脂肪酶calb突變體、其制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程領(lǐng)域，具體地說，設(shè)及一種脂肪酶CALB突變體、其制備方法 及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪酶化ipase，甘油醋水解酶）是分解脂肪的酶。在動植物體和微生物中普遍存 在，它是一類特殊的醋鍵水解酶，催化如下反應(yīng)：甘油=醋+水一甘油+游離脂肪酸。脂肪 酶的另一重要特征是，它只作用于異相系統(tǒng)，即在油（或脂）一水界面上作用，對均勻分散 的或水溶性底物無作用，即使作用也極緩慢，因此也可說脂肪酶是?？谠诋愊嘞到y(tǒng)或水不 溶性系統(tǒng)的油（脂）一水界面上水解醋的酶。脂肪酶是最早研究的酶類之一，從1834年兔 膜脂肪酶活性的報道至今，微生物脂肪酶研究已有上百年的歷史。
[0003] 脂肪酶的微生物發(fā)酵法的應(yīng)用前景優(yōu)于提取法及化學(xué)合成法。目前，黑曲霉、白地 霉、毛霉等微生物來源的脂肪酶已制成結(jié)晶。來源于根霉、圓柱假絲酵母、德氏根霉、多球 菌、粘質(zhì)色桿菌等的脂肪酶也得到高度提純，并對它們的理化性質(zhì)展開進(jìn)一步研究。早在上 世紀(jì)60年代，由假絲酵母、曲霉、根霉等微生物產(chǎn)生的脂肪酶相繼在日本進(jìn)入商品化生產(chǎn)。 與此同時，我國也已開展脂肪酶的研究開發(fā)。1967年，中國科學(xué)院微生物所篩選到解脂假絲 酵母（Candidalipolytica)AS2. 1203,并于1969年制成酶制劑供應(yīng)市場。近年來，隨著非 水酶學(xué)的不斷深入，脂肪酶的應(yīng)用已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了油一水界面上進(jìn)行水解反應(yīng)的范疇，被廣 泛應(yīng)用于醋合成、手性化合物的拆分、化工合成中間體的選擇性基因保護(hù)、高聚物的合成、 膚合成等方面，應(yīng)用前景十分廣闊。盡管在產(chǎn)脂肪酶菌株選育、培養(yǎng)條件、酶的性質(zhì)及工業(yè) 應(yīng)用上已研究了幾十年，但由于脂肪酶的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的多樣性、酶的不穩(wěn)定性、底物的水不 溶性、酶的來源不足、提純困難W及應(yīng)用范圍不廣泛等問題，脂肪酶的研究進(jìn)展及工業(yè)應(yīng)用 與蛋白酶、淀粉酶相比遜色許多。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種脂肪酶CALB突變體、其制備方法及應(yīng)用。
[0005] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明利用基因體外定向進(jìn)化策略中易錯PCR技術(shù)構(gòu)建基 因工程菌株獲得高效生產(chǎn)脂肪酶的方法，其是通過在畢赤酵母中表達(dá)突變的脂肪酶基因， 然后對表達(dá)的脂肪酶進(jìn)行分離純化，獲得高純度高活力的脂肪酶。
[0006] 易錯PCR技術(shù)具體如下： 陽007] (1)由產(chǎn)脂肪酶的克雷伯氏菌化lebsiellaSP.)擴(kuò)增CALB的編碼基因ca化； 陽00引似將ca化基因連接在表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA上，酶切位點為EcoRI和甜al，獲得重 組質(zhì)粒pPICZaA-ca化；
[0009] 做采用易錯PCR技術(shù)，W重組質(zhì)粒pPICZaA-ca化為模板，設(shè)計引物，擴(kuò)增獲得 ca化突變基因；
[0010] (4)將步驟做所得易錯PCR產(chǎn)物及表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA用EcoRI和甜al雙酶切 后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入畢赤酵母X33感受態(tài)細(xì)胞，涂布于博來霉素抗性狂ecOYTO平板上， 即得構(gòu)建好的重組ca化基因突變庫；
[0011] (5)將YTO平板上長出的菌落逐一對應(yīng)轉(zhuǎn)接至含甲醇的S下酸甘油醋狂ecO平板 上，轉(zhuǎn)板后將平板置于3(TC恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2地，然后采用剛果紅染色法觀察水解圈的大 小，同時每個平板分別W原始菌和不含有脂肪酶的空載體作為陽性對照和陰性對照。
[0012] 本發(fā)明提供的脂肪酶CALB突變體，其為：1)由SEQIDNo. 1所示的氨基酸序列構(gòu) 成的蛋白；或2)SEQIDNo. 1所示氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且 同等功能的由1)衍生的蛋白。
[0013] 本發(fā)明還提供編碼所述CALB突變體的基因，其核巧酸序列如SEQIDNo.2所示。
[0014] 本發(fā)明還提供含有編碼所述CALB突變體的基因的載體、宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因工程 -tt： 園〇
[0015] 本發(fā)明還提供含有編碼所述CALB突變體的基因的畢赤酵母工程菌。
[0016] 本發(fā)明還提供含有編碼所述CALB突變體的基因的畢赤酵母X33。
[0017] 本發(fā)明進(jìn)一步提供所述CALB突變體的制備方法，將含有編碼所述CALB突變體的 基因的畢赤酵母X33接種于含博來霉素的BMGY培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)至ODe。。為8-10時， 離屯、后收集菌體，將菌體轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY中，3(TC誘導(dǎo)表達(dá)20h，離屯、后收集上清；將 上清加入到M2+-NTA樹脂柱中，反復(fù)加入2~3次后，用5倍柱體積的NTA-1緩沖液洗涂介 質(zhì)W去除雜蛋白，最后用NTA-2緩沖液洗脫帶有6個組氨酸標(biāo)簽的脂肪酶突變體。
[0018] 其中，所述NTA-1緩沖液為含有80mmol/L咪挫的NTA-0緩沖液，NTA-2緩沖液為 含有 300mmol/L咪挫的NTA-0 緩沖液。NTA-0 緩沖液：20mMTris-肥 1 抑7. 9,0. 5MNaCl。
[0019] 本發(fā)明還提供所述脂肪酶CALB突變體在洗涂劑加工領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明進(jìn)一步提供含有所述脂肪酶CALB突變體的洗涂劑制品。
[0021] 本發(fā)明利用基因體外定向進(jìn)化策略中易錯PCR技術(shù)，對來源于克雷伯氏菌屬 (KlebsiellaSP.)的野生型脂肪酶基因進(jìn)行體外誘變，通過鑒別培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，獲得高 效生產(chǎn)脂肪酶的菌株。獲得的脂肪酶CALB突變體表達(dá)活性高，是野生型脂肪酶催化活性的 8. 7倍，可用于脂類水解相關(guān)行業(yè)中。通過對含有編碼所述CALB突變體的基因的工程菌進(jìn) 行大規(guī)模發(fā)酵，可實現(xiàn)脂肪酶CALB突變體的批量生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0022] 圖1為本發(fā)明實施例2中PCR擴(kuò)增脂肪酶CALB突變體基因的電泳檢測結(jié)果；其 中，M為DNAMarker, 1為目的基因。 陽02引 圖2為本發(fā)明實施例3中質(zhì)粒pPICZaA-ca化的酶切電泳圖。
[0024] 圖3為本發(fā)明實施例4中CALB突變體的SDS-PAGE電泳檢測圖；其中，M為蛋白Marker, 1為上清濃縮沉淀蛋白。
【具體實施方式】
[00巧]W下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:a1油oratorymanual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。 陽0%] 實施例1構(gòu)建脂肪酶CALB突變體文庫
[0027] 1、由產(chǎn)脂肪酶的克雷伯氏菌aUebsiellaSP.)擴(kuò)增CALB的編碼基因ca化； 陽02引 2、將ca化基因連接在表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA上，酶切位點為EcoRI和甜al，獲得重組 質(zhì)粒pPICZaA-ca化；
[0029]