專利名稱：融合蛋白、其制備方法及其在重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用的制作方法
融合蛋白、其制備方法及其在重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及融合蛋白、其制備方法和它們在重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用。背景技術(shù)：
富含特異性蛋白的提取物的制備容易從產(chǎn)生它們的生物罕有發(fā)生。由此，產(chǎn)生重組蛋白常是以需要的量產(chǎn)生及產(chǎn)生有必需的活性水平的那些蛋白的僅有可能的方式。重組蛋白的表達(dá)是在研究和開發(fā)水平以及工業(yè)水平最相關(guān)和最可應(yīng)用的方法之一。在良好限定的模型中使用細(xì)菌、真菌或真核細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的可能性、構(gòu)成在生物技術(shù)加工領(lǐng)域有巨大潛力和關(guān)聯(lián)性的工具，使得產(chǎn)生大量目的蛋白。大腸埃希氏菌(E. coli)已經(jīng)是世界上最廣泛使用的用于不要求翻譯后修飾(例如糖基化)而呈現(xiàn)活性的蛋白的系統(tǒng)。由于細(xì)菌的簡單、快速和成本有效生長的能力、既有的生理知識和遺傳表征、以及先進的遺傳工具(其中有大量種有適當(dāng)?shù)耐蛔兊馁|(zhì)粒、融合重組偶體和株)的可利用性，在大腸埃希氏菌(E. coli)中表達(dá)重組蛋白是異源生產(chǎn)的最有吸引力的方法之一。基于此模型提供的優(yōu)勢，在大腸埃希氏菌(E. coli)中重組蛋白的表達(dá)成為最廣泛使用的在實驗室和工業(yè)水平產(chǎn)生蛋白的方法之一。已描述并商業(yè)上使用幾種表達(dá)具有為了分離和生產(chǎn)穩(wěn)定目的添加的序列的融合蛋白的載體。最廣泛報道的包括用所謂的"組氨酸_標(biāo)簽"生產(chǎn)蛋白，其特征在于添加具有多個組氨酸的序列，與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、RNA結(jié)合蛋白的融合蛋白(文獻(xiàn)US2004033564)，或與泛素的融合蛋白(文獻(xiàn)W09701627)的產(chǎn)生。使用這些表達(dá)系統(tǒng)的主要困難之一是蛋白以包含體形式產(chǎn)生，常見的導(dǎo)致非常低產(chǎn)率的條件，和難以操作的沉淀的形成。當(dāng)使用不穩(wěn)定片段時，此發(fā)生尤其常見。本發(fā)明的目標(biāo)基于允許顯著增加重組蛋白的產(chǎn)生和使得它們的分離更容易的方法的開發(fā)、基于蛋白序列或鈣結(jié)合蛋白的融合。本發(fā)明是重組抗原產(chǎn)生領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)系統(tǒng)的替代方案，描述為可在研究水平和商業(yè)應(yīng)用中具有顯著的影響的簡單、高產(chǎn)率和通用的方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及融合蛋白，其在它們的結(jié)構(gòu)中包括⑴肝片形吸蟲(Fasciola hepatica)成蟲排泄的/分泌的鈣結(jié)合蛋白的部分或全氨基酸序列；及目的不相關(guān)的蛋白或蛋白片段。本發(fā)明也旨在提供制備這些融合蛋白的方法，其允許非常顯著的表達(dá)增加和融合蛋白及結(jié)果添加的片段或蛋白的增溶。將蠕蟲肝片形吸蟲(Fasciolahepatica)鈣結(jié)合蛋白(SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4)或成蟲排泄的/分泌的相同的蛋白(SEQ ID NO=U SEQ ID NO 3)的小片段(以下被稱為H(蠕蟲)片段)或優(yōu)選有90 95%的同源性的類似序列添加到不相關(guān)的蛋白片段或蛋白允許這些多肽的產(chǎn)生水平和它們的增溶顯著增加。由此，本發(fā)明第一方面是融合蛋白，其包括具有肝片形吸蟲(Fasciola hepatica)成蟲排泄的-分泌的H片段或鈣結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)的氨基酸序列，其后是結(jié)構(gòu)上類似于不相關(guān)的蛋白片段或蛋白的氨基酸序列?？稍贜或C-端位置將融合標(biāo)簽(H片段或鈣結(jié)合蛋白) 添加到不相關(guān)的蛋白。本發(fā)明另一方面是表達(dá)載體，其特征在于包括編碼所述融合蛋白的多核苷酸序列。本發(fā)明再一方面是宿主細(xì)胞，其包括提及的表達(dá)載體。

本發(fā)明也是制備融合蛋白的方法，其特征在于，將之前提及的宿主細(xì)胞在適于所述融合蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)，及分離所述融合蛋白。本發(fā)明還是所述用于產(chǎn)生添加的蛋白或蛋白片段的融合蛋白在重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)中應(yīng)用。本發(fā)明另一方面是肝片形吸蟲(Fasciola hepatica)成蟲排泄的-分泌的H片段或鈣結(jié)合蛋白用于生產(chǎn)重組蛋白的用途。這些融合蛋白的產(chǎn)生允許添加的片段或蛋白非常顯著的表達(dá)增加和增溶，由此增強它們用于研究和開發(fā)、以及工業(yè)目的。

圖1被稱為鈣結(jié)合蛋白FhS和Fh22的H片段的重組蛋白和蛋白片段的表征。 A-多肽FhS的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO 1)；稱為FhS的H片段的多肽的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO 2) ；B-多肽Fh22的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO 3)；稱為多肽Fh22 的H片段的多肽的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO :4)。圖2用于評估H片段或FhS對蛋白產(chǎn)生的效應(yīng)的亞克隆過程的示意圖。圖3含CP12片段的構(gòu)建體的產(chǎn)生結(jié)果。A-蛋白產(chǎn)生的圖形化表示；B-考馬斯藍(lán)-染色的SDS-PAGE Tris-Tricine凝膠。M-預(yù)染的SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)記物(Biorad)。 (a) =F1, F2和F3-收集自Ni-NTA柱的CP12的級分1、2和3。(b) =F1, F2, F3和F4-收集自 Ni-NTA 柱的 HCP12 的級分 1、2、3 和 4。(c) =F1, F2, F3> F4, F5, F6 和 F7-收集自 Ni-NTA 柱的 Fh8CP12的級分1、2、3、4、5、6和7。箭標(biāo)表示相應(yīng)蛋白的條帶。圖4含IL5片段的構(gòu)建體的產(chǎn)生結(jié)果。A-蛋白產(chǎn)生的圖形化表示；B-考馬斯藍(lán)_染色的SDS-PAGE Tris-Tricine凝膠。M-預(yù)染的SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)記物(Biorad)。 (a) =F1, F2和F3-收集自Ni-NTA柱的IL5的級分1、2和3。(b) =F1, F2, F3和F4-收集自 Ni-NTA柱的HIL5的級分1、2、3和4。箭標(biāo)表示相應(yīng)蛋白的條帶。圖5含TgOffP片段的構(gòu)建體的產(chǎn)生結(jié)果。A-蛋白產(chǎn)生的圖形化表示；B-考馬斯藍(lán)-染色的SDS-PAGE Tris-Tricine凝膠。M-預(yù)染的SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)記物(Biorad)。 (a) =F1J^F3 和 F4-收集自 Ni-NTA 柱的 TgOWP 的級分 1、2、3 和 4。(b) =FpF2^F4 和 F5-收集自Ni-NTA柱的HTgOWP的級分1、2、3、4和5。箭標(biāo)表示相應(yīng)蛋白的條帶。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及重組蛋白融合到肝片形吸蟲(Fasciola hepatica)成蟲排泄的-分泌的鈣結(jié)合蛋白、即以Fh8或fasciolin表示的蛋白(Genbank數(shù)AF213970)，及通常被知為 Fh22的鈣結(jié)合蛋白家族之內(nèi)的片段(被稱為H片段(來自蠕蟲的)-SEQ ID NO :2和/或 SEQ IDNO 4)或全氨基酸序列，其包括EMBL號AJ003822 ；AJ003821描述的抗原。此策略允許增加融合到H片段或含H片段的蛋白的抗原的產(chǎn)生水平，而且也增加它們的增溶，由此增加既有的重組蛋白產(chǎn)生系統(tǒng)的效率。此系統(tǒng)允許防止包含體內(nèi)的目的抗原的產(chǎn)生，由此使得它們?nèi)菀追蛛x。由于鈣結(jié)合能力，鈣結(jié)合抗原的生物化學(xué)特征允許通過堿性的層析技術(shù) (即離子交換柱)的融合蛋白的分離，由此產(chǎn)生傾向于作為回收融合抗原的基礎(chǔ)的帶電的元素。提供的實施例涉及使用Fh8的H片段(SEQ ID NO 2)或蛋白Fh8 (SEQ ID NO 1) 的應(yīng)用。實驗結(jié)果顯示，蛋白Fh22的H片段(SEQ ID NO 4)或蛋白Fh22 (SEQ ID NO 3)具有類似作用。同樣，本發(fā)明背景下開發(fā)的方法不限于實施例中顯示的融合蛋白的產(chǎn)生，在不扭曲本發(fā)明的精神的情況下可延伸至任何多肽。
在大腸埃希氏菌(Escherichia coli)中將幾種構(gòu)建體亞克隆進表達(dá)載體 pQE (Qiagen)、導(dǎo)致N-端序列表現(xiàn)為6組氨酸序列的重組蛋白的產(chǎn)生，所述產(chǎn)生在大腸埃希氏菌(E. coli)M15(pREP4) (Qiagen)中進行，由此允許它們通過用NiNTA瓊脂糖柱(Qiagen) 的親和層析，基于生產(chǎn)商(Castro，2001，Silva等人，2004)提供的流程的分離。全部產(chǎn)生比較使用此系統(tǒng)進行，在以實現(xiàn)最有效的分離的變性條件下實現(xiàn)重組抗原的分離，以便比較不同構(gòu)建體的產(chǎn)生水平。對于產(chǎn)生和分離目的蛋白而言，可使用任何重組蛋白表達(dá)和分離系統(tǒng)。本發(fā)明涉及含H片段的構(gòu)建體、或含H片段的抗原，以便使融合多肽增溶和增加它們的產(chǎn)生?？稍谄渌鞍桩a(chǎn)生系統(tǒng)、即真菌或真核系統(tǒng)中使用相同的方法。本發(fā)明的原理之一的特征在于通過分子生物學(xué)技術(shù)將H片段尤其FhS或Fh22的 N-端片段序列(SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4)，添加到對應(yīng)于待產(chǎn)生的多肽序列之前。此構(gòu)建體可通過分子生物學(xué)技術(shù)使包含此序列來獲得，即使用適當(dāng)?shù)南拗泼?，并在片段序列之前和之后添加那些限制性位點；或通過其他方法獲得，例如將含目的序列(接頭)的DNA 片段添加到PCR產(chǎn)物；或通過其他可應(yīng)用的方法獲得。H片段的減少的幅度允許用于融合到目的多肽的各種策略的使用。構(gòu)建體的另一可能性是使用對應(yīng)于FhS或Fh22和待產(chǎn)生的多肽序列的多肽制備融合蛋白。插入FhS或Fh22序列的過程可使用分子生物學(xué)技術(shù)實現(xiàn)，即使用限制酶，所述方法用于例示方法。本發(fā)明應(yīng)用于幾種片段，即-CP12 :CP12 是小隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)(屬于頂復(fù)門 (Apicomplexa)、隱孢子蟲屬(Cryptosporidium)的球蟲原生動物)的表面蛋白。此蛋白具有104個氨基酸(GenBank N0 XM_625821)、及12kDa的分子量、具有氨基-末端信號序列 (aa 1-28)和跨膜區(qū)(aa 12_32)，其為表面蛋白的特征，且不含保守的或有功能的結(jié)構(gòu)域 (Yao等人，2006)。此工作中使用的CP12片段具有213bp的長度，且對應(yīng)于無跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白CP12的核苷酸序列。片段經(jīng)PCR-擴增，并亞克隆進載體pQE(CP12)；也制備含H片段、 且其后是CP12(HCP12)，及含融合到CP12序列的FhS序列(Fh8CP12)的構(gòu)建體。在變性條件下、使用NiNTA瓊脂糖樹脂(QIAGEN)分離的重組抗原的產(chǎn)生分析顯示CP12和HCP12產(chǎn)生之間216%的增加、及CP12和Fh8CP12產(chǎn)生之間954%的增加。-IL5 人白細(xì)胞介素5是造血生長因子，其具有編碼134個氨基酸的816bp的核苷酸序列(GenBank N0 BC069137. 1)。用于評估的IL5片段對應(yīng)于小部分IL5，由144bp構(gòu)成，對應(yīng)于編碼48個氨基酸的位 于IL5的5'末端的外顯子。片段經(jīng)PCR-擴增，并亞克隆進載體pQE (IL5)；也制備含H片段、且其后是IL5(HIL5)，及含融合到IL5序列的FhS序列 (Fh8IL5)的構(gòu)建體。在變性條件下、使用NiNTA瓊脂糖樹脂(QIAGEN)分離的重組抗原的產(chǎn)生的分析、顯示IL5和HIL5的產(chǎn)生之間610%的增加、及IL5和Fh8IL5的產(chǎn)生之間1600% 的增加。-TgOWP =TgOWP蛋白是鼠弓形蟲(Toxoplasma gondii)卵囊壁蛋白，其具有編碼 499個氨基酸的長度為1846bp的核苷酸序列(GenBank N° EU851867. 1)。TgOWP片段對應(yīng)于包含2875和3238bp之間的第二外顯子。片段經(jīng)PCR-擴增，并亞克隆進載體pQE (TgOffP)； 也制備含H片段、且其后是TgOWP (HTgOWP)的構(gòu)建體。在變性條件下、使用NiNTA瓊脂糖樹脂(QIAGEN)分離的重組抗原的產(chǎn)生的分析顯示TgOWP和HTgOWP的產(chǎn)生之間575%的增加。在以上描述的3例中，產(chǎn)生水平從與它們在包含體中的表達(dá)一致的水平增加到對應(yīng)于可溶性蛋白的產(chǎn)生水平，從而可說，肝片形吸蟲(Fasciola hepatica)成蟲排泄的/分泌的H片段或鈣結(jié)合蛋白的定位允許重組蛋白產(chǎn)生非常顯著增加，可能增加產(chǎn)生的抗原的溶解度。抗原Fh8和Fh22和它們的H片段的表征先分離Fh8和Fh22抗原，并由屬于所列發(fā)明人的成員(Castro，2001，Silva等人， 2004，Eguino等人，1999)用以下提供的抗原簡述(圖1)表征。進行編碼被稱為Fh8或fasciolin (Genbank號AF213970)的計算的分子量是8kDa 的69個氨基酸多肽的cDNA克隆(圖1)的分離。多肽的主要特征是2個推定的鈣結(jié)合基序(EF-手)的存在。獲得的結(jié)果(Castro、 2001)顯示，F(xiàn)h8是存在于肝片形吸蟲(F.h印atica)成蟲的排泄/分泌產(chǎn)物(ESP)的抗原， 且可呈現(xiàn)為聚合物形式。為表征目的和分析FhS活性，以及潛在診斷性目的，獲得了含對應(yīng)于FhS的序列的重組抗原rFh8。為研究目的，將對應(yīng)于Fh8的片段在大腸埃希氏菌(Escherichia coli)中亞克隆進表達(dá)載體pQE (Qiagen)。在大腸埃希氏菌(E. coli)M15 (pREP4) (Qiagen)中進行N-端序列表現(xiàn)為6個組氨酸的序列的重組蛋白rFh8的產(chǎn)生，并通過親和層析用NiNTA瓊脂糖柱 (Qiagen)，基于生產(chǎn)商提供的流程(Castro，2001，Silva等人，2004)分離。分離幾種編碼具有高同源性的鈣結(jié)合蛋白的cDNA克隆。將這些克隆亞克隆和分析，及一些顯示含對應(yīng)于有22kDa的計算的分子量的191個氨基酸肽的ORF的相同的插入子(EMBL號AJ003822)，將其表示為Fh22-1。另一克隆含有具有有與之前的高同源性的蛋白的ORF的插入子，將其在下文表征，及稱為Fh22-2 (EMBL號AJ003821)。Fh22是具有4個被描述為肝片形吸蟲(F. hepatica)成蟲的ESP的成分的EF-手結(jié)構(gòu)的鈣結(jié)合蛋白(Eguino等人，1999)。將這些抗原亞克隆進表達(dá)載體pQE及在表達(dá)載體 PQE中產(chǎn)生。FhS和Fh22抗原的表征顯示ESP中存在一組具有類似結(jié)構(gòu)特征的蛋白。因此將此一組抗原表征為存在EF-手、調(diào)節(jié)其折疊的鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)，可能導(dǎo)致大腸埃希氏菌(E. coli) 中產(chǎn)生的天然的蛋白和重組抗原的穩(wěn)定性。兩種重組蛋白以高于6mg/L的培養(yǎng)物的水平產(chǎn)生，且兩種蛋白顯示在大腸埃希氏菌(E. coli)細(xì)胞質(zhì)中以可溶性形式產(chǎn)生。
基于在Fh8水平定向突變獲得的結(jié)果顯示，大腸埃希氏菌(E. coli)中觀察到的產(chǎn)生水平取決于那些EF-手之外的結(jié)構(gòu)元件，由于在分離的EF-手(防止鈣結(jié)合)突變的重組蛋白水平不顯著變化。這些數(shù)據(jù)提示確保所述穩(wěn)定性的其他蛋白結(jié)構(gòu)的存在。FhS的三維結(jié)構(gòu)顯示、除了在N-端(Ilaa)和C-端(6aa)的小序列之外，全部其余序列涉及由結(jié)合到EF-手的鈣所致的結(jié)構(gòu)或受(活性中心的形成)由結(jié)合到EF-手的鈣所致的結(jié)構(gòu)影響。 由此，這些研究導(dǎo)致將FhS的N-端序列(在下文中稱之為H序列)鑒定為在FhS的穩(wěn)定性和產(chǎn)生中起關(guān)鍵作用。 對于蛋白Fh22，HLH(EF-手結(jié)構(gòu)、螺旋-環(huán)-螺旋-HLH)基序的排列類似于Fh8， 且如在FhS中，除了 N和C-端序列之外，其余蛋白涉及鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)，或受它們影響。在大腸埃希氏菌(Escherichia coli)中將片段和構(gòu)建體亞克隆進表達(dá)載體 PQE(Qiagen)。在大腸埃希氏菌(E coli)M15 (pREP4) (Qiagen)中進行N-端序列表現(xiàn)為6個組氨酸的序列的重組蛋白rFh8的產(chǎn)生，及將其通過親和層析，用NiNTA瓊脂糖柱(Qiagen)， 基于生產(chǎn)商提供的流程(Castro，2001，Silva等人，2004)分離。為產(chǎn)生和分離抗原，可使用任何重組蛋白表達(dá)和分離系統(tǒng)。株在此工作中，將大腸埃希氏菌(Escherichia coli) XLlBlue (Stratagene) 和大腸埃希氏菌(Escherichia coli)M15 [pREP4] (QIAGEN)株分別用于克隆pGEM-T Easy (Promega)質(zhì)粒和 pQE30 以及 pQE32 (QIAGEN)質(zhì)粒。將大腸埃希氏菌(Escherichia coli)M15[pREP4]株用于蛋白表達(dá)。將質(zhì)粒DNA 使用來自 Promega 的1Wizard Plus SV MiniprepsDNA 純化系統(tǒng)試劑盒，從于37°C過夜生長的細(xì)菌培養(yǎng)物，根據(jù)生產(chǎn)商提供的使用說明分離的和純化。構(gòu)建體圖2提供制備用于評定重組抗原FhS和其11個氨基酸結(jié)構(gòu)元件(H片段)對增加的重組蛋白表達(dá)的效應(yīng)的構(gòu)建體的示意圖。圖2中顯示的全部構(gòu)建體如下通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)獲得，并克隆進pGEM和然后克隆進PQE。PCRPCR中使用的引物描述于表1。為了獲得含BamHI和SacI限制性位點的H片段和Fh8RSac片段，將含編碼Fh8多肽的基因的PQE30載體用作PCR反應(yīng)的模板(Castro，2001 ；Silva等人，2004)。PCR反應(yīng)開始于95°C、1分鐘的變性步驟，其后是30個擴增循環(huán)、于94°C變性45s、于50°C退火30s 和于72°C延伸45s。于72°C進行額外的延伸步驟11分鐘。獲得選擇以評估重組抗原(及其部分)對蛋白表達(dá)產(chǎn)生陽性效應(yīng)的能力的片段 (CP12、IL5和TgOWP)并通過PCR擴增。此PCR反應(yīng)也包括將SacI和KpnI限制酶的限制性位點添加到相應(yīng)片段。表1.制備的構(gòu)建體、DNA模板、使用的引物和相應(yīng)PCR程序的列表
權(quán)利要求
1.融合蛋白，其特征在于，包括相同于或90 95%結(jié)構(gòu)上類似于肝片形吸蟲 (Fasciola hepatica)成蟲排泄的-分泌的H片段或鈣結(jié)合蛋白的氨基酸序列，其后是對應(yīng)于非相關(guān)添加的蛋白或蛋白片段的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其特征在于，H片段對應(yīng)于結(jié)構(gòu)上類似于FhS蛋白的 N-端11個氨基酸的片段，所述FhS蛋白的N-端11個氨基酸是SEQ ID NO :2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其特征在于，H片段對應(yīng)于結(jié)構(gòu)上類似于Fh22蛋白的 N-端20個氨基酸的片段，所述Fh22蛋白的N-端20個氨基酸是SEQ ID NO :4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其特征在于，對應(yīng)于鈣結(jié)合蛋白的氨基酸序列在結(jié)構(gòu)上類似于肝片形吸蟲(Fasciola hepatica)成蟲排泄的-分泌的鈣結(jié)合蛋白FhS的氨基酸序歹丨J -SEQ ID NO :1ο
5.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其特征在于，對應(yīng)于鈣結(jié)合蛋白的氨基酸序列在結(jié)構(gòu)上類似于肝片形吸蟲(Fasciola hepatica)成蟲排泄的-分泌的鈣結(jié)合蛋白Fh22的氨基酸序列-SEQ ID NO :3ο
6.根據(jù)前述權(quán)利要求的融合蛋白，其特征在于，標(biāo)簽添加到于N或C-端位置連接的不相關(guān)的蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其特征在于，對應(yīng)于不相關(guān)的蛋白片段或蛋白的氨基酸序列是CP12。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其特征在于，對應(yīng)于不相關(guān)的蛋白片段或蛋白的氨基酸序列是IL5。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其特征在于，對應(yīng)于不相關(guān)的蛋白片段或蛋白的氨基酸序列是TgOWP。
10.表達(dá)載體，其特征在于，包括編碼根據(jù)權(quán)利要求1 8之任一項的融合蛋白的多核苷酸序列。
11.宿主細(xì)胞，其特征在于，包括根據(jù)權(quán)利要求10的表達(dá)載體。
12.制備根據(jù)權(quán)利要求1 9之任一項的融合蛋白的方法，其特征在于，在適于表達(dá)融合蛋白的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞，及分離所述融合蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求1 9之任一項的融合蛋白用于在重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)添加的蛋白或蛋白片段的用途。
14.肝片形吸蟲(Fasciolahepatica)成蟲排泄的-分泌的H片段或鈣結(jié)合蛋白用于生產(chǎn)重組蛋白的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及融合蛋白，其包括對應(yīng)于肝片形吸蟲(Fasciola hepatica)成蟲排泄的-分泌的H片段或鈣結(jié)合蛋白，即蛋白Fh8和Fh22的氨基酸序列，其后是對應(yīng)于不相關(guān)的蛋白片段或蛋白的氨基酸序列，及其制備方法和它們在重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/62GK102348800SQ200980157975
公開日2012年2月8日 申請日期2009年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月13日
發(fā)明者A·A·達(dá)席爾瓦阿爾梅達(dá), A·M·奧利韋拉卡斯特羅, M·A·佩雷拉達(dá)孔塞桑, S·J·馬克斯達(dá)科斯塔 申請人:Hitag-生物技術(shù)有限公司, 科英布拉農(nóng)業(yè)大學(xué)