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一種快速定量檢測h-fabp的時間分辨熒光免疫層析試劑及制備方法

文檔序號:10533094閱讀:750來源:國知局
一種快速定量檢測h-fabp的時間分辨熒光免疫層析試劑及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種快速定量檢測H?FABP的時間分辨熒光免疫層析試劑及其制備方法,屬于臨床醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域。該試劑由試紙條和熒光液兩部分組成。其中,試紙條包括底板、Fusion5、硝酸纖維素膜和吸水墊;所述Fusion5、硝酸纖維素膜和吸水墊水平方向順序連接固定于底板上。所述硝酸纖維素膜上包被有H?FABP單克隆抗體1的檢測線和兔IgG抗體構(gòu)成的質(zhì)控線。熒光液包含H?FABP單克隆抗體2標(biāo)記的時間分辨熒光微球、羊抗兔抗體標(biāo)記的時間分辨熒光微球。本發(fā)明利用時間分辨熒光微球提高熒光強(qiáng)度,降低背景信號,同時定量檢測全血、血清或血漿中的H?FABP含量,樣本僅需要10~20微升。該試紙條具有方便快捷、操作簡單、檢測時間短、特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確,適用于臨床POCT的快速診斷。
【專利說明】
一種快速定量檢測H-FABP的時間分辨熒光免疫層析試劑及制 備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域,具體涉及一種快速定量檢測H-FABP的時間分辨熒 光免疫層析試劑及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪酸結(jié)合蛋白(FABPs)在活性脂肪酸代謝的組織中大量存在,如心臟和肝臟,它 們的主要功能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的長鏈脂肪酸運(yùn)輸。現(xiàn)已確定九個不同類型的FABP,其中,H-FABP (心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白)是最廣泛的,因?yàn)樗罅看嬖谟谛募〖?xì)胞。其低分子量和細(xì)胞質(zhì) 的位置相結(jié)合,使H-FABP成為急性冠脈綜合癥(尤其是胸痛發(fā)作6小時內(nèi))的一個高敏的早 期標(biāo)志物,缺血性發(fā)作30分鐘后即可檢測。這可能是因?yàn)樵谛募∪毖托募乃酪院?,它?速從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)。H-FABP在6-8小時左右達(dá)到濃度峰值,然后在24-30小時左右恢 復(fù)至正常水平。如此迅速恢復(fù)至正常水平得益于高腎清除率,這意味著H-FABP不僅能夠用 作AMI早期標(biāo)志物,還是理想的心肌梗死復(fù)發(fā)診斷標(biāo)志物。盡管H-FABP的釋放特點(diǎn)與肌紅蛋 白相似,但其心肌特異性是肌紅蛋白的15-20倍;因此H-FABP是更有效的心肌損傷標(biāo)志物。 此外,H-FABP的正常血清/血漿值比肌紅蛋白低,從而降低假陽性比率。
[0003] 相較于單獨(dú)使用肌鈣蛋白的情況,使用H-FABP和肌鈣蛋白的組合已證實(shí),在癥狀 出現(xiàn)后的早期(〈4小時或〈6小時),可顯著改善MI/ACS的診斷敏感性。關(guān)于預(yù)后,一些大型臨 床試驗(yàn)中肌鈣蛋白陽性和肌鈣蛋白陰性的患者分層長期ACS的風(fēng)險已經(jīng)說明了H-FABP的價 值。即使在使用高度敏感的肌鈣蛋白的情況下,診斷和預(yù)后,也常增添H-FABP。除了ACS,H-FABP還用于其他范圍,例如肺栓塞(PE),冠狀動脈搭橋手術(shù)(CABG)和腦血管疾病。
[0004]時間分辨熒光(TRF)分析技術(shù)是以具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘蔫|系元素及其螯合劑作為 示蹤物,建立的一種新型的非放射性微量分析技術(shù)。自從1983年P(guān)ettersson等采用時間分 辨熒光免疫分析(TRFIA)法定量測定hCG以來,TRFIA方法學(xué)研究和臨床應(yīng)用發(fā)展迅速,成為 既RIA之后標(biāo)記免疫分析發(fā)展的一個新的里程碑,國內(nèi)外相繼研制出了多鐘TRFIA儀和配套 的商業(yè)化試劑盒。TRFIA技術(shù)具有靈敏度高、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、操作簡便、無放射性污染、多 標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn),廣泛地應(yīng)用于腫瘤、傳染病、內(nèi)分泌疾病、自身免疫性疾病、遺傳性疾病的臨床 實(shí)驗(yàn)室診斷,已成為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床超微量生化檢驗(yàn)常用的分析手段之一。將TRF、聚 苯乙烯微球及硝酸纖維素膜結(jié)合,可用于快速體外診斷領(lǐng)域。專利(ZL03819391.4)涉及一 種采用時間分辨熒光的基于膜的檢測,用于檢測測試樣本中分析物的存在和含量;專利(CN 202149903 U)發(fā)明C反應(yīng)蛋白時間分辨熒光免疫層析定量檢測;專利(CN 202166649 U)發(fā) 明新喋呤時間分辨熒光免疫層析定量檢測試紙條;專利(CN 102879559 A)發(fā)明一種時間分 辨熒光免疫層析即時定量檢測試劑盒方法;專利(CN 103760368 A)發(fā)明一種AFP和Free-P-HCG時間分辨熒光雙標(biāo)的定量檢測試劑盒;專利(CN 204514928 U)發(fā)明一種基于時間分辨 熒光免疫層析法檢測胃蛋白酶原I和II的試紙條以及其應(yīng)用的試紙條。
[0005]專利(CN 2783324 Y)發(fā)明一種心血管疾病診斷和預(yù)測多指標(biāo)蛋白芯片檢測試劑 盒,用于CRP、My o、cTn I、cTnT、NT-proBNP、CKMB、H-FABP、GPBB 的聯(lián)合檢測。
[0006] 專利(CN 102226811B)發(fā)明一種檢測尿液中心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白診斷試劑的制 備方法,主要采用固相膠體金免疫層析法。
[0007] 專利(CN102520194B)發(fā)明一種定量檢測人心臟脂肪酸結(jié)合蛋白的熒光免疫層析 試劑盒,主要采用基于量子點(diǎn)標(biāo)記的固相免疫層析法。
[0008] 專利(CN102608325A)發(fā)明一種脂肪酸結(jié)合蛋白測定試劑盒,主要采用膠乳增強(qiáng)免 疫比濁法。
[0009] 專利(CN102628864B)發(fā)明一種膠乳增強(qiáng)免疫比濁法測定血清或尿液中心臟型脂 肪酸結(jié)合蛋白的試劑盒。
[0010] 專利(CN102788880A)發(fā)明一種心型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測試劑盒及其制備方法,主 要采用免疫比濁法。
[0011] 專利(CN103123319B)發(fā)明一種心型脂肪酸結(jié)合蛋白含量檢測試劑盒及其制備方 法,主要采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法。
[0012] 專利(CN103543272A)發(fā)明一種同時檢測心型脂肪酸結(jié)合蛋白和肌鈣蛋白I的快速 定量檢測裝置及檢測方法,主要采用膠體金免疫層析法。
[0013] 專利(CN104215772A)發(fā)明一種心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測試劑盒及其制備方法, 主要采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法。
[0014] 專利(CN104330576A)發(fā)明一種心型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測試劑及其制備方法,主要 采用膠體金顆粒進(jìn)行標(biāo)記。
[0015] 專利(CN104678098A)發(fā)明一種心肌肌鈣蛋白I和心型脂肪酸結(jié)合蛋白聯(lián)檢試紙制 備方法,主要采用膠體金固相免疫層析方法。
[0016] 專利(CN104714015A)發(fā)明一種心型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測試劑盒及檢測方法,主要 采用固相熒光免疫層析法。
[0017] 專利(CN203490224U)發(fā)明一種人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白免疫層析試紙條,主要采 用上轉(zhuǎn)發(fā)光固相免疫層析法。
[0018] 專利(CN204228721U)發(fā)明一種心型脂肪酸結(jié)合蛋白定量檢測試紙條,主要采用固 相熒光免疫層析法。
[0019] 專利(CN204287199U)發(fā)明一種心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白免疫層析定量檢測試紙條, 主要采用固相熒光免疫層析法。
[0020] 專利(CN204405681U)發(fā)明一種用于心型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測的試紙條,主要采用 量子點(diǎn)熒光免疫層析法。
[0021] 目前,H-FABP檢測的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法、膠乳增強(qiáng)免疫比濁法、膠體金免 疫層析法、熒光免疫層析法等。酶聯(lián)免疫吸附法操作復(fù)雜、檢測時間長、檢測范圍窄;膠乳增 強(qiáng)免疫比濁需要結(jié)合大型儀器,成本高;膠體金免疫層析法定性或定量檢測,靈敏度低、線 性范圍窄,不能滿足定量、準(zhǔn)確檢測的要求;熒光免疫層析法大多數(shù)采用熒光素或其他物質(zhì) 作為發(fā)光源,雖然有較高的線性范圍,但受背景信號的干擾,不能夠保證低端靈敏度。
[0022] 盡管時間分辨熒光免疫層析法已經(jīng)廣泛用于多種項(xiàng)目的檢測,但是大多數(shù)都采用 將時間分辨熒光微球固定在結(jié)合物釋放墊上,由于微球的釋放不均一,導(dǎo)致不精密度很大, 無法滿足靈敏度要求高的項(xiàng)目,尤其是肌鈣蛋白I的檢測。此外,為了檢測全血樣本,多數(shù)廠 家的樣品墊采用人工處理過玻璃纖維作為結(jié)合物釋放墊,同樣增加了不精密度。
[0023] 綜上所述,在H-FABP定量檢測時,迫切需要一種樣本量少、精密度高、檢測背景信 號低、靈敏度高、線性范圍寬、樣品墊不需處理就能檢測全血樣本的時間分辨熒光免疫層析 試劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0024] 本發(fā)明的目的是提供一種快速定量檢測H-FABP的時間分辨熒光免疫層析試劑,該 試劑能在較短的檢測時間內(nèi)完成H-FABP的檢測,檢測時間短,檢測靈敏度高。
[0025] 本發(fā)明還提供了快速定量檢測H-FABP的時間分辨熒光免疫層析試劑的制備方法。
[0026] -種快速定量檢測H-FABP的時間分辨熒光免疫層析試劑由試紙條和熒光液兩部 分組成
[0027]所述的試紙條包括底板(l)、Fusi〇n5(2)、硝酸纖維素膜(3)和吸水墊(4)。
[0028]所述Fusion5(2)、硝酸纖維素膜(3)和吸水墊(4)水平方向順序連接固定于底板 上。
[0029]所述的熒光液(7)包含H-FABP單克隆抗體2標(biāo)記的時間分辨熒光微球、羊抗兔抗體 標(biāo)記的時間分辨焚光微球
[0030] 所述硝酸纖維素膜(3)上包被有H-FABP單克隆抗體1(5)、的檢測線和兔IgG抗體 (6)構(gòu)成的質(zhì)控線。
[0031] 所述的時間分辨熒光微球選自修飾過的聚苯乙烯微球。
[0032]所述的聚苯乙稀微球,表面修飾官能團(tuán)為羧基、羥基或環(huán)氧基的一種,粒徑為100 ~500nm。
[0033]所述的時間分辨熒光微球內(nèi)部填充鑭系元素的螯合物。
[0034] 所述的鑭系元素為銪、釤、鉍、鏑中的一種。
[0035] 所述的時間分辨熒光微球標(biāo)記步驟如下:
[0036] (1 )H_FABP單克隆抗體2標(biāo)記時間分辨熒光微球的制備及稀釋:
[0037]將時間分辨熒光微球溶于MES緩沖液中,加入活化劑活化;隨后加入氨基乙酸,使 得微球表面連接手臂;洗滌、離心后,再次加入活化劑活化;再次洗滌、離心,將時間分辨熒 光微球用硼酸緩沖液復(fù)溶,隨后加入H-FABP單克隆抗體2進(jìn)行反應(yīng),硼酸緩沖液、微球與抗 體的質(zhì)量比為l〇mg: 0.0 lmg~10mg: 2. Omg;反應(yīng)完后加入封閉劑進(jìn)行封閉;封閉過后,洗滌、 離心,再次用硼酸緩沖液及封閉劑復(fù)溶、超聲,使微球均勻分散在緩沖液中,2-8°C避光保 存。選擇合適的緩沖液稀釋熒光微球,工作濃度在〇. 5~50μg/ml,用于H-FABP性能的評估。 [0038] (2)羊抗兔抗體標(biāo)記的熒光微球的制備及稀釋過程同(1)所述。
[0039] 優(yōu)選的,采用銪粒子螯合物填充的時間分辨熒光微球,粒徑為:100~500nm;
[0040] 優(yōu)選的,微球與抗體的包被比例為:10mg: 0.0 lmg~10mg: 2. Omg;
[00411優(yōu)選的,熒光液的工作濃度為:0 ? 5~50μg/ml;
[0042] 一種快速定量檢測H-FABP的時間分辨熒光免疫層析試劑及制備方法,包括如下步 驟:
[0043] (1)制備檢測線和質(zhì)控線:硝酸纖維素膜(3)在免疫熒光試紙條中用于固定包被抗 體,同時也是免疫反應(yīng)的發(fā)生的場所;檢測線(5)是將H-FABP單克隆抗體1使用檸檬酸鹽或 蔗糖稀釋液稀釋,劃線于所述硝酸纖維素膜(3)上;質(zhì)控線(6)是將兔IgG抗體使用檸檬酸鹽 或蔗糖稀釋液稀釋,劃線與所述硝酸纖維素膜(3)上。將劃好的硝酸纖維素膜置于真空干燥 箱(37~45°C),烘干24~48小時。檢測線(5)位于質(zhì)控線(6)左側(cè),即液體首先接觸的位置;
[0044] (2)試紙條的組裝:試紙條底板(1)由左到右依次粘附Fusion5(2)、硝酸纖維素膜 (3)、吸水紙(4)。將組裝好的大板切成小條,即得到所述快速定量檢測H-FABP的時間分辨熒 光免疫層析試紙條。
[0045] 優(yōu)選的,檸檬酸鹽或蔗糖稀釋液稀中檸檬酸鹽或蔗糖占5-20% ;
[0046] 優(yōu)選的,檢測線和質(zhì)控線抗體的劃膜濃度為0.5~2mg/ml;
[0047]優(yōu)選的,檢測線和質(zhì)控線抗體的劃膜噴量為0.5~2. Oyl/cm;
[0048]以上快速定量檢測H-FABP的時間分辨熒光免疫層析試劑的檢測方法,其步驟包 括:
[0049] (1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:取10~2(^1的1?^?標(biāo)準(zhǔn)品與80~50(^1的熒光混合液(11- FABP、羊抗兔熒光液)混合,取混合液70~100y 1滴加到試紙條的Fus ion5上,反應(yīng)時間15~ 20分鐘,通過與試紙條配套的時間分辨免疫層析定量分析儀讀取系統(tǒng)檢測信號,然后以標(biāo) 準(zhǔn)品的各濃度為橫坐標(biāo),各濃度系統(tǒng)檢測信號的平均值為縱坐標(biāo),擬合制備標(biāo)準(zhǔn)品曲線; [0050] (2)待測樣品的檢測,分別取10~20yl的待測樣品與80~500yl的熒光混合液(H- FABP、羊抗兔熒光液)混合,取混合液70~100y 1滴加到試紙條的Fus ion5上,反應(yīng)時間15~ 20分鐘,通過系統(tǒng)檢測信號的值即可得到待測樣品中的H-FABP的濃度值。
[0051 ]所述(1)中,H-FABP標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為:0、1、2、5、10、20、40、80、120ng/ml;
[0052]本發(fā)明的有益效果是:
[0053] (1)本發(fā)明采用Fusion5為樣品墊,摒棄了傳統(tǒng)的樣品墊及結(jié)合物釋放墊,無需預(yù) 處理,可以進(jìn)行全血、血清、血漿樣本的檢測,能夠極大的提高檢測精密度和準(zhǔn)確性。
[0054] (2)本發(fā)明將熒光液置于硝酸纖維素膜之外,不同于傳統(tǒng)方法將熒光微球固定于 結(jié)合物釋放墊上,不存在熒光微球釋放不均一的現(xiàn)象,同樣能夠極大的提高檢測精密度和 準(zhǔn)確性。
[0055] (3)本發(fā)明采用銪粒子螯合物填充的時間分辨熒光微球,由于其大的Stokes位移 (激發(fā)波長為340nm左右,發(fā)射波長為615nm左右,差值為275nm左右),能夠明顯降低背景信 號值,提高檢測的靈敏度。
[0056] (4)本發(fā)明的采用極少的樣本量(10~20yl),能夠有效的排除樣本的干擾。
【附圖說明】
[0057] 圖1是本發(fā)明快速定量檢測H-FABP的時間分辨熒光免疫層析試劑的結(jié)構(gòu)示意圖(1 為底板、2為Fusi〇n5、3為硝酸纖維素膜、4為吸水墊、5為H-FABP檢測線、6為兔IgG質(zhì)控線): [0058]圖2是本發(fā)明H-FABP的標(biāo)準(zhǔn)品曲線;
[0059] 圖3是本發(fā)明奧普與膠乳增強(qiáng)免疫比濁H-FABP的相關(guān)性曲線;
【具體實(shí)施方式】
[0060] 下面結(jié)合實(shí)施例,對本發(fā)明作進(jìn)一步說明:
[0061 ]本發(fā)明中,H-FABP抗體和熒光微球的供應(yīng)商和貨號如下所示
[0063] 實(shí)施例1
[0064] H-FABP時間分辨熒光免疫層析試紙條的制備:
[0065] (1)檢測線(T)溶液的制備:用10倍、50mM的檸檬酸鹽溶液稀釋H-FABP單克隆抗體1 至1~2mg/ml;
[0066] (2)質(zhì)控線(C)溶液的制備:用用10倍、50mM的檸檬酸鹽溶液稀釋兔I gG抗體至1~ 2mg/ml;
[0067] 在帶有背膠的底板(1)上采用搭接的方式,首先粘貼硝酸纖維素膜(3),然后再硝 酸纖維素膜(3)的兩端分別粘貼Fusion5膜(2)和吸水紙(4)。在硝酸纖維素膜(3)且靠近 Fusion5膜⑵處,劃T(H-FABP捕獲線(5))、,在靠近吸水紙(4)的一端劃C(兔IgG)線,T、C的 間距為5mm。
[0068] 在T線處劃T線,在C線處劃C線。T線抗體的終濃度為lmg/ml,C線兔IgG的終濃度為 lmg/ml,C、T線的噴量為1 .Oyl/crn。
[0069]將噴好的大卡置于37°C恒溫烘箱中烘烤24小時。烘烤完后,在濕度小于40%的房 間,用切條機(jī)將其切成3.85mm寬度的試紙條,將其裝入塑料殼中壓實(shí),然后裝入一袋干燥 劑,封口置于干燥柜中保存,待用。具體如圖1所示。
[0070] 實(shí)施例2
[0071 ] H-FABP時間分辨熒光免疫層析試紙條的檢測 [0072] (1)制備H-FABP、羊抗兔時間分辨熒光微球
[0073] 將時間分辨熒光微球(粒徑為200nm左右)溶于100mM MES緩沖液(PH為6.0)中,加 入活化劑(NHS,20mg/ml; EDC,20mg/ml)活化15分鐘;洗滌、離心,將時間分辨熒光微球用 60mM硼酸緩沖液(PH為8.5)復(fù)溶,隨后加入H-FABP單克隆抗體2進(jìn)行反應(yīng)2小時(微球與抗體 的質(zhì)量比在l〇mg:0.5mg);反應(yīng)完后加入封閉劑(BSA,100mg/ml)進(jìn)行封閉2小時;封閉過后, 洗滌、離心,再次用60mM硼酸緩沖液(PH為8.5)及封閉劑(BSA,100mg/ml)復(fù)溶、超聲,使微球 均勻分散在緩沖液中,2-8 °C避光保存。
[0074] 羊抗兔抗體標(biāo)記的熒光微球的制備過程同H-FABP制備微球的過程相同。
[0075] (2)滴配
[0076]用PH為8.0、200mM的Tris緩沖液將步驟(1)中的H-FABP、羊抗兔包被的熒光微球進(jìn) 行稀釋。其中,H-FABP包被的熒光微球稀釋200~300倍,羊抗兔包被的熒光微球稀釋2000~ 3000倍,混合后即為所需要的熒光混合液。
[0077] (3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0078] 用小牛血清稀釋H-FABP標(biāo)準(zhǔn)品,濃度為:0、1、2、5、10、20、40、80、120ng/ml。分別取 1 〇y 1混合標(biāo)準(zhǔn)品與80y 1熒光混合液混合,再取80y r混合液滴加載實(shí)施例1中的H-FABP時間 分辨熒光免疫層析試紙條上,反應(yīng)15分鐘后,通過與H-FABP時間分辨熒光免疫層析試紙條 配套的免疫層析讀數(shù)儀,讀取系統(tǒng)檢測信號,每個混合標(biāo)準(zhǔn)品的濃度檢測三次,具體數(shù)值如 表1所示。表1標(biāo)準(zhǔn)品檢測值
[0081 ]由表1數(shù)據(jù)可知,H-FABP的靈敏度可達(dá)lng/ml,檢測上限可達(dá)120ng/ml。本發(fā)明H-FABP檢測性能均優(yōu)于膠體金層析法,同膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑性能相近,體現(xiàn)出時間分辨 熒光免疫層析法的優(yōu)勢。
[0082] (4)制作 ID 卡:
[0083]以標(biāo)準(zhǔn)品H-FABP濃度值為橫坐標(biāo),各濃度的系統(tǒng)檢測信號平均值為縱坐標(biāo),繪制 標(biāo)準(zhǔn)品曲線,具體如圖2所示,燒錄ID卡,并導(dǎo)入配套儀器中。
[0084] 實(shí)施例3 [0085]精密度檢測
[0086]用實(shí)施例2中的測試方法,測試H-FABP的標(biāo)準(zhǔn)品(濃度為10和80ng/ml),每個標(biāo)準(zhǔn) 品重復(fù)檢測十次,具體檢測數(shù)值如下表2所示。
[0087]表2精密度測試結(jié)果表
[0090] 如表2數(shù)據(jù)可知,采用本發(fā)明的H-FABP檢測試紙條,H-FABP的精密度小于10%,完 全符合P0CT產(chǎn)品精密度小于15 %的要求。
[0091] 實(shí)施例4
[0092]臨床樣本的相關(guān)性檢測
[0093]用實(shí)施例2中的測試方法,選取40例國外膠乳增強(qiáng)免疫比濁法檢測H-FABP的臨床 樣本(樣本濃度覆蓋標(biāo)準(zhǔn)品的檢測范圍),采用上海奧普生物的H-FABP試劑進(jìn)行檢測。具體 檢測結(jié)果如表3所示。
[0094]表3上海奧普三聯(lián)檢測與膠乳增強(qiáng)免疫比濁法檢測數(shù)據(jù)

[0097]以膠乳增強(qiáng)免疫比濁法檢測的H-FABP濃度為橫坐標(biāo),上海奧普生物檢測H-FABP濃 度為縱坐標(biāo),繪制樣本相關(guān)性曲線。如圖3。其中,H-FABP的相關(guān)性方程為y = 0.935x+l. 163, 相關(guān)性系數(shù)R大于0.95,完全符合臨床試驗(yàn)的要求。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種快速定量檢測H-FABP的時間分辨熒光免疫層析試劑,其特征在于:該試劑由試 紙條和熒光液兩部分組成;所述的試紙條包括底板(l)、Fusi 〇n5(2)、硝酸纖維素膜(3)和吸 水墊(4); 所述Fusion5(2)、硝酸纖維素膜(3)和吸水墊(4)水平方向順序連接固定于底板上; 所述的熒光液(7)包含H-FABP單克隆抗體2標(biāo)記的時間分辨熒光微球、羊抗兔抗體標(biāo)記 的時間分辨焚光微球。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速定量檢測H-FABP的時間分辨熒光免疫層析試劑,其特征 在于:所述硝酸纖維素膜(3)上包被有H-FABP單克隆抗體1 (5 )、的檢測線和兔IgG抗體(6)構(gòu) 成的質(zhì)控線。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速定量檢測H-FABP的時間分辨熒光免疫層析試劑,其特征 在于:所述的時間分辨熒光微球選自修飾過的聚苯乙烯微球。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速定量檢測H-FABP的時間分辨熒光免疫層析試劑,其特征 在于:所述的聚苯乙稀微球,表面修飾官能團(tuán)為羧基、羥基或環(huán)氧基的一種,粒徑為100~ 500nm〇5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速定量檢測H-FABP的時間分辨熒光免疫層析試劑,其特征 在于:所述的時間分辨熒光微球內(nèi)部填充鑭系元素的螯合物。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速定量檢測H-FABP的時間分辨熒光免疫層析試劑,其特征 在于:所述的鑭系元素為銪、釤、鉍、鏑中的一種。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速定量檢測H-FABP的時間分辨熒光免疫層析試劑,其 特征在于:所述的時間分辨熒光微球標(biāo)記步驟如下: (1) H-FABP單克隆抗體2標(biāo)記時間分辨熒光微球的制備及稀釋: 將時間分辨熒光微球溶于MES緩沖液中,加入活化劑活化;隨后加入氨基乙酸,使得微 球表面連接手臂;洗滌、離心后,再次加入活化劑活化;再次洗滌、離心,將時間分辨熒光微 球用硼酸緩沖液復(fù)溶,隨后加入H-FABP單克隆抗體2進(jìn)行反應(yīng),硼酸溶液、微球與抗體的質(zhì) 量比為IOmg: 0 · 0 Img~I Omg: 2 · Omg;反應(yīng)完后加入封閉劑進(jìn)行封閉;封閉過后,洗滌、離心, 再次用硼酸緩沖液及封閉劑復(fù)溶、超聲,使微球均勻分散在緩沖液中,2-8°C避光保存。選擇 合適的緩沖液稀釋熒光微球,工作濃度在〇. 5~50μg/ml,用于H-FABP性能的評估。 (2) 羊抗兔抗體標(biāo)記的熒光微球的制備及稀釋過程同(1)所述。8. -種快速定量檢測H-FABP的時間分辨熒光免疫層析試劑及制備方法,包括如下步 驟: (1) 制備檢測線和質(zhì)控線:硝酸纖維素膜(3)在免疫熒光試紙條中用于固定包被抗體, 同時也是免疫反應(yīng)的發(fā)生的場所;檢測線(5)是將H-FABP單克隆抗體1使用檸檬酸鹽或蔗糖 稀釋液稀釋,劃線于所述硝酸纖維素膜(3)上;質(zhì)控線(6)是將兔IgG抗體使用檸檬酸鹽或蔗 糖稀釋液稀釋,劃線與所述硝酸纖維素膜(3)上。將劃好的硝酸纖維素膜置于真空干燥箱, 在37~45°C下,烘干24~48小時。檢測線(5)位于質(zhì)控線(6)左側(cè),即液體首先接觸的位置; (2) 試紙條的組裝:試紙條底板(1)由左到右依次粘附Fusion5(2)、硝酸纖維素膜(3)、 吸水紙⑷。將組裝好的大板切成小條,即得到所述快速定量檢測H-FABP的時間分辨熒光免 疫層析試紙條。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的快速定量檢測H-FABP的時間分辨熒光免疫層析試劑的制備方 法,其特征在于:所述的檸檬酸鹽或蔗糖稀釋液中檸檬酸鹽或蔗糖占5-20%。
【文檔編號】G01N33/68GK105891508SQ201610223375
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月12日
【發(fā)明人】朱傳增, 石曉強(qiáng), 朱奇朗, 安永君, 張蕾
【申請人】上海奧普生物醫(yī)藥有限公司
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