抗?mif免疫組織化學(xué)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及對組織中的MIF、特別是oxMIF、以及抗?oxMIF抗體的特異性檢測。提供一種檢測方法，其使用免疫組織化學(xué)或免疫熒光法，以及其中使用特異性抗?oxMIF抗體和特異性獨特型單克隆兔抗體。DSM2511020110831 DSM2511120110831 DSM2511220110831 DSM2511320110831 DSM2511420110831 DSM2511520110831 DSM2585920120412 DSM2586020120412 DSM2586120120412 DSM2586220120412 DSM2586320120412 DSM2586420120412 DSM2818020131219 DSM2818120131219 DSM2818220131219 DSM2818320131219
【專利說明】
抗-Μ IF免疫組織化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及組織中MIF、特別是oxMIF的特異性檢測。本發(fā)明的檢測方法也使得允 許檢測組織中的抗-MI巧亢體，例如RAM9。提供了 一種檢測方法，其使用免疫組織化學(xué)或免疫 巧光，W及其中使用特異性抗-oxMIF抗體和單克隆兔抗-oxMIF-抗體。本發(fā)明同樣提供了有 利的檢測抗體和一種提供該檢測抗體的方法。本發(fā)明進一步設(shè)及一種用于測定祀標(biāo)飽和度 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 巨隧細胞遷移抑制因子(MIF)是一種細胞因子，最初基于其抑制結(jié)核菌素過敏豚 鼠（含有巨隧細胞)的腹腔滲出細胞的體外隨機遷移能力而被分離(Bloom等，Science 1966 年，153，80-2 ;David等，PNAS 1966年，56，72-7)。今天，MIF作為具有廣譜活性的先天性和獲 得性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵性上游調(diào)控子而被眾所周知。
[0003] 1989年，人的MIF的cDNA被克隆(Weiser等，PNAS 1989，86，7522-6)，其基因定位映 射于22號染色體。人的MIF基因產(chǎn)物是具有114個氨基酸(N-末端蛋氨酸裂解后)且表觀分子 量大約為12.5kDa的蛋白質(zhì)。MIF與任何其他的蛋白質(zhì)沒有顯著的序列同源性。該蛋白質(zhì)結(jié) 晶為相同亞基的Ξ聚體。每個單體包含兩個反向平行的α-螺旋，α-螺旋堆集成四鏈的β-折 疊。所述單體具有另外兩個0鏈，該兩0鏈與相鄰亞單位的0-折疊相互作用從而形成單體之 間的交界面。Ξ個亞單位排布成一個包含溶劑可及的通道的管道，該管道沿分子的Ξ重軸 穿過蛋白質(zhì)的中屯、（Sun 等，PNAS 1996,93,5191-5196)。
[0004] 據(jù)報道，低濃度的糖皮質(zhì)激素可誘導(dǎo)巨隧細胞分泌MIF(Calandra等，Nature 1995,377,68-71)。然而，MIF也反向調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素的作用并刺激其它細胞因子如腫瘤壞 死因子TNF-a和白介素 IL-Ιβ的分泌（Bau曲等，Crit Care Med 2002,30,527-35)。]?^還顯 示出，例如表現(xiàn)為促血管生成、促增殖和抗細胞調(diào)亡的特性，從而促進腫瘤細胞的生長 (Mitchell，R.A.'Cellular Si即ailing,2004.16(1):p.13-19;Lue，H.等，Oncogene 2007.26(35) :p. 5046-59)。它也與例如淋己瘤，黑素瘤和結(jié)腸癌的生長直接有關(guān) (Nishihira等，J Interferon Cytokine Res.2000,20:751-62)。
[0005] MIF是許多病理狀況的中介體，因而與多種疾病相關(guān)，其包括但不限于，尤其是炎 癥性腸?。↖抓）、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、哮喘、血管球性腎炎、 IgA腎病、屯、肌梗死(MI)、敗血癥和癌癥。
[0006] 多克隆抗體和單克隆抗MIF抗體已被研發(fā)，用來抵抗重組的人MIF(化imizu等， F邸S Lett.1996;381，199-202;Kawaguchi等，Leukoc.Biol.1986,39,223-232,和Weiser 等，Cell. Immunol. 1985,90,167-78)。
[0007] 已經(jīng)有人建議抗MIF抗體用于治療用途。據(jù)報道，化laiKlra等(J.Inflamm.(1995)， 47,39-51)使用抗MIF抗體保護動物使其免于來自實驗性誘導(dǎo)的革蘭氏陰性和革蘭氏陽性 敗血性休克。運表明抗MIF抗體可用作一種治療手段來調(diào)節(jié)感染性休克和其它炎性疾病狀 態(tài)中細胞因子的產(chǎn)生。
[0008] 美國專利6,645,493公開了來源于雜交瘤細胞的單克隆抗MIF抗體，其能夠中和 MIF的生物學(xué)活性。在動物模型中表明運些源于小鼠的抗MI巧亢體在內(nèi)毒素引起的休克的治 療上取得了有益的效果。
[0009] 美國專利200310235584公開了一種在動物中制備MIF高親和性抗體的方法，其中 MIF基因已經(jīng)被純合敲除。
[0010] Galat等人描述了糖基化抑制因子（GIF)是一種蛋白質(zhì)化ur. J.Biochem，1994， 224,417-21 )eMIF 和 GIF 現(xiàn)在被認為是相似的。Wa 化 rai 等(PNAS2000,97,13251-6)描述了與 不同的GIF表位結(jié)合的多克隆抗體，W識別Ts細胞中的經(jīng)翻譯后修飾的GIF的生化性質(zhì)。同 上，Wa化ri等報告了體外GIF呈現(xiàn)出不同構(gòu)象的同種型。一類異構(gòu)體通過單個半脫氨酸殘基 的化學(xué)修飾而產(chǎn)生。該化學(xué)修飾導(dǎo)致了 GIF蛋白內(nèi)的構(gòu)象變化。
[0011] 各種疾病在起始之后，特別是炎癥疾病或癌癥起始之后，可W檢測到MIF水平上 升-即MIF總體水平上升。然而，MIF也循環(huán)于健康個體內(nèi)，運使得難W清楚地區(qū)分。相反地， oxMIF不存在于健康個體。oxMIF在疾病狀態(tài)下升高，并且在病人的樣品例如血液、血清和尿 中可W檢測到oxMIF。
[001。 通過對MIF及其抗體的深入研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抗體RAB9、RAB4和RAB0能夠特異性結(jié)合 oxMIF(其不能結(jié)合redMIF)。
[0013] 根據(jù)本申請發(fā)明人的早期研究，表明氧化過程例如脫氨酸介導(dǎo)的氧化、GSSG(ox. 谷脫甘膚)-介導(dǎo)的氧化或MIF與Proclin300或蛋白質(zhì)交聯(lián)劑(如BM0E)的溫育會引起MIF與 上述抗體的結(jié)合。
[0014] 本申請發(fā)明人得出了 W下令人驚異的結(jié)論：
[0015] ?重組MIF (人、鼠、大鼠、CH0、猴）的氧化還原調(diào)節(jié)（脫氨酸/GSSG-介導(dǎo)的輕度氧 化)或使用Proclin300或蛋白質(zhì)交聯(lián)劑處理重組MIF將導(dǎo)致其與百特的抗-MIF抗體RAB9、 RAB巧PRAB0的結(jié)合
[0016] · oxMIF的還原導(dǎo)致抗體結(jié)合減少
[0017] · oxMIF-同種型的特異性與體外生物抗體功效相關(guān)
[001引 · oxMIF水平與疾病狀態(tài)相關(guān)。
[0019] 關(guān)于(οχ)ΜΠ ^^上述額外知識作為本申請發(fā)明人的進一步研究的基礎(chǔ)。
[0020] 已經(jīng)表明，MIF蛋白質(zhì)W不同的同種型存在。通過免疫組織化學(xué)下也稱為IHC) 或免疫巧光（IF)法針對自然產(chǎn)生的、被認為是組織中（例如玻璃片中的組織切片）的MIF相 關(guān)疾病狀態(tài)的強且可靠的標(biāo)志物oxMIF的特異性檢測受阻于下述事實：當(dāng)實施標(biāo)準(zhǔn)的IHC或 IF方法時，oxMIF的結(jié)構(gòu)會受影響或完全喪失。在一些IHC或IF方法中，含有內(nèi)源性生物素或 親和素結(jié)合蛋白質(zhì)和內(nèi)源性過氧化物酶的組織存在很高的背景噪聲。
[0021] 因此，目前顯然需求一種可靠地檢測oxMIF同種型的方法。本申請發(fā)明人解決了該 需求，并且通過W下關(guān)于本發(fā)明的描述實現(xiàn)了其目標(biāo)。特別地，下面描述的本發(fā)明能夠高靈 敏地和特異地檢測組織中的oxMIF和抗-oxMIF抗體，且其背景噪聲低。同樣地，在即使已經(jīng) 使用抗-oxMI巧亢體治療過的病人的組織中，也可W執(zhí)行該方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0022] 本發(fā)明設(shè)及一種檢測oxMIF(ox巨隧細胞遷移抑制因子）的檢測方法。本發(fā)明還設(shè) 及抗-οχΜΙ巧亢體的檢測。該檢測方法是基于免疫組織化學(xué)檢測的原則。它用于組織樣品，特 別是組織切片。
[0023] 優(yōu)選地，運些組織切片被提供在玻璃或塑料載體上，例如載玻片或塑料片。
[0024] 該方法使用特異性oxMIF結(jié)合抗體（"oxMIF結(jié)合物"，抗-oxMIF抗體或一級抗體;運 些表達在本申請中可交替使用）W及特異性獨特型抗-oxMIF結(jié)合物抗體Γ獨特型抗體"或 二級抗體;運些表達在本申請中可交替使用）。
[0025] 在本發(fā)明中用作oxMIF結(jié)合物的抗體優(yōu)選是單克隆抗體。在一個特別優(yōu)選的實施 方式中，如下詳細所述的，單克隆抗-oxMIF抗體選自由RAB9、RAB0和/或RAB4構(gòu)成的組，或選 自由RAM9、RAM0和/或RAM4構(gòu)成的組。
[0026] 而且，本發(fā)明是特別有利的，因為本申請發(fā)明人成功地識別了針對上述oxMIF結(jié)合 抗體的獨特型單克隆抗體，運可W可靠地且特異地檢測與oxMIF結(jié)合的運些oxMIF結(jié)合抗 體。因此，本發(fā)明-在一個實施方式中-設(shè)及此處所述的一級抗體的獨特型抗體。它們也能特 異地結(jié)合到運些一級抗體。優(yōu)選地，當(dāng)一級抗體也結(jié)合于oxMI即寸，它們也可W特異地結(jié)合 運些一級抗體。在一個優(yōu)選的實施方式中，該獨特型抗體是兔獨特型抗體。
[0027] 最優(yōu)選的二級抗體是命名為54-5和68-1的那些，其均已在下面進行了詳細描述。
[0028] 在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供了一種用于提供該二級抗體的方法，其中 執(zhí)行含有oxMIF抗體的化b片段的免疫方法，隨后執(zhí)行中和(neutralizing化LISA篩選。如果 抗體在中和化ISA中的IC5〇《60ng/ml，則被認為是適當(dāng)?shù)亩壙贵w。
[0029] 通過對下述同種型對照抗體(其不能檢測MIF/oxMIF，從而適于用作陰性對照）或 其它抗-oxMIF單克隆抗體(其可W結(jié)合oxMIF但不能被例如抗-RAM9獨特型抗體檢測到）進 行染色可W顯示本發(fā)明所述方法的有利的特異性(也可參見下述的實施例部分），而且該有 利的特異性已經(jīng)通過本申請發(fā)明人的其它發(fā)現(xiàn)(表明oxMIF僅僅可W在病變的例如癌組織 中被檢測到)得到進一步證實。
[0030] 在優(yōu)選的實施方式中，檢測方法包括染色步驟。該創(chuàng)造性的檢測/染色方案被設(shè)計 用于保護組織切片中的oxMIF天然結(jié)構(gòu)。本發(fā)明之前已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)會使得MIF向oxMIF的 轉(zhuǎn)變，因而在免疫組織化學(xué)技術(shù)中產(chǎn)生假陽性染色。
[0031] 本發(fā)明的詳細說明
[0032] 本發(fā)明（部分地)如W下幾項所述：
[0033] 1. 一種免疫組織化學(xué)（I肥)檢測方法，用于oxMIF的體外檢測，其中oxMIF是在個體 的組織樣品中與抗體RAB4、RAB9和/或RAB0差異性結(jié)合的MIF，所述檢測包括測定在體外所 述樣品中化合物與oxMIF的結(jié)合，其中執(zhí)行下述一個W上步驟：
[0034] a)可選的封閉步驟，其使用封閉緩沖液，和
[0035] b)使用一級抗-oxMIF抗體的結(jié)合步驟而沒有使用有機或無機固定劑特別是甲醒 或丙酬的在先固定步驟；
[0036] C)可選的固定步驟；
[0037] d)與二級抗體進行溫育，其中所述二級抗體是針對抗-oxMIF抗體的抗-獨特型兔 單克隆抗體;和/或
[0038] e)檢測一級抗-oxMIF抗體和二級抗體之間的結(jié)合。
[0039] 2.如項目1所述的IHC檢測，其中在第一結(jié)合步驟b)之前，不使用有機或無機固定 劑進行固定，特別是甲醒或丙酬。
[0040] 3.如項目1或2所述的IHC檢測，其中所述樣品是被風(fēng)干的，優(yōu)選被風(fēng)干約30分鐘。
[0041] 4.如項目1至3中任一項或多項所述的IHC檢測，其中，所述一級抗體沒有被標(biāo)記， 例如沒有被生物素化，和/或所述一級抗體優(yōu)選包含在一級稀釋緩沖液中和/或其中所述一 級抗體與樣品溫育，優(yōu)選溫育45至90分鐘，更優(yōu)選約60分鐘。
[0042] 或者，一級抗體和樣品的溫育時間可W是30至90分鐘，更優(yōu)選約30分鐘。
[0043] 5.如項目1至4中任一項或多項所述的IHC檢測，其中，在結(jié)合步驟b)之后進行沖洗 步驟W洗去多余的抗體，W及其中可選地，在全部后續(xù)步驟之后執(zhí)行進一步的沖洗步驟。
[0044] 6.如項目1至5中任一項或多項所述的I肥檢測，其中，所述檢測步驟e)包括染色步 驟或由染色步驟構(gòu)成，和/或其中在檢測步驟之后進行進一步的(復(fù))染色步驟，其包括Ξ級 抗體的使用。
[0045] 7.如項目1至6中任一項或多項所述的IHC檢測，其中，在步驟e)之后使用蘇木精進 行所述(復(fù))染步驟。
[0046] 8.如前述項目中任一項所述的IHC檢測，其中，通過巧光、優(yōu)選通過使用巧光團標(biāo) 記的針對二級抗體的Ξ級抗體，來檢測一級抗體和二級抗體之間的結(jié)合。
[0047] 9.如項目1至8中任一項所述的I肥檢測，其中所述二級抗體是選自于由抗-RAM9抗 體、抗-RAM4抗體構(gòu)成的組，最優(yōu)選抗-RAM9抗體，甚至更優(yōu)選兔抗-RAM9抗體。
[004引 10.如項目1至9中任一項所述的I肥檢測，其中所述一級抗體結(jié)合oxMIF、但不結(jié)合 redMIF。
[00例 11.如項目10所述的IHC檢測，其中差異性結(jié)合是指結(jié)合oxMIF的Kd值小于lOOnM， 優(yōu)選小于50nM，甚至更優(yōu)選小于lOnM; W及不結(jié)合redMIF的特征在于Kd值大于400nM。
[0050] 12.如項目1至11中任一項所述的IHC檢測，其中所述一級抗體選自于由oxMIF結(jié)合 物，例如抗體RAB4、RAB9和/或RAB0和/或RAM4、RAM9和/或RAM0構(gòu)成的組。
[0051] 13.如前述項目中任一項所述的IHC檢測，其中所述樣品是組織活檢，優(yōu)選冰凍組 織活檢，優(yōu)選0CT包埋切片，或針忍活檢。
[0052] 14. 一種獨特型抗體，其可W特異性結(jié)合于抗-oxMIF抗體，優(yōu)選結(jié)合于抗-RAM9抗 體。
[0053] 15.如項目14所述的獨特型抗體，其中，所述抗體的特征在于，其在含有固定的MIF 和 RAM9 的中和(neutralizing 化 LISA 中的 IC5〇《60ng/ml。
[0054] 16. -種獨特型抗體，優(yōu)選如項目14或15所述的獨特型抗體，用于例如如前述項目 中任一項或多項所述的方法或試劑盒，其特征在于SEQ ID NO: 15和/或16,或SEQ ID NO: 17 和/或18。
[0055] 17. -種獨特型抗體，用于例如如前述項目中任一項或多項所述的方法或試劑盒， 其特征在于W保藏編號DSM 28180保藏在DSMZ的重鏈和/或W保藏編號DSM 28181保藏在 DSMZ的輕鏈;或其特征在于W保藏編號DSM 28182保藏在DSMZ的重鏈和/或W保藏編號DSM 28183保藏在DSMZ的輕鏈。
[0化6] 18. -種檢測抗-oxMIF抗體的方法，所述抗-oxMIF抗體優(yōu)選RAM9、RAM0或RAM4，其 特征在于使用針對所述抗-oxMIF抗體的獨特型單克隆兔抗體，優(yōu)選如項目14-17中任一項 所述的獨特型抗體。
[0化7] 19.在一個優(yōu)選的實施方式中，如上述項目18中的檢測方法檢測RAM9。
[0058] 20.-種IHC檢測試劑盒，適于執(zhí)行如前述權(quán)利要求中任一項或多項所述的方法， 和或包含前述項目中任一項或多項所述的抗體。
[0059] 在一個更優(yōu)選的實施方式中，本申請發(fā)明人還提供了如下所述的方法：
[0060] 21. -種通過抗-MIF抗體(優(yōu)選如上述項目1和10至12中所述)測定目標(biāo)組織中的 祀標(biāo)飽和度的方法，其中所述祀標(biāo)飽和度通過如上述項目1-13中任一項所述的方法測定。 [0061 ]用于測定祀標(biāo)飽和度的方法也適用于測定在給藥所述抗-MIF抗體后，抗-MI巧亢體 是否真正到達了目標(biāo)組織及其到達程度。
[0062] 在特別優(yōu)選的實施方式中，該方法也適于測定目標(biāo)組織例如基質(zhì)和腫瘤細胞之間 的飽和度差異。
[0063] 下述實施例5和圖6顯示了該方法的一個可能的實施例。
[0064] 上述(一級)抗體（"oxMIF結(jié)合物"）通過它們的序列和通過保藏為大腸桿菌的質(zhì)粒 (TG1菌株)而表征和支持，包括上述每個抗體RAB0、RAB4和RAB9，W及RAM0、RAM4和RAM9各自 的輕鏈或重鏈。
[0065] 質(zhì)粒的特征在于它們的DSM編號，DSM是根據(jù)布達佩斯條約在德國微生物保藏和細 胞培養(yǎng)中屯、化SMZ)(位于Mascheroder Weg化，布倫瑞克，德國）保藏時得到的官方編號。運 些質(zhì)粒分別保存在大腸桿菌菌株。
[0066] 編號為DSM25110的質(zhì)粒包含抗-MIF抗體RAB4的輕鏈序列。
[0067] 編號為DSM25112的質(zhì)粒包含抗-MIF抗體RAB4的重鏈(IgG4)序列。
[006引質(zhì)粒DSM25110和DSM25112在適宜的宿主細胞內(nèi)的共表達導(dǎo)致了優(yōu)選的抗-MIF抗 體RAB4的產(chǎn)生。
[0069] 編號為DSM25111的質(zhì)粒包含抗-MIF抗體RAB9的輕鏈序列。
[0070] 編號為DSM25113的質(zhì)粒包含抗-MIF抗體RAB9的重鏈(IgG4)序列。
[0071] 質(zhì)粒DSM25111和DSM25113在適宜的宿主細胞內(nèi)的共表達導(dǎo)致優(yōu)選的抗-MIF抗體 RAB9的產(chǎn)生。
[0072] 編號為DSM25114的質(zhì)粒包含抗-MIF抗體RAB0的輕鏈序列。
[0073] 編號為DSM25115的質(zhì)粒包含抗-MIF抗體RAB0的重鏈(IgG4)序列。
[0074] 質(zhì)粒DSM25114和DSM25115在適宜的宿主細胞內(nèi)的共表達導(dǎo)致優(yōu)選的抗MIF抗體 RAB0的產(chǎn)生。
[0075] 同樣被保存的還有抗體RAM0、RAM9和RAM4;均按照布達佩斯條約于2012年4月12日 被保藏于DSMZ(德國，布倫瑞克），使用W下命名：
[0076] RAM9-重鏈:大腸桿菌GA.662-01.pRAM9hc-DSM 25860。
[0077] RAM4-輕鏈:大腸桿菌GA.906-04.pRAM41c-DSM 25861。
[007引 RAM9-輕鏈:大腸桿菌GA.661-01.pRAM91c-DSM 25859。
[00巧]RAM4-重鏈:大腸桿菌GA.657-02.pRAM4hc-DSM 25862。
[0080] RAM0-輕鏈:大腸桿菌GA.906-01.pRAMOlc-DSM 25863。
[0081 ] RAMO-重鏈:大腸桿菌GA.784-01.pRAMOhc-DSM 25864。
[0082]同樣保存了抗體54-5、及68-1;均按照布達佩斯條約于2013年12月19日被保藏于 DSMZ(德國，布倫瑞克），使用W下命名：
[0083] 54-5-重鏈:大腸桿菌TGI抗-RAM9抗體-DSM 28180。
[0084] 54-5-輕鏈:大腸桿菌TG1 抗-RAM9抗體-DSM 28181。
[0085] 68-1-輕鏈:大腸桿菌TG1 抗-RAM9抗體DSM 28183。
[00化]68-1-重鏈:大腸桿菌TG1抗-RAM9抗體-DSM 28182。
[0087] 在本申請的文中，在優(yōu)選的實施方式中，生物樣本是組織樣本，優(yōu)選組織活檢，組 織活檢的冰凍切片(新鮮冷凍或例如0CT包埋），或針忍活檢。然而，除了上述優(yōu)選的樣本，本 領(lǐng)域技術(shù)人員所知的所有已知的組織或細胞樣本均可W用于本發(fā)明的方法。在本文中0CT 包埋設(shè)及一種用于包埋冷凍組織的包埋介質(zhì)，其為一種經(jīng)常使用的程序并在本領(lǐng)域是已知 的。0CT代表最佳切割溫度，其通過使用例如該介質(zhì)得W確保。0CT介質(zhì)可W防止冰凍人工痕 跡例如由水導(dǎo)致的組織破壞的形成。
[0088] 0CT介質(zhì)由10.24 %聚乙締醇、4.26 %聚乙二醇和85.50 %非反應(yīng)性成份組成。該介 質(zhì)，或根據(jù)基本常識的類似介質(zhì)用于在例如低溫恒溫器上進行切片前包埋組織。該介質(zhì)的 輕微變化對本發(fā)明沒有影響。
[0089] 檢測病人的樣品中的oxMIF對于提供可靠的疾病或素亂的診斷中，特別是診斷正 經(jīng)受MIF相關(guān)疾病如(ox)MIF參與的疾病的折磨的病人而言是特別重要的步驟。
[0090] 術(shù)語"預(yù)防性"或"治療性"治療是現(xiàn)有技術(shù)中已知的，其設(shè)及給藥于病人。如果在 臨床上表現(xiàn)出不期望的狀態(tài)(例如宿主，例如人體或動物，出現(xiàn)疾病或其他不期望的狀態(tài)） 之前給藥給定化合物，該治療是預(yù)防性的，即它保護宿主免于發(fā)展成不期望的狀態(tài)，其中如 果是在臨床上表現(xiàn)出不期望的狀態(tài)之后，該治療是治療性的（即它的目的在于減小、改良或 維持現(xiàn)存的不期望的狀態(tài)或其副作用）。
[0091] 此處，抗-(ox)MIF化合物指能夠減弱、抑制、抵制、抵消或降低(ox)MIF的生物學(xué)活 性的任意試劑?？?0 X) ΜIF化合物可W是能夠抑制或中和(0 X) ΜI巧舌性的任意試劑，例如抗 體，特別優(yōu)選本文所述的抗體，更優(yōu)選抗體RAB9、RAB4、和/或RAB0、或RAM9、RAM4和/或RAM0。
【附圖說明】
[0092] 根據(jù)下列附圖進一步描述本發(fā)明：
[0093] 圖1Α:通過對浸潤性膜腺導(dǎo)管癌進行免疫組織化學(xué)來原位檢測oxMIF，其中RAM9為 一級抗體、W及兔抗-RAM9(獨特型，68-1)作為二級抗體。
[0094] 圖1B:圖1A的陰性對照。
[00M]圖2A:通過對正常肺進行IHC來原位檢測oxMIF，其中一級抗體為RAM9,二級抗體為 兔抗-RAM9(獨特型）。
[0096] 圖2B:通過對鱗狀細胞癌進行I肥來原位檢測oxMIF，其中一級抗體為RAM9,二級抗 體為兔抗-RAM9(獨特型）。
[0097] 圖3:單克隆兔抗-RAM9抗體的初級化ISA篩選。
[0098] 圖4a:單克隆兔抗-RAM9抗體的次級化ISA篩選。
[0099] 圖4b:終純化單克隆兔抗-RAM9抗體68-1和54-5的次級化ISA篩選。
[0100] 圖5:通過對浸潤性膜腺導(dǎo)管癌進行免疫組織化學(xué)來原位檢測oxMIF，其中RAM9為 一級抗體、W及兔抗-RAM9(獨特型）、克隆54-5(左)和克隆68-1(右)作為二級抗體。
[0101] 圖6:檢測組織中的抗-MIF抗體RAM9。
[0102] 圖6a:CLL淋己結(jié)，采用RAM9處理。
[0103] 圖化:CLL淋己結(jié)，采用賦形劑處理。
[0104] 圖7:在本發(fā)明的免疫組織化學(xué)之后計算祀標(biāo)飽和度的代表性圖和步驟。
[0105] 圖8:第一列顯示了化L淋己結(jié)組織微陣列的全部玻片掃描（同樣見于實施例5)。每 組一個淋己結(jié)并且染色被選擇性地顯示細節(jié)(第一列的黑色矩形顯示在第二列中）。然而， 針對所有淋己結(jié)執(zhí)行如實施例5所述的計算。在第二列中，深灰色的標(biāo)記強調(diào)組織區(qū)域，其 為手動注釋的(從上面數(shù)第3張和第4張圖片)或通過軟件自動注釋的（從上面數(shù)第1張和第2 張）。由于例如壞死、組織折疊等排除淺灰色區(qū)域。第Ξ列顯示了 W放大后的來自第二列的 注釋區(qū)域的代表性原始圖。第四列中顯示了在通過軟件算法(深灰色至黑色區(qū)域）自動注釋 棟色色原（=RAM9或oxMIF染色的標(biāo)志物區(qū)域)之后的相同的代表性圖。在最后一列中，所有 淋己結(jié)的平均標(biāo)志物區(qū)域描繪在RAM9和oxMIF染色的柱狀圖中。
[0106] 圖9:祀標(biāo)飽和度的計算
[0107] 圖10:腫瘤、基質(zhì)中的祀標(biāo)飽和度W及總體祀標(biāo)飽和度，數(shù)據(jù)表示含有四分差的中 位數(shù)。
【具體實施方式】
[0108] 定義和一般技術(shù)
[0109] 除非此處另有定義，與本發(fā)明相關(guān)的科學(xué)和專業(yè)詞匯應(yīng)當(dāng)具有本領(lǐng)域中的技術(shù)人 員共同理解的含義。通常，此處所用的與細胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、 基因?qū)WW及蛋白質(zhì)和核酸化學(xué)相關(guān)的命名及其技術(shù)是本領(lǐng)域中為人所熟知的和被共同使 用的。本發(fā)明的方法和技術(shù)通常是根據(jù)本領(lǐng)域中為人所熟知的常規(guī)方法來操作的，如本說 明書中引用和討論的各種一般的和更具體的參考文獻中所描述的一樣，除非另有說明。例 如，如Sambrook等的《分子克?。簩嶒炇沂謨浴?，第二版，美國冷泉港實驗室出版社，冷泉港， 紐約（1989)，和Ausubel等的《當(dāng)代分子生物學(xué)實驗指南》，Greene出版協(xié)會（1992),?及 化rlow和Lane的《抗體:實驗室手冊》，美國冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約（1990)，并入 此文W供參考。
[0110] "MIF"或者"巨隧細胞遷移抑制因子"指的是蛋白質(zhì)，其是已知的免疫和炎癥反應(yīng) 中的關(guān)鍵的中介體，特別是作為糖皮質(zhì)激素的反向調(diào)節(jié)劑。MIF包括哺乳動物MIF，特別是人 MIF(Swiss-Prot最初登錄號:P14174)，其中單體形式被編碼成具有115個氨基酸的蛋白質(zhì)， 但是由于初始的甲硫氨酸被切除，產(chǎn)生具有114個氨基酸的蛋白質(zhì)。"MIF"也包括"GIF"(糖 基化抑制因子)及其它形式的MIF如MIF融合蛋白。MIF中氨基酸的編號起始于N末端甲硫氨 酸(氨基酸1)并結(jié)束于C末端丙氨酸(氨基酸115)。
[0111] 根據(jù)本發(fā)明的目的，"氧化的MIF"或oxMIF被定義為MIF的同種型，其通過采用溫和 的氧化劑例如脫氨酸處理MIF得到。如本發(fā)明已經(jīng)顯示的，用運種方法處理的重組oxMIF包 括MIF的同種型，該同種型和oxMIF共享結(jié)構(gòu)重排，其在(例如)動物被細菌攻擊后在體內(nèi)發(fā) 生。
[0112] 根據(jù)本發(fā)明的目的，redMIF定義為還原的MIF，其為不和RAB0、RAB9和/或RAB4結(jié)合 的 MIF。
[0113] 本發(fā)明所述的抗-oxMIF抗體能夠區(qū)分oxMIF和red MIF，所述oxMIF和red MIF分別 通過輕度氧化或還原得到?？?oxMIF抗體可用于特異性檢測oxMIF。運些構(gòu)象體之間的區(qū)別 可通過酶聯(lián)免疫吸附化LISA)或表面等離子體共振進行評估。
[0114]通過Biaco;re評估抗體的差異結(jié)合.
[011日]使用Biacore3000系統(tǒng)，通過表面等離子體共振分析來檢測oxMIF和redMIF與抗體 RAB9和RAB0的結(jié)合動力學(xué)。所述抗體涂覆于CM5(=簇甲基葡聚糖）忍片，并且注射與0.2% Proclin300預(yù)培養(yǎng)的重組MIF蛋白。（Proclin300由氧化異嚷挫酬構(gòu)成，其能夠通過避免 oxMIF向redMIF轉(zhuǎn)化而穩(wěn)定oxMIF結(jié)構(gòu)）。在不添加 ProClin300的天然皿S-EP緩沖液（= Biacore運行緩沖液）中，不能與RAB9、RAB0或相關(guān)抗體(不相關(guān)的同型對照抗體)結(jié)合的重 組MIF蛋白用作陰性(背景)結(jié)合對照。
[0116] 在一個優(yōu)選的實施方式中，oxMIF是與抗體RAB9、RAB4和/或RAB0或其抗原-結(jié)合片 段差異性結(jié)合的MIF，運意味著運些抗體能與oxMIF結(jié)合，而redMIF不能與運些抗體中的任 何一個結(jié)合。
[0117] 在其它實施方式中，抗-oxMIF抗體ToxMIF結(jié)合物"），例如上述抗體或結(jié)合oxMIF 的抗原結(jié)合部分的Kd值小于lOOnM，優(yōu)選Kd值小于50nM，更優(yōu)選Kd值小于lOnM。特別優(yōu)選本發(fā) 明的抗體結(jié)合oxMIF的Kd值低于5nM。
[0118] 針對抗體例如RAB9，RAB4或RAB0(與oxMIF或redMIF)的結(jié)合或不結(jié)合的測定，對于 本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是基本已知的，實施例是下述方法中的任何一個:用重組MIF差異性地 結(jié)合至酶聯(lián)免疫吸附化ISA，或用還原或氧化狀態(tài)下的重組MIF的表面等離子共振，例如眾 所周知的上述的Biacore測定方法。
[0119] 對于確定結(jié)合的一個優(yōu)選方法是抗體與例如rec. (ox)MIF的表面等離子體共振， 在此的"結(jié)合"意味著Kd值低于lOOnM、優(yōu)選低于50nM、甚至更優(yōu)選低于lOnM，其中不結(jié)合 redMIF，其特征在于Kd值超過400nM。"結(jié)合"和"特異性結(jié)合"在本文可交換使用，定義如上 所述。在本申請中，"差異性結(jié)合"是指一種化合物，尤其是如本文中所述的抗體，其可W結(jié) 合oxMIF(例如具有上述Kd值)但不結(jié)合redMIF(如上所述的不結(jié)合）。
[0120] "抗體"指的是完整的抗體或者可與完整的抗體進行(特異性)結(jié)合競爭的抗原結(jié) 合部分。通常參見《基礎(chǔ)免疫學(xué)》，第7章(Paul, W.編著，第2版。Raven出版社，紐約（1989)) (通過引用包含在本文）。術(shù)語抗體包括但不限于人類抗體、哺乳動物抗體、分離的抗體和基 因工程形式的抗體例如嵌合抗體、駱駝化抗體或人源化抗體。
[0121] 術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"指的保留特異性結(jié)合抗原(如(ox)MIF)的能力的抗體 一個或多個片段?？乖Y(jié)合部分可W通過重組DNA技術(shù)或者通過酶法或化學(xué)法裂解完整的 抗體來生成。抗原結(jié)合部分包括但不限于例如下述:Fab、Fab'、F(ab'）2、Fv和互補性決定簇 區(qū)域(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、抗體和多抗體，W及含有至少一部分抗體的多 膚，使得特異性抗原足W與該多膚即OX或redMIF結(jié)合。從N末端至C末端，成熟輕鏈和重鏈可 變區(qū)域兩者都包含區(qū)域。31、〔01?1^1?2^01?2少1?、〔01?3和。1?4。氨基酸至每個結(jié)構(gòu)域的排列 與下述文獻中的定義保持一致:Kabat，參見"免疫學(xué)上感興趣的蛋白質(zhì)序列"（國立衛(wèi)生研 究院，貝塞斯達，馬里蘭州（1987 和 1991))，Chothia 等，J.Mol.Biol.l96:901-917(1987)，或 者化othia等，化化re. 342:878-883( 1989)?？贵w或者其抗原結(jié)合部分可W被衍生化或者被 連接至另一個功能性分子(如另一種膚或蛋白質(zhì)）。例如，抗體或者其抗原結(jié)合部分可W被 功能性地連接至一個或多個其它分子實體比如另一個抗體(如雙特異性抗體或者雙抗體）、 可檢測的試劑、細胞毒素試劑、藥物試劑和/或連接分子。
[0122] 按照本領(lǐng)域技術(shù)人員的公知常識，術(shù)語"Kd"在運里是指，特定抗體相對于各自抗 原的平衡解離常數(shù)。運種平衡解離常數(shù)可W測量較大物體(運里指oxMIF或red MIF復(fù)合物/ 抗體)的分離傾向，即分解成更小的成分(運里指oxMIF或redMIF和抗體）。
[0123] 術(shù)語"人的抗體"是指任何其中可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域序列是人的序列的抗體。 該術(shù)語包含具有來源于人類基因但卻被改變過的序列的抗體，所述改變比如為了減少可能 的免疫原性、增加親和性、去除可能引起不良折疊的半脫氨酸等等。該術(shù)語包含了在非人類 細胞中重組制備的抗體，其能夠如給予人類細胞非典型的糖基化。
[0124] 術(shù)語"人源化抗體"是指包含人類序列及也包含非人類序列的抗體。
[0125] 術(shù)語"駱駝化抗體"是指抗體的結(jié)構(gòu)或序列已改變成更接近于來自于駱駝的抗體， 也被命名為駱駝抗體。駱駝化抗體的設(shè)計和生產(chǎn)方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是一般常識。
[0126] 術(shù)語"嵌合抗體"是指包含來自兩種或W上的不同種類的區(qū)域的抗體。
[0127] 術(shù)語"分離的抗體"或者"其分離的抗原結(jié)合部分"指的是從抗體源比如使隧菌體 展示文庫或者B細胞譜中被識別和挑選的一種抗體或其抗原結(jié)合部分。
[0128] 本發(fā)明的抗-(ox)MIF抗體（"oxMIF結(jié)合物"）的制備包含采用基因工程生產(chǎn)重組 DNA的任意方法，例如通過反向轉(zhuǎn)錄RNA和/或擴增DNA和將其克隆到表達載體中。在一些實 施例中，所述載體是病毒載體，其中額外的DNA片段可W連接到病毒基因組中。在一些實施 方式中，所述載體能夠在被引入的宿主細胞中自主復(fù)制(例如，具有細菌復(fù)制起點的細菌載 體和游離型(episomal)哺乳動物載體）。在其它實施方式中，所述載體(例如非-游離型哺乳 動物載體)在引入宿主細胞時可W整合進宿主細胞的基因組中，從而隨著宿主基因組一起 復(fù)制。此外，特定的載體能夠引導(dǎo)與它們可操作地連接的基因的表達。運樣的載體在本文中 稱為"重組表達載體"（或簡稱為，"表達載體"）。
[0129] 抗-(ox)MIF抗體（"oxMIF結(jié)合物"）尤其可W通過常規(guī)的表達載體來制備，常規(guī)的 表達載體例如為細菌載體(例如，PBR322中和其衍生物)或真核載體。編碼所述抗體的那些 序列可由調(diào)節(jié)宿主細胞的復(fù)制，表達和/或分泌的調(diào)控序列一起被提供。運些調(diào)控序列包括 例如啟動子(例如，巨細胞病毒CMV或SV40)和信號序列。表達載體還可W包括選擇和擴增標(biāo) 記物，如二氨葉酸還原酶基因（DHFR)、潮霉素-B-憐酸轉(zhuǎn)移酶和胸巧激酶。所用載體的組分 例如選擇標(biāo)記物、復(fù)制子、增強子可W購買得到或通過常規(guī)方法制備。載體可W構(gòu)建為在不 同的細胞培養(yǎng)物中的表達，例如哺乳動物細胞例如C冊、COS、肥K293、NS0、纖維組織母細胞， 昆蟲細胞、酵母或細菌例如大腸桿菌。在一些情況下，使用允許給予所表達蛋白質(zhì)最佳糖基 化的細胞。
[0130] 抗-(ox)MIF抗體的輕鏈基因（S)和抗(ox)MI巧亢體的重鏈基因（S)可W被插入到不 同的載體或插入到同一表達載體中。所述抗體基因通過標(biāo)準(zhǔn)方法被插入到表達載體中，例 如通過抗體基因片段和載體上的互補限制性位點的連接，或如果沒有限制位點則通過平末 端連接。
[0131] 抗-(ox)MIF抗體（"oxMIF結(jié)合物"）或其抗原結(jié)合片段的制備可W包括本領(lǐng)域已知 的通過轉(zhuǎn)染將重組DNA導(dǎo)入真核細胞的任何方法，例如通過電穿孔或顯微注射。例如，抗- (ox)MIF抗體的重組表達可通過下述方式實現(xiàn):在受一種或多種調(diào)控序列例如強啟動子的 控制下，將包含編碼抗-(ox)MIF抗體的DNA序列的表達質(zhì)粒通過適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)入適當(dāng) 的宿主細胞株，從而得到所轉(zhuǎn)入的序列已經(jīng)穩(wěn)定整合到基因組的細胞。根據(jù)本發(fā)明，脂轉(zhuǎn)染 法是可使用的轉(zhuǎn)染方法中的一個例子。
[0132] 抗-(ox)MIF抗體（"oxMIF結(jié)合物"）的生產(chǎn)也可W包括本領(lǐng)域中已知的用于培養(yǎng)所 述轉(zhuǎn)化的細胞的任意方法，例如W連續(xù)或分批培養(yǎng)，及抗-(ox)MIF抗體的表達，例如組成性 或誘導(dǎo)性表達。特別是進一步參考在W0 2009/086920中提及的抗-(ox)MIF抗體的生產(chǎn)。在 一個優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的抗-(ox)MI巧亢體可W結(jié)合oxMIF或其表位。根據(jù) 本發(fā)明，特別優(yōu)選的抗體是RAB9、RAB4和/或RAB0 W及RAM9、RAM4和/或RAM0。
[0133] 運些抗體的序列的一部分已經(jīng)公開于W02009/086920;本申請的其它序列如下所 示：
[0164] RAB4的重鏈的氨基酸序列：SEQ ID N0:6

[0241]抗-RAM9-68-化c的氨基酸序列：SEQ ID N0:15
[0271] 本發(fā)明的抗MIF抗體優(yōu)選分離的單克隆抗體。該抗-MIF抗體可W是I gG、IgM、IgE、 IgA、或I曲分子。在其它實施方式中，抗-MIF抗體是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞類。在其它實 施方式中，抗體是亞類IgGl或IgG4的任何一個。在其它實施方式中，抗體是亞類IgG4。在一 些實施方式中，所述的IgG4抗體具有一個單一突變，其將絲氨酸(絲氨酸228,根據(jù)Kabat編 號排列）改變?yōu)楦彼?。因此，IgG4的化區(qū)的子序列CPSC亞序列變?yōu)镃PPC，其為IgGl的亞序 列（Angal等，Mol Immunol，1993，30，105-108)。
[0272] 此外，抗-(ox)MIF抗體（"oxMIF結(jié)合物"）的生產(chǎn)可W包括本領(lǐng)域中已知的用于抗 體純化的任何方法，例如通過陰離子交換色譜法或親和色譜法。在一個實施方式中，抗- (ox)MI巧亢體可W通過體積排阻色譜法從細胞培養(yǎng)物上清液純化而來。
[0273] 術(shù)語MIF的"中屯、區(qū)域"和乂末端區(qū)域"分別是指包含氨基酸第35-68位和氨基酸第 86-115位的區(qū)域的人類MIF，優(yōu)選分別包含人類MIF氨基酸第50-68位和氨基酸第86到102位 的區(qū)域。
[0274] 本發(fā)明的特別優(yōu)選的抗體（即"oxMIF結(jié)合物"）可W結(jié)合至人類MIF的氨基酸第50- 68位或氨基酸第86-102位的任一區(qū)域。運也可W通過優(yōu)選的抗體RAB0、RAB4、RAB2和RAB9的 結(jié)合W及RAM4、RAM9和RAM0的結(jié)合來反映，上述結(jié)合如下所示：
[0275] 348巧郵施4:氨基酸86-102
[0276] RAB9 和 RAM9:氨基酸 50-68
[0277] 3480和1?施0:氨基酸86-102 [027引 3482:氨基酸86-102
[0279] 術(shù)語"表位"包括任何能夠與免疫球蛋白或者抗體片段特異性地結(jié)合的任何蛋白 決定簇。表位決定簇通常由化學(xué)性質(zhì)活躍的表面分子基團比如暴露的氨基酸、氨基糖或者 其他碳水化合物側(cè)鏈組成，并且通常有特定的Ξ維結(jié)構(gòu)特征W及特定的荷電特性。
[0280] 術(shù)語"載體"指的是能夠轉(zhuǎn)運另一個與之相連接的核酸的核酸分子。在一些實施方 式中，載體是質(zhì)粒，即額外的DNA片段可與之相連接的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。
[0281] 術(shù)語"寄主細胞"指的是在引入表達載體后能夠制備重組蛋白質(zhì)的細胞系。術(shù)語 "重組細胞系"指的是已經(jīng)引入重組表達載體的細胞系。應(yīng)當(dāng)理解，"重組細胞系"不僅指特 定的個體細胞系，也指該細胞系的后代。由于突變或者環(huán)境影響，而在后代中可能出現(xiàn)某些 修飾，所W其后代事實上可能和母細胞不一致，但是仍然包括在此處使用的術(shù)語"重組細胞 系"的范圍中。
[0282] 根據(jù)本發(fā)明的宿主細胞的類型例如是COS細胞、C冊細胞或例如皿K293細胞，或本 領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何其他宿主細胞，也包括例如細菌細胞，例如大腸桿菌細胞。在一個 實施方式中，抗-MIF抗體在缺乏DHFR的C冊細胞系中例如DXB11中被表達，其中添加 G418作 為選擇標(biāo)志物。當(dāng)將編碼抗體基因的重組表達載體引入到C冊宿主細胞時，通過將宿主細胞 培養(yǎng)一段足夠長的時間W使得抗體足W在宿主細胞中表達或抗體足W分泌到宿主細胞生 長的培養(yǎng)基中，從而制備抗體。
[0283] 可W使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法將抗(ox)MIF抗體（即"oxMIF結(jié)合物"）從培養(yǎng)基中 回收。
[0284] 令人非常意外的是，本申請發(fā)明人表明可W避免現(xiàn)有技術(shù)中在結(jié)合之前的甲醒固 定步驟，并且具有重要的意義。如果使用(有機或無機)溶劑，即使使用熟知的并通常有用的 固定劑甲醒或丙酬(其在組織切片領(lǐng)域是最常用的固定劑)執(zhí)行固定，樣品中的MIF仍可能 改變它的構(gòu)象，繼而產(chǎn)生假陽性結(jié)果。運可能是由于，雖然僅僅是理論上，固定劑/溶劑誘導(dǎo) 的MIF蛋白質(zhì)中的結(jié)構(gòu)重排，從而導(dǎo)致與oxMIF表位類似的結(jié)構(gòu)。
[0285] 令人驚異地，本申請發(fā)明人表明如果在與一級抗-oxMIF抗體的結(jié)合步驟之前不使 用固定步驟，可W獲得良好的、可靠的結(jié)果。運與本領(lǐng)域技術(shù)人員的期望不同，本領(lǐng)域技術(shù) 人一般認為固定步驟對于提供適當(dāng)?shù)慕Y(jié)果是必要的，因為它已經(jīng)通過該領(lǐng)域所有常用方法 的實踐而得到廣泛的證實。
[0286] 而且，在一個特別優(yōu)選的實施方式中，二級檢測抗體是獨特型單克隆抗體，優(yōu)選獨 特型兔單克隆抗體。已經(jīng)表明運些抗體是特別有利地，因為它們允許oxMIF結(jié)合物抗體例如 RAM9的直接檢測，而不必標(biāo)記oxMIF結(jié)合物。有些時候，標(biāo)記是不利的，因為它可能導(dǎo)致例如 活性損失。本發(fā)明的二級抗體(獨特型)使得允許信號放大和降低檢測方法的背景噪聲。
[0287]本發(fā)明是特別有利的，因為本申請發(fā)明人成功地識別了針對上述oxMIF結(jié)合抗體 的獨特型單克隆抗體，所述oxMIF結(jié)合抗體可W可靠地且特異地檢測結(jié)合了 oxMIF的運些 oxMIF結(jié)合抗體。因此，本發(fā)明-在一個實施方式中-設(shè)及對于此處所述的一級抗體而言是獨 特型的抗體。它們也特異地結(jié)合運些一級抗體。優(yōu)選地，當(dāng)一級抗體被結(jié)合于oxMI即寸，它們 可W特異地結(jié)合運些一級抗體。在一個優(yōu)選的實施方式中，獨特型是單克隆抗體。在一個更 優(yōu)選的實施方式中，獨特型抗體是單克隆兔獨特型抗體。
[028引最優(yōu)選的二級抗體是被命名為54-5和68-1的那些，其如上文或下文中所述。54-5 和68-1抗體是抗-RAM9抗體。
[0289] 在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供了一種用于提供運種二級抗體的方法，其 中使用oxMIF抗體的化b片段執(zhí)行免疫方案，隨后進行中和化ISA篩選。如果在中和化ISA中， 抗體的IC5〇《60ng/ml，則該抗體被認為適合用作二級抗體。
[0290] 在一個非常優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的獨特型抗體選自下組：
[0291] -獨特型(兔)單克隆抗-RAM9抗體，
[0292] -獨特型(兔)單克隆抗-RAM0抗體，和
[0293] -獨特型(兔)單克隆抗-RAM4抗體。
[0294] 最優(yōu)選的，獨特型抗體是
[0295] -獨特型(兔)單克隆抗-RAM9抗體。
[0296] 通過運些獨特型單克隆抗體，可W有利地將早期方法的背景噪聲最小化，并在已 經(jīng)使用oxMIF結(jié)合抗體例如RAM9治療過的病人組織中可靠地檢測oxMIF。
[0297] 本發(fā)明的兔獨特型單克隆抗體模擬oxMIF的結(jié)合表位。它們自身不結(jié)合oxMIF，但 反而結(jié)合一級oxMIF結(jié)合抗體，因此可W提高信號強度。它們可W特異地結(jié)合一級抗體。令 人驚異的是，可W提供特異性抗體和使用化b-片段的免疫方法。"特異性結(jié)合"通過IC50值進 行定義。在中和化ISA中，如果IC50《60,則抗體被認為適用做二級抗體W及特異性結(jié)合。中 和化ISA作為"二級"ELISA在下文中詳細描述。
[029引本發(fā)明也公開了一種提供運種二級抗體的方法。特別地，抗-oxMIF抗體的化b-片 段被用于免疫。在一個優(yōu)選的實施方式中，RAM9的化b-片段用于兔子的免疫。優(yōu)選地，根據(jù) 下面的實施例3所描述的進行免疫。免疫方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是熟知的。在免疫之 后，選擇表現(xiàn)出最高免疫反應(yīng)的那些動物。用于監(jiān)測免疫反應(yīng)的一種優(yōu)選的方法是區(qū)分型 (different ial化LISA，特別是如下所述的初步篩選化ISA。該化ISA例如可W通過使用抗- oxMIF抗體相對于對照來執(zhí)行，如實施例3。通過標(biāo)準(zhǔn)方法得到的兔淋己細胞與適當(dāng)?shù)幕锇?(padner)細胞進行融合，并且執(zhí)行適當(dāng)?shù)摹⑹熘目寺『蛠喛寺〔襟E(見實施例3)。
[0299] 優(yōu)選地，執(zhí)行初步篩選化ISA。初步篩選使用抗-MIF抗體和非特異性人類同種型 和/或純化的總?cè)祟怚gG(作為陰性對照）。測定二級抗體的結(jié)合。如果抗體的信號高出抗- RAM抗體的至少50倍，則認為該抗體適用于初級篩選，相應(yīng)地，抗-RAM抗體為陰性對照。
[0300] 在二次篩選中，繼續(xù)評估那些認為適用于初步篩選的抗體。將（人類)MIF涂覆于 ELISA板上。添加二級抗體的樣品。然后，將抗-οχΜΙ巧亢體的系列稀釋用于校準(zhǔn)，1C日日《60ng/ ml被認為是適當(dāng)?shù)那矣欣摹?br>[0301] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，組織樣品的切片應(yīng)當(dāng)具有2至15μπι的厚度。在 一個更優(yōu)選的實施方式中，運些切片的厚度為5至ΙΟμπι。優(yōu)選的厚度為ΙΟμπι。
[0302] 根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的現(xiàn)有技術(shù)制備新鮮冷凍的或例如OCT包埋的活組織檢 查，并制備具有上述厚度的切片。如果沒有另外的說明，優(yōu)選在室溫下進行下述方法和染色 步驟。
[0303] 在一個優(yōu)選的實施方式中，在開始真正的步驟之前，將切片風(fēng)干20至45分鐘，優(yōu)選 約30分鐘。
[0304] 在本申請的IHC檢測方法中的一個優(yōu)選的實施方式中，樣品，特別是組織樣品，沒 有被固定，特別是沒有使用任何無機或有機固定劑或溶劑例如甲醒或丙酬來固定。然而，在 可選的實施方式中，可W在第一結(jié)合之前，風(fēng)干樣品。特別重要的是，W避免樣品特別是可 能包含(ox)MIF的樣品被氧化的方式執(zhí)行干燥步驟，可W根據(jù)本申請發(fā)明人所述的風(fēng)干來 滿足該要求。需要在沒有干燥成分例如酒精成分的情況下，完成干燥步驟，所述酒精成分含 有氧化特性。
[0305] 特別地，本申請發(fā)明人表明，通過在第一結(jié)合步驟之前不使用固定程序(其意味著 在可選的封閉步驟之前沒有固定），可W避免MIF的氧化;使用其它方式，MIF的結(jié)構(gòu)可能被 重排，因此在隨后的抗體與oxMIF的結(jié)合中導(dǎo)致假陽性結(jié)果。然而，樣品可W在第一結(jié)合步 驟之前被風(fēng)干。
[0306] 針對本發(fā)明的結(jié)合化合物的特異性結(jié)合，優(yōu)選地，使用上述一級抗-οχΜΙ巧亢體。運 些抗體不需要被生物素化或另外標(biāo)記。
[0307] 在另一個實施方式中，可W直接檢測經(jīng)該抗體治療過的病人組織中的抗-oxMIF抗 體。然后根據(jù)本申請所述的方法完成檢測，且如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的該檢測適用于直接 檢測。在一個非限制性實施例中，它可W通過風(fēng)干開始，然后是固定(例如甲醒）、透化、內(nèi)源 性的過氧物酶封閉、使用封閉緩沖液的封閉，W及然后通過添加獨特型抗-RAM9抗體進行。 當(dāng)然，在該實施方式中，不必添加一級抗體來進行該特定的檢測?？蒞參考實施例4，其為該 方法的工作實施方式。
[0308] 本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中的特異性結(jié)合（即一級抗體和oxMIF之間的結(jié)合），在 優(yōu)選的實施方式中可W通過使用封閉緩沖液進行，其可W阻止非特異性結(jié)合。在該實施方 式的一個有利的替換中，封閉緩沖液包含山羊血清、溶于化iS緩沖鹽水(TBS)的血清白蛋白 和魚膠;在一個更優(yōu)選的實施方式中，其包含20 %的正常山羊血清、溶于TBS的2 %的血清白 蛋白和0.2 %的魚膠。在另一個實施方式中，封閉緩沖液包含20 %的正常山羊血清、溶于杜 氏憐酸緩沖液(DPBS)的2%的牛血清白蛋白和明膠。
[0309] 在使用一級抗oxMIF抗體的特異性結(jié)合步驟之前，使用封閉緩沖處理樣品優(yōu)選進 行15至45分鐘，更優(yōu)選進行30分鐘。已經(jīng)表明，如果封閉緩沖也處理進行少于15分鐘，信號/ 噪聲比將劣化，即背景信號相對于特異信號將變得太高。
[0310] 而且，在一個優(yōu)選的實施方式中，一級抗-οχΜΙ巧亢體的濃度為0.3至20μg/ml之間。 特別有利的是，抗oxMIF抗體的濃度范圍在0.5至16μg/ml之間。甚至更優(yōu)選，抗oxMIF抗體的 濃度范圍在1至l〇μg/ml稀釋緩沖液之間，更優(yōu)選1至扣g/ml之間。優(yōu)選地，使用οχΜΙ巧亢體溶 液完全覆蓋該切片，基于該目的，在大部分情況下50化1是足夠的。
[0311] 優(yōu)選地，將一級抗-oxMIF抗體稀釋在一級稀釋緩沖液中。在一個優(yōu)選的實施方式 中，該一級稀釋緩沖液包含溶于TBS的牛血清白蛋白和魚膠，在更優(yōu)選的實施方式中，包含 溶于TBS的2 %的牛血清白蛋白和0.2 %的魚膠。與oxMIF抗體的溫育優(yōu)選進行30至90分鐘， 更優(yōu)選進行50-70分鐘，更優(yōu)選進行約60分鐘。
[0312] 在結(jié)合步驟之后，該切片-在優(yōu)選的實施方式中-應(yīng)當(dāng)短暫地浸在新鮮的TBS(或例 如DPBS;洗涂緩沖液）中W洗去多余的抗體;在另一個實施方式中，當(dāng)封閉緩沖液和稀釋緩 沖液使用DPBS而不是TBS時，所述浸泡應(yīng)該是在新鮮的DPBS中。在浸泡之后，在新鮮的洗涂 緩沖液中的洗涂步驟應(yīng)該進行約5至15分鐘，在一個更優(yōu)選的實施方式中進行10分鐘。
[0313] 作為可選的但非優(yōu)選的步驟-應(yīng)該再第一結(jié)合步驟之后進行-它可能在適當(dāng)?shù)墓?定溶液例如憐酸緩沖甲醒中將樣品固定10至25分鐘，優(yōu)選15至20分鐘。使用甲醒的固定步 驟是可選的，雖然不是優(yōu)選的，其起到維持組織結(jié)構(gòu)的作用。該步驟對(ox)MIF結(jié)構(gòu)沒有負 面影響，也不會導(dǎo)致假陽性結(jié)果。
[0314] 在該可選的步驟之后，優(yōu)選再次浸在TBS(或DPBS)中W洗去多余的甲醒;浸泡時間 如上所述;之后可W在新鮮的TBS(或DPBS，分別地)溫育5-15分鐘，優(yōu)選10分鐘。
[0315] 可選地，然后封閉內(nèi)源性過氧化物酶。運可W通過將組織切片在例如溶于甲醇的 出〇2,優(yōu)選在溶于甲醇0.3%的出化中溫育20-30分鐘而完成。優(yōu)選，通過在TBS中沖洗5-10分 鐘而去掉多余的甲醇。過氧物酶的封閉(PB)可W通過市售過氧物酶封閉劑例如來自DAK0的 雙重內(nèi)源性酶阻斷劑來完成(參見例如實施例4)。如果使用運些市售PB，可W在固定步驟之 后額外地進行透化步驟。在此，可能的工作實施方式為在TBS+0.2%的化itonX-100中溫育5 分鐘。
[0316] 其它方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。
[0317] 通過向反應(yīng)溶液中添加獨特型抗體來進行檢測步驟。W稀釋緩沖液的形式提供獨 特型抗體。濃度優(yōu)選為約0.扣g/ml。該稀釋緩沖液和上述一級抗體的相同。優(yōu)選的溫育時間 為15至45分鐘之間，更優(yōu)選20至40分鐘之間。在另一種方法中，也可W直接使用巧光標(biāo)記或 例如過氧物酶標(biāo)記的獨特型抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可W意識到能夠直接沖洗和形成(標(biāo)記 的過氧化物酶)或直接沖洗和固定(巧光團標(biāo)記）。
[0318] 根據(jù)優(yōu)選的實施方式，在運些步驟之后，應(yīng)該在適當(dāng)?shù)娜旧噭┲羞M行染色?？蒞 使用已知的兔I肥檢測試劑例如SigrmlSlainKBoost I肥檢測試劑(兔)來完成染色?？蛇x地， 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它檢測方法也是合適的，例如巧光團-標(biāo)記的抗體可W用作（第 Ξ)檢測工具，例如作為Alexa Fluor標(biāo)記的抗兔抗體或通過巧光標(biāo)記二級抗體。根據(jù)本申 請發(fā)明人，使用巧光標(biāo)記的實體的檢測表明適于本發(fā)明（參見例如實施例2)。運作為可選的 方式，在實施例3中描述的更詳細且普遍適用的。
[0319] 優(yōu)選的染色試劑是Si即alStain Boost IHC檢測試劑(兔）。染色周期持續(xù)至少20 分鐘，優(yōu)選至少30分鐘，在一個非常優(yōu)選的實施方式中，持續(xù)至少45分鐘。
[0320] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，也可W使用適當(dāng)?shù)摩壙贵w來檢測一級和二級抗體之 間的結(jié)合。
[0321] 優(yōu)選地，將切片再次短暫地浸在TBS(可選地DPBS，如上）W洗去多余的二級試劑； 然后在一個優(yōu)選的實施方式中，進一步在新鮮的TBS或新鮮的DPBS中進行溫育5至15分鐘， 優(yōu)選10分鐘。
[0322] 在優(yōu)選的實施方式中，得到的玻片是通過基質(zhì)例如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適于形 成(development)的基質(zhì)例如ImmPACT DAM基質(zhì)經(jīng)過1至10分鐘，優(yōu)選5分鐘而形成的。
[0323] 然后，在優(yōu)選的實施方式中，將切片短暫地浸在TBS(或DPBS中，如上所述）W洗去 多余的基質(zhì)，然后在新鮮的TBS或可選地DPBS中溫育5至15分鐘，優(yōu)選10分鐘。
[0324] 在上述步驟之后，優(yōu)選進行復(fù)染色步驟來染色核酸；此處可W使用所有已知的用 于免疫組織化學(xué)步驟的染色劑。在一個優(yōu)選的實施方式中，使用蘇木精。該染色應(yīng)該進行 0.5至3分鐘，優(yōu)選1至2分鐘。
[0325] 然后切片使用自來水進行沖洗并短暫地浸潰(優(yōu)選還是再自來水中）W洗去多余 的染色試劑。然后，在可選的實施方式中，進行溫育1至5分鐘，優(yōu)選1至2分鐘。在蘇木精的情 況下，溫育時間不同并取決于從紫色到藍色的顏色變化的發(fā)生。
[0326] 對于顯微鏡檢查，組織切片優(yōu)選根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是熟知的下述方式進行 干燥:例如在70%、隨后是90%、W及純乙醇中進行例如各自2分鐘，然后優(yōu)選在例如二甲苯 中進行至少3分鐘而清除。在另一個實施方式中，干燥步驟在96%至純乙醇中進行2x 20秒。 為了切片的長期儲存，切片使用VECTASTAIN Permamount來封固，并使用蓋玻片覆蓋。干燥 和封固步驟對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言屬于基本常識的一部分。
[0327] 通過下述實施例將進一步解釋本發(fā)明，然而下述實施例不是對本發(fā)明范圍的限 審IJ，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求決定。
[032引實施例
[0329] 實施例1:在浸潤性導(dǎo)管癌病人的膜腺中，通過免疫組織化學(xué)（IHC)進行原位檢測 oxMIF(圖1)
[0330] 使用商購獲得的來自64歲的浸潤性導(dǎo)管癌病人的活組織檢查的冰凍切片。使用 RAM9或不使用RAM9，通過抗獨特型單克隆兔RAM9抗體檢查oxMIF的檢測。
[0331 ]材料和方法
[0332]根據(jù)本領(lǐng)域?qū)＜乙阎募夹g(shù)制備新鮮冷凍的或0CT包埋的玻片(slide)，W10皿進 行切片，并在切片后保存在< = -80°C的條件下。在室溫下進行W下步驟。將冰凍切片風(fēng)干30 分鐘，并使用封閉緩沖液(BB:20%正常山羊血清/2%牛血清白蛋白/0.2%溶于TBS的魚膠） 封閉非特異性結(jié)合15分鐘。然后在沒有一級抗體或在含有溶于一級抗體稀釋緩沖液(PADB: 2 %牛血清白蛋白/0.2 %溶于TBS的魚膠）中的濃度為化g/ml的抗-oxMIF抗體RAM9中，溫育 切片60分鐘。在TBS沖洗之后，將樣品固定在4 % PBS緩沖的甲醒中20分鐘。通過在TBS中沖洗 5-10分鐘洗去多余的甲醒。通過將組織切片在溶于甲醇的0.3%的此化中溫育20分鐘，封閉 內(nèi)源性的過氧化物酶。通過在TBS中沖洗5-10分鐘洗去多余的甲醇/此〇2。通過將組織切片與 稀釋在PADM中的lμg/ml的抗-獨特型兔單克隆抗體(68-1)進行溫育30分鐘，完成檢測。通過 在TBS中清洗5-10分鐘，去除多余的檢測抗體。使用沒gnalStain? Boo St I肥檢測試劑(兔)進 行染色30分鐘。然后，將切片再次在TBS中徹底沖洗10分鐘。通過使用mmPACT DAB底物進行5 分鐘，染色可視化為棟色。在TBS中沖洗玻片，并且使用蘇木精復(fù)染細胞核1-2分鐘。通過在 自來水下沖洗玻片，復(fù)染的顏色從紫色變?yōu)樗{色。為了用于顯微鏡，通過將組織切片各自在 96%乙醇隨后是純乙醇條件下進行2x 20秒W干燥組織切片，隨后在二甲苯中進行2分鐘W 清潔組織切片。為了長期保存，使用VECTASTAIN Permamount固定切片，并使用蓋玻片覆蓋 切片。
[03削結(jié)果
[0334] 和觀察不到染色的正常膜腺組織相比（數(shù)據(jù)未顯示），通過在化nIN導(dǎo)管結(jié)構(gòu)中進 行主染色(深灰染色；即圖1A的深灰色)可W檢測到來自患有浸潤性膜腺導(dǎo)管癌的病人膜腺 中的oxMIF。切片中觀察到的深色結(jié)構(gòu)（附圖1A中的點樣)是來自細胞的細胞核（蘇木精染 色）。應(yīng)該注意到，當(dāng)使用相同的條件而沒有使用上述一級檢測抗體（圖1B)進行染色時，在 來自正?；蚰は侔┙M織的冷凍切片中沒有觀察到染色。
[0335] 通過進行進一步研究，本申請發(fā)明人可W確定，在優(yōu)選的實施方式中，厚度為2至 16皿，或5-10皿的切片是特別有利的。而且，一級抗-oxMIF抗體的濃度范圍在0.5至16yg/ ml，優(yōu)選0.5-^ig/ml，是特別有利的。
[0336] 結(jié)論
[0337] 在病變器官例如患浸潤性膜腺導(dǎo)管癌的病人的膜腺中，可W通過本發(fā)明的IHC技 術(shù)檢測到oxMIF，然而在來自健康膜腺的組織中沒有檢測到oxMIF。
[033引實施例2(圖2):
[0339] 通過對人類肺中的組織活檢進行免疫巧光，可W執(zhí)行原位檢測oxMIF。樣品均來自 于66歲女性捐贈者的正常的肺(圖2A)和來自61歲女性病人的鱗狀細胞癌（圖2B)。
[0340] 步驟；
[CX341]根據(jù)本領(lǐng)域?qū)＜乙阎募夹g(shù)制備新鮮冷凍的或0CT包埋玻片，WlOym進行切片，并 在切片后保存在< = -80°C的條件下。在室溫下進行W下步驟。將冰凍切片風(fēng)干30分鐘，并使 用封閉緩沖液(BB:20%正常山羊血清/2%牛血清白蛋白/0.2%溶于TBS的魚膠)封閉非特 異性結(jié)合20分鐘。然后在含有溶于一級抗體稀釋緩沖液(PADB: 2 %牛血清白蛋白/0.2 %溶 于TBS的魚膠）中的濃度為化g/ml的抗-oxMIF抗體RAM9中，溫育切片60分鐘。在TBS沖洗之 后，將樣品固定在4%PBS緩沖甲醒中20分鐘。通過在TBS中沖洗5-10分鐘去除多余的甲醒。 通過在甲醇中溫育5分鐘來透化組織切片，（或者，在PADB+0.25%TritonX-100中溫育5-10 分鐘也是可行的）。通過在TBS中沖洗5-10分鐘去除多余的甲醇（組織切片未風(fēng)干）。通過將 組織切片與稀釋在PADM中的lμg/ml的抗-獨特型兔單克隆抗-RAM9抗體溫育30分鐘，完成 RAM9的檢測。通過在TBS中清洗5-10分鐘，去除多余的檢測抗體。使用稀釋在PADB中的化g/ ml的AlexaFluo化555標(biāo)記的抗-兔抗體進行30分鐘，完成染色。然后，將切片在PBST(PBS+ 0 . 1 % T W e e η 2 0 )中徹底沖洗10分鐘。為了用于顯微鏡，使用D A PI將組織切片固定在 ProLong孩Gold Antifade試劑中（核復(fù)染）。
[0；342]結(jié)果
[0343]通過本發(fā)明的方法，可W觀察到oxMIF在癌組織中的清晰染色。而在正常肺中沒有 染色。
[0；344]結(jié)論
[0345]在病變器官例如患肺部鱗狀細胞癌的病人的肺中，可W通過本發(fā)明的IF技術(shù)原位 檢測到oxMIF，然而在健康肺組織中沒有檢測到oxMIF。
[0；346] 實施例3
[0347] 制備單克隆兔RAM9抗-獨特型抗體
[0348] 材料和方法
[0349] 單克隆兔抗oxMIF抗體的免疫步驟
[0350] 為了制備特異性單克隆兔獨特型抗體，使用RAM9的化b片段免疫兔子，所述RAM9的 化b片段是通過木瓜蛋白酶酶切和隨后的在化ros S離子交換柱上的純化而制備的。在SDS- PAGE之后，通過考馬斯亮藍染色證實其純度。
[0351] 使用五次注射的標(biāo)準(zhǔn)免疫來完成免疫。
[0352] 針對起始免疫:將0.4mg重組RAM9-Fab與等份的CFA(弗氏完全佐劑)一起混合。動 物皮下接受2(Κ)μ1(4χ 5化1)的混合物。如上所述，使用IFA(弗氏不完全佐劑)對每個動物每 隔3周使用0.2mg劑量，執(zhí)行放大免疫。在第一之前，即在最終免疫加強和通過化ISA的初步 篩選的測試之間和之后，取得血清。在最后一次加強之后，兔子通過靜脈注射己比妥酸鹽進 行人工安樂死。
[0淵]細胞融合
[0354]通過初級篩選化ISA(RAM9相對于預(yù)涂了人類對照抗體，通過山羊抗兔IgG/皿P檢 測)監(jiān)測，在兔子中執(zhí)行的脾切除術(shù)顯示出最高的免疫反應(yīng)。將脾臟浸潰在新鮮的充滿含有 1%盤尼西林/鏈霉素/兩性霉素 B的RPMI 1640的化tri盤中，沖洗若干次，并使用3ml的注射 器的無菌活塞壓碎成粉。通過將壓碎的脾臟通過2個100μπι-細胞過濾器，從殘渣中分離出淋 己細胞。在沖洗若干次之后，將2χ108個淋己細胞和IxlO8個融合搭檔(partner)細胞進行融 合，并且每個融合置于20個96孔板。
[0巧引 制備多克隆和亞克隆
[0356]通過初級篩選化ISA，檢測針對免疫原(RAM9)的多克隆上清液。使用有限次細胞稀 釋方法，亞克隆所選擇的陽性多克隆。如上所述檢測亞克隆的上清液。在介質(zhì)級別的方法 中，使用最好的克隆用于生產(chǎn)兔抗RAM9抗體。
[0巧7] 生產(chǎn)單克隆兔抗-RAM9抗體
[0358] 始于冷凍的細胞小平，將每個雜交瘤克隆接種到125ml的搖瓶中的15ml的細胞培 養(yǎng)基中，所述細胞培養(yǎng)基中添加有2-琉基乙醇、盤尼西林/鏈霉素和5%的超低IgG FBS，并 在37°C、且5%C02的氣氛下，W12化pm進行搖晃。耗費更大體積的培養(yǎng)基，并定期取得上清 液。
[0359] 在發(fā)酵末期，將細胞培養(yǎng)基上清液進行離屯、W去除細胞和碎片。在通過0.2WI1的膜 過濾之后，將上清液儲存在<-20°C或立即施用于抗體純化。
[0360] 單克隆兔抗-RAM9抗體的純化
[0361] 將生產(chǎn)抗體的兔雜交瘤的細胞培養(yǎng)基上清液施用于化Trap MabSelect Sure柱 (GE醫(yī)療）。通過使用10倍柱體積的pH為7.2的20mM化甜P04緩沖液進行沖洗，W去除雜質(zhì)。 在低抑條件下，使用lOOmM的抑為2.8的甘氨酸緩沖液，執(zhí)行單克隆抗-RAM9抗體的洗脫。然 后，然后通過在PBS(抑7.2)中進行稀釋，來中和一步純化的單克隆抗體，并濃縮和儲存在- 20°C下用于進一步實驗。
[0362] 在HEK293細胞中克隆和生產(chǎn)所選的（selected)單克隆兔抗-RAM9抗體
[0363] 使用市售化bo化pture試劑盒(Qiagen:第72232號），根據(jù)生廠商的建議分離雜交 瘤細胞的mRNA，然后使用寡-dT引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA。重鏈的可變區(qū)（VH)進行PCR擴增。對整個 輕鏈化C)進行PCR擴增。使用限制性酶化ndlll和Kpnl酶切PCR片段的VH區(qū)域。使用化ndlll 和Notl酶切LC PCR片段。使用Qiagen PCR純化試劑盒(編號#28016)純化所有的酶切產(chǎn)物。 在純化之后，將VH或LC片段連接到相應(yīng)的重鏈或輕鏈表達載體中，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH5 a(MC實驗室，編號#DA-100)中。選擇轉(zhuǎn)化的克隆，并使用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶證實其插入 (根據(jù)期望的大小:VH為大約44化P，W及LC為74化P)。
[0364] 插入了期望大小的質(zhì)粒進行測序(SEQ ID NO 15-18)。輕鏈和重鏈共轉(zhuǎn)染至6孔板 的HEK293細胞。在轉(zhuǎn)染四天之后，收集上清液，并在初級篩選ELISA中測試其針對相應(yīng)的抗 原。而且，測定兔IgG的濃度。選擇最好的生產(chǎn)性特異性克隆用于大規(guī)模生產(chǎn)。然后，根據(jù)上 述方法純化細胞培養(yǎng)基上清液。
[0365] 而且，使用化ndlll和Notl將整個輕鏈或重鏈片段從相應(yīng)的表達載體中切除，并隨 后使用Qiagen PCR純化試劑盒(編號#28016)純化。將cDNA插入物克隆至PCDNA3.1質(zhì)粒中。 [0化6] 初級篩選化ISA
[0367]將溶于PBS的化g/ml的RAM9(祀標(biāo))和非特異性人類同種型和/或純化的人類總IgG (陰性對照）Κ?(Κ)μ1/孔固定到微平板上。使用20化1 20%HAS(人類血清白蛋白VTBST(含 有0.1 %吐溫20的TBS)封閉微平板。在所有溫育步驟之間都包含沖洗步驟。將兔雜交瘤細胞 系的細胞培養(yǎng)上清液W選定的稀釋比例溶于30%HAS/TBST施用到運些微平板中。使用山羊 抗-兔IgG化+U-皿P檢測抗體測定抗-RAM9抗體的結(jié)合。使用TMB或其它染色粒過氧物酶底 物分析信號。相比陰性對照，針對RAM9的特異性抗體表現(xiàn)高至少50倍的信號(見圖3)。
[0；36引 次級篩選化ISA
[0369] 使用人類MIF(l〇μg/ml PBSaO化1/孔）涂覆微平板，并使用25化1 1.5%的溶于 PBS的魚膠進行封閉。在所有溫育步驟之間都包含沖洗步驟(每孔4x 250μ1 PBS)。樣品進行 系列預(yù)稀釋（溶于1 %新鮮魚膠/PBS)至2χ最終稀釋，并和相同體積的生物素化的RAM9 (30ng/ml)(等于1:2稀釋，RAM9的最終濃度為15ng/ml)進行混合。運些混合物允許形成復(fù)合 物30分鐘。溶于1 %的魚膠/PBS的生物素化的RAM9( 25-0.2ng/ml)的系列稀釋被用于校準(zhǔn)， W及15ng/ml的生物素化的RAM9被用作陰性對照(對應(yīng)于在相同制劑中的生物素化的RAM9 的最終濃度）。將樣品（100μΙ/孔)施用到微平板中2小時。使用HRP偶聯(lián)的鏈霉親和素和TMB 作為發(fā)色底物檢測被捕捉到平板上的生物素化的RAM9。每孔的吸收值和通過線性回歸的標(biāo) 準(zhǔn)曲線的吸收值相關(guān)，并表達為ng/ml。樣品中生物素化的RAM9的計算濃度與陰性對照中生 物素化的RAM9的計算濃度（％回收=(100 % /陰性對照中生物素化的RAM9的測量濃度)x樣 品中RAM9的測量濃度)相關(guān)。通過兔抗-RAM9的印跡(b 1011ing) 1 og濃度相對于％回收，W及 非線性4-參數(shù)曲線與圖4a的可變斜率進行擬合，來計算抗-RAM9抗體的半數(shù)最大結(jié)合抑制 值（眼〇)。
[0370] 在最終的純化步驟之后，在上述次級篩選中再次檢測兩種特定的有期望的抗體 (命名為68-1和54-5)，并且IC50值分別為：68-1幾乎為29.65，W及54-5幾乎為5.958,見圖 4b。
[0371] 兩種抗體非常適合為次級檢測抗體。例如參見圖1和圖5所示的浸潤性導(dǎo)管癌中 oxMIF的原位檢測。
[0372] 實施例4
[0373] 檢測組織中的RAM9
[0374] 將來自慢性淋己細胞性白血病小鼠模型的淋己結(jié)進行新鮮冷凍和0CT包埋，其中 一組使用RAM9處理，一組使用抗體賦形劑處理。組織塊W10皿進行冷凍切割，并在切片之后 保存在《-80°C。W下步驟均在室溫下進行。將冷凍切片風(fēng)干30分鐘，隨后在4%PBS緩沖甲 醒中進行固定15-20分鐘。同時，透化組織切片，并通過在TBS+0.2%化itonX-100中沖洗δ? ι? 分鐘 W 去除多余的甲醒。通過將組織切片與雙重的 內(nèi)源性封閉酶 (enzyme blockKDako) 溫育10分鐘來封閉內(nèi)源性過氧物酶。通過在TBS中沖洗5-10分鐘去除多余的雙重內(nèi)源性封 閉酶。使用封閉緩沖液(BB:20%正常山羊血清/2%牛血清白蛋白/0.2%溶于TBS的魚膠)來 封閉非特異性結(jié)合15-20分鐘。通過將組織切片與稀釋在PDAB中的0.扣g/ml的單克隆兔抗- RAM9抗體(68-1)溫育30分鐘，完成RAM9的檢測。通過在TBS中沖洗5-10分鐘，去除多余的檢 測抗體。使用高度交叉吸附的稀釋在PDAM中的1.化g/ml的山羊抗-兔皿P結(jié)合物(賽默飛世 爾)進行染色30分鐘。然后，將切片再次在TBS中徹底沖洗10分鐘。通過使用DAB底物(Dako) 染色5-10分鐘，使得著色變得可視化。將玻片在TBS進行沖洗，并使用蘇木精復(fù)染細胞核10 秒至1分鐘。通過將玻片在自來水中沖洗，使得復(fù)染的顏色由紫色變?yōu)樗{色。為了用于顯微 鏡，將組織切片在96%然后是純乙醇中分別干燥2x 20秒，之后在二甲苯中清洗約3分鐘。為 了長期保存，使用VECTASTAIN化rmamount固定切片，并覆蓋蓋玻片。
[03對結(jié)果；
[0376] 在病變器官例如來自患慢性淋己細胞性白血病小鼠的淋己結(jié)中，可W通過本發(fā)明 的IHC技術(shù)原位檢測到RAM9結(jié)合于oxMIF中（黑色箭頭）（圖6A)。在來自賦形劑處理的對照小 鼠中的淋己結(jié)中沒有觀察到背景染色（圖6B)。
[0377] 實施例5:
[0378] 該實施例的目的在于半定量測定RAM9含量，所述RAM9能夠在治療性靜脈施用之后 在惡性組織中滲透和累積，并且RAM9能夠?qū)⑺c半定量測定腫瘤活檢兩個連續(xù)玻片中相同 組織區(qū)域中的祀標(biāo)（=〇xMIF)含量相關(guān)聯(lián)。如果半定量測定RAM9和oxMIF(=祀標(biāo))各自的含 量相等，獲得100 %祀標(biāo)飽和度。
[03巧]動物模型：
[0380] 將來自慢性淋己細胞性白血病小鼠模型的淋己結(jié)切除并速凍，其中一組使用RAM9 處理，一組使用抗體賦形劑處理。冷凍淋己結(jié)包埋在0CT中W制備組織微陣列（來自一個組 織塊的一組全部淋己結(jié)），組織塊WlOwii進行冷凍切割，并在切片之后保存在《-80°c。
[0381] 免疫組織化學(xué)：
[0382] 如上述實施例4所述執(zhí)行RAM9的染色。
[0383] 一該方法檢測施用于體內(nèi)的RAM9,但不能區(qū)分結(jié)合于oxMIF的RAM9和累積在組織 中的自由RAM9
[0384] oxMIF (祀標(biāo))染色:
[03化]一該方法可W檢測結(jié)合于oxMIF的RAM9,并且沒有被RAM9結(jié)合的oxMIF(自由 oxMIF)，所述RAM9施用于體內(nèi)。通過將外源性RAM9施用于未固定的組織，沒有被體內(nèi)施用的 RAM9結(jié)合的oxMIF是飽和的。在施用外源RAM9之后，W及在組織固定之前的沖洗可W避免檢 測到未結(jié)合的RAM9,其中通過該免疫組織化學(xué)方法僅能檢測到oxMIF。
[0386]所有W下步驟均在室溫下進行。將凍干切片風(fēng)干30分鐘，并使用封閉緩沖液(BB: 20%正常山羊血清白蛋白/2%牛血清白蛋白/0.2%溶于TBS的魚膠)經(jīng)過15-20分鐘封閉非 特異性結(jié)合。通過將切片和稀釋在PADB(2%牛血清白蛋白/0.2%溶于TBS的魚膠）中的化g/ ml的RAM9溫育30分鐘，檢測oxMIF。通過在TBS中清洗5-10分鐘去除多余的RAM9。隨后在4% PBS緩沖甲醒中固定15-20分鐘，組織切片被透化，并且通過在TBS+0.2 %化i tonX-100中沖 洗5-1 ο分鐘W去除多余的甲醒。通過將組織切片和雙重（dual)的內(nèi)源性封閉酶（enzyme block) (Dako)溫育10分鐘W封閉內(nèi)源性過氧物酶。通過在TBS中沖洗5-10分鐘去除多余的 雙重內(nèi)源性封閉酶(enzyme block)。通過將組織切片與稀釋在PADB中的0.扣g/ml的單克隆 兔抗-RAM9抗體溫育30分鐘，完成RAM9的檢測。通過在TBS中沖洗5-10分鐘，去除多余的檢測 抗體。使用高度交叉吸附的稀釋在PDAM中的1.化g/ml的山羊抗-兔HRP結(jié)合物(賽默飛世爾） 進行染色30分鐘。然后，將切片再次在TBS中徹底沖洗10分鐘。通過使用DAB底物化ako)染色 5-10分鐘，使得著色變得可視化。將玻片在TBS中進行沖洗，并使用蘇木精復(fù)染細胞核10秒 至1分鐘。通過將玻片在自來水中沖洗，使得復(fù)染的顏色由紫色變?yōu)樗{色。為了用于顯微鏡， 將組織切片在96%然后是純乙醇中分別進行2x 20秒W干燥，之后在二甲苯中清洗約3分 鐘。為了長期保存，使用VECTASTAIN化rmamount固定切片，并覆蓋蓋玻片。通過奧林己斯掃 描顯微鏡(VS120)W20x放大掃描全部的玻片。
[0387]評估；
[038引使用Definiens Tissue Studio?V3.6分析數(shù)字玻片全圖像。組織區(qū)域通過人工標(biāo) 記或通過軟件自動標(biāo)記。將壞痘區(qū)域或權(quán)皺組織從進一步分析中排除。一旦組織區(qū)域被標(biāo) 記，軟件能夠區(qū)分棟色免疫染色(oxMIF或RAM9)和藍色復(fù)染(蘇木精），并計算整個組織區(qū)域 的免疫染色面積。通過將計算的RAM9染色的染色區(qū)域（％)除W計算的oxMIF( =祀標(biāo))染色 的染色區(qū)域（％ )，得到祀標(biāo)飽和度的比例。
[0389] 結(jié)果參見圖8-9。該方法非常適于獲得祀標(biāo)飽和度的測定，并因此使得治療變得合 適并提供治療成功性的預(yù)測。
[0390] 實施例6:
[0391] 上述實施例5中描述的方法施用于來自患有晚期轉(zhuǎn)移性直腸癌的病人的活檢。每 周使用lOmg/kg RAM9治療病人7個月。在第一次施用RAM9之前，W及在用RAM9處理1個月、2 個月和6個月之后獲取活組織檢查。將活檢在化中速凍，包埋在0CT中，然后WlOym進行切 片。將冰凍切片進行針對oxMIF和RAM9的免疫組織化學(xué)分析。如實施例5所述，評估祀標(biāo)飽和 度。除了先前實施例，在活檢的數(shù)字圖像分析期間，病理學(xué)家標(biāo)記了腫瘤細胞。因此，也可W 計算腫瘤細胞、基質(zhì)（總體組織區(qū)域-腫瘤細胞區(qū)域)和總組織區(qū)域中的祀標(biāo)飽和度。
[0392] 結(jié)果：
[0393] 使用lOmg/kg的RAM9每隔一周治療病人，導(dǎo)致在治療過程中RAM9在腫瘤細胞和基 質(zhì)組織中的累積。數(shù)據(jù)代表來自一個病人的每個時間點的2-5個的活檢的平均值，其中誤差 棒表示范圍（見圖10)。
【主權(quán)項】
1. 一種免疫組織化學(xué)（IHC)檢測方法，用于oxMIF的體外檢測，其中oxMIF是在個體的組 織樣品中與抗體RAB4、RAB9和/或RAB0差異性結(jié)合的MIF，所述檢測包括體外測定化合物與 所述樣品中的oxMIF的結(jié)合，其中執(zhí)行下述一個以上步驟： a) 可選的使用封閉緩沖液的封閉步驟，和 b) 使用一級抗-oxMIF抗體的結(jié)合步驟而沒有在先的固定步驟，特別是沒有使用甲醛或 丙酮； c) 可選的固定步驟； d) 與二級抗體的溫育，其中所述二級抗體是針對抗-oxMIF抗體的抗-獨特型兔單克隆 抗體;和/或 e) 檢測一級抗-oxMIF抗體和二級抗體之間的結(jié)合。2. 如權(quán)利要求1所述的IHC檢測，其中在結(jié)合步驟b)之前，不使用有機或無機固定劑進 行固定，特別是甲醛或丙酮。3. 如權(quán)利要求1或2所述的IHC檢測，其中所述樣品被風(fēng)干，優(yōu)選被風(fēng)干約30分鐘。4. 如權(quán)利要求1至3中任一項或多項所述的IHC檢測，其中，所述一級抗體沒有被標(biāo)記， 例如沒有被生物素化，和/或所述一級抗體優(yōu)選包含在一級稀釋緩沖液中和/或其中所述一 級抗體與樣品溫育，優(yōu)選溫育45至90分鐘，更優(yōu)選約60分鐘。5. 如權(quán)利要求1至4中任一項或多項所述的IHC檢測，其中，在結(jié)合步驟b)之后進行沖洗 步驟，以洗去多余的抗體，以及其中可選地，在全部后續(xù)步驟之后進行進一步的沖洗步驟。6. 如權(quán)利要求1至5中任一項或多項所述的IHC檢測，其中，所述檢測步驟e)包括染色步 驟或由染色步驟構(gòu)成，和/或其中在檢測步驟之后進行進一步的(復(fù))染步驟，其包括三級抗 體的使用。7. 如權(quán)利要求1至6中任一項或多項所述的IHC檢測，其中，在步驟e)之后，使用蘇木精 進行所述(復(fù))染步驟。8. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的IHC檢測，其中，通過熒光、或熒光直接標(biāo)記的二級 抗體(例如標(biāo)記的抗_Ram9)、優(yōu)選使用熒光團標(biāo)記的針對二級抗體的三級抗體，來檢測一級 抗體和二級抗體之間的結(jié)合。9. 如權(quán)利要求1至8中任一項所述的IHC檢測，其中所述二級抗體是選自于由抗-RAM9抗 體、抗-RAM0抗體和抗-RAM4抗體構(gòu)成的組中的二級單克隆抗體，最優(yōu)選抗-RAM9抗體，甚至 更優(yōu)選兔抗-RAM9抗體。10. 如權(quán)利要求1至9中任一項所述的IHC檢測，其中所述一級抗體結(jié)合oxMIF、但不結(jié)合 redMIF〇11. 如權(quán)利要求10所述的IHC檢測，其中差異性結(jié)合是指結(jié)合oxMIF的KD值小于ΙΟΟηΜ，優(yōu) 選小于50nM，甚至更優(yōu)選小于10nM;以及不結(jié)合redMIF的特征在于其K D值大于400nM。12. 如權(quán)利要求1至11中任一項所述的IHC檢測，其中所述一級抗體選自于由oxMIF結(jié)合 物，例如抗體RAB4、RAB9和/或RAB0和/或RAM4、RAM9和/或RAM0構(gòu)成的組。13. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的IHC檢測，其中所述樣品是組織活檢，優(yōu)選冰凍組 織活檢，優(yōu)選0CT包埋切片，或針芯活檢。14. 一種獨特型抗體，其可以特異性結(jié)合于抗-oxMIF抗體，優(yōu)選結(jié)合于抗-RAM9抗體。15. 如權(quán)利要求14所述的獨特型抗體，其中，所述抗體的特征在于，其在使用固定的MIF 和RAM9的中和ELI SA中的I C5〇為彡60ng/ml。16. -種獨特型抗體，優(yōu)選如權(quán)利要求14或15所述的獨特型抗體，用于例如如前述權(quán)利 要求中任一項或多項所述的方法或試劑盒，其特征在于SEQ ID NO: 15和/或16,或其特征在 于SEQ ID 從)：17和/或18。17. -種抗獨特型抗體，用于例如如前述權(quán)利要求中任一項或多項所述的方法或試劑 盒，其特征在于以保藏編號DSM 28180在DSMZ保藏的重鏈和/或以保藏編號DSM 28181在 DSMZ保藏的輕鏈;或其特征在于以保藏編號DSM 28182在0312保藏的重鏈和/或以保藏編號 DSM 28183在03]\^保藏的輕鏈。18. -種檢測抗-oxMIF抗體的方法，所述抗-oxMIF抗體優(yōu)選RAM9、RAM0或RAM4，其特征 在于使用針對所述抗-oxMIF抗體的獨特型單克隆兔抗體，優(yōu)選如權(quán)利要求14-17中任一項 所述的獨特型抗體。19. 一種IHC檢測試劑盒，適于執(zhí)行如前述權(quán)利要求中任一項或多項所述的方法。
【文檔編號】C07K16/24GK106068456SQ201580003726
【公開日】2016年11月2日
【申請日】2015年1月2日 公開號201580003726.3, CN 106068456 A, CN 106068456A, CN 201580003726, CN-A-106068456, CN106068456 A, CN106068456A, CN201580003726, CN201580003726.3, PCT/2015/50005, PCT/EP/15/050005, PCT/EP/15/50005, PCT/EP/2015/050005, PCT/EP/2015/50005, PCT/EP15/050005, PCT/EP15/50005, PCT/EP15050005, PCT/EP1550005, PCT/EP2015/050005, PCT/EP2015/50005, PCT/EP2015050005, PCT/EP201550005
【發(fā)明人】A·席納格爾, M·蒂勒, P·杜亞爾, G·安托萬, R·克施鮑默
【申請人】百深有限責(zé)任公司, 百深公司