一種巨大兒輔助診斷標(biāo)志物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分析化學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種巨大兒輔助診斷標(biāo)志物及其應(yīng)用，特點(diǎn)是基于UPLC-Q exactive MS檢測與巨大兒發(fā)生相關(guān)的代謝小分子標(biāo)志物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]巨大兒(Macrosomia)是指出生后I小時(shí)內(nèi)體重大于等于4kg的新生兒。巨大兒的發(fā)生對母嬰皆有危害。我國產(chǎn)婦中巨大兒造成的難產(chǎn)死亡率高于順產(chǎn)死亡率；巨大兒引起的剖宮術(shù)后引發(fā)的傷口感染、腹腔粘連、子宮內(nèi)膜異位等疾病，都有可能直接或間接導(dǎo)致產(chǎn)婦的死亡。巨大兒對新生兒的健康也有危害。巨大兒在分娩時(shí)通過勉強(qiáng)的牽拉過程易引發(fā)骨骼損傷，因?yàn)榉置鋾r(shí)間的延長，還會(huì)發(fā)生窒息，甚至死亡；剖宮產(chǎn)術(shù)后的巨大兒易發(fā)生低血糖、紅細(xì)胞增多癥、高膽紅素血癥和肺部的并發(fā)癥。此外，巨大兒中發(fā)生心臟畸形的比例高于一般正常體重兒?，F(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)，巨大兒長大后患肥胖癥的幾率較大，將成為糖尿病、高血壓等多種疾病的易患人群。
[0003]目前巨大兒的早期診斷一般基于母親的一些易感醫(yī)學(xué)特征比如患有糖尿病、肥胖和過期妊娠。然而對于不具備上述特征的人群，巨大兒的早期診斷需要依賴B超檢測。然而B超檢測時(shí)間較長，檢查價(jià)格較高，且有些孕婦對B超檢查的輻射也較為擔(dān)心。這些都給巨大兒診斷帶來了難度并且給家庭帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因而亟需找到新的巨大兒的診斷方法。
[0004]代謝組學(xué)(Metabolomics/Metabonomics)是20世紀(jì)90年代末期發(fā)展起來的一門新興學(xué)科，它是通過考察生物體系在遺傳改變或受刺激或擾動(dòng)后，其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時(shí)間的變化，來研究生物體系的一門科學(xué)。所謂代謝組(Metabolome)是基因組的下游產(chǎn)物也是最終產(chǎn)物，是一些參與生物體新陳代謝、維持生物體正常功能和生長發(fā)育的小分子化合物的集合，主要是相對分子質(zhì)量小于1000的內(nèi)源性小分子，這些內(nèi)源性代謝小分子涉及糖代謝、能量代謝、脂代謝、氨基酸代謝、核酸代謝、輔酶代謝等。
[0005]正常狀態(tài)下的生物體是一個(gè)完整的系統(tǒng)，生物體液、細(xì)胞和組織中的代謝物處于一個(gè)穩(wěn)定的平衡狀態(tài)。機(jī)體由于遺傳或者后天原因發(fā)生了病理變化，這一平衡就被打破，代謝產(chǎn)物和代謝過程也產(chǎn)生了相應(yīng)的變化。通過代謝組學(xué)分析了解代謝小分子在疾病過程中的變化，可以幫助人們尋找有關(guān)的生物標(biāo)志物(b1marker)輔助疾病的診斷，也可以幫助人們通過小分子物質(zhì)本身涉及的代謝通路了解疾病的發(fā)病機(jī)制并為藥物研發(fā)提供特異性的靶標(biāo)。近年來，代謝組學(xué)在人類各類疾病的研究中在疾病的早期診斷中取得了諸多具有重大意義的研究成果，如心血管疾病、糖尿病和癌癥，相關(guān)論文發(fā)表在學(xué)術(shù)期刊《Nature》、((Nature medicine〉〉、〈〈Journal of hepatology〉〉和〈〈Cancer research〉〉上，展現(xiàn)了代謝小分子在人類疾病診斷中巨大的潛力與價(jià)值。然而采用代謝組學(xué)分析孕期血漿中代謝小分子在巨大兒早期診斷監(jiān)測中的應(yīng)用還未得到相應(yīng)的關(guān)注。
[0006]目前代謝組學(xué)研究常用技術(shù)包括液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)、氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)及核磁共振技術(shù)(NMR)。核磁共振技術(shù)特點(diǎn)是對待測組分無破壞，樣本前處理簡單，但靈敏度較低；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用具有較好的靈敏度和重現(xiàn)性，但一般要采用衍生化方法對樣本進(jìn)行前處理，使得實(shí)驗(yàn)步驟變得復(fù)雜。而LC-MS具有樣本處理簡單，靈敏度高，臨床實(shí)用性強(qiáng)的特點(diǎn)。UPLC-Q exactive MS是新一代高分辨質(zhì)譜與超高效液相的組合，具有相比傳統(tǒng)LC-MS更強(qiáng)的靈敏度、特異度和穩(wěn)定性。故而采用UPLC-Q exactive MS進(jìn)行代謝小分子的代謝組學(xué)分析，若能發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的與巨大兒發(fā)病相關(guān)的特異血漿代謝小分子作為生物標(biāo)志物，并研發(fā)相應(yīng)疾病的代謝小分子標(biāo)志的UPLC-Q exactive MS檢測方法，不僅在該領(lǐng)域處于國際領(lǐng)先地位，還可創(chuàng)造令人矚目的經(jīng)濟(jì)效益，對提高我國母嬰健康水平也將是一次強(qiáng)有力的推動(dòng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種巨大兒發(fā)生相關(guān)的孕期血漿代謝小分子標(biāo)志物。
[0008]本發(fā)明另一個(gè)目的是提供上述孕期血漿代謝小分子標(biāo)志物在制備巨大兒診斷和監(jiān)測試劑盒的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明再有一個(gè)目的是提供上述血漿代謝小分子標(biāo)志物的色譜質(zhì)譜檢測用的診斷和監(jiān)測試劑盒。
[0010]本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)的:
[0011]與人類巨大兒相關(guān)的孕期血漿代謝小分子標(biāo)志物，為煙酰胺和檸檬酸的組合，可采用UPLC-Q exactive MS方法檢測上述代謝小分子進(jìn)行巨大兒的早期診斷。
[0012]所述的孕期血漿代謝小分子標(biāo)志物在制備巨大兒診斷和監(jiān)測試劑盒中的應(yīng)用。
[0013]—種用于巨大兒診斷和監(jiān)測試劑盒，該試劑盒含有煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品，碳13標(biāo)記的煙酰胺穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)物，碳13標(biāo)記的檸檬酸穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)物，試劑A(流動(dòng)相用，含0.1 %的甲酸的水)，試劑B (流動(dòng)相用，含0.1 %的甲酸的乙腈)，試劑C (沉淀蛋白用，含100 %甲醇)，試劑D (復(fù)溶用，超純水)。
[0014]所述的診斷試劑盒，該試劑盒還含有C18色譜柱(10mmX 2.1mm,粒徑1.9 μ m)。
[0015]另外，本發(fā)明通過UPLC-Q exactive MS的方法確定正常和巨大兒患兒母親孕期血漿中具有較高豐度的代謝小分子。然后，在其中通過基于UPLC-Q exactive MS的代謝組學(xué)技術(shù)篩選與巨大兒相關(guān)的代謝小分子，作為巨大兒診斷以及診斷程度的指標(biāo)。最后將篩選出的對應(yīng)血漿代謝小分子的數(shù)量控制在2個(gè)，這是在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上做出的最優(yōu)化的精簡。選用這2個(gè)代謝小分子的組合既能保證診斷的精確(靈敏度為80.00%，特異度為86.67%,ROC曲線下面積為0.8889)又能最大化減少檢測成本，降低病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也利于臨床推廣使用。
[0016]本發(fā)明詳細(xì)描述如下:
[0017]本發(fā)明人以標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的孕期血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人群基礎(chǔ)信息和臨床資料，并采用了基于UPLC-Q exactive MS的代謝組學(xué)方法進(jìn)行分析。
[0018]具體來說研究的實(shí)驗(yàn)方法主要包括以下幾個(gè)部分:
[0019]—、研究對象選擇和分組依據(jù)
[0020]第一階段篩選階段
[0021]隨機(jī)納入孕產(chǎn)婦共100人。
[0022]1.年齡在23到36歲間；
[0023]2.無妊娠高血壓、妊娠糖尿病等妊娠期疾??；
[0024]3.無吸煙、飲酒史；
[0025]4.均為初產(chǎn)婦；
[0026]5.孕周小于41周；
[0027]6.無全身重大疾??；
[0028]7.含巨大兒病例(嬰兒出生體重彡4kg，15人)。
[0029]第二階段驗(yàn)證階段
[0030]納入病例和對照孕產(chǎn)婦共30人。
[0031]A組:健康對照組(15人，2.5kg彡嬰兒出生體重<4kg):
[0032]1.年齡在23到33歲間；
[0033]2.無妊娠高血壓、妊娠糖尿病等妊娠期疾??；
[0034]3.無吸煙、飲酒史；
[0035]4.均為初產(chǎn)婦；
[0036]5.孕周小于41周；
[0037]6.無全身重大疾病。
[0038]B組:巨大兒組(15人，嬰兒出生體重彡4kg):
[0039]1.年齡在25至34歲間；
[0040]2.無妊娠高血壓、妊娠糖尿病等妊娠期疾??；
[0041]3.無吸煙、飲酒史；
[0042]4.均為初產(chǎn)婦；
[0043]5.孕周小于41周；
[0044]6.無全身重大疾病。
[0045]二、UPLC-Q exactive MS代謝組學(xué)分析和巨大兒診斷用代謝小分子篩選和驗(yàn)證
[0046]1.樣本前處理
[0047]1.1.新鮮孕期血液于離心機(jī)3000rpm離心5min，取上清100 μ I分裝至潔凈1.5ml
EP管中。
[0048]1.2.50 μ I血漿用150 μ I甲醇(試劑C)沉淀蛋白。
[0049]1.3.吸取上清，用氮?dú)獯蹈稍儆谜婵崭稍铩?br>[0050]1.4.用100 μ L水(試劑D)溶解干燥物。
[0051]2.儀器檢測
[0052]2.1.分析儀器:UPLC Ultimate 3000 system(D1nex)高效液相色譜儀；Q-Exactive高分辨質(zhì)譜儀。
[0053]2.2.液相條件:
[0054]2.2.1液相色譜柱為C18色譜柱(100_X 2.1mm,粒徑1.9 μ m)，柱溫為40°C。
[0055]2.2.2采用的流動(dòng)相為流動(dòng)相A含0.1 %甲酸的水(試劑A)和流動(dòng)相B含0.1 %甲酸的乙腈(試劑B)，流速為400 μ L/min。
[0056]2.2.3 儀器梯度為:0-3min 1% B (99% C), 3-lOmin I %到 99% B (99%到 I % C)，10-13min99% B(l% C), 13-13.1min 99% 到 I % B (I % 到 99% C)，13.l_17min 1% B(99%C) O
[0057]2.2.4進(jìn)樣方式:體積10 μ I。
[0058]2.3.質(zhì)譜條件
[0059]2.3.1加熱電噴霧電離方式(HESI)進(jìn)行分析。
[0060]2.3.2正尚子模式噴霧電壓:3.5kV ;負(fù)尚子模式噴霧電壓:2.5kV ;兩種模式下毛細(xì)管溫度:250°C，加熱器溫度:425°C，鞘氣氣流:50AU，輔助氣氣流:13AU，反吹氣氣流:OAU ;透鏡電壓:60V。采用全掃模式，掃描范圍:70到1050m/z ;分辨率:70000 ;自動(dòng)增益控制(ACG):1 X 10-6charges ;最大注射時(shí)間:30ms。
[0061]3.物質(zhì)定性和定量
[0062]代謝小分子定性采用與煙酰胺和檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品比對色譜信息(保留時(shí)間)和質(zhì)譜信息(精確分子量、同位素分布和MS/MS碎片信息)，并實(shí)時(shí)比對樣本中同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品(碳13標(biāo)記的煙酰胺穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)物、碳13標(biāo)記的檸檬酸穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)物)的色譜信息(保留時(shí)間)；定量采用煙酰胺和檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品和同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品(碳13標(biāo)記的煙酰胺穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)物、碳13標(biāo)記的檸檬酸穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)物)的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法。
[0063]4.數(shù)據(jù)分析
[0064]生物標(biāo)志物篩選采用多元線性回歸篩選穩(wěn)健的與出生體重有關(guān)的代謝物，再采用多元Logistic回歸確認(rèn)關(guān)鍵代謝物。
[0065]5.健康對照組、巨大兒組血漿樣本中代謝小分子的差異和診斷意義
[0066]經(jīng)過校正母親的年齡、孕末期體質(zhì)指數(shù)、孕周和出生嬰兒的性別，多元線性回歸分析發(fā)現(xiàn)孕期血漿煙酰胺和檸檬酸的含量與子代的出生體重呈正相關(guān)。經(jīng)過校正母親的年齡、孕末期體質(zhì)指數(shù)、孕周和出生嬰兒的性別，多元Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)孕期血漿煙酰胺和檸檬酸的含量增加顯著提高了子代為巨大兒的風(fēng)險(xiǎn)。采用獨(dú)立人群應(yīng)用上述代謝小分子組合診斷巨大兒，靈敏度為80.00%，特異度為86.67%, ROC曲線下面積為0.8889，具有較高的診斷價(jià)值。
[0067]三、診斷試劑盒制備方法
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