一種提高三七組培苗皂苷產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種施用茉莉酸甲酯提高三七組培苗皂 苷產(chǎn)量的新方法。 技術(shù)背景：
[0002] 三七（Panaxnotoginseng(Burk. )F. H. Chen)為五加科人參屬植物，是我國傳統(tǒng)的 名貴中藥，主產(chǎn)云南，也是云南省重要的特色植物藥。隨著三七有效成分和藥理作用的不斷 闡明，三七產(chǎn)品不斷開發(fā)，市場需求日增。截至2013年底，經(jīng)SFDA批準(zhǔn)含有三七藥材的中 成藥制劑達(dá)400多種，相關(guān)藥品生產(chǎn)批準(zhǔn)文號(hào)3300多個(gè)和制藥企業(yè)1300多家，三七產(chǎn)業(yè)年 總產(chǎn)值超過200億，三七在我國醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。
[0003] 三七皂苷主要通過三七的大田栽培獲得。但因三七栽培產(chǎn)業(yè)中種苗混雜、種質(zhì)資 源退化、三七連作障礙現(xiàn)象突出、輪作間隔年限長、病害種類繁多、危害巨大、過量農(nóng)藥的施 入導(dǎo)致農(nóng)殘和重金屬超標(biāo)等因素，從質(zhì)量、產(chǎn)量和安全性上嚴(yán)重影響了三七種植業(yè)的發(fā)展， 加劇了合格三七產(chǎn)品的供求矛盾，進(jìn)一步制約了以三七為原料的醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展壯大。無論 是進(jìn)行三七優(yōu)良種苗的繁育、縮短三七輪作間隔時(shí)間還是規(guī)范農(nóng)藥的施用方式，都很難從 根本上打破三七產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸，達(dá)到快速、穩(wěn)定的工廠化生產(chǎn)。研發(fā)一種有效提高三七皂 苷產(chǎn)量的生產(chǎn)方法，是解決三七原料供需矛盾的關(guān)鍵所在。
[0004] 茉莉酸甲酯（Me-JA)作為植物信號(hào)誘導(dǎo)子能夠安全有效地激發(fā)植物次生代謝物 的產(chǎn)生和積累，但對(duì)植物生物量的增長具有負(fù)面影響。因此，優(yōu)選合適的茉莉酸甲酯施用時(shí) 間和濃度，才能最大限度地提高藥用植物活性成分的產(chǎn)量。目前，現(xiàn)有技術(shù)中未見有合適的 茉莉酸甲酯提高三七皂苷產(chǎn)量的施用時(shí)間和濃度的方法報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的目的在于減緩三七產(chǎn)品的供求矛盾，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，基于 三七皂苷在植物體內(nèi)分布的特點(diǎn)及其在藥理方面的活性，提供一種施用茉莉酸甲酯提高 三七組培苗皂苷產(chǎn)量的新方法，此方法能有效地提高三七皂苷的產(chǎn)量，具有見效快、成本 低、操作簡單、方便實(shí)施、產(chǎn)品無毒無殘留等特征，對(duì)滿足三七皂苷大規(guī)模生產(chǎn)具有重要意 義。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：
[0007] -種提高三七組培苗皂苷產(chǎn)量的方法，包括三七組培苗快繁體系的建立、三七組 培苗施加茉莉酸甲酯、栽培三七施加茉莉酸甲酯等步驟：
[0008] 所述的三七組培苗快繁體系的建立步驟是用固體培養(yǎng)法誘導(dǎo)三七愈傷組織、叢生 芽、組培苗，確定三七組培苗快繁條件，建立三七組培苗快繁體系，獲得三七組培苗；
[0009] 所述的三七組培苗施加茉莉酸甲酯步驟是將上述步驟所得的三七組培苗接種在 含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基中，置于相對(duì)濕度60~66%、光照強(qiáng)度30 μπιο? HT2s'光照 /黑暗8/16,溫度23±2°C條件下培養(yǎng)，于不同的培養(yǎng)時(shí)間采集三七組培苗全株，采用UV和 HPLC法進(jìn)行三七總皂苷和主要單體皂苷產(chǎn)量檢測；
[0010] 所述的栽培三七施加茉莉酸甲酯步驟是將上述步驟所得的三七組培苗移栽至以 不同材料為基質(zhì)的苗床內(nèi)，移栽8個(gè)月后，采用茉莉酸甲酯進(jìn)行葉面噴施，噴施后不同時(shí)間 采樣進(jìn)行三七總皂苷和主要單體皂苷產(chǎn)量分析。
[0011] 根據(jù)所述的提高三七組培苗皂苷產(chǎn)量的方法，其中所述誘導(dǎo)三七愈傷組織是 將三七幼嫩葉片、莖干、芽和須根，經(jīng)常規(guī)滅菌后接種在以B5為基本培養(yǎng)基，添加不同 濃度和組合的NAA，KT和2, 4-D (濃度梯度設(shè)置為ΝΑΑ0. 1-1. 5mg/L，ΚΤ0. 5-2. Omg/L， 2, 4-D1. 0-3. Omg/L)培養(yǎng)基中進(jìn)行三七愈傷組織誘導(dǎo)，將誘導(dǎo)后的愈傷組織接種在MS 為基本培養(yǎng)基，添加6-BA0. 2-2. Omg/L及ΙΒΑ0. 05-0. 5mg/L的固體培養(yǎng)基中進(jìn)行三七 叢生苗的誘導(dǎo)，將誘導(dǎo)出的三七叢生苗接種在以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的 ΙΒΑ0. 5-2. Omg/L、IAA 0· 5-2. Omg/L和6-BA0.0 l-L Omg/L的培養(yǎng)基中進(jìn)行三七不定根的誘 導(dǎo)。
[0012] 根據(jù)所述的一種提高三七組培苗皂苷產(chǎn)量的方法，其中所述的三七組培苗施加 茉莉酸甲酯步驟是用20%的乙醇溶解茉莉酸甲酯，配制成50mmol/L的乙醇母液，并用 0. 22 μπι的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到滅菌并冷卻至35±5°C的固 體培養(yǎng)基中，所述的固體培養(yǎng)基配比為MS+6-BA1. 0mg/L+IBA0. 2mg/L，至茉莉酸甲酯最終濃 度為50 - 400 μ mol/L ;然后將三七組培苗快繁體系的建立步驟所得的三七組培苗轉(zhuǎn)接在 上述添加了茉莉酸甲酯母液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于培養(yǎng)后的2, 5,10,15, 30天進(jìn)行采樣分析。
[0013] 根據(jù)所述的一種提高三七組培苗皂苷產(chǎn)量的方法，其中所述的栽培三七施加茉莉 酸甲酯步驟是將三七組培苗快繁體系的建立步驟所得的三七組培苗移栽至以不同材料為 基質(zhì)的苗床內(nèi)，所述的材料為珍珠巖、蛭石、腐殖土、草炭、河沙、泥炭和蔗渣中的一種或多 種復(fù)配。
[0014] 根據(jù)所述的一種提高三七組培苗皂苷產(chǎn)量的方法，其中栽培三七施加茉莉酸甲酯 步驟中，用少量乙醇助溶，將茉莉酸甲酯原液配成50 - 400 μ mol/L的溶液，噴灑于移栽8個(gè) 月后的三七葉面，至葉面滴水為止，早、中、晚各噴施一次，于噴施后的2, 5,10,15, 30天進(jìn) 行采樣分析。
[0015] 本發(fā)明為一種施用茉莉酸甲酯提高三七組培苗皂苷產(chǎn)量的新方法，能有效地提高 三七皂苷的產(chǎn)量。其操作簡單、不受季節(jié)限制、且有效降低三七皂苷的生產(chǎn)成本，對(duì)滿足 三七皂苷大規(guī)模生產(chǎn)具有重要意義。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明的優(yōu)異性在于：
[0017] 1.固體培養(yǎng)法繁育三七組培苗，無需昂貴的發(fā)酵設(shè)備、投資少；培養(yǎng)方法簡單、繁 育系數(shù)高、繁殖速度快、污染率低。
[0018] 2.本發(fā)明以提高優(yōu)質(zhì)、安全的三七總皂苷和主要皂苷的產(chǎn)量為最終目的。
[0019] 3.本發(fā)明于三七完整植株為研宄對(duì)象，研宄結(jié)果對(duì)三七皂苷的大田生產(chǎn)指導(dǎo)更具 實(shí)施意義。
[0020] 4.本發(fā)明在短時(shí)間內(nèi)，安全有效地提高單位面積三七總皂苷和主要皂苷的產(chǎn)量。
【具體實(shí)施方式】：
[0021] 下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明。本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不以此為限。
[0022] 實(shí)施例1 :
[0023] 步驟1 :三七組培苗快繁體系的建立。
[0024] 兩年生三七植株用堿性肥皂水洗去表面污泥后以清水漂洗干凈，流水沖洗30min， 蒸餾水沖洗4-5次。取其葉片和葉柄在75 %的乙醇溶液中浸泡Imin后，無菌蒸餾水沖洗 3-4次，無菌濾紙吸干，置于0. 1 %的升汞（HgCl2)溶液中浸泡40min，無菌水沖洗5-6次， 無菌濾紙將水吸干。于無菌超凈工作臺(tái)中將葉片切成0. 5cm2的塊狀，葉柄切成0. 5cm的條 狀。接種于B5+KT 0. 5mg/L+NAA0. 6mg/L+2, 4D2mg/L固體培養(yǎng)基中，于25±2°C、黑暗條件下 進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)20日，其愈傷組織誘導(dǎo)率為98. 3%。將生長良好的愈傷組織 轉(zhuǎn)接至MS+6-BAlmg/L+IBA0. lmg/L固體培養(yǎng)基中，置于光照強(qiáng)度30 ymol HT2s-1,光照/黑 暗8/16,溫度23±2°C的培養(yǎng)室中進(jìn)行叢生苗的誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)60日時(shí)，三七愈傷組 織誘導(dǎo)幼苗的分化率為97. 0±1. 4%，每塊愈傷組織的成苗株數(shù)為42. 2±3. 1株。將生長至 長度為Icm的三七叢生苗單株接種在1/2MS+IBA0. 8mg/L+6-BA0. lmg/L固體培養(yǎng)基中進(jìn)行 誘導(dǎo)生根培養(yǎng)，培養(yǎng)20日時(shí)，三七單株生根率為96%，單株生根數(shù)量13.0±1.0。將生根后 的三七完整植株接種在MS+6-BA lmg/L+IBAO. 2mg/L固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng)90日，生 物量增長率為400%。
[0025] 步驟2 :三七組培苗總皂苷含量的檢測。
[0026] 將培養(yǎng)至90日的三七組培苗全株取出，流水沖去表面附著的培養(yǎng)基，于45°C條件 下干燥、粉碎。精密稱取樣品干重〇. 3g，置于2mL的容量瓶中，70%的甲醇定容至刻度線、稱 重。間隔超聲提取3次，每次超聲30min，冷卻過夜，70 %的甲醇補(bǔ)足重量。過直徑為0. 45 μ m 的濾膜，續(xù)濾液進(jìn)行總皂苷和5個(gè)主要的單體皂苷檢測。
[0027] 分別吸取上述準(zhǔn)備好的續(xù)濾液20 μ L于IOmL的試管中，同時(shí)做一空白對(duì)照，在水 浴上蒸干，冷卻至室溫，加5%香草醛冰醋酸溶液0. 2mL，加0. SmL高氯酸，在70°C熱水浴中 顯色15分鐘，流水冷卻，加冰醋酸5mL，搖勻，在560nm波長處測定吸收值。同時(shí)精密稱取 總皂苷（標(biāo)定為100% )10. 〇mg，置于IOmL容量瓶中，加70%甲醇溶解、搖勻后定容至刻度 線，分別吸取20、40、60、80、100、120、140、160和180 μ L置于IOmL的試管中，按照上述的 樣品檢測方法進(jìn)行檢測。根據(jù)樣品