基于生物標志物的腎損傷早期檢測試紙條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型設(shè)及生命健康技術(shù)領(lǐng)域,具體設(shè)及一種基于生物標志物的腎損傷早期 檢測試紙條。
【背景技術(shù)】
[000^ 微量白蛋白(又名微量尿白蛋白,Micora化uminuria, mA化)是指尿中出現(xiàn)的微量 白蛋白。微量白蛋白的非正常出現(xiàn),通常被認為是腎功能衰竭、糖尿病和屯、血管疾病并發(fā)癥 等重要臨床標志之一。因此,尿液中白蛋白存在水平的檢測對腎病、糖尿病和屯、血管病的早 期診斷、早期治療和減小風險由重要的參考價值和臨床意義。中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì) 運載蛋白(neutrophil gelatinase-associatedlipocalin, NGAL)是 1993 年在中性粒細 胞內(nèi)首次被發(fā)現(xiàn)的,與炎癥、胚胎發(fā)育、免疫應答、趨化作用、信號轉(zhuǎn)導W及多種腫瘤的發(fā)生 于發(fā)展等過程相關(guān)。近年來國內(nèi)外研究表明,NGAL蛋白在多種疾病發(fā)生過程中具有特異性 表達變化的特點,使得NGAL成為檢測疾病的生物標志物。近年美國臨床化學協(xié)會(AACC)年 度會議的研究結(jié)果發(fā)表得知檢測尿中中性粒細胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白可能有助于臨床醫(yī) 生檢測屯、臟移植患者環(huán)抱霉素誘導的毒性,W及調(diào)節(jié)環(huán)抱霉素劑量W預防其對腎臟造成的 不可逆?zhèn)ΑV袊鴮@鸆N101163971研究在急性腎衰竭(ARF)、急性腎小管壞死(ATN)和急 性腎小管間質(zhì)性腎病(ATIN)發(fā)病的早期,尿液和血液中NGAL水平顯著增加,因此NGAL是 早期檢測腎臟對缺血性損傷的標志物。mA化和NGAL是新近發(fā)現(xiàn)的兩個性能良好的腎功能 良好的生物標志物,特別是在急性或腎功能損傷早期就有明顯的變化,因而受到臨床檢測 人員的歡迎,如果將兩種標志物同時檢測,則能更準確全面地反映腎功能性能。目前市場上 腎損傷的早期診斷僅僅單獨依靠單一的腎功能標志物的檢測,常常因為單一的檢驗周期 長,靈敏度低,從而無法確保腎損傷的診斷率W及甚至會影響腎損傷患者后續(xù)的治療和生 命健康。 【實用新型內(nèi)容】
[0003] 實用新型的主要目的在于提供一種基于生物標志物的腎損傷早期檢測試紙條,同 時檢測mA化和NGAL,對于腎損傷發(fā)生的診斷起到協(xié)同互補作用,可W根據(jù)實際檢測結(jié)果,為 腎損傷早期提供輔助診斷,縮短檢測周期,增加了檢測的靈敏度,方便了用戶使用。
[0004] 本方案中的一種基于生物標志物的腎損傷早期檢測試紙條,所述試紙條包括底襯 W及設(shè)置于所述底襯上的包被膜,所述包被膜上依次設(shè)置有樣品墊、包被線區(qū)和吸水紙;所 述包被線區(qū)依次設(shè)置有標記線、質(zhì)控線、mA化檢測線和NGAL檢測線;所述標記線包括被巧光 膠乳標記的第二mA化單克隆抗體、第二NGAL單克隆抗體和兔IgG抗體;所述質(zhì)控線包括羊抗 兔IgG抗體;所述mA化檢測線包括能與待檢測抗原mA化特異性結(jié)合的第一 mA化單克隆抗體; 所述NGAL檢測線包括能與待檢測抗原NGAL特異性結(jié)合的第一 NGAL單克隆抗體。
[0005] 進一步,所述待檢測抗原mA化為人源mAlb,所述待檢測抗原NGAL為人源NGAL。
[0006] 進一步,所述標記線、質(zhì)控線、mA化檢測線和NGAL檢測線之間的間隔距離分別設(shè)置 為3mm ~5mm ο
[0007] 本實用新型的有益效果是:通過mA化與NGAL兩項聯(lián)檢,對于腎損傷發(fā)生的診斷起 到協(xié)同互補作用,可W根據(jù)實際檢測結(jié)果,為腎損傷早期提供輔助判斷,縮短檢測周期,增 加了檢測的靈敏度,方便了用戶使用。
【附圖說明】
[0008] 圖1為本實用新型基于生物標志物的腎損傷早期檢測試紙條較佳實施例的內(nèi)部 結(jié)構(gòu)示意圖;
[0009] 圖2為采用本實用新型基于生物標志物的腎損傷早期檢測試紙條與羅氏E170化 學發(fā)光儀針對相同臨床樣本測量出的mA化的相關(guān)性圖;
[0010] 圖3為采用本實用新型基于生物標志物的腎損傷早期檢測試紙條與羅氏E170化 學發(fā)光儀針對相同臨床樣本測量出的NGAL的相關(guān)性圖。
【具體實施方式】
[0011] 應當理解,此處所描述的具體實施例僅僅用W解釋本實用新型,并不用于限定本 實用新型。
[0012] 本實用新型的主要目的在于提供一種基于生物標志物的腎損傷早期檢測試紙條, 同時檢測mMb和NGAL,對于腎損傷發(fā)生的判斷起到協(xié)同互補作用,可W根據(jù)實際檢測結(jié)果, 為腎損傷早期提供輔助判斷,縮短檢測周期,增加了檢測的靈敏度,方便了用戶使用。
[0013] 參照圖1,所述基于生物標志物的腎損傷早期檢測試紙條包括底襯及設(shè)置于所 述底襯1上的包被膜3,所述包被膜3上依次設(shè)置有樣品墊2、包被線區(qū)和吸水紙4,其中:所述 包被線區(qū)依次設(shè)置有標記線5、質(zhì)控線6、mA化檢測線7和NGAL檢測線8;所述標記線5包括被 巧光膠乳標記的第二mA化單克隆抗體、第二NGAL單克隆抗體和兔IgG抗體;所述質(zhì)控線6包 括羊抗兔IgG抗體;所述mMb檢測線7包括能與待檢測抗原mA化特異性結(jié)合的第一 mA化單克 隆抗體;所述NGAL檢測線8包括能與待檢測抗原NGAL特異性結(jié)合的第一 NGAL單克隆抗體。所 述待檢測抗原mA化為人源mAlb,所述待檢測抗原NGAL為人源NGAL。所述標記線、質(zhì)控線、 mA化檢測線和NGAL檢測線之間的間隔距離分別設(shè)置為3mm~5mm。
[0014] 本實用新型針對上述基于生物標志物的腎損傷早期檢測試紙條采用如下制備方 法。
[0015] 所述基于生物標志物的腫瘤早期檢測試紙條的制備方法包含W下步驟:
[0016] 1. mA化和NGAL單克隆抗體巧光膠乳微球的制備
[0017] 將常規(guī)方法共價活化后的巧光膠乳超聲波200W-400W處理20-30秒后,按照50- 2(K)yg標記抗體ΛΟΟμΙ巧光膠乳的比例加入第二mMb單克隆抗體(購自武漢華美生物工程 有限公司)、第二NGAL單克隆抗體(購自武漢華美生物工程有限公司)和兔IgG抗體(購自武 漢華美生物工程有限公司),混勻后室溫攬拌反應2 h,離屯、洗涂3次,每次10000- 15000xg、離屯、10 min,沉淀用PBS-TBN溶解并超聲波100W處理30 S,用PBS-TBN恢復 離屯、前體積,4°C保存,備用。
[001引 2.樣品墊的封閉
[0019]2.1封閉液的制備:將含1%854,0.2%吐溫-20,2.5%薦糖,0.05%疊氮化鋼,0.0謹、 pH7.4的PBS,用0.22μ膜過濾,置于4°C備用,有效期3天。
[0020] 2.2樣品墊的封閉:按65 ul/cm2的量將封閉液均勻的加到樣品墊上,使得樣品墊 完全濕透。
[0021] 2.3樣品墊的干燥:將封閉好的樣品墊轉(zhuǎn)入鼓風干燥箱干燥,干燥溫度控制在37± rC干燥時間為12-24小時。
[0022] 3.NC膜的包被
[0023] 3.1標記線的制備:用包被緩沖液稀釋標記有mA化單克隆抗體的巧光膠乳、標記有 NGAL單克隆抗體的巧光膠乳和標記有兔抗IgG抗體的巧光膠乳,將運Ξ種標記抗體的膠 乳混合,劃線于包被膜上形成標記線;其中巧光膠乳標記的mA化單克隆抗體和巧光膠乳標 記的NGAL單克隆抗體的濃度均為0.5-1.0mg/ml,用量均為0.02-0.1μg/cm2;巧光膠乳 標記的兔抗IgG抗體的濃度為1. Omg/ml,用量為0.001- 0.025yg/cm2 ;所述包被緩沖液中 含有 1%BSA,0. 吐溫-20,2.5% 薦糖,0.05%疊氮化鋼,0.01M、pH7.4 的PBS);
[0024] 3.2質(zhì)控線和檢測線的制備:用0.01M、抑7.4的PBS緩沖液稀釋羊抗兔IgG抗體、 能與待檢抗原mAlb特異結(jié)合的不同于步驟3.1的mAlb單克隆抗體的另一株mA化單克隆 抗體、W及能與待檢抗原NGAL特異結(jié)合的不同于步驟3.1的NGAL單克隆抗體的另一株 NGAL單克隆抗體,并將稀釋后的Ξ種抗體分別依次平行地劃線于包被膜上形成質(zhì)控線、 mA化檢測線