專利名稱：5′呈味核苷酸的生物合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及5′呈味核苷酸的制備方法，特別是涉及一種生物合成5′呈味核苷酸的方法。
背景技術(shù)：
上個世紀(jì)50年代，研究人員發(fā)現(xiàn)5’-肌苷酸(5’-IMP)和5’-鳥苷酸(5’-GMP)與谷氨酸鈉(MSG)混合時產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)(又稱相乘作用)，可使食品鮮度提高數(shù)倍至數(shù)十倍。因此，以5’-肌苷酸和5’-鳥苷酸為代表的呈味核苷酸的應(yīng)用引起了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。如今，呈味核苷酸作為一種新型的添加劑，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、營養(yǎng)、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域。
自上世紀(jì)60年代日本率先進(jìn)行呈味核苷酸的工業(yè)化生產(chǎn)以來，已有多種生產(chǎn)呈味核苷酸及其衍生物的方法。按生產(chǎn)工藝進(jìn)行歸納，主要有三種化學(xué)合成法、RNA酶解法及微生物發(fā)酵法。這三種方法的生產(chǎn)工藝及其產(chǎn)品均有很大差別。
化學(xué)合成法主要是利用核苷進(jìn)行磷酸酯化反應(yīng)。常用的磷酸化試劑主要是磷酸或焦磷酸的活性衍生物。焦磷酸的活性衍生物可為焦磷酰氯或雙-對-硝基苯焦磷酸等，而工業(yè)上廣泛采用的是三氯氧化磷。要在核苷的5’位上導(dǎo)入磷酸基，需在磷酸化反應(yīng)前，保護(hù)核苷上核糖的2’和3’位的羥基。磷酸化完成后，再脫去保護(hù)劑，得到5’-核苷酸。
由于化學(xué)合成法所用試劑較昂貴，致使生產(chǎn)成本偏高，且具有一定毒性，一般用于生產(chǎn)一些有特殊用途的核苷酸及其衍生物。
酶解法生產(chǎn)5’-核苷酸的歷史最長、技術(shù)也最成熟。利用桔青霉發(fā)酵，得到5’-磷酸二酯酶與從酵母中提取的RNA進(jìn)行反應(yīng)，可生成四種5’-核苷酸的混合物，將混合物經(jīng)離子交換樹脂分離純化，即可得到四種核苷酸的純品。
通常采用固體發(fā)酵或深層發(fā)酵法制備5’-磷酸二酯酶。前者簡便、成本低，但占地面積大，生產(chǎn)效率低，且產(chǎn)生的分生孢子易污染環(huán)境，后者成本偏高。利用5’-磷酸二酯酶酶解RNA后，需要將四種核苷酸混合物進(jìn)行分離純化，才能得到5’-肌苷酸的純品。但要獲得5’-IMP，則是將5’-AMP進(jìn)行化學(xué)或酶轉(zhuǎn)化，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，成本偏高。
早期用酶法得到的與呈味無關(guān)的5’-CMP(5’-胞苷酸)、5’-UMP(5’-尿苷酸)，在當(dāng)時無法利用，使得成本更高，因此，在谷氨酸發(fā)酵研究成功的基礎(chǔ)上，日本開始了核酸類物質(zhì)的發(fā)酵研究。
微生物發(fā)酵法又分一步法和二步法。一步法主要用于5’-肌苷酸和5’-黃苷酸的生產(chǎn)。二步法即直接由碳源發(fā)酵生產(chǎn)或先發(fā)酵生成核苷，再經(jīng)化學(xué)磷酸化，獲得了相應(yīng)的核苷酸。
1961年，日本科學(xué)家利用枯草芽孢桿菌(Bacillus subitilis)的腺嘌呤缺陷型生成了5’-肌苷酸、肌苷。隨后又報道了高產(chǎn)肌苷的枯草芽孢桿菌腺嘌呤缺陷型菌株，并建立了肌苷的工業(yè)化生產(chǎn)(Konjo K，Imai K，et al.Annual Congress Agr.Chem.Soc.1963 Abstracts，P.40)。1968年，在深入研究腺嘌呤缺陷型的產(chǎn)氨短桿菌(B.Ammoniagenes)時，在培養(yǎng)基中加入錳離子，以觀察對其生長的影響，結(jié)果篩選到了對錳離子不敏感的菌株，能夠高產(chǎn)肌苷酸。上述研究結(jié)果表明，一步法生產(chǎn)菌株的選育比較復(fù)雜，產(chǎn)生的肌苷酸易于分解，而且解決或解除終產(chǎn)物反饋調(diào)節(jié)問題也比較復(fù)雜，這都極大地限制了一步法生產(chǎn)肌苷酸的工業(yè)應(yīng)用；而二步法得到的中間產(chǎn)物，如肌苷、鳥苷等本身也是很重要的發(fā)酵產(chǎn)品，其調(diào)控相對容易，因此二步法生產(chǎn)工藝的關(guān)鍵問題在于中間產(chǎn)物發(fā)酵后，如何高效地轉(zhuǎn)化成目標(biāo)核苷酸。
1999年日本Asano等發(fā)現(xiàn)，Morganella morganii等許多腸桿菌的酸性磷酸酶具有選擇性磷酸酶轉(zhuǎn)移酶活性。該磷酸酶可利用焦磷酸和核苷酸為底物，特異性催化5’肌苷酸的生成，從而為酶法進(jìn)行核苷的5’磷酸化提供了新方法。而且，在核苷磷酸化方面，由于酶催化具有反應(yīng)條件溫和、低成本、低毒性和特異性高等優(yōu)點，展現(xiàn)了較大的發(fā)展?jié)摿?。然而迄今為止，有關(guān)酸性磷酸酶轉(zhuǎn)移酶活性的酶學(xué)動力學(xué)、細(xì)胞催化、融合蛋白催化及酶相關(guān)催化過程的參數(shù)還沒有被系統(tǒng)報道過。
通過以上分析可見，上述合成5’呈味核苷酸的方法各有不足，開發(fā)生產(chǎn)呈味劑的新方法是核苷酸發(fā)酵工業(yè)發(fā)展的重要方向之一。目前，我國發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷和鳥苷已經(jīng)實現(xiàn)工業(yè)化，以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步開發(fā)生產(chǎn)5’-肌苷酸技術(shù)的關(guān)鍵是如何實現(xiàn)肌苷和鳥苷的特異性磷酸化。酶法轉(zhuǎn)化因其具有簡便高效和選擇性強等優(yōu)點，具有很大的發(fā)展?jié)摿Γ_發(fā)具有特異性催化合成5’呈味核苷酸潛力的菌株和工藝，是解決問題的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)量較高、成本低廉的生物合成5′呈味核苷酸的方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案一種生物合成5′呈味核苷酸的方法，是將含有酸性磷酸酶基因的產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)菌體作為催化劑添加到含底物焦磷酸和肌苷(Inosine)或鳥苷(Guanosine)的反應(yīng)溶液中，在25-35℃，pH 4.0-8.4下反應(yīng)，得到5’-肌苷酸(5’-IMP)或5’-鳥苷酸(5’-GMP)。
在上述5′呈味核苷酸的合成方法中，反應(yīng)條件優(yōu)選為30℃，pH 4.6。
為獲得更高的合成效率，可將含有酸性磷酸酶基因的產(chǎn)氣腸桿菌菌體細(xì)胞破碎后，用破碎細(xì)胞液進(jìn)行上述催化反應(yīng)，此時的反應(yīng)條件優(yōu)選為30℃，pH 7.6。
可用常規(guī)方法對產(chǎn)氣腸桿菌菌體細(xì)胞進(jìn)行破碎處理，如超聲、化學(xué)破碎法或酶學(xué)破碎法等。所述破碎菌體的方法可為將菌體置于pH 7.2-8.4，0.1mM的Tris·HCl緩沖液中，在0℃冰水浴中超聲50-150次，每次超聲時間為2-4sec，間隔時間為2-4sec。
上述反應(yīng)液中肌苷的濃度為5-40mg/mL，優(yōu)選為10mg/mL；鳥苷的濃度為5-40mg/mL，優(yōu)選為10mg/mL；焦磷酸的濃度為200-300mg/mL，優(yōu)選為250mg/mL；產(chǎn)氣腸桿菌菌體細(xì)胞的濃度為10-80mg/mL，優(yōu)選為20mg/mL。
此外，為提高酶促反應(yīng)效率，在上述反應(yīng)液中還可添加濃度為0.1-0.4mg/mL的硫酸鎂，以提供Mg2+。
所述含有酸性磷酸酶基因的產(chǎn)氣腸桿菌可按照常規(guī)培養(yǎng)方法獲得，如將產(chǎn)氣腸桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，在30-37℃，100-250rpm下培養(yǎng)。
本發(fā)明提供了一種生物合成呈味核苷酸(5′-IMP和5′-GMP)的方法。該方法是以焦磷酸和肌苷(或鳥苷)為底物，利用產(chǎn)氣腸桿菌所具有的酸性磷酸酶活性將肌苷(或鳥苷)特異性催化生成5′-IMP(或5′-GMP)，反應(yīng)原理見圖1。本發(fā)明具有以下優(yōu)點1)選用的菌株具有酸性磷酸酶活性高，生長速度快和環(huán)境適應(yīng)性強的優(yōu)點，在好氧及厭氧條件下均可生長，適于工業(yè)化生產(chǎn)；2)合成方法簡單，目的產(chǎn)物的產(chǎn)量高，5′-肌苷酸的濃度可達(dá)6.21mg/mL、5′鳥苷酸的濃度可達(dá)6.0mg/mL；3)原料來源廣泛，對設(shè)備要求低，生產(chǎn)成本低廉。
本發(fā)明將在5′呈味核苷酸的工業(yè)化生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為本發(fā)明5’-肌苷酸合成方法的原理圖。
圖2為pH值對產(chǎn)氣腸桿菌整細(xì)胞催化合成5′-肌苷酸影響的檢測結(jié)果。
圖3為最適pH值產(chǎn)氣腸桿菌整細(xì)胞催化合成5′-肌苷酸隨時間變化關(guān)系的檢測結(jié)果。
圖4為產(chǎn)氣腸桿菌整細(xì)胞催化合成5′-肌苷酸時底物肌苷的轉(zhuǎn)化率與目標(biāo)產(chǎn)物5′-肌苷酸的轉(zhuǎn)化率隨時間變化關(guān)系的檢測結(jié)果。
圖5為用產(chǎn)氣腸桿菌細(xì)胞破碎液進(jìn)行催化5′-肌苷酸的生物合成時不同pH酶活力影響的檢測結(jié)果。
圖6為最適pH值時產(chǎn)氣腸桿菌細(xì)胞破碎液催化合成5′-肌苷酸隨時間變化關(guān)系的檢測結(jié)果。
圖7為產(chǎn)氣腸桿菌細(xì)胞破碎液催化合成5′-肌苷酸時底物肌苷的轉(zhuǎn)化率與目標(biāo)產(chǎn)物5′-肌苷酸的轉(zhuǎn)化率隨時間變化關(guān)系的檢測結(jié)果。
圖8為產(chǎn)氣腸桿菌內(nèi)酸性磷酸轉(zhuǎn)移酶的存在方式檢測結(jié)果。
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實施例1、用產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)整細(xì)胞催化5′-肌苷酸的生物合成及不同pH對整細(xì)胞催化合成5′-肌苷酸的影響1、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)菌體的獲得挑取產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)(購自日本東京大學(xué)應(yīng)用微生物研究所(IAM)菌種庫)的單菌落，將其接種于50mL盛有20mL LB液體培養(yǎng)基的小三角瓶中，在37℃、100rpm搖床培養(yǎng)12小時(過夜)作為種子液；再取1.5mL種子液，將其接種到盛有150mL LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在37℃、180rpm下培養(yǎng)至OD600值為1.8時，12000rpm離心8min，棄上清，得到產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenesIAM1183)菌體細(xì)胞。
2、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)整細(xì)胞催化5′-肌苷酸的生物合成時不同pH對整細(xì)胞催化合成5′-肌苷酸的影響向含10mg/mL肌苷，250mg/mL Na4P2O7·10H2O和0.2mg/mL MgSO4·7H2O的溶液反應(yīng)體系中添加步驟1獲得的0.4g產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)菌體細(xì)胞(相當(dāng)20mg/mL)，然后在30℃及不同pH(4.0-5.6)下反應(yīng)16h后，離心取上清，稀釋一倍，用高壓液相色譜法對合成的5′-肌苷酸進(jìn)行定性、定量測定，以檢測不同pH對產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)整細(xì)胞催化合成5′-肌苷酸的影響。檢測結(jié)果如圖2所示(縱坐標(biāo)為5′-肌苷酸的濃度(mg/mL)，橫坐標(biāo)為pH值)，pH值為4.0-5.6時均能生成5′-肌苷酸，且在pH值約為4.8時，5′-肌苷酸的合成速率最快。
實施例2、用產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)整細(xì)胞催化5′-肌苷酸的生物合成時5′-肌苷酸隨時間的變化關(guān)系用與實施例1相同的方法得到產(chǎn)氣腸桿菌菌體細(xì)胞，然后向含10mg/mL肌苷，250mg/mL Na4P2O7·10H2O和0.2mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加實施例1步驟一獲得的0.4g產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)菌體細(xì)胞(相當(dāng)20mg/mL)，然后在28℃、pH4.8下進(jìn)行催化反應(yīng)，每隔2小時取樣，離心取上清，用高壓液相色譜法對合成的5′-肌苷酸進(jìn)行定性、定量測定，以檢測產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes IAM1183)整細(xì)胞催化合成5′-肌苷酸隨時間的變化關(guān)系。檢測結(jié)果如圖3所示(縱坐標(biāo)為5′-肌苷酸的濃度(mg/mL)，橫坐標(biāo)為反應(yīng)時間)，隨著反應(yīng)時間的延長，5′-肌苷酸的濃度近似呈線性增加，表明反應(yīng)速度并無明顯下降，即底物濃度相對過量，反應(yīng)速度仍保持最大速度，產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenesIAM1183)的磷酸轉(zhuǎn)移酶仍具有較高活力，酶活穩(wěn)定。
實施例3、用產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)整細(xì)胞進(jìn)行5′肌苷酸的生物合成及底物轉(zhuǎn)化率與目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率隨時間的變化關(guān)系用與實施例1相同的方法得到產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)菌體細(xì)胞，然后向含8mg/mL肌苷，300mg/mL Na4P2O7·10H2O和0.4mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加實施例1步驟一獲得的0.4g產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenesIAM1183)細(xì)胞(相當(dāng)20mg/mL)，然后在30℃、pH4.8下進(jìn)行催化反應(yīng)，每隔2小時取樣，離心取上清，用高壓液相色譜法對合成的5′-肌苷酸及底物濃度進(jìn)行定性、定量測定。以檢測底物肌苷的轉(zhuǎn)化率與目標(biāo)產(chǎn)物5′-肌苷酸的轉(zhuǎn)化率隨時間的變化關(guān)系。檢測結(jié)果如圖4所示(縱坐標(biāo)為轉(zhuǎn)化率(％)，橫坐標(biāo)為反應(yīng)時間)，肌苷轉(zhuǎn)化率隨時間的變化關(guān)系較為平緩，隨反應(yīng)時間的變化不大，表明肌苷對于細(xì)胞膜的滲透性較強，能夠較容易地進(jìn)入細(xì)胞；而5′-肌苷酸的生成隨時間變化較為明顯，且近似線性，這與5′-肌苷酸的滲透性較差有關(guān)，合成的5′-肌苷酸需逐步釋放到胞外。
實施例4、檢測用產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)細(xì)胞破碎液催化5′-肌苷酸的生物合成時不同pH對游離磷酸轉(zhuǎn)移酶活力的影響用與實施例1相同的方法得到產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌體，然后用超聲法破碎菌體細(xì)胞，方法為將菌體置于pH 7.6，0.1mM的Tris·HCl緩沖液中，在0℃冰水浴中超聲99次，每次超聲時間為3sec，間隔時間為3sec。再向含10mg/mL肌苷，250mg/mL Na4P2O7·10H2O和0.2mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加20mg/mL產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerrogenes IAM1183)菌體破碎液，然后在30℃及不同pH(5.2-8.4)下反應(yīng)10min后，用0.15mL濃鹽酸終止反應(yīng)。用高壓液相色譜法對合成的5′-肌苷酸進(jìn)行定性、定量測定。酶活性檢測結(jié)果如圖5所示(縱坐標(biāo)為游離的磷酸轉(zhuǎn)移酶活力(U)，MES表示醋酸鈉緩沖溶液pH5.2-6.8，Tris·HCl表示pH7.2-8.4橫坐標(biāo)為pH值)，在pH為7.6時，游離的磷酸轉(zhuǎn)移酶活力最高，且具有最大的催化反應(yīng)速度，為最佳反應(yīng)的pH值，同時也說明pH值對游離磷酸轉(zhuǎn)移酶的活力影響比用產(chǎn)氣腸桿菌整細(xì)胞進(jìn)行催化合成時更為明顯。
實施例5、在最佳pH 7.6下用產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)破碎細(xì)胞液催化生物合成5′-肌苷酸隨時間的變化關(guān)系。
與實施例1相同的方法得到產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌體，然后用與實施例4相同的方法破碎細(xì)胞，再向含15mg/mL肌苷，250mg/mLNa4P2O7·10H2O和0.2mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加40mg/mL產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)菌體破碎液，然后在30℃、pH 7.6條件下進(jìn)行催化反應(yīng)，每隔2小時取樣，加入0.15mL濃鹽酸終止反應(yīng)。在20℃、8000rmp下離心20min，將上清液稀釋1倍，用高壓液相色譜法對合成的5′-肌苷酸進(jìn)行定性、定量測定；以檢測產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)破碎細(xì)胞催化合成5′-肌苷酸隨時間的變化關(guān)系。檢測結(jié)果如圖6所示(縱坐標(biāo)為5′-肌苷酸的濃度(mg/mL)，橫坐標(biāo)為反應(yīng)時間)，破碎細(xì)胞催化能力較強，反應(yīng)10分鐘可將加入肌苷總量的38.4％轉(zhuǎn)化為5′-肌苷酸，當(dāng)5′-肌苷酸濃度達(dá)到5.8mg/mL時，反應(yīng)速度明顯下降，說明酶活受到產(chǎn)物的抑制。
實施例6、在最佳pH7.6下用產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)破碎細(xì)胞液進(jìn)行5′-肌苷酸的生物合成及底物轉(zhuǎn)化率與目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率隨時間的變化關(guān)系用與實施例1相同的方法得到產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌體，然后用與實施例4相同的方法破碎菌體細(xì)胞，再向含10mg/mL肌苷，250mg/mLNa4P2O7·10H2O和0.1mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加15mg/mL產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)菌體破碎液，然后在30℃、pH7.6下進(jìn)行催化反應(yīng)，每隔2小時，用0.15mL濃鹽酸終止反應(yīng)。用高壓液相色譜法對合成的5′-肌苷酸及底物濃度進(jìn)行定性、定量測定，以檢測底物肌苷的轉(zhuǎn)化率與目標(biāo)產(chǎn)物5′-肌苷酸的轉(zhuǎn)化率隨時間的變化關(guān)系。檢測結(jié)果如圖7所示(縱坐標(biāo)為轉(zhuǎn)化率(％)，橫坐標(biāo)為反應(yīng)時間)，在初始較短的時間內(nèi)，反應(yīng)可以很快地進(jìn)行，在10min內(nèi)，5′-肌苷酸的濃度可以達(dá)到5.85mg/mL，而在此后5′-肌苷酸的濃度隨反應(yīng)時間的變化并不明顯，到達(dá)16h后，5′-肌苷酸的濃度可達(dá)6.21mg/mL。
實施例7、檢測產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)內(nèi)酸性磷酸轉(zhuǎn)移酶的存在方式用與實施例1相同的方法得到產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌體，然后用與實施例4相同的方法破碎細(xì)胞，然后在20℃、8000rmp下離心20min，分離上清液和沉淀，再將破碎菌體的上清液和沉淀，以及未進(jìn)行離心分離的破碎菌體和含全菌體的培養(yǎng)菌液分別作為催化物加到含10mg/mL肌苷，250mg/mL Na4P2O7·10H2O和0.2mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中在30℃、pH 7.6條件下進(jìn)行催化反應(yīng)，以無催化物的反應(yīng)體系為陰性對照，用高壓液相色譜法測定產(chǎn)物的5′-肌苷酸的濃度。檢測結(jié)果如圖8所示(縱坐標(biāo)為5′-肌苷酸的濃度(mg/mL)，橫坐標(biāo)為反應(yīng)時間)，產(chǎn)氣腸桿菌細(xì)胞破碎液上清的催化能力遠(yuǎn)大于破碎沉淀物的催化能力，說明產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)的酸性磷酸轉(zhuǎn)移酶處于細(xì)胞內(nèi)，并且具有可溶性強的特點。
實施例8、利用產(chǎn)氣腸桿菌(Enterbacter aerogenes IAM1183)整細(xì)胞合成5′-鳥苷酸用與實施例1相同的方法得到產(chǎn)氣腸桿菌(Enterbacter aerogenes IAM1183)全菌體，然后向含10mg/mL鳥苷，250mg/mL Na4P2O7·10H2O和0.2mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加20mg/mL產(chǎn)氣腸桿菌(Enterbacter aerogenes 1AM1183)全菌體，然后在30℃、pH4.8下進(jìn)行催化反應(yīng)，并每隔2小時取樣，用高壓液相色譜法對合成的5′-鳥苷酸進(jìn)行定性、定量測定。結(jié)果隨著反應(yīng)時間的延長，5′-鳥苷酸的濃度近似呈線性增加，表明本發(fā)明所選用的菌株具有較高的酸性磷酸酶活性，可用于5′-鳥苷酸的生物合成中。
實施例9、利用產(chǎn)氣腸桿菌破碎細(xì)胞合成5′-鳥苷酸用與實施例1相同的方法得到產(chǎn)氣腸桿菌(Enterbacter aerogenes IAM1183)全菌體，然后用與實施例4相同的方法破碎細(xì)胞，再向含12mg/mL鳥苷，280mg/mLNa4P2O7·10H2O和0.3mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加50mg/mL產(chǎn)氣腸桿菌(Enterbacter aerogenes IAM1183)細(xì)胞破碎液，然后在32℃、pH 8.0下進(jìn)行催化反應(yīng)，每隔2小時用高壓液相色譜法對合成的5′-鳥苷酸濃度進(jìn)行定性、定量測定。結(jié)果且隨著反應(yīng)時間的延長，5′-鳥苷酸的濃度近似呈線性增加，表明本發(fā)明所選用的菌株具有較高的酸性磷酸酶活性，可用于5′-鳥苷酸的生物合成中。
實施例10、利用產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)整細(xì)胞合成5′-鳥苷酸用與實施例1相同的方法得到產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌體，然后向含10mg/mL鳥苷，250mg/mL Na4P2O7·10H2O和0.2mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加20mg/mL產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌體，然后在30℃、pH4.8下進(jìn)行催化反應(yīng)，并每隔2小時取樣，用高壓液相色譜法對合成的5′-鳥苷酸進(jìn)行定性、定量測定。結(jié)果隨著反應(yīng)時間的延長，5′-鳥苷酸的濃度近似呈線性增加，到達(dá)16h后，5′-鳥苷酸的濃度可達(dá)5.9mg/mL，表明本發(fā)明所選用的菌株具有較高的酸性磷酸酶活性，可用于5′-鳥苷酸的生物合成中。
實施例11、利用產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)整細(xì)胞合成5′-鳥苷酸用與實施例1相同的方法得到產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌體，然后向含5mg/mL鳥苷和200mg/mL Na4P2O7·10H2O的溶液中添加10mg/mL產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌體，然后在25℃、pH7.6下進(jìn)行催化反應(yīng)，并每隔2小時取樣，用高壓液相色譜法對合成的5′-鳥苷酸進(jìn)行定性、定量測定。結(jié)果隨著反應(yīng)時間的延長，5′-鳥苷酸的濃度近似呈線性增加，5′-鳥苷酸的濃度可達(dá)5.5mg/mL，表明本發(fā)明所選用的菌株具有較高的酸性磷酸酶活性，可用于5′-鳥苷酸的生物合成中。
實施例12、利用產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)整細(xì)胞合成5′-鳥苷酸用與實施例1相同的方法得到產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌體，然后向含40mg/mL鳥苷，300mg/mL Na4P2O7·10H2O和0.4mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加80mg/mL產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes I4M1183)全菌體，然后在35℃、pH8.4下進(jìn)行催化反應(yīng)，并每隔2小時取樣，用高壓液相色譜法對合成的5′-鳥苷酸進(jìn)行定性、定量測定。結(jié)果隨著反應(yīng)時間的延長，5′-鳥苷酸的濃度近似呈線性增加，5′-鳥苷酸的濃度可達(dá)5.9mg/mL，表明本發(fā)明所選用的菌株具有較高的酸性磷酸酶活性，可用于5′-鳥苷酸的生物合成中。
實施例13、利用產(chǎn)氣腸桿菌破碎細(xì)胞合成5′-鳥苷酸用與實施例1相同的方法得到產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)全菌體，然后用超聲法破碎菌體細(xì)胞，方法為將菌體置于pH 8.4，0.1mM的Tris·HCl緩沖液中，在0℃冰水浴中超聲150次，每次超聲時間為5sec，間隔時間為2sec。再向含12mg/mL鳥苷，280mg/mL Na4P2O7·10H2O和0.1mg/mL MgSO4·7H2O的溶液中添加50mg/mL產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)細(xì)胞破碎液，然后在30℃、pH 7.6下進(jìn)行催化反應(yīng)，每隔2小時用高壓液相色譜法對合成的5′-鳥苷酸濃度進(jìn)行定性、定量測定。結(jié)果且隨著反應(yīng)時間的延長，5′-鳥苷酸的濃度近似呈線性增加，5′-鳥苷酸的濃度可達(dá)6.0mg/mL，表明本發(fā)明所選用的菌株具有較高的酸性磷酸酶活性，可用于5′-鳥苷酸的生物合成中。
權(quán)利要求
1.一種生物合成5′呈味核苷酸的方法，是將含有酸性磷酸酶基因的產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)菌體添加到含底物焦磷酸和肌苷或鳥苷的反應(yīng)溶液中，在25-35℃，pH4.0-8.4下反應(yīng)，得到5’-肌苷酸或5’-鳥苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于向反應(yīng)溶液中添加濃度為0.1-0.4mg/mL的硫酸鎂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)條件為30℃，pH4.6。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于破碎含有酸性磷酸酶基因的產(chǎn)氣腸桿菌菌體細(xì)胞，再用細(xì)胞破碎液進(jìn)行反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述破碎菌體的方法為將菌體置于pH7.2-8.4，0.1mM的Tris·HCl緩沖液中，在0℃冰水浴中超聲50-150次，每次超聲時間為2-4sec，間隔時間為2-4sec。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)條件為30℃，pH7.6。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于所述肌苷的濃度為5-40mg/mL，鳥苷的濃度為5-40mg/mL，焦磷酸的濃度為200-300mg/mL，產(chǎn)氣腸桿菌菌體的添加量為10-80mg/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述肌苷的濃度為10mg/mL，鳥苷的濃度為10mg/mL，焦磷酸的濃度為250mg/mL，產(chǎn)氣腸桿菌菌體的添加量為20mg/mL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種5′呈味核苷酸的生物合成方法。該方法是將含有酸性磷酸酶基因的產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes IAM1183)菌體添加到含底物焦磷酸和肌苷或鳥苷的反應(yīng)溶液中，在25－35℃，pH 4.0－8.4下反應(yīng)，得到5’－肌苷酸或5’－鳥苷酸。本發(fā)明具有以下優(yōu)點1)選用的菌株具有酸性磷酸酶活性高，生長速度快和環(huán)境適應(yīng)性強的優(yōu)點，在好氧及厭氧條件下均可生長，適于工業(yè)化生產(chǎn)；2)生產(chǎn)方法簡單，目的產(chǎn)物的產(chǎn)量高；3)原料來源廣泛，對設(shè)備要求低，生產(chǎn)成本低廉。本發(fā)明將在5′呈味核苷酸的工業(yè)化生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號C12R1/01GK1974780SQ20061016527
公開日2007年6月6日 申請日期2006年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月15日
發(fā)明者邢新會, 趙洪新, 楊成, 盧元, 張翀, 王立言 申請人:清華大學(xué)