專利名稱：：純化脂肪酶的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及可適用于各種酯化反應(yīng)、酯交換反應(yīng)等的純化脂肪酶的制造方法，可適用于酯交換反應(yīng)的酯交換用脂肪酶的制造方法，使用由這些方法得到的脂肪酶的油脂的酯交換方法以及含有該脂肪酶的脂肪酶組合物。
背景技術(shù)：
：脂肪酶廣泛應(yīng)用于脂肪酸等各種羧酸和一元醇或多元醇等醇類的酯化反應(yīng)、多個(gè)羧酸酯間的酯交換反應(yīng)等中。其中，酯交換反應(yīng)是作為動(dòng)植物油脂類的改性，各種脂肪酸的酯、糖酯或甾類化合物的制造方法的重要技術(shù)。作為這些反應(yīng)的催化劑，使用作為油脂水解酶的脂肪酶時(shí)，在室溫至約70。C左右的溫和條件下即可進(jìn)行酯交換反應(yīng)，與以往的化學(xué)反應(yīng)相比，不僅可抑制副反應(yīng)、降低能源成本，而且作為催化劑的脂肪酶是天然物質(zhì)，因此安全性也很高。另外，利用其基質(zhì)特異性和位置特異性，可以高效地生產(chǎn)目的物。另一方面，培養(yǎng)脂肪酶的生產(chǎn)菌時(shí)，為了消泡通常在培養(yǎng)基中添加有機(jī)硅，添加的有機(jī)硅會(huì)混入收集的脂肪酶中。用這種脂肪酶進(jìn)行油脂的酯交換時(shí)，所得酯交換油脂中往往混有有機(jī)硅，用含有有機(jī)硅的油炸食品時(shí)有起泡性增高的問(wèn)題。另一方面，培養(yǎng)脂肪酶的生產(chǎn)菌時(shí)，脂肪酶往往會(huì)產(chǎn)生色素等，使用這種脂肪酶進(jìn)行油脂的酯交換時(shí)得到的酯交換油脂往往著色、風(fēng)味變差。因此，尋求高度除去認(rèn)為來(lái)自有機(jī)硅或脂肪酶的各種雜質(zhì)的純化脂肪酶。進(jìn)而尋求脂肪酶活性提高的酯交換用脂肪酶。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的在于提供(純化)脂肪酶的制造方法。本發(fā)明的目的還在于提供(酯交換用)脂肪酶的制造方法。本發(fā)明的目的還在于提供使用上述制造方法得到的脂肪酶的油脂組合物的制造方法。本發(fā)明的目的還在于提供含有上述制造方法得到的脂肪酶的脂肪酶組合物。本發(fā)明正是基于將脂肪酶與長(zhǎng)鏈甘油三脂肪酸酯和中鏈甘油三脂肪酸酯混合時(shí)，脂肪酶中的各種雜質(zhì)高效地轉(zhuǎn)移到甘油三酯中，可純化脂肪酶這一知識(shí)而達(dá)成的。即，本發(fā)明提供(純化)脂肪酶的制造方法(本發(fā)明的第1實(shí)施方式)，包括(a)使長(zhǎng)鏈甘油三脂肪酸酯和中鏈甘油三脂肪酸酯與脂肪酶相接觸來(lái)純化該脂肪酶的工序；以及(b)收集純化脂肪酶的工序。本發(fā)明提供(酯交換用)脂肪酶的制造方法(本發(fā)明的第2實(shí)施方式)，包括(a)使甘油的脂肪酸偏酯和/或甘油縮合物的脂肪酸偏酯與脂肪酶相接觸的工序；以及(b)接觸后，收集脂肪酶的工序。本發(fā)明還提供油脂組合物的制造方法，其特征在于，在通過(guò)上述制造方法制造的脂肪酶存在下，進(jìn)行油脂的酯交換。本發(fā)明還提供一種脂肪酶組合物，其含有由上述方法制造的脂肪酶和相當(dāng)于該脂肪酶0.5~5倍質(zhì)量的甘油三酯。具體實(shí)施例方式首先，對(duì)本發(fā)明的第1實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明。[長(zhǎng)鏈甘油三脂肪酸酯]本發(fā)明中使用的長(zhǎng)鏈甘油三脂肪酸酯優(yōu)選為構(gòu)成脂肪酸的碳數(shù)為14-24，優(yōu)選為16-18的甘油三酯。構(gòu)成的脂肪酸可以是飽和脂肪酸也可以是不飽和脂肪酸，可以是直鏈也可以是支鏈。構(gòu)成甘油三酯的3個(gè)脂肪酸可以是3個(gè)完全相同，也可以是2個(gè)構(gòu)成的脂肪酸相同而另l個(gè)不同，還可以是3個(gè)都互不相同。其中，優(yōu)選碳數(shù)16-22的不飽和脂肪酸，特別優(yōu)選碳數(shù)16-18的直鏈不飽和脂肪酸。特別優(yōu)選選自菜籽油、大豆油、葵花籽油、紅花油、玉米油中的脂肪酸。這些長(zhǎng)鏈甘油三脂肪酸酯可以單獨(dú)使用，也可以2種以上并用。本發(fā)明中可用的長(zhǎng)鏈甘油三脂肪酸酯可以用公知的方法制造，也可以使用市售品。市售品例如為曰清奧利友集團(tuán)林式會(huì)社出售的商品名為Canola油的產(chǎn)品o本發(fā)明中使用的中鏈甘油三脂肪酸酯優(yōu)選構(gòu)成脂肪酸的碳數(shù)為6~12,優(yōu)選為8-10的甘油三酯。構(gòu)成的脂肪酸可以是飽和脂肪酸也可以是不飽和脂肪酸，可以是直鏈也可以是支鏈。構(gòu)成甘油三酯的3個(gè)脂肪酸可以是3個(gè)完全相同，也可以是2個(gè)構(gòu)成的脂肪酸相同，還可以是3個(gè)都互不相同。其中，優(yōu)選碳數(shù)8-10的飽和脂肪酸。這些中鏈甘油三脂肪酸酯可以單獨(dú)使用，也可以2種以上并用。本發(fā)明中可用的中鏈甘油三脂肪酸酯可以用公知的方法制造，也可以使用市售品。市售品例如為日清奧利友集團(tuán)林式會(huì)社出售的商品名為ODO的產(chǎn)品。本發(fā)明的純化脂肪酶作為油脂的酯交換用酶使用時(shí)，優(yōu)選本發(fā)明中使用的長(zhǎng)鏈甘油三脂肪酸酯和/或中鏈甘油三脂肪酸酯與進(jìn)行酯交換的油脂相同。本發(fā)明中，長(zhǎng)鏈甘油三脂肪酸酯和中鏈甘油三脂肪酸酯優(yōu)選以質(zhì)量比為99:1-1:99的比率使用，更優(yōu)選為以95:5-50:50的比率使用。進(jìn)一步優(yōu)選為以90:10-80:20的比率使用。因?yàn)橐赃@種比率使用時(shí)操作性提高而優(yōu)選。本發(fā)明中，優(yōu)選使相當(dāng)于脂肪酶總質(zhì)量2倍~100倍，優(yōu)選5~10倍質(zhì)量的甘油三酯與脂肪酶相接觸。因?yàn)橐赃@樣的用量使用時(shí)酶的洗滌效果提高而優(yōu)選。作為本發(fā)明中可用的脂肪酶，可舉出脂蛋白脂酶、單酰甘油脂肪酶、二酰甘油脂肪酶、三酰甘油脂肪酶、半乳糖酯酶、磷脂酶等。其中，優(yōu)選三酰甘油脂肪酶。作為產(chǎn)生這些脂肪酶的微生物，并不特別限定于細(xì)菌、酵母、線狀菌、放線菌等，可舉出假單胞桿菌屬(Pseudomonassp.)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenessp.)、節(jié)桿菌屬(Arthrobactersp.)、葡萄球菌屬(Staphylococcussp.)、球擬酵母屬(Torulopsissp.)、埃希氏桿菌屬(Escherichiasp.)、芽生圓酵母屬(Mycotorulasp.)、丙酸桿菌屬(Propionibacteriumsp.)、色桿菌屬(Chromobacteriumsp.)、黃單胞菌屬(Xanthomonassp.)、乳芽孢桿菌屬(Lactobacillussp.)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridiumsp.)、假絲酵母菌屬(Candidasp.)、地霉屬(Geotrichumsp.)、莢復(fù)膜孢糖酵母屬(Saccharomycopsissp.)、諾卡氏菌屬(Nocardiasp.)、鐮孢菌屬(Fusariumsp.)、曲霉屬(Aspergillussp.)、青霉屬(Penicil1iumsp.)、根毛霉屬(Rhizomucorsp.)、毛霉菌屬(Mucorsp.)、根霉屬(Rhizopussp.)、須霉屬(Phycomycessp.)、柄銹菌屬(Pucciniasp.)、芽孢桿菌屬(Baci1lussp.)、鏈霉菌屬(Streptomycessp.)等。本發(fā)明優(yōu)選其中來(lái)自產(chǎn)堿桿菌屬、假單胞桿菌屬、根毛霉屬、毛霉菌屬、嗜熱真菌屬(Thermomycessp.)、根霉屬或青霉屬的脂肪酶，更優(yōu)選來(lái)自米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)和產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenessp.)的月旨肪酶。本發(fā)明中使用的脂肪酶，可以有位置特異性，也可以沒(méi)有。有位置特異性時(shí)，優(yōu)選為1，3-特異性。本發(fā)明中使用的脂肪酶，可以是固定于陰離子交換樹脂、苯酚吸附樹脂、疏水性載體、陽(yáng)離子交換樹脂、螯合樹脂等載體上的形態(tài)，也可以是不固定于載體上的粉末狀形態(tài)，但優(yōu)選為不固定于載體上的粉末狀形態(tài)。使用這種粉末狀的脂肪酶(以下簡(jiǎn)稱為粉末脂肪酶)時(shí)，通過(guò)本發(fā)明的制造方法得到的純化脂肪酶的酶活性更高，因此是優(yōu)選的。上述脂肪酶為粉末脂肪酶時(shí)，其粒徑可為任意大小，但優(yōu)選其90質(zhì)量％以上的粒徑為l~10(Vm，優(yōu)選為10~70一。因?yàn)樵谠摲秶鷥?nèi)操作性良好而優(yōu)選。在此，粉末脂肪酶的粒徑例如可以用HORIBA公司的粒度分布測(cè)定裝置(LA-500)進(jìn)行測(cè)定。另外，反應(yīng)前后脂肪酶的含水量?jī)?yōu)選調(diào)整為0.1~10%。因?yàn)樵谠摲秶鷥?nèi)操作性良好而優(yōu)選。本發(fā)明中使用的脂肪酶可以使用可商購(gòu)的產(chǎn)品。這些脂肪酶例如為名糖產(chǎn)業(yè)(林)銷售的商品名lipaseQLM、lipasePL，麗0ZYMES銷售的lipaseRM、lipaseTL。本發(fā)明中使用的脂肪酶為粉末狀時(shí)，例如可通過(guò)對(duì)含有脂肪酶的水溶液進(jìn)行噴霧干燥或冷凍干燥得到。在此，作為含有脂肪酶的水溶液，可舉出除去菌體的脂肪酶培養(yǎng)液、純化培養(yǎng)液、將由此制得的脂肪酶粉末再次溶解分散在水中的溶液、將市售的脂肪酶粉末再次溶解.分散在水中的溶液、市售的液狀脂肪酶等。進(jìn)而，優(yōu)選為了更提高脂肪酶活性而除去了鹽類等低分子成分的溶液，另外，更優(yōu)選為了更提高粉末性狀而除去了糖等低分子成分的溶液。作為脂肪酶培養(yǎng)液，例如可舉出含有大豆粉、蛋白胨、玉米漿、L跳、(NH4)肌、MgS047H20等的水溶液。其濃度為大豆粉O.1~20質(zhì)量％、優(yōu)選1.0~10質(zhì)量％，蛋白胨O.1~30質(zhì)量％、優(yōu)選O.5~10質(zhì)量％，玉米漿O.1~30質(zhì)量％、優(yōu)選O.5~10質(zhì)量％，K2HP040.01~20質(zhì)量%、優(yōu)選O.1~5質(zhì)量％。另夕卜，(NH4)2S040.01~20質(zhì)量%、優(yōu)選O.05~5質(zhì)量％，MgS04.7H200.01~20質(zhì)量％、優(yōu)選O.05~5質(zhì)量％。培養(yǎng)條件調(diào)控為培養(yǎng)溫度1040'C、優(yōu)選2035'C，通氣量O.1~2.OVVM、優(yōu)選O.1~1.5VVM，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)100~800rpm、優(yōu)選200~400rpm，pH3.0~10.0、優(yōu)選4.0~9.5為宜。菌體分離優(yōu)選通過(guò)離心分離、膜過(guò)濾等進(jìn)行。另外，鹽類或糖等低分子成分的去除可以通過(guò)UF(超濾)膜處理進(jìn)行。具體地，進(jìn)行UF膜處理，將含有脂肪酶的水溶液濃縮至l/2量的體積后，加入與濃縮液等量的磷酸緩沖液，重復(fù)上述操作1~5次，由此得到除去了低分子成分的含有脂肪酶的水溶液。優(yōu)選離心分離控制在200~20000xg，膜過(guò)濾釆用MF膜(微孔濾膜)，用MF膜、壓濾器等將壓力控制在3.0kg/m2以下。菌體內(nèi)的酶優(yōu)選用均質(zhì)器、韋林搗切機(jī)、超聲粉碎、弗氏壓碎機(jī)、球磨機(jī)等進(jìn)行細(xì)胞粉碎，通過(guò)離心分離、膜過(guò)濾等除去細(xì)胞殘留。均質(zhì)器的攪拌轉(zhuǎn)數(shù)為50030000rpm、優(yōu)選為1000~15000rpm,韋林搗切機(jī)的轉(zhuǎn)數(shù)為500~10000rpm、優(yōu)選為1000~5000rpm。攪拌時(shí)間為0.5~IO分鐘，優(yōu)選為15分鐘。超聲波粉碎在l50KHz、優(yōu)選在1020KHz的條件下進(jìn)行為宜。球磨機(jī)使用直徑O.1~0.5mm左右的玻璃制小球?yàn)橐?。本發(fā)明中，含有脂肪酶的水溶液優(yōu)選為含有固體成分5~30質(zhì)量％。優(yōu)選在即將進(jìn)行噴霧千燥等干燥工序前將含有脂肪酶的水溶液的pH調(diào)整至6~7.5。特別優(yōu)選調(diào)整至pH7.O以下，更優(yōu)選調(diào)整到pH6.5~7.O的范圍內(nèi)。pH調(diào)整也可以在噴霧干燥等干燥工序前的任一工序中進(jìn)行，為了使即將進(jìn)行干燥工序前的pH在上述范圍內(nèi)，也可以預(yù)先調(diào)整含有脂肪酶的水溶液的pH。pH調(diào)整可采用各種堿性物質(zhì)或酸，但優(yōu)選使用氫氧化鈉等堿金屬氫氧化物。另外，也可以在干燥工序前的中間工序中對(duì)含有脂肪酶的水溶液進(jìn)行濃縮。濃縮方法沒(méi)有特別限定，例如可舉出蒸發(fā)器、閃蒸器、UF膜濃縮、MF膜濃縮、采用無(wú)機(jī)鹽類的鹽析、溶劑沉淀法、采用離子交換纖維素等的吸附法、采用吸水性凝膠的吸水法等。優(yōu)選為UF膜濃縮、蒸發(fā)器。UF膜濃縮用膜優(yōu)選截留分子量為3000~100000、更優(yōu)選為6000~50000的平膜或中空纖維膜，材質(zhì)優(yōu)選為聚丙烯腈類、聚砜類等。噴霧干燥例如使用噴管逆流式、盤式逆流式、噴管并流式、盤式并流式等的噴霧干燥機(jī)進(jìn)行為宜。優(yōu)選為盤式并流式，優(yōu)選噴霧器轉(zhuǎn)數(shù)為4000~20000rpm，加熱控制為入口溫度IOO~200°C、出口溫度40~100'C的噴霧干燥。另外，也優(yōu)選冷凍干燥，例如優(yōu)選通過(guò)實(shí)驗(yàn)室型的少用量冷凍干燥機(jī)、層板式冷凍干燥來(lái)進(jìn)行。進(jìn)而，也可以通過(guò)減壓干燥制備。本發(fā)明的(a)工序中，通過(guò)使長(zhǎng)鏈甘油三脂肪酸酯和中鏈甘油三脂肪酸酯與脂肪酶相接觸來(lái)純化該脂肪酶。接觸例如可以通過(guò)向脂肪酶中添加長(zhǎng)鏈甘油三脂肪酸酯和中鏈甘油三脂肪酸酯的混和物，在環(huán)境溫度下攪拌O.5~IOO小時(shí)來(lái)進(jìn)行。通過(guò)攪拌可得到純度更高的純化脂肪酶。(a)工序后，通過(guò)過(guò)濾等從甘油三酯中收集脂肪酶，但優(yōu)選在(a)工序中進(jìn)一步與助濾劑接觸。因?yàn)橥ㄟ^(guò)與助濾劑接觸操作性良好而優(yōu)選。本發(fā)明中可用的助濾劑可舉出日本制紙化學(xué)林式會(huì)社銷售的商品名為KCFlock的產(chǎn)品。在(a)工序中，除了甘油三酯以外，還可以與甘油的脂肪酸偏酯和/或甘油縮合物的脂肪酸偏酯相接觸。通過(guò)與甘油的脂肪酸偏酯和/或甘油縮合物的脂肪酸偏酯相接觸，所得油脂組合物的色澤和氣味均良好，因此是優(yōu)選的。甘油的脂肪酸偏酯可舉出甘油單酯和甘油二酯等。在此，可用的甘油單酯可舉出碳數(shù)8~22的脂肪酸和甘油的酯。具體可舉出甘油單油酸酯、甘油單亞油酸酯、甘油單硬脂酸酯、甘油單棕櫚酸酯等。其中，優(yōu)選甘油單油酸酯。也可以并用2種以上的甘油單酯。甘油二酯可舉出碳數(shù)8~18的脂肪酸和甘油的酯。具體可舉出甘油二油酸酯、甘油二亞油酸酯、甘油二硬脂酸酯、甘油二棕櫚酸酯等。其中優(yōu)選甘油二油酸酯。也可以并用2種以上的甘油二酯。優(yōu)選甘油的脂肪酸偏酯和/或甘油縮合物的脂肪酸偏酯(gl)與甘油三酯(g2)以質(zhì)量比(gl)/(g2)為l:99~99:l的比率使用，更優(yōu)選以l:99~60:40的比率使用。優(yōu)選甘油單酯和/或甘油二酯(gl)與甘油三酯(g2)以質(zhì)量比(gl)/(g2)為0.1:99.9~99:l的比率使用，更優(yōu)選以O(shè).1:99,1~90:IO的比率使用。以這樣的比率混合使用時(shí)可以得到色澤良好的酯交換油，因而優(yōu)選。并用甘油的脂肪酸偏酯與甘油縮合物的脂肪酸偏酯時(shí)，優(yōu)選甘油的脂肪酸偏酯與甘油縮合物的脂肪酸偏酯以質(zhì)量比為99:1~1:99的比率使用，更優(yōu)選以99:1~50:50的比率使用。并用甘油單酯與甘油二酯時(shí)，更優(yōu)選以l:99~90:IO的比率使用。以這樣的比率使用時(shí)操作性提高，因而優(yōu)選。甘油縮合物的脂肪酸偏酯可舉出與碳數(shù)8~18的脂肪酸形成的酯。具體可舉出多甘油油酸酯等。其中，優(yōu)選十甘油油酸酯。也可以并用2種以上的甘油縮合物的脂肪酸偏酯。甘油的脂肪酸偏酯和/或甘油縮合物的脂肪酸偏酯，可以通過(guò)對(duì)菜籽油等液狀油脂進(jìn)行水解、分子蒸餾等本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制得，也可以使用市售品，例如甘油單酯可用太陽(yáng)化學(xué)(抹)銷售的商品名為Sunsoft8090的產(chǎn)品。(a)工序中，并用助濾劑與甘油的脂肪酸偏酯和/或甘油縮合物的脂肪酸偏酯，從反復(fù)反應(yīng)方面出發(fā)是優(yōu)選的。這樣制得的純化脂肪酶可以直接使用，但是從操作性的觀點(diǎn)來(lái)看優(yōu)選使其浸漬或潤(rùn)濕在甘油三酯中而作為脂肪酶組合物使用。在此，脂肪酶組合物中甘油三酯的質(zhì)量?jī)?yōu)選為相當(dāng)于該脂肪酶的O.5~5倍，更優(yōu)選為1~3倍。接下來(lái)，對(duì)本發(fā)明的第2實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明。在此，甘油的脂肪酸偏酯是碳數(shù)8~22、優(yōu)選14~18的脂肪酸與甘油形成的甘油單酯，或碳數(shù)8~18、優(yōu)選14~18的脂肪酸與甘油形成的甘油二酯。在(a)工序中，也可以加入甘油三酯。甘油的脂肪酸偏酯可舉出甘油單酯和甘油二酯等。這里，可使用的甘油單酯或甘油二酯可以采用本發(fā)明的第l實(shí)施方式中所述的物質(zhì)?？梢允褂酶视偷闹舅崞ズ?或甘油縮合物的脂肪酸偏酯(gl)和甘油三酯(g2)，它們可以采用本發(fā)明的第l實(shí)施方式中所述的物質(zhì)。另外，甘油縮合物的脂肪酸偏酯和脂肪酶也可以使用本發(fā)明的第l實(shí)施方式中所述的物質(zhì)。即，本發(fā)明的第l實(shí)施方式中的[甘油的脂肪酸偏酯和甘油縮合物的脂肪酸偏酯]中所述的內(nèi)容和[脂肪酶]中所述的內(nèi)容也適用于本發(fā)明的第2實(shí)施方式。本發(fā)明的第2實(shí)施方式的(a)工序中，通過(guò)使甘油的脂肪酸偏酯和/或甘油縮合物的脂肪酸偏酯與脂肪酶相接觸，可得到脂肪酶活性高的酯交換用脂肪酶。接觸例如可以通過(guò)向脂肪酶中添加甘油的脂肪酸偏酯和/或甘油縮合物的脂肪酸偏酯，在環(huán)境溫度下攪拌O.5~IOO小時(shí)來(lái)進(jìn)行。通過(guò)攪拌可得到脂肪酶活性更高的酯交換用脂肪酶。(a)工序后，通過(guò)過(guò)濾等從甘油的脂肪酸偏酯和/或甘油縮合物的脂肪酸偏酯中收集脂肪酶，但優(yōu)選在(a)工序中進(jìn)一步與助濾劑接觸。助濾劑可使用本發(fā)明的第l實(shí)施方式中所述的物質(zhì)。優(yōu)選在(a)工序中進(jìn)一步與甘油三酯接觸。此處使用的甘油三酯優(yōu)選為長(zhǎng)鏈甘油三脂肪酸酯和/或中鏈甘油三脂肪酸酯。本發(fā)明中可用的長(zhǎng)鏈甘油三脂肪酸酯和中鏈甘油三脂肪酸酯可以采用本發(fā)明的第l實(shí)施方式中所述的物質(zhì)。即，本發(fā)明的第l實(shí)施方式中的[長(zhǎng)鏈甘油三脂肪酸酯]和[中鏈甘油三脂肪酸酯]中所述的內(nèi)容也適用于本發(fā)明的第2實(shí)施方式。根據(jù)本發(fā)明的第2實(shí)施方式，可以制造與原料脂肪酶相比其酯交換活性至少提高2~10倍，期望提高2~5倍以上的酯交換用脂肪酶。在此，酉旨交換酶活性可根據(jù)S.Negishi，S.Shirasawa，Y.Arai，J.Suzuki，S.Mukataka，EnzymeMicrob.Technol，32，66-70(2003)公開的內(nèi)容進(jìn)行測(cè)定。即，用甘油三油酸酯和甘油三辛酸酯各5g進(jìn)行酯交換，用氣相色譜法測(cè)定酯交換的程度，算出酯交換活性。這樣制得的酯交換用脂肪酶可以直接使用，但是從操作性的觀點(diǎn)來(lái)看優(yōu)選使其在甘油的脂肪酸偏酯和/或甘油縮合物的脂肪酸偏酯中浸漬或潤(rùn)濕而作為脂肪酶組合物使用。在此，脂肪酶組合物中的甘油的脂肪酸偏酯和/或甘油縮合物的脂肪酸偏酯的質(zhì)量?jī)?yōu)選為相當(dāng)于該脂肪酶的0.5~5倍，更優(yōu)選為1~3倍。根據(jù)本發(fā)明的第1和第2實(shí)施方式得到的脂肪酶，可適用作酯交換用脂肪酶。使用這種脂肪酶可以有效地通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行甘油三酯等的酯交換反應(yīng)。詳細(xì)而言除了可用于酯和酯的反應(yīng)還可用于酯和醇或羧酸的反應(yīng)。進(jìn)而，本發(fā)明的脂肪酶還可用于由醇和羧酸合成酯的反應(yīng)。更具體地，酯交換是通過(guò)使酯與分子內(nèi)至少具有1個(gè)醇性羥基的化合物、羧酸或酯作用而進(jìn)行的，作為酯交換對(duì)象的酯，可舉出碳數(shù)4~22的甘油三酯。具體可舉出菜籽油、大豆油、葵花籽油、玉米油、米油、紅花油、芝麻油、亞麻籽油、棕櫚油及其分選不飽和油、椰子油、橄欖油、低芥酸菜籽油、山茶油、可可脂、牛油樹脂、婆羅雙樹籽油脂、東印度山欖科植物油等植物油，魚油、牛油、豬油等動(dòng)物油脂等。其中優(yōu)選菜籽油、中鏈甘油三酯。分子內(nèi)至少含有l(wèi)個(gè)醇性羥基的化合物，可舉出各種一元醇、植物甾醇、多元醇、氨基醇等各種化合物。具體可舉出短鏈、中鏈、長(zhǎng)鏈的飽和、不飽和、直鏈、支鏈醇、二醇類、甘油、赤蘚醇類等多元醇。其中優(yōu)選甘油。羧酸可舉出短鏈、中鏈、長(zhǎng)鏈的飽和、不飽和、直鏈、支鏈羧酸。其中，碳數(shù)630的脂肪酸例如可舉出辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸等。可以使用他們中的l種或并用2種以上。其中，優(yōu)選使用不飽和脂肪酸，更優(yōu)選使用共軛亞油酸。酯交換條件，例如可以按照特開平13-169795號(hào)公報(bào)等所述的條件進(jìn)行?，F(xiàn)舉一例，用本發(fā)明的酯交換用脂肪酶對(duì)中鏈甘油三酯ODO(日清奧利友集團(tuán)林式會(huì)社)和菜籽油進(jìn)行酯交換，可以得到中鏈甘油三脂肪酸酯。應(yīng)予說(shuō)明，使用(a)的來(lái)自青霉屬(Penicilliumsp.)的粉末狀脂肪酶時(shí)，最好預(yù)先添加相對(duì)于基質(zhì)總質(zhì)量為O.1~5質(zhì)量％的水使反應(yīng)開始來(lái)進(jìn)行反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的制造方法得到的脂肪酶，經(jīng)過(guò)濾、再生可重復(fù)使用。使用再生的脂肪酶時(shí)，可以單獨(dú)使用再生的脂肪酶，也可以與本發(fā)明所得的未使用的脂肪酶并用。根據(jù)本發(fā)明的第l實(shí)施方式，可以得到降低了有機(jī)硅等雜質(zhì)含量的純化脂肪酶。特別是可以得到有機(jī)硅的含量降至100ppm以下的脂肪酶。另外，可以得到風(fēng)味、色澤良好的油脂組合物。另外，可以得到抑制油炸食品時(shí)的起泡而烹飪操作性良好的油脂組合物。根據(jù)本發(fā)明的第2實(shí)施方式，可以得到酯交換活性提高的脂肪酶。另外，可以得到色香味俱佳的油脂組合物。實(shí)施例實(shí)施例l向名糖產(chǎn)業(yè)社制的脂肪酶QLM20g中添加菜籽油90g、ODO(日清奧利友集團(tuán)林式會(huì)社)10g、助濾劑KCflock(日本制紙化學(xué)林式會(huì)社)20g，在25。C下攪拌5小時(shí)后過(guò)濾。將菜籽油90g、ODO(日清奧利友集團(tuán)林式會(huì)社)10g換成其他的油、溶劑進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，用HPLC(島津制作所)測(cè)定處理后的脂肪酶的有機(jī)硅含量。然后，向ODO(日清奧利友集團(tuán)林式會(huì)社)150g、菜籽油(日清奧利友集團(tuán)抹式會(huì)社)850g中添加制得的脂肪酶0.5%，攪拌15小時(shí)，進(jìn)行酯交換反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾脂肪酶。之后，按常規(guī)方法對(duì)所得的油進(jìn)行脫酸、脫色及除臭，制備酯交換油。用Lobbybond測(cè)定所得酯交換油的色澤，由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的研究小組成員來(lái)比較油的風(fēng)p未。結(jié)果如下表所示，通過(guò)混合長(zhǎng)鏈甘油三脂肪酸酯和中鏈甘油三脂肪酸酯進(jìn)行預(yù)處理，可以減少有機(jī)硅。另外可知，使用通過(guò)本發(fā)明的制造方法所得的純化脂肪酶進(jìn)行酯交換反應(yīng)，可以獲得色澤風(fēng)味俱佳的油脂。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)施例3向脂肪酶QLM20g中添加菜籽油和ODO(日清奧利友集團(tuán)林式會(huì)社)以9/l混合的甘油三酯、甘油單酯(Sunsoft8090，太陽(yáng)化學(xué))共100g、助濾劑KCflock(日本制紙化學(xué)抹式會(huì)社)20g，在60。C下攪拌3小時(shí)后過(guò)濾。改變此時(shí)甘油三酯與甘油單酯的比率。所得脂肪酶與實(shí)施例l同樣地，制造酯交換油，測(cè)定其色澤，評(píng)價(jià)油的風(fēng)味。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)施例4向名糖產(chǎn)業(yè)社制的脂肪酶PL20g中添加菜籽油90g、ODO(日清奧利友集團(tuán)抹式會(huì)社)10g、助濾劑KCflock(日本制紙化學(xué)林式會(huì)社)20g,在25。C下攪拌5小時(shí)后過(guò)濾。所得脂肪酶與實(shí)施例l同樣地，制造酯交換油，測(cè)定其色澤，評(píng)價(jià)油的風(fēng)味。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實(shí)施例5向脂肪酶QLM20g中添加菜籽油90g、ODO(日清奧利友集團(tuán)林式會(huì)社)10g、菜籽油水解后經(jīng)分子蒸餾得到的甘油二酯200g、助濾劑KCflock(日本制紙化學(xué)林式會(huì)社)20g，在25。C下攪拌5小時(shí)后過(guò)濾。得到的脂肪酶和實(shí)施例l同樣地，制造酯交換油，測(cè)定其色澤，評(píng)價(jià)油的風(fēng)味。脂肪酶處理前活性處理后活性脂肪酶QLM(名糖產(chǎn)業(yè))13.1脂肪酶PL(名糖產(chǎn)業(yè))12.8脂肪酶RM(N0V0ZYMES公司)14.1脂肪酶TL(N0V0ZYMES公司)12.6實(shí)施例7向脂肪酶QLM20g中添加菜籽油和ODO(日清奧利友集團(tuán)林式會(huì)社)以9/l混合的甘油三酯、甘油單酯(Sunsoft8090，太陽(yáng)化學(xué))共100g、助濾劑KCflock(日本制紙化學(xué)抹式會(huì)社)20g，在60。C下攪拌3小時(shí)后過(guò)濾，改變此時(shí)甘油三酯與甘油單酯的比率。得到的脂肪酶和實(shí)施例6同樣地，制造酯交換油，測(cè)定其酯交換活性。甘油三酯/甘油單酯的比率處理前活性處理后活性1/0*11.82/112.11/112.51/213.71/514.01/1013.6*比較例實(shí)施例8向脂肪酶QLM20g中添加菜籽油90g、ODO(日清奧利友集團(tuán)林式會(huì)社)10g、菜籽油水解后經(jīng)分子蒸餾得到的甘油二酯200g、助濾劑KCflock(日本制紙化學(xué)林式會(huì)社)20g，在25。C下攪拌5小時(shí)后過(guò)濾。所得脂肪酶與實(shí)施例6同樣地，制造酯交換油，測(cè)定其酯交換油的活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>權(quán)利要求1.純化脂肪酶的制造方法，包括(a)使長(zhǎng)鏈甘油三脂肪酸酯和中鏈甘油三脂肪酸酯與脂肪酶相接觸來(lái)純化該脂肪酶的工序；以及(b)收集純化脂肪酶的工序。2.權(quán)利要求1所述的脂肪酶的制造方法，其中，長(zhǎng)鏈甘油三脂肪酸酯為構(gòu)成脂肪酸的碳數(shù)為14~24的甘油三酯，中鏈甘油三脂肪酸酯為構(gòu)成脂肪酸的碳數(shù)為6~12的甘油三酯。3.權(quán)利要求2所述的脂肪酶的制造方法，其中，長(zhǎng)鏈甘油三脂肪酸酯選自菜籽油、大豆油、葵花籽油、紅花油、玉米油。4.權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的脂肪酶的制造方法，其中，長(zhǎng)鏈甘油三脂肪酸酯與中鏈甘油三脂肪酸酯以質(zhì)量比為95:5~50:50的比率使用。5.權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的脂肪酶的制造方法，其中，相當(dāng)于脂肪酶總質(zhì)量的2倍~100倍質(zhì)量的甘油三酯與脂肪酶相接觸。6.酯交換用脂肪酶的制造方法，包括(a)使甘油的脂肪酸偏酯和/或甘油縮合物的脂肪酸偏酯與脂肪酶相接觸的工序；以及(b)接觸后收集脂肪酶的工序。7.權(quán)利要求6所述的脂肪酶的制造方法，其中，甘油的脂肪酸偏酯是碳數(shù)8~22的脂肪酸與甘油的甘油單酯，或碳數(shù)8~18的脂肪酸與甘油的甘油二酯。8.權(quán)利要求7所述的脂肪酶的制造方法，其中，甘油單酯選自甘油單油酸酯、甘油單亞油酸酯、甘油單硬脂酸酯、甘油單棕櫚酸酯，甘油二酯選自甘油二油酸酯、甘油二亞油酸酯、甘油二硬脂酸酯、甘油二棕櫚酸酯。9.權(quán)利要求6~8中任一項(xiàng)所述的脂肪酶的制造方法，其中，甘油單酯和甘油二酯以質(zhì)量比為1:99~90:10的比率使用。10.權(quán)利要求6~9中任一項(xiàng)所述的脂肪酶的制造方法，其中，在(a)工序中進(jìn)一步與甘油三酯接觸。11.權(quán)利要求IO所述的脂肪酶的制造方法，其中，(gl)甘油單酯和/或甘油二酯與(g2)甘油三酯以質(zhì)量比(gl)/(g2)為0.1:99.1~90:10的比率使用。12.權(quán)利要求10或11所述的脂肪酶的制造方法，其中，甘油三酯為長(zhǎng)鏈甘油三脂肪酸酯和/或中鏈甘油三脂肪酸酯。13.權(quán)利要求1~12中任一項(xiàng)所述的脂肪酶的制造方法，其中，在(a)工序中進(jìn)一步與助濾劑接觸。14.權(quán)利要求1~13中任一項(xiàng)所述的脂肪酶的制造方法，其中，上述脂肪酶是來(lái)自產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenessp.)、假單胞桿菌屬(Pseudomonassp.)、根毛霉屬(Rhizomucorsp.)、毛霉菌屬(Mucorsp.)、嗜熱真菌屬(The訓(xùn)mycessp.)、根霉屬(Rhizopussp.)或青霉屬(Penicilliumsp.)的脂肪酶。15.權(quán)利要求1~14中任一項(xiàng)所述的脂肪酶的制造方法，其中，上述脂肪酶為粉末脂肪酶，其90質(zhì)量％以上的粒徑為l~10(Vm。16.權(quán)利要求1~15中任一項(xiàng)所述的脂肪酶的制造方法，其中，反應(yīng)前后脂肪酶的含水量調(diào)整為0.1~10%。17.油脂組合物的制造方法，其特征在于，在通過(guò)權(quán)利要求1~16中任一項(xiàng)所述制造方法制造的脂肪酶的存在下，進(jìn)行油脂的酯交換。18.脂肪酶組合物，含有通過(guò)權(quán)利要求1~16中任一項(xiàng)所述方法制造的脂肪酶和相當(dāng)于該脂肪酶0.5~5倍質(zhì)量的甘油三酯。19.脂肪酶組合物，含有通過(guò)權(quán)利要求1~16中任一項(xiàng)所述方法制造的脂肪酶和相當(dāng)于該脂肪酶0.5~5倍質(zhì)量的甘油的脂肪酸偏酯和/或甘油縮合物的脂肪酸偏酯。全文摘要本發(fā)明提供一種純化脂肪酶的制造方法，包括(a)使長(zhǎng)鏈甘油三脂肪酸酯和中鏈甘油三脂肪酸酯與脂肪酶相接觸來(lái)純化該脂肪酶的工序；以及(b)收集純化脂肪酶的工序。通過(guò)該制造方法，可以得到降低了有機(jī)硅等雜質(zhì)含量的純化脂肪酶。文檔編號(hào)C12P7/64GK101115831SQ20068000445公開日2008年1月30日申請(qǐng)日期2006年1月18日優(yōu)先權(quán)日2005年1月19日發(fā)明者上原秀隆,山內(nèi)良枝,廣瀬忠城,新井有里,有本真,根岸聰,櫻井智香,菅沼智巳,鈴木順子申請(qǐng)人:日清奧利友集團(tuán)株式會(huì)社