用于AChE的組合物、篩選AChE抑制劑方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種用于乙酰膽堿酯酶（AChE)的組合物、篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑的方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]AChE (乙酰膽堿酯酶)是一種可以在膽堿神經(jīng)突觸催化分解乙酰膽堿的酶，使突觸傳遞終止。很多研究已證實(shí)AD小鼠腦脊液中AChE水平顯著降低，低水平的AChE與一定程度的認(rèn)知障礙顯著相關(guān)。小鼠腦脊液中低水平AChE可能表明大腦處于風(fēng)險(xiǎn)或者個(gè)體正處于AD的臨床癥狀前階段。由于現(xiàn)有的AD確診不僅需要存在嚴(yán)重的認(rèn)知功能缺損，而且需要證實(shí)存在典型的腦組織病理學(xué)改變，這些信息對(duì)于早期阻斷和治療疾病就非常有用?，F(xiàn)在尚無(wú)準(zhǔn)確的方法在早期無(wú)癥狀階段識(shí)別AD，越來(lái)越多的證據(jù)表明，使用腦脊液（CSF)生物標(biāo)記物本身（β_淀粉樣蛋白，全蛋白和磷酸化tau蛋白水平）或者與神經(jīng)影像學(xué)結(jié)合，可為AD的臨床診斷提供有效的信息。CSF中AChE的水平與AD認(rèn)知進(jìn)程的相關(guān)性，可以作為一個(gè)重要的參數(shù)應(yīng)用于監(jiān)測(cè)AD進(jìn)程和治療效果，尤其是同時(shí)結(jié)合其他CSF生物標(biāo)記物和神經(jīng)影像學(xué)檢查。因此開(kāi)發(fā)可靠的方法來(lái)檢測(cè)CSF中AChE的水平十分重要。
[0003]傳統(tǒng)方法檢測(cè)AChE水平包括使用Ellman試劑的比色法，和檢測(cè)乙酰膽堿酯酶氧化膽堿產(chǎn)生的過(guò)氧化氫，這兩個(gè)方法均靈敏度低且需要大量時(shí)間。為了提高靈敏度，增強(qiáng)的化學(xué)方法，如基于有機(jī)化合物和量子點(diǎn)的電化學(xué)探針和化學(xué)發(fā)光或者熒光檢測(cè)AChE，起到了重要作用。然而這些方法仍然靈敏度較低且需要繁瑣的化學(xué)合成步驟。
[0004]已報(bào)道兩種基于AuNP(納米金）比色法檢測(cè)AChE，一種是基于AuNP的聚集，會(huì)導(dǎo)致紅色吸收帶的紅移，以及從紅色到藍(lán)色的顏色變化；另一種依賴于AChE催化的單分散AuNPs尺寸的擴(kuò)大。然而，研究者仍然面臨提高試驗(yàn)靈敏度和準(zhǔn)確性的挑戰(zhàn)，更重要的是，沒(méi)有報(bào)道評(píng)估它們?cè)趯?shí)際復(fù)雜混合物樣品，如CSF或血清分析中的應(yīng)用。因此，開(kāi)發(fā)具有高靈敏度和特異性的檢測(cè)AChE實(shí)際樣本方法有很大需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明需要解決的現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題是：現(xiàn)有的用于乙酰膽堿酯酶分析以及篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑的方法，其靈敏度和準(zhǔn)確性較低且需要繁瑣的化學(xué)反應(yīng)步驟，而且不合適應(yīng)用于復(fù)雜的樣品中。
[0006]為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種乙酰膽堿酯酶分析用的組合物、用于篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑的方法以及用途。
[0007]具體而言，本發(fā)明提供了一種乙酰膽堿酯酶分析用的組合物，包括羅丹明素、納米金和乙酰膽堿酯酶的作用底物。
[0008]優(yōu)選的，所述的羅丹明素、所述納米金以及所述乙酰膽堿酯酶的作用底物的摩爾比為:800 ?1800:5 ： 10000 ?40000，優(yōu)選摩爾比為 1000 ?1600 ：5:10000 ?30000，更優(yōu)選摩爾比為 1000 ?1400 ：5:15000 ?20000。
[0009]優(yōu)選的，所述的納米金為檸檬酸修飾的納米金。
[0010]優(yōu)選的，所述的納米金的粒徑大小為10nm?80nm，優(yōu)選為10?40nm，更優(yōu)選為13 ?20nm。
[0011]優(yōu)選的，所述乙酰膽堿酯酶的作用底物為碳數(shù)子數(shù)為2-6個(gè)的羧酸?；哪憠A類化合物及其類似物；優(yōu)選為乙酰膽堿及其類似物，丙酰膽堿及其類似物，丁酰膽堿及其類似物；更優(yōu)選為乙酰膽堿及其類似物。
[0012]其中，本發(fā)明中的乙酰膽堿酯酶可以作用于乙酰膽堿酯酶的作用底物，特異性的斷開(kāi)乙酰膽堿酯酶作用底物中的酯鍵，生成碳原子數(shù)為2-6個(gè)的羧酸和膽堿類化合物或者其類似物。
[0013]優(yōu)選的，所述的碳數(shù)子數(shù)為2-6的羧酸酰化的膽堿類化合物的類似物為碳數(shù)子數(shù)為2-6個(gè)的羧酸?；哪憠A類含鹽類似物或者碳原子數(shù)為2-6個(gè)的羧酸酰化的膽堿類受體類似物；優(yōu)選為乙酰膽堿含鹽類似物，乙酰膽堿受體類似物，丙酰膽堿含鹽類似物，丙酰膽堿受體類似物，丁酰膽堿含鹽類似物，丁酰膽堿受體類似物；更優(yōu)選為乙酰膽堿含鹽類似物或乙酰膽堿受體類似物；進(jìn)一步優(yōu)選為乙酰膽堿含磷類似物。
[0014]優(yōu)選的，所述組合物為含有羅丹明素、納米金和乙酰膽堿酯酶的作用底物的緩沖溶液。
[0015]優(yōu)選的，所述的緩沖溶液的pH值為9.0-11.0，優(yōu)選pH值為10.0，更優(yōu)選為碳酸氫鈉-氫氧化鈉的緩沖溶液。
[0016]本發(fā)明同時(shí)提供了一種用于篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑的方法，包括如下步驟:
[0017](1)將樣本置于含有羅丹明素、納米金、乙酰膽堿酯酶的作用底物的溶液中反應(yīng)；
[0018](2)利用紫外吸收的方法，測(cè)定溶液的吸收值；
[0019]以及
[0020](3)采用熒光檢測(cè)，測(cè)定溶液的熒光值。
[0021]優(yōu)選的，所述的紫外吸收檢測(cè)波長(zhǎng)范圍為400?800nm。
[0022]優(yōu)選的，所述的熒光檢測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)范圍為540nm?560nm，吸收波長(zhǎng)范圍為560 ?580nm。
[0023]本發(fā)明還通過(guò)了以上所述的組合物或以上所述的方法在硫代膽堿含量測(cè)定領(lǐng)域、乙酰膽堿酯酶分析領(lǐng)域或者在乙酰膽堿酯酶抑制劑篩選領(lǐng)域中的用途。
[0024]本發(fā)明的檢測(cè)原理為:RB(羅丹明素)可溶于水、耐光、有強(qiáng)烈的熒光，且容易吸附到金納米粒子的表面導(dǎo)致熒光淬滅。RB分子上帶正電荷的氨基能夠通過(guò)靜電相互作用識(shí)別帶負(fù)電荷的檸檬酸-AuNPs，從而連接到AuNPs的表面。同時(shí)RB分子的熒光被AuNPs淬滅。此時(shí)若加入乙酰膽堿類似物(acetylth1choline，ATC)和AChE到RB_AuNPs溶液中，AChE可以水解ATC形成硫代膽堿，硫代膽堿通過(guò)形成Au - S鍵替代RB分子，緊密結(jié)合到AuNPs表面，導(dǎo)致RB分子從Au表面脫離，釋放出熒光。同時(shí)，吸附到不同AuNP表面的硫代膽堿和RB分子可以通過(guò)硫代膽堿上的季銨基團(tuán)和RB分子上的酸性基團(tuán)之間的靜電相互作用發(fā)生反應(yīng)，引起AuNPs聚集。這個(gè)過(guò)程導(dǎo)致吸收光譜帶的快速變化，同時(shí)AuNPs溶液的顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色。另外，如果存在AChE抑制劑，AChE就無(wú)法水解ATC產(chǎn)生硫代膽堿來(lái)引起RB-AuNPs聚集或恢復(fù)RB分子的熒光。
[0025]應(yīng)用以上原理，本發(fā)明提供了一個(gè)使用RB-AuNPs篩選AChE抑制劑的高靈敏度檢測(cè)方法，同時(shí)驗(yàn)證了它在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因AD小鼠CSF中AChE的效用。
[0026]基于羅丹明素納米金（RB-AuNP)的雙讀數(shù)（比色和熒光）檢測(cè)，其靈敏度高、特異性強(qiáng)，可以應(yīng)用于監(jiān)測(cè)阿爾茨海默氏?。ˋD)小鼠腦脊液（CSF)中乙酰膽堿酯酶（AChE)的含量。由于分子的變化可以容易轉(zhuǎn)化為顏色變化，從而被吸光度或表面等離子體共振改變識(shí)別，所以使用AuNP比色進(jìn)行檢測(cè)成為強(qiáng)有吸引力的檢測(cè)方式。
[0027]本發(fā)明的有益效果是：
[0028](1)本發(fā)明通過(guò)AuNP溶液的顏色改變和RB分子的熒光恢復(fù)可以作為檢測(cè)復(fù)雜樣本中AChE的含量的有效工具。
[0029](2)本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于篩選AChE抑制劑，如果存在AChE抑制劑，AChE就無(wú)法水解ATC產(chǎn)生硫代膽堿來(lái)引起RB-AuNPs聚集或恢復(fù)RB分子的熒光。
[0030](3)本發(fā)明采用雙信號(hào)輸出是一個(gè)顯著的進(jìn)步，而且雖然巰基化合物與硫代膽堿類似，可從AuNPs表面釋放RB分子，引起熒光恢復(fù)，但是巰基化合物并不能引起肉眼可見(jiàn)的AuNPs聚集。因此如果滿足熒光恢復(fù)和溶液顏色變化兩個(gè)條件，必須滿足可以指示硫代膽堿的條件。這個(gè)要求有效的避免了來(lái)自巰基化合物的干擾，因此保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。兩個(gè)信號(hào)的輸出，包括AuNP溶液的顏色改變和RB分子的熒光恢復(fù)，能夠有效的用于避免假陽(yáng)性信號(hào)。
[0031]下面結(jié)合附圖和各個(gè)【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明及其有益技術(shù)效果進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，其中：
【附圖說(shuō)明】
[0032]圖la為本發(fā)明