟲與 其病原微生物之間蛋白質(zhì)相互作用研宄提供便捷、有效的技術(shù)手段。
【附圖說明】
[0032] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的雙分子熒光互補(bǔ)系統(tǒng)原理示意圖；
[0033] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的昆蟲細(xì)胞雙分子熒光互補(bǔ)系統(tǒng)表達(dá)載體示意圖；
[0034] 圖中：Aciel-p:苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒iel基因啟動(dòng)子;ApR:氨節(jié)青霉素抗 性基因；Bait，誘餌蛋白；GP64p(A):苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒gp64基因多聚腺苷酸尾序 列（P〇ly(A)) ;Lac_p:乳糖啟動(dòng)子；Prey，捕獲蛋白，（詳細(xì)的各元件名稱中英文對照說明見 表2);
[0035] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的Westernblot檢測融合蛋白在Sf9細(xì)胞中表達(dá)示意 圖；
[0036] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的共轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞熒光觀察及目標(biāo)蛋白Wester