專利名稱：二核苷酸結(jié)晶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及P1-(2’-脫氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸酯(dCP4U)或其藥學(xué)可接受鹽(此后可以簡(jiǎn)單稱為“dCP4U”)，其適于作為慢性支氣管炎、鼻竇炎等的治療劑；本發(fā)明涉及制備所述結(jié)晶的方法；并且涉及有效制備dCP4U的方法。
迄今為止，還無法獲得結(jié)晶形式的dCP4U，并且dCP4U只能夠以白色粉末(白色固體)的形式經(jīng)過冷凍干燥制得。常規(guī)獲得的dCP4U的粉狀產(chǎn)物具有82％的低純度(通過HPLC測(cè)定)。特別是，難以把dCP4U與作為起始原料的尿苷5’-三磷酸(UTP)分開，而且只有通過慣用的離子交換色譜才能夠制備高純dCP4U，但這非常困難(WO98/34942)。
上述低醇的白色粉末具有如吸濕性的缺點(diǎn)。所以，由dCP4U起始的藥物制備必須在其濕度被嚴(yán)格控制的專用設(shè)備中進(jìn)行。甚至在藥物的制備之后，產(chǎn)品必須密封包裝。此外，由于粉狀產(chǎn)物的穩(wěn)定性差導(dǎo)致藥物具有非常短的有效期，人們期望獲得高純度和穩(wěn)定的dCP4U結(jié)晶。
dCP4U是由2’-脫氧胞苷5’-一磷酸(dCMP)和UTP通過活化劑如二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的使用來合成。然而，常規(guī)方法提供的合成收率非常低；即低達(dá)約9％(重量)(參見WO 98/24942的實(shí)施例20)，并且可能永遠(yuǎn)不能作為實(shí)用方法。因此，人們還希望開發(fā)出可以高收率和大規(guī)模制備dCP4U的方法。
鑒于述觀點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供穩(wěn)定的dCP4U結(jié)晶，其適合用來制備藥物。本發(fā)明的另一目的在于提供制備所述結(jié)晶的方法。本發(fā)明的再一目的是提供適合大規(guī)模dCP4U生產(chǎn)的高效方法。
本發(fā)明人在通過使用低廉的尿苷5’-一磷酸(UMP)代替昂貴的UTP合成dCP4U的方法上也作了大量研究，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過二苯基磷酰氯(DPC)和焦磷酸鹽(PPi)的使用可以有效制備dCP4U。本發(fā)明在這些發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上完成。
所以，本發(fā)明提供dCP4U的結(jié)晶。
本發(fā)明還提供一種用于制備dCP4U的結(jié)晶的方法，該方法包括通過陰離子交換色譜和活性炭色譜來純化dCP4U粗品，并且在提純的dCP4U溶液中加入親水性有機(jī)溶劑，由此沉淀出結(jié)晶形式的dCP4U。
本發(fā)明還提供一種制備dCP4U的方法，其包括使UMP、dCMP、DPC和PPi反應(yīng)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是表示結(jié)晶dCP4U·4Na(3.5-水合物)的晶形的相片。該相片是在偏光顯微鏡(放大率×440)下拍攝，其中圖像中的1mm對(duì)應(yīng)于25μm。
圖2表示結(jié)晶dCP4U·4Na(3.5-水合物)的X射線衍射光譜。
圖3表示dCP4U·4Na(十水合物)的X射線衍射光譜。
圖4表示白色粉狀dCP4U(冷凍干燥產(chǎn)物)的X射線衍射光譜。
圖5表示結(jié)晶dCP4U·4Na(3.5-水合物)的13C-CPMAS-NMR光譜。
圖6表示dCP4U·4Na(十水合物)的13C-CPMAS-NMR光譜。
圖7表示白色粉狀dCP4U(冷凍干燥產(chǎn)物)的13C-CPMAS-NMR光譜。
苯乙烯或丙烯酸樹脂可以在實(shí)施色譜技術(shù)中作為陰離子交換樹脂使用?？梢允褂玫臉渲膶?shí)例包括強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂如AMBERLITE IRA 402(Rohm & Hass Co.)、DIAION PA-312和DIAIONSA-11A(Mitsubishi Chemical Co.Ltd.)，和弱堿型陰離子交換樹脂如AMBERLITE IRA 67(Rohm & Hass Co.)和DIAION WA-30(Mitsubishi Chemical Co.Ltd.)。
活性炭可以是色譜級(jí)活性炭，其被壓碎或成形為顆粒，并且可以包括市售產(chǎn)品(例如Wako Pure Chemical Industries，Ltd.和Futamura Chemical Industries，Co.，Ltd.的那些產(chǎn)品)。
色譜可以以分批的方式、通過柱的使用等進(jìn)行。當(dāng)進(jìn)行柱色譜時(shí)，酸性水溶液或其與具有提高離子強(qiáng)度的鹽(如氯化鈉)的混合物可以用作陰離子交換色譜的洗脫劑；并且水或堿(如氫氧化鈉)的水溶液可以用作活性炭柱色譜的洗脫劑。利用進(jìn)行小規(guī)模的預(yù)備試驗(yàn)以便選擇各洗脫劑在0.001至10M范圍內(nèi)的適當(dāng)濃度。(2)dCP4U的結(jié)晶通過在含有由此純化的dCP4U的溶液中加入親水性有機(jī)溶劑可以結(jié)晶出dCP4U。
可以使用的親水性有機(jī)溶劑的實(shí)例包括含有等于或小于6個(gè)碳原子的醇，如甲醇和乙醇；酮類，如丙酮；醚類，如二噁烷；腈類，如乙腈；和酰胺，如二甲基甲酰胺。其中，特別優(yōu)選醇類化合物，尤其是乙醇。
更加具體地說，由此純化的dCP4U的溶液，或經(jīng)溶液濃縮獲得的漿液，可以選擇性地處理以調(diào)整pH至5-10，優(yōu)選6-9；并且在60℃或更低溫度下，優(yōu)選在等于或低于20℃的溫度下，向上述溶液或漿液中加入親水性有機(jī)溶劑，由此沉淀出溶質(zhì)，其為dCP4U的穩(wěn)定結(jié)晶。
本發(fā)明的由此制得的dCP4U結(jié)晶含有等于或高于95％的dCP4U和等于或小于3％的UTP。更加可取地，dCP4U結(jié)晶含有等于或高于97％的dCP4U，和等于或小于2％的UTP。更加優(yōu)選地，dCP4U結(jié)晶含有等于或高于98％的dCP4U，和等于或小于1％的UTP。
如此高純度dCP4U結(jié)晶可以是鹽、水合物或水合物鹽的形式。所述鹽的實(shí)例包括藥學(xué)可接受鹽，例如堿金屬鹽，如鈉鹽和鉀鹽；堿土金屬鹽，如鈣鹽和鎂鹽；和銨鹽。所述的dCP4U可以被1-4個(gè)金屬原子取代形成鹽。
上述水合物可以含有1-14個(gè)分子的水，這些水鍵合或附著在dCP4U的一個(gè)分子上；并且上述水合物鹽可以含有1-14個(gè)分子的水，這些水結(jié)合或附著于dCP4U的堿金屬鹽的一個(gè)分子上。
此外，按照本發(fā)明dCP4U的結(jié)晶還可以包括其互變異構(gòu)體。
由此制得的dCP4U結(jié)晶選擇性地經(jīng)過常規(guī)方法干燥，如減壓下干燥、空氣流下干燥，或通過加熱干燥，并且隨后被置于容器(例如瓶、袋、罐、安瓿)內(nèi)。完成包裝在容器中，容器可以是敞開、封閉、氣密或熔封的。從維持結(jié)晶的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性的角度考慮，敞開在空氣中包裝是不可取的。
按照本發(fā)明制備dCP4U的方法包括UMP、dCMP、DPC和PPi反應(yīng)。
具體地說，該方法包括UMP與DPC反應(yīng)，由此合成UMP二苯基磷酸酯(UMP-DPP)；含UMP-DPP的反應(yīng)混合物進(jìn)一步用PPi處理，由此在混合物中形成UTP；和，無需從反應(yīng)混合物中分離，由此生成的UTP與dCMP在DPC的存在下反應(yīng)，由此生成目標(biāo)dCP4U。
在由UMP合成UMP-DPP中，可以將常規(guī)制得的UMP三烷基胺鹽(例如UMP三丁基胺鹽)溶于溶劑中。所述溶劑的實(shí)例包括酰胺類，如DMF和二甲基乙酰胺(DMAC)；環(huán)醚類，如二噁烷和四氫呋喃；酮類，例如丙酮；和二甲基咪唑啉酮、六甲基磷三酰胺；或兩種或多種這些溶劑的混合物。所以，將DPC和任選的三烷基胺加入到溶液中，令該混合物在10-50℃下反應(yīng)約30分鐘至5小時(shí)。
與UMP-DPP反應(yīng)的PPi優(yōu)選是PPi-有機(jī)堿鹽。所述鹽的實(shí)例包括己基胺鹽、二丁基胺鹽、三乙胺鹽和三丁基胺鹽。
在UMP-DPP與PPi-有機(jī)堿鹽的反應(yīng)中，PPi-有機(jī)堿鹽可以溶于溶劑中。所述溶劑的實(shí)例包括酰胺，如DMF、DMAC和甲酰胺；環(huán)醚類，如二噁烷和四氫呋喃；酮類，如丙酮；和二甲基咪唑啉酮、六甲基磷三酰胺、二甲基亞砜、乙腈；或兩種或多種這些溶劑的混合物。所以，將溶液加入由此合成的UMP-DPP溶液中，并且令該混合物在10-50℃下反應(yīng)約30分鐘至5小時(shí)。
UMP-DPP與PPi-有機(jī)堿鹽之間的反應(yīng)可以在適當(dāng)堿的存在下進(jìn)行。所述堿的實(shí)例包括吡啶堿類，如吡啶、2，6-二甲基吡啶、2，4-二甲基吡啶、α-甲基吡啶、β-甲基吡啶、γ-甲基吡啶、2，4-二甲基氨基吡啶、α-可力丁、β-可力丁和γ-可力丁，其中特別優(yōu)選吡啶。反應(yīng)的堿性溶劑也屬于本發(fā)明所用的堿。堿的濃度沒有特別規(guī)定。優(yōu)選堿以基于UMP計(jì)等于或大于6當(dāng)量、優(yōu)選等于或大于18當(dāng)量的量加入。
經(jīng)過UMP-FPP和PPi-有機(jī)堿鹽之間的反應(yīng)，反應(yīng)混合物中合成了UTP。由此生成的UTP在DPC的存在下與dCMP反應(yīng)，由此合成dCP4U。
雖然dCMP本身可以加在反應(yīng)混合物中，但dCMP可以以和采用UMP情況中的相似方式轉(zhuǎn)化為dCMP二苯基磷酸酯(dCMP-DPP)；而且也可以加入dCMP-DPP。
dCP4U的反應(yīng)可以通過向上述合成的UTP溶液中加入基于用作起始原料的UMP計(jì)等于或大于1.1當(dāng)量的DPC和0.5-1.5當(dāng)量的dCMP或dCMP-DPP來進(jìn)行，并且令混合物在10-50℃下反應(yīng)約30分鐘-5小時(shí)。
由此所得的dCP4U按照上述方式純化和結(jié)晶，從而得到本發(fā)明的dCP4U結(jié)晶。
將由此所得的dCP4U溶液用水稀釋，從而調(diào)至1000ml的總體積，并且將稀釋溶液上樣在中等堿性陰離子交換樹脂(AMBERLITEIRA-67，Rohm & Hass Co.的產(chǎn)品)的柱子中。順序用水、0.18M鹽酸水溶液和含有0.5M氯化鈉的0.005M鹽酸水溶液進(jìn)行洗脫，由此收集含有dCP4U的餾分。
將由此得到的dCP4U餾分(4000ml)上樣在帶有色譜級(jí)活性炭(Taiko Granular Activated Charcoal SGP，F(xiàn)utamura ChemicalIndustries，Co.，Ltd.的產(chǎn)品)的柱子中。通過用0.05M氫氧化鈉水溶液(8000ml)洗脫dCP4U。
將由此得到的dCP4U餾分合并且濃縮，從而制得一個(gè)漿液。把該漿液的pH調(diào)至6.0。攪拌該漿液同時(shí)逐漸向該漿液中加入乙醇，并且在攪拌的同時(shí)令所得的漿液進(jìn)一步冷卻至10℃，從而沉淀出dCP4U·4Na結(jié)晶。分離結(jié)晶由此得到8.9g的dCP4U·4Na。分離的結(jié)晶在減壓下、在約60℃下干燥約4小時(shí)，隨后用來儀器分析。(2)使用DPC的方法將UTP·3Na(12.8kg)溶于水(135L)中，并且將所得的溶液上樣在帶有陽離子交換樹脂(Mitsubishi Chemical Co.Ltd.的產(chǎn)品)的柱子中。令該溶液流經(jīng)該柱子并且合并用水洗脫的餾分，并且在攪拌的同時(shí)向合并的溶液中緩慢加入三丁基胺(TBA；13.6kg)以便中和。濃縮該溶液，向該溶液中加入甲酰胺(10kg)。所得的溶液通過與二噁烷沸騰來除水。隨后，經(jīng)脫水的物質(zhì)用吡啶(11.6kg)稀釋，從而制備UTP的吡啶溶液。
向另一個(gè)含有甲醇(181)的罐中加入dCMP(7.5kg)。攪拌的同時(shí)向該溶液緩慢加入TBA(4.5kg)，將該溶液加熱至60℃。組分溶解之后，使溶液濃縮至干。干燥的物質(zhì)進(jìn)一步在75℃的真空中干燥并且壓碎。將壓碎的物質(zhì)(10.3kg)懸浮在二甲基乙酰胺(DMAC)(16.7kg)中，并且向該混懸液中加入二苯基磷酰氯(DPC)(4.4kg)，并且將該混合物攪拌10分鐘。隨后，進(jìn)一步向該混合物中加入TBA(10.8kg)，并且所得的混合物攪拌30分鐘，由此制備dCMP-DPP溶液。
在攪拌下，向由此制備的dCMP-DPP溶液中加入已按照上述方式制備的UTP的吡啶溶液。加料完畢后，室溫下將該混合物攪拌過夜，通過加入去離子水中止該反應(yīng)。
向上述混合物中加入30％氫氧化鈉水溶液(31L)。將該混合物攪拌30分鐘，并且通過分層除去釋放的TBA。向水層加入6mol/L鹽酸溶液，從而將溶液的pH調(diào)至約7。通過除去溶劑濃縮該溶液，并且向該濃縮溶液內(nèi)加入等體積的95％乙醇。令所得的混合物放置過夜?；旌衔锏纳蠈?，即乙醇層，通過抽吸取出，并且向所得的粘性沉淀加入水以便溶解沉淀。通過濃縮溶劑除去殘余的溶劑。
將由此合成的dCP4U溶液的總體積調(diào)至2500L，并且將該溶液上樣在帶有中等堿性陽離子交換樹脂(AMBERLITE IRA-67，Rohm &Hass Co.的產(chǎn)品)的柱子中。順序用水、0.1mol/L鹽酸水溶液和含有0.4mol/L氯化鈉的0.005mol/L鹽酸水溶液進(jìn)行洗脫，由此收集含有dCP4U的餾分。
將由此得到的dCP4U餾分(2100ml)上樣在帶有色譜級(jí)活性炭(Taiko Granular Activated Charcoal SGP，F(xiàn)utamura ChemicalIndustries，Co.，Ltd.的產(chǎn)品)的柱子中。通過用0.05mol/L氫氧化鈉水溶液(12001)洗脫dCP4U。
合并由此所得的餾分并且濃縮。所得溶液的pH用30％氫氧化鈉水溶液調(diào)至7.5。攪拌該溶液的同時(shí)向該溶液中緩慢加入95％乙醇，由此沉淀出dCP4U·4Na結(jié)晶。分離結(jié)晶并且在60℃下干燥4小時(shí)，由此生成4.2kg的dCP4U·4Na結(jié)晶(水含量5.9％，分離收率22％)。<dCP4U·4Na結(jié)晶的物理性質(zhì)>
實(shí)施例1的(1)或(2)中制備的dCP4U·4Na結(jié)晶和按照與WO98/34942的實(shí)施例20所述方法相同的方式制備的dCP4U·4Na結(jié)晶的白色粉末(冷凍干燥產(chǎn)物)進(jìn)行儀器分析。把結(jié)晶和凍干產(chǎn)物在物理性質(zhì)上進(jìn)行比較。(3)儀器分析1)純度分析利用高效液體色譜的方式，實(shí)施例1的(1)和(2)中所得的dCP4U·4Na結(jié)晶，和經(jīng)過各色譜純化的dCP4U餾分進(jìn)行純度分析。結(jié)果在表1和2中給出。高效液體色譜的條件如下所述。
柱子HITACHIGEL #3013-N(Hitachi Keisoluli Service的產(chǎn)品)洗脫劑10％CH3CN，0.18M NH4Cl，0.03KH2PO4，和0.03M K2HPO4檢測(cè)方法在262nm下UV檢測(cè)表1(DCC的檢測(cè))
(-)未測(cè)量，*)離子交換，AC活性炭表1(DPC的檢測(cè))
(-)未測(cè)量，*)離子交換，AC活性炭2)晶形圖1表示dCP4U·4Na(3.5水合物)結(jié)晶的典型晶形的相片。3)含水量通過Karl Fischer法測(cè)量dCP4U·4Na結(jié)晶的含水量。發(fā)現(xiàn)dCP4U·4Na結(jié)晶在6.9-17.4％(重量)的含水量下穩(wěn)定，含水量隨干燥的程度而變化。計(jì)算結(jié)果顯然表示出3.5-10個(gè)水分子結(jié)合或附著在一個(gè)dCP4U分子上。4)熔點(diǎn)利用常規(guī)方法測(cè)定dCP4U·4Na結(jié)晶的熔點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)其熔點(diǎn)為202-210℃。凍干產(chǎn)物的熔點(diǎn)為約195-210℃。5)X射線衍射在下列條件(測(cè)量誤差±0.1°)下，利用X射線衍射儀(型號(hào)RINT2500V，Rigaku Denki的產(chǎn)品)對(duì)dCP4U·4Na結(jié)晶進(jìn)行X射線衍射。由此得到dCP4U·4Na 3.5水合物的X射線衍射光譜和峰的數(shù)據(jù)分別列在圖2中和表3中。同樣地，dCP4U·4Na 10水合物的X射線衍射光譜和峰的數(shù)據(jù)分別列在圖3中和表4中。此外，凍干產(chǎn)物的X射線衍射光譜在圖4中給出作為參比。(測(cè)量的條件)X射線管Cu-KαX射線輸出50kV-300mA掃描速率4.0°/分鐘掃描間隔0.02°角度測(cè)量范圍2-40°狹縫DS-0.5°，RS-0.15mm，SS-0.5°預(yù)處理用攪拌馬達(dá)研磨表3結(jié)晶dCP4U·4Na 3.5水合物
表4結(jié)晶dCP4U·4Na十水合物
6)吸濕性令具有約17.4％含水量的dCP4U·4Na結(jié)晶(十水合物)在下列條件a)、b)和c)下放置2天a)25℃和57％的相對(duì)濕度；b)25℃和75％的相對(duì)濕度；和c)25℃和93％的相對(duì)濕度。在上述三種情況中觀察到?jīng)]有分解和重量變化。證明這些結(jié)晶穩(wěn)定并且不具有吸濕性。此外，令相同的結(jié)晶在下列苛刻條件d)下放置7天d)40℃和75％的相對(duì)濕度。在這種情況中觀察到?jīng)]有變化。
相反，當(dāng)將凍干產(chǎn)物(起始含水量約1％)在下列條件b)或c)下儲(chǔ)藏2天時(shí)b)25℃和75％的相對(duì)濕度與c)25℃和93％的相對(duì)濕度，在儲(chǔ)藏的第2天，該產(chǎn)物呈泥漿狀態(tài)，這歸因于含水量的逐漸增高。7)穩(wěn)定性將dCP4U·4Na結(jié)晶(十水合物)和凍干產(chǎn)物分別置于瓶中，隨后將瓶子溶封并且在60℃下保存13天(加速試驗(yàn))。觀察到結(jié)晶不分解。相反，發(fā)現(xiàn)凍干產(chǎn)物部分分解，這是通過觀察到產(chǎn)物的純度損失為約2.2％來證實(shí)的。8)NMR將dCP4U·4Na結(jié)晶和凍干產(chǎn)物分別直接加入氧化鋯制的轉(zhuǎn)鼓中，并且測(cè)定相應(yīng)的13C-CPMAS-NMR波譜。測(cè)量條件如下所述13C-CPMAS-NMR1)儀器CMX-300(Chemagnetics的產(chǎn)品)2)測(cè)量的方法 CPMAS(邊帶抑制)3)測(cè)量溫度室溫4)觀測(cè)核13C5)觀測(cè)頻率75.502MHz6)質(zhì)子激發(fā)的脈沖寬度 4.5μs7)接觸時(shí)間0.5毫秒8)測(cè)量寬度30.03kHz9)測(cè)量點(diǎn)204810)數(shù)據(jù)點(diǎn) 1638411)反復(fù)時(shí)間 15.0秒(圖6和7)60.0秒(圖5)12)化學(xué)位移標(biāo)準(zhǔn) 六甲基苯(外標(biāo)17.35ppm)13)樣品旋轉(zhuǎn)速度 5kHz14)整合 256次圖5和表5分別表示結(jié)晶dCP4U·4Na 3.5水合物的13C-CPMAS-NMR波譜和峰數(shù)據(jù)，圖6和表6分別表示結(jié)晶dCP4U·4Na十水合物的13C-CPMAS-NMR波譜和峰數(shù)據(jù)。圖7和表7分別表示白色粉末形式的dCP4U(凍干產(chǎn)物)的13C-CPMASONMR波譜和峰數(shù)據(jù)。圖5-7中的數(shù)字是指表5-7中對(duì)于的峰編號(hào)。表5結(jié)晶dCP4U·4Na 3.5水合物(ppm)(1)166.1 (2)156.2 (3)150.9 (4)141.6(5)138.4 (6)101.3 (7)99.2 (8)93.2(9)84.9 (10)80.6 (11)76.7 (12)73.1(13)69.0 (14)67.2 (15)62.2 (16)43.9表6結(jié)晶dCP4U·4Na十水合物(ppm)(1)167.4 (2)157.8 (3)151.6 (4)139.0(5)117.9 (6)102.6 (7)99.3 (8)93.3(9)90.1(10)87.3 (11)80.6 (12)77.2(13)75.0 (14)73.9 (15)72.0 (16)67.0(17)63.1 (18)60.4 (19)42.0 (20)40.8表7dCP4U的白色粉末(凍干產(chǎn)物)(ppm)(1)166.5 (2)157.4 (3)149.9 (4)140.9(5)103.0 (6)99.0(7)96.9 (8)85.9(9)73.4 (10)71.7 (11)67.1 (12)42.0(13)39.3實(shí)施例2由UMP起始的dCP4U合成將甲酰胺(2.5ml)和吡啶(7.6ml)加入脫水焦磷酸的三乙胺鹽(10mmol)(TEA-PPi)，隨后攪拌所得的混合物。向置于另一容器中的脫水尿苷5’-一磷酸的三丁基胺鹽(UMP-TBA)(10mmol)加入DMAC(3.6ml)、二噁烷(3.2ml)，并且加入三丁基胺(3.3ml)和攪拌，向其中滴加DPC(2.3ml)。室溫下攪拌該混合物1小時(shí)，由此形成UMP-DPP，將其加入預(yù)先制備的上述脫水TEA-PPi溶液中。室溫下將該反應(yīng)混合物攪拌1小時(shí)，生成UTP。向置于另一容器中的2’-脫氧胞苷5’-一磷酸的三丁基胺鹽(TBA-dCMP)(4.9g，10mmol)加入DMAC(7.2ml)，由此生成混懸液，并且將DPC(2.2ml，1.1當(dāng)量)加入該混懸液。將所得混合物攪拌40分鐘，并且向該混合物中加入三丁基胺(TBA)(9.5ml)。繼續(xù)攪拌20分鐘，由此制得dCMP-DPP。將由此制備的dCMP-DPP溶液加入預(yù)先制備的上述合成UTP溶液中，并且室溫下攪拌該混合物56小時(shí)。通過加入水中止該反應(yīng)，加入30％氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)該反應(yīng)混合物的pH至11。濃縮除去溶劑之后，通過溶劑6mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0。該混合物用乙酸乙酯分配。通過分配生成的水層進(jìn)行HPLC分析(272nm)，顯示出dCP4U的合成收率為37.7％。
工業(yè)實(shí)用性如上所述，與凍干產(chǎn)物比較，通過本發(fā)明的方法獲得的dCP4U的結(jié)晶具有高純度和高穩(wěn)定性并且沒有吸濕性，由此在制備藥物中成為有效的原材料。
本發(fā)明制備dCP4U的方法允許使用低廉的UMP作為原料并且具有高收率。所以，該方法適合dCP4U的大規(guī)模合成。
權(quán)利要求
1.P1-(2’-脫氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)-四磷酸酯或其鹽的結(jié)晶。
2.P1-(2’-脫氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸酯·4Na的結(jié)晶。
3.按照權(quán)利要求1或2的結(jié)晶，其具有至少95％的純度。
4.按照權(quán)利要求1或2的結(jié)晶，其具有至少97％的純度和含有等于或小于2％尿苷5’-三磷酸酯。
5.按照權(quán)利要求1或2的結(jié)晶，其具有至少98％的純度和含有等于或小于1％尿苷5’-三磷酸酯。
6.一種制備權(quán)利要求1所述結(jié)晶的方法，該方法包括使P1-(2’-脫氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)-四磷酸酯粗品進(jìn)行陽離子交換色譜和活性炭色譜的純化過程，并且向所得的提純P1-(2’-脫氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)-四磷酸酯溶液中加入親水性有機(jī)溶劑，由此引起P1-(2’-脫氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)-四磷酸酯以結(jié)晶的形式沉淀。
7.按照權(quán)利要求6的方法，其中所述純化過程包括首先進(jìn)行的陽離子交換色譜和隨后進(jìn)行的活性炭色譜。
8.一種P1-(2’-脫氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)-四磷酸酯(dCP4U)的方法，該方法包括使尿苷5’-一磷酸酯(UMP)、2’-脫氧胞苷5’-一磷酸酯(dCMP)、二苯基磷酰氯(DPC)和焦磷酸鹽(Ppi)反應(yīng)。
9.按照權(quán)利要求8的方法，其包括在第一步中UMP和DPC反應(yīng)合成UMP二苯基磷酸酯(UMP-DPP)；進(jìn)一步用PPi處理含有UMP-DPP的反應(yīng)混合物，由此在混合物中生成尿苷5’-三磷酸酯(UTP)；和無需由反應(yīng)混合物分離，由此生成的UTP與dCMP在DPC的存在下反應(yīng)，生成dCP4U。
全文摘要
本發(fā)明涉及P
文檔編號(hào)C07H21/00GK1359387SQ00809735
公開日2002年7月17日 申請(qǐng)日期2000年6月30日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月30日
發(fā)明者盛健也, 宮下孝德, 前田秀明, 佐藤浩史, 野田豐 申請(qǐng)人:雅瑪山醬油株式會(huì)社