一種基于化學(xué)發(fā)光的結(jié)晶紫檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種基于化學(xué)發(fā)光的結(jié)晶紫檢測方法，是由碳酸鈉溶液、碳酸氫鈉溶液或碳酸鈉與碳酸氫鈉的混合溶液與魯米諾配制濃度為1.0×10?6mol·L?1～1.0×10?4mol·L?1的魯米諾工作液，另配制濃度為10μg·mL?1～1.0×104μg·mL?1的過氧化氫水溶液，分別檢測空白水樣及待測水樣與過氧化氫水溶液及魯米諾工作液在避光條件下反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度，記為I0和I，計(jì)算得到相對發(fā)光強(qiáng)度ΔI＝I0?I，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到待測水樣中結(jié)晶紫的濃度。本發(fā)明通過建立結(jié)晶紫?魯米諾(3?氨基鄰苯二甲酰肼)?過氧化氫的特殊發(fā)光體系檢測水體中結(jié)晶紫的含量，檢測靈敏及準(zhǔn)確度高，并可實(shí)現(xiàn)自動進(jìn)樣、多個(gè)樣品同時(shí)檢測，操作簡便、成本低。
【專利說明】
一種基于化學(xué)發(fā)光的結(jié)晶紫檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于化學(xué)分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于化學(xué)發(fā)光的結(jié)晶紫檢測方法。 技術(shù)背景
[0002] 結(jié)晶紫，分子式為C25H3QClN3,其結(jié)構(gòu)如附圖1所示，屬三芳基甲烷化學(xué)物質(zhì)，被廣泛 地用于紡織業(yè)、皮革業(yè)、制陶業(yè)和細(xì)胞染色等。同時(shí)，由于它能抑制寄生蟲，殺死真菌和細(xì) 菌，許多國家在較長一段時(shí)間里曾將其作為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的常用殺菌劑，用于魚類高發(fā)的水 霉病、原蟲病的控制，提高魚類存活率。但結(jié)晶紫對魚類的生殖系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)具有高毒 性、高殘留、致癌、致畸、致突變等的毒副作用，大部分國家和地區(qū)將結(jié)晶紫列為水產(chǎn)獸醫(yī)行 業(yè)的禁用藥，但由于結(jié)晶紫價(jià)格低、易制備、使用方便和藥效顯著等特點(diǎn)，我國許多地方在 水產(chǎn)品養(yǎng)殖、保鮮和運(yùn)輸過程中仍在使用，引起的水產(chǎn)品體內(nèi)的殘留和環(huán)境污染，因此，需 要建立水體中結(jié)晶紫的快速檢測方法，對結(jié)晶紫的使用進(jìn)行監(jiān)測監(jiān)管。
[0003] 目前結(jié)晶紫的檢測手段有高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜法
[0004] (HPLC-MS)、液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS-MS)、同位素內(nèi)標(biāo)法、酶聯(lián)免疫分析 法等，但這些方法有操作繁瑣、耗時(shí)長、儀器價(jià)格昂貴、需要專業(yè)的技術(shù)人員、不適合現(xiàn)場大 規(guī)模的檢測等缺點(diǎn)，而化學(xué)發(fā)光法具有靈敏度高、檢測速度快、線性范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，在環(huán)境 監(jiān)測、化學(xué)分析等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，但目前對于結(jié)晶紫還沒有出現(xiàn)高效的基于化學(xué)發(fā)光的檢 測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種基于化學(xué)發(fā)光的結(jié)晶紫檢測方法，該 方法通過建立結(jié)晶紫-魯米諾(3-氨基鄰苯二甲酰肼)_過氧化氫的特殊發(fā)光體系，檢測水體 中結(jié)晶紫的含量，具有分析速度快、靈敏度高、試劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] -種基于化學(xué)發(fā)光的結(jié)晶紫檢測方法，包括以下步驟：
[0008] 由碳酸鈉溶液、碳酸氫鈉溶液或碳酸鈉與碳酸氫鈉的混合溶液與魯米諾配制濃度 為1.0 X 10-6mol · L-1~1.0 X 10-4mol · L-1的魯米諾工作液，另配制濃度為IOyg · mL-1~1.0 X 104yg · ml/1的過氧化氫水溶液，分別檢測空白水樣及待測水樣與過氧化氫水溶液及魯米 諾工作液在避光條件下反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度，記為Io和I，計(jì)算得到相對發(fā)光強(qiáng)度AI = Iq-I,對 照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到待測水樣中結(jié)晶紫的濃度。
[0009] 優(yōu)選的，所述碳酸鈉溶液、碳酸氫鈉溶液或碳酸鈉與碳酸氫鈉的混合溶液的濃度 為0.05mol · L-1 ~0.20mol · L-SpH值為9.5~13.0。
[0010] 所述待測水樣為水產(chǎn)養(yǎng)殖水或環(huán)境水樣，不含有結(jié)晶紫以外的其他影響結(jié)晶紫與 魯米諾、過氧化氫反應(yīng)發(fā)光強(qiáng)度的物質(zhì)，所述空白水樣為不含有結(jié)晶紫及其他影響結(jié)晶紫 與魯米諾、過氧化氫反應(yīng)發(fā)光強(qiáng)度的水樣，優(yōu)選的，待測水樣中結(jié)晶紫的濃度為2~SOOng · ml/1，保證結(jié)晶紫濃度與相對發(fā)光強(qiáng)度之間的正比關(guān)系。
[0011] 優(yōu)選的，所述待測水樣經(jīng)過預(yù)處理后再與過氧化氫水溶液及魯米諾工作液混合， 所述預(yù)處理是將待測水樣經(jīng)過濾后，用活化的強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂和強(qiáng)堿性陰離子交換 樹脂進(jìn)行處理，再加入乙二胺四乙酸二鈉作為掩蔽劑消除金屬離子的干擾，得到預(yù)處理后 的待測水樣。
[0012] 本發(fā)明利用結(jié)晶紫對魯米諾-過氧化氫在堿性條件下發(fā)光強(qiáng)度的影響來檢測結(jié)晶 紫的含量，實(shí)際中隨結(jié)晶紫含量增加，結(jié)晶紫-魯米諾-過氧化氫在堿性條件下反應(yīng)的化學(xué) 發(fā)光強(qiáng)度I降低，則魯米諾-過氧化氫在堿性條件下反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度Io與結(jié)晶紫-魯米 諾-過氧化氫在堿性條件下發(fā)生反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度I的差值（即相對發(fā)光強(qiáng)度A I = Iq-I ) 隨結(jié)晶紫的含量增加而增加。在該檢測方法中，所述過氧化氫水溶液與魯米諾工作液反應(yīng) 的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度Io隨過氧化氫水溶液用量的增加而增加，即該空白反應(yīng)體系中魯米諾是過 量的，而含結(jié)晶紫的待測水樣與魯米諾工作液及過氧化氫水溶液反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度I隨 待測水樣用量增加而減小，據(jù)此調(diào)節(jié)各種物質(zhì)的用量。
[0013] 優(yōu)選的，所述反應(yīng)的時(shí)間為IOs~30s。所述反應(yīng)是在避光條件下進(jìn)行，反應(yīng)過程的 化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度是逐漸增強(qiáng)后衰減的過程，因而需要根據(jù)實(shí)際情況選擇檢測時(shí)間。
[0014] 本發(fā)明的基于化學(xué)發(fā)光的結(jié)晶紫檢測方法優(yōu)選在帶有多個(gè)樣品檢測槽、自動進(jìn)樣 裝置及化學(xué)發(fā)光檢測裝置的現(xiàn)有設(shè)備中進(jìn)行，在檢測槽中分別加入結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)溶液、待測 水樣及空白樣，由自動進(jìn)樣裝置同時(shí)將魯米諾工作液及過氧化氫水溶液注入樣品槽中進(jìn)行 化學(xué)發(fā)光，由化學(xué)發(fā)光檢測裝置檢測相對發(fā)光強(qiáng)度，計(jì)算后得到待測水樣中結(jié)晶紫的濃度， 可實(shí)現(xiàn)單個(gè)待測樣品的平行檢測、多個(gè)樣品同時(shí)檢測以及標(biāo)準(zhǔn)溶液的同步檢測，進(jìn)樣準(zhǔn)確 度高，檢測速度快。所述現(xiàn)有設(shè)備可以為帶有自動進(jìn)樣器、化學(xué)發(fā)光檢測單元的酶標(biāo)儀或其 他化學(xué)發(fā)光檢測儀，另配套使用自動讀板裝置(如微孔板）。
[0015] 本發(fā)明具有以下有益效果：
[0016] 本發(fā)明通過建立結(jié)晶紫-魯米諾(3-氨基鄰苯二甲酰肼)_過氧化氫的特殊化學(xué)發(fā) 光體系檢測水體中結(jié)晶紫的含量，具有檢測靈敏及準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)，并可結(jié)合現(xiàn)有的自動 進(jìn)樣、化學(xué)發(fā)光檢測等裝置，實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣品同時(shí)檢測，操作簡便、成本低，適用于實(shí)時(shí)監(jiān)測及 環(huán)境預(yù)警監(jiān)測。
【附圖說明】
[0017] 圖1結(jié)晶紫的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖；
[0018] 圖2標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 本發(fā)明可通過如下的實(shí)施例進(jìn)一步的說明，但實(shí)施例不是對本發(fā)明保護(hù)范圍的限 制。
[0020] 實(shí)施例
[0021]待測水樣的制備：取水樣IOOmL，用0.45μπι微孔濾膜過濾，所得濾液經(jīng)過活化后的 強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂(732,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）和強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂(717， 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）處理，再加入IyL IX l(T7m〇l · I/1的乙二胺四乙酸二鈉作為 掩蔽劑消除金屬離子的干擾，得到預(yù)處理后的待測水樣;在100mL預(yù)處理后的待測水樣中加 入IyL Img · ml/1的結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)溶液充分混合均勾，得到濃度為10.OOng · ml/1的模擬待測 水樣。
[0022] 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與待測水樣的檢測：
[0023] 使用濾光片型多功能酶標(biāo)儀Infinite? 200 (TECAN，瑞士），配套使用白色96孔聚苯 乙烯平底微孔板（3922，Corning，美國），將空白水樣、待測水樣和濃度為800ng · mL一1、 500ng · mL-\300ng · mL-\200ng · mL-\l50ng · mL-\100 ng · mL-\50ng · mL-\25ng · ml,-1、 IOng · mL-1Jng · mL-1Jng · mL-1Jng · mL-1的結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)溶液按照50yL/孔的體積用量分 別加入到微孔板的微孔中，空白水樣、待測水樣及每個(gè)濃度的結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)溶液均設(shè)置3個(gè)平 行孔；
[0024] 用？!1=11.5、濃度為0.2111〇1.1/1的恥20)3溶液配置濃度為2\10- 5111〇1.1/1的魯米 諾工作液，用超純水配置濃度為1.11 X 103yg · ml/1過氧化氫水溶液，將魯米諾工作液與過 氧化氫水溶液分別連接酶標(biāo)儀的自動進(jìn)樣器，設(shè)定自動進(jìn)樣體積均為50yL、震蕩時(shí)間為 20s，開啟自動進(jìn)樣進(jìn)行測試，得到空白水樣發(fā)生反應(yīng)后的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度分別與待測水樣、 標(biāo)準(zhǔn)溶液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的差值（即相對發(fā)光強(qiáng)度AI = I〇-I)，由結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對 發(fā)光強(qiáng)度與結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2,標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y = 78444Ln(x) + 124295(R2 = 0.9939)，由待測水樣反應(yīng)后的相對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度計(jì)算待測水樣的結(jié)晶紫濃 度為10.43ng · mL-、
[0025]考察檢測方法的回收率:取5yL初始濃度為Img · ml/1的結(jié)晶紫溶液，用預(yù)處理后的 待測水樣稀釋成10mL，此時(shí)濃度為50ng · mL-S再倍比稀釋成25ng · mL-1UOng · mL-1Jng · mL'得到4個(gè)添加后的待測水樣，并設(shè)空白樣，按照50μ!7孔的體積用量分別加入到微孔板 的微孔中，每個(gè)添加后的待測水樣及空白樣均設(shè)11個(gè)平行孔，開啟自動進(jìn)樣進(jìn)行測試，得到 空白樣發(fā)生反應(yīng)后與添加后的待測水樣的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的差值（即相對發(fā)光強(qiáng)度A I = I0-I)，計(jì)算得到該檢測方法的回收率為89.4~112.5%，RSD〈10.4%。
[0026]最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護(hù) 范圍的限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行若干推演或者等 同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于化學(xué)發(fā)光的結(jié)晶紫檢測方法，包括以下步驟： 由碳酸鈉溶液、碳酸氫鈉溶液或碳酸鈉與碳酸氫鈉的混合溶液與魯米諾配制濃度為 1.0X10-6mol · L-1~1.0X10-4mol · L-1的魯米諾工作液，另配制濃度為IOyg · mL-1~1.0X 104yg · ml/1的過氧化氫水溶液，分別檢測空白水樣及待測水樣與過氧化氫水溶液及魯米諾 工作液在避光條件下反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度，記為Io和I，計(jì)算得到相對發(fā)光強(qiáng)度AI = I〇-I，對照 標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到待測水樣中結(jié)晶紫的濃度。2. 如權(quán)利要求1所述的基于化學(xué)發(fā)光的結(jié)晶紫檢測方法，其特征在于，所述碳酸鈉溶 液、碳酸氫鈉溶液或碳酸鈉與碳酸氫鈉的混合溶液的濃度為〇.〇5mol · IZ1~0.20mol · L一S pH 值為9.5~13.0〇3. 如權(quán)利要求1所述的基于化學(xué)發(fā)光的結(jié)晶紫檢測方法，其特征在于，所述待測水樣中 結(jié)晶紫的濃度為2~800ng · mL一、4. 如權(quán)利要求1所述的基于化學(xué)發(fā)光的結(jié)晶紫檢測方法，其特征在于，所述反應(yīng)的時(shí)間 為IOs~30s。5. 如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的基于化學(xué)發(fā)光的結(jié)晶紫檢測方法，其特征在于，所述基 于化學(xué)發(fā)光的結(jié)晶紫檢測在帶有多個(gè)樣品檢測槽、自動進(jìn)樣裝置及化學(xué)發(fā)光檢測裝置的設(shè) 備中進(jìn)行。
【文檔編號】G01N21/76GK105891190SQ201610207824
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月4日
【發(fā)明人】趙肅清, 楊靈珊, 焦洛瑩, 秦靜, 夏娜娜, 沈定
【申請人】廣東工業(yè)大學(xué)