專利名稱：一種微生物轉(zhuǎn)化制備s-(+)-3-羥基丁酸甲酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的方法，特別涉及一種 以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No. 2266為生物催化劑，以乙酰乙酸甲酯 為底物制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的方法。
背景技術(shù)：
S- (+) -3-羥基丁 酸甲酯((S) - (+) -methyl 3-hydroxybutyrate)，CAS 登錄號(hào) 53562-86-0，分子式C5HltlO3,分子量118. 13?？捎糜诠鈱W(xué)活性聚β _羥基丁酸酯P [ (R) _HB] 的合成，Pt(R)-HB]是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的一類生物聚酯，具有良好的生物降解性，其分解產(chǎn)物可 全部為生物利用，對(duì)環(huán)境無任何污染，其熔融溫度為175 180°C，是一種可完全分解的熱 塑性塑料?？梢宰鳛槭中灾虚g體用于藥物合成。拆分外消旋體3-羥基丁酸甲酯，可以獲得S- (+) -3-羥基丁酸甲酯，但是拆分效率 最大只有50%，生產(chǎn)效率不高。以乙酰乙酸甲酯為底物采用化學(xué)法和微生物法不對(duì)稱還原 底物中的羰基均可以得到S-(+)-3-羥基丁酸甲酯?；瘜W(xué)法不對(duì)稱還原需要制備手性化學(xué) 催化劑，價(jià)格昂貴，制備過程繁瑣。采用微生物法不對(duì)稱還原乙酰乙酸甲酯可以獲得對(duì)映體 過剩值較高的光學(xué)純S-(+)-3-羥基丁酸甲酯，反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好，成本低廉，易于實(shí) 現(xiàn)輔酶的原位再生，微生物易于大規(guī)模培養(yǎng)，易于工業(yè)化生產(chǎn)，是S-(+)-3-羥基丁酸甲酯 的綠色合成工藝。大量的文獻(xiàn)報(bào)道采用各種類型的鎳催化劑催化乙酰乙酸甲酯的不對(duì)稱加氫反應(yīng) 制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯，該過程中催化劑的制備較為繁瑣，成本較高。采用微生物轉(zhuǎn) 化法不對(duì)稱還原乙酰乙酸甲酯制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的工藝過程未見專利和文獻(xiàn)報(bào) 道，是一種高效、節(jié)能、環(huán)保的S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的合成工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)_3-羥基丁酸甲酯的方法，該方法 反應(yīng)條件溫和，操作簡便，環(huán)境友好，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率高，易于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是—種微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)_3-羥基丁酸甲酯的方法，所述方法是以乙酰乙酸甲 酯為底物，以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC No. 2266發(fā)酵獲得的含酶菌體 細(xì)胞為生物催化劑，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制得所述S-(+)-3-羥基丁酸甲酯。本發(fā)明所述的微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)_3-羥基丁酸甲酯的方法為在pH5. 0 8. 0 的磷酸鹽緩沖液中，以乙酰乙酸甲酯為底物、以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC No. 2266發(fā)酵獲得的含酶菌體細(xì)胞為生物催化劑，于25 45°C下轉(zhuǎn)化反應(yīng)8 40 小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到所述S- (+) -3-羥基丁酸甲酯。所述的乙酰乙酸甲酯在磷酸鹽緩沖液中的初始終濃度為0. 01 0. 10mol/Lo進(jìn)一步，本發(fā)明所述的磷酸鹽緩沖液中還添加有終濃度為10 150g/L的葡萄糖作為輔助底物，有利于提高底物的摩爾轉(zhuǎn)化率。所述的含酶菌體細(xì)胞用量以細(xì)胞干重計(jì)為1 70g/g底物，這里所述的底物的量 即乙酰乙酸甲酯的質(zhì)量；所述含酶菌體細(xì)胞干重的測定是將發(fā)酵液離心分離后，棄去上清 液，將濕細(xì)胞在120°C烘干48小時(shí)至恒重，測定干細(xì)胞的重量；取部分發(fā)酵液中離心所得濕 細(xì)胞測定細(xì)胞干重，計(jì)算出發(fā)酵液中單位含酶菌體細(xì)胞中干細(xì)胞比率，再以這個(gè)比率計(jì)算 定量細(xì)胞干重所需含有含酶菌體細(xì)胞發(fā)酵液用量。所述的含酶菌體細(xì)胞按照以下方法制備將釀酒酵母CGMCC No. 2266接種至發(fā)酵 培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速為150 200r/minJ6 35°C下培養(yǎng)18 30h，將發(fā)酵液離心，制得含 酶菌體細(xì)胞。所述的S-(+)_3-羥基丁酸甲酯分離純化方法如下反應(yīng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液4000r/ min離心20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清液用等體積乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯 萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入無水硫酸鈉除去水分，抽濾，濾液蒸餾除去乙酸乙酯，即 得所述S- (+) -3-羥基丁酸甲酯。本發(fā)明所述的S-(+)_3-羥基丁酸甲酯制備方法推薦按照以下步驟進(jìn)行(1)斜面 培養(yǎng)將釀酒酵母CGMCC No. 2266接種到斜面培養(yǎng)基，26 35°C培養(yǎng)4 6天得菌體斜面； 所述的斜面培養(yǎng)基終濃度組成為麥芽汁5 15g/L，酵母粉2 4g/L，蛋白胨4 6g/L， 葡萄糖7 12g/L，瓊脂15 25g/L，自然pH值，溶劑為水；(2)種子培養(yǎng)從菌體斜面取一 接種環(huán)菌體轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基，搖床轉(zhuǎn)速為150 200r/minJ6 35°C培養(yǎng)18 2 得種 子液；所述的種子培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖26 32g/L，酵母粉2 4g/L，硫酸銨3 6g/L，無水 MgSO4O. 2 0. 4g/L, K2HPO4 · 3Η20 0· 5 1. 5g/L, KH2PO4O. 6 1. 5g/L，用 NaOH 或HCl溶液調(diào)整液體培養(yǎng)基的pH值為7. 0，溶劑為水；(3)發(fā)酵培養(yǎng)取種子液，以體積分 數(shù)10 20%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速為150 200r/min，26 35°C培養(yǎng) 18 30h，將發(fā)酵液離心分離得到所述含酶菌體細(xì)胞；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄 糖 26 32g/L，酵母粉 2 4g/L，硫酸銨 3 6g/L，無水 MgSO4O. 2 0. 4g/L，K2HPO4 · 3H20 0· 5 1. 5g/L, KH2PO4O. 6 1. 5g/L，用NaOH或HCl溶液調(diào)整液體培養(yǎng)基的pH值為7. 0，溶 劑為水；(4)生物轉(zhuǎn)化在pH 5. 0 8. 0的磷酸鹽緩沖液中，添加10 150g/L的葡萄糖作 為輔助底物，加入0. 01 0. 10mol/L的乙酰乙酸甲酯，以及細(xì)胞干重質(zhì)量為乙酰乙酸甲酯 1 50倍的菌體細(xì)胞，25 45°C下轉(zhuǎn)化反應(yīng)8 40小時(shí)，得轉(zhuǎn)化液；(5)分離純化反應(yīng)結(jié) 束后，將轉(zhuǎn)化液于4000r/min離心20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清液用等體積乙酸乙酯連續(xù) 萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入無水硫酸鈉除去水分，抽濾，濾 液蒸餾除去乙酸乙酯，即得所述S-(+)-3-羥基丁酸甲酯。釀酒酵母CGMCC No. 2266，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物保 藏中心，位于北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所內(nèi)，保藏號(hào)CGMCC No. 2266，保 藏日期2007年11月沈日，已在先前授權(quán)專利200810059686中作為新菌株予以保護(hù)。菌株來源本發(fā)明中所述的微生物菌株釀酒酵母CGMCC No. 2266是從杭州西湖啤 酒廠附近的土壤中篩選得到。將土壤中分離得到的菌株用于轉(zhuǎn)化乙酰乙酸甲酯，得到釀酒 酵母CGMCC No. 2266具有良好的轉(zhuǎn)化乙酰乙酸甲酯生產(chǎn)S_(+)_3_羥基丁酸甲酯的能力。所述釀酒酵母CGMCC No. 2266的菌落特征在瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出乳白色、有光 澤、平坦、邊緣整齊、濕潤、表面光滑，質(zhì)地均勻的菌落形態(tài)。
所述的S- (+) -3-羥基丁酸甲酯純品可用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測，確定產(chǎn)物的 純度和分子量。摩爾轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的對(duì)映體過剩值(ee% )的確定采用氣相色譜分析檢測。色譜柱為Varian CP Chirasil-DEX手性柱。該手性柱 可以檢測到R-(-)-3-羥基丁酸甲酯和S-(+)-3-羥基丁酸甲酯兩種對(duì)映體的含量，進(jìn)一步 計(jì)算出反應(yīng)的摩爾轉(zhuǎn)化率和S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的對(duì)映體過剩值(ee% )。本發(fā)明中采用微生物細(xì)胞不對(duì)稱還原乙酰乙酸甲酯制備S-(+)_3-羥基丁酸甲 酯，可以獲得高對(duì)映體過剩值的產(chǎn)品，添加10 150g/L的葡萄糖作為輔助底物有利于提高 底物的摩爾轉(zhuǎn)化率。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明采用的微生物轉(zhuǎn)化法制備 S-(+)-3-羥基丁酸甲酯與化學(xué)合成法、酶催化法相比具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)生產(chǎn)菌株安全無 毒，微生物菌體易于大規(guī)模培養(yǎng)；( 可以獲得大量的生物催化劑，比化學(xué)催化劑成本低 廉；(3)反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好；(4)操作簡便，反應(yīng)過程中不需要添加價(jià)格昂貴的輔酶； (5)易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，摩爾轉(zhuǎn)化率高，是S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的綠色合成工 藝。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此斜面培養(yǎng)基配制麥芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，瓊脂 20g/L,自然pH值，溶劑為水；121°C滅菌20min，滅菌后冷卻制成斜面。種子和發(fā)酵培養(yǎng)基配制葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸銨5g/L，無水 MgSO4O. 25g/L，K2HPO4 · 3H20 lg/L，KH2PO4lg/L,溶劑為水，用 NaOH 或 HCl 溶液調(diào)整液體培養(yǎng) 基的PH值為7. 0，121°C滅菌20min。實(shí)施例1將釀酒酵母CGMCC No. 2266菌種接種至斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)4 6天制得菌體 斜面。用接種針從菌體斜面取一接種環(huán)菌體接種在含有IOOmL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶 中，于30°C、180r/min的條件下培養(yǎng)24h獲得種子液。將IOmL種子液(接種量為液體培養(yǎng) 基體積用量10% )接種于含有IOOmL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于30°C、180r/min的 條件下培養(yǎng)24h獲得發(fā)酵液，發(fā)酵液離心，得含酶菌體細(xì)胞。菌體干重的測定是將發(fā)酵液離心后從濕細(xì)胞中取小部份在120°C烘干48小時(shí)至 恒重，測定干細(xì)胞的重量，計(jì)算出發(fā)酵液中單位含酶菌體細(xì)胞中干細(xì)胞比率，再以這個(gè)比率 計(jì)算定量細(xì)胞干重所需含有含酶菌體細(xì)胞發(fā)酵液用量。本實(shí)施例的每升發(fā)酵液中含有含酶菌體細(xì)胞的干重為50克。在十份含有IOOmL pH7. 0磷酸鹽緩沖液的三角瓶中加入上述所得200mL發(fā)酵液 離心后獲得的濕細(xì)胞，其中含有含酶菌體細(xì)胞的干重為10g，分別加入乙酰乙酸甲酯，使乙 酰乙酸甲酯的終濃度分別為 0. 01mol/L、0. 02mol/L、0. 03mol/L、0. 04mol/L、0. 05mol/L、 0. 06mol/L、0. 07mol/L、0. 08mol/L、0. 09mol/L、0. lOmol/L,均置于 30 °C，180r/min 的搖床 中反應(yīng)Mh。反應(yīng)結(jié)束后將轉(zhuǎn)化液于4000r/min離心20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清液用等體積乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入無水硫酸鈉 除去少量水分，抽濾，濾液蒸餾除去乙酸乙酯，即得所述S-(+)-3-羥基丁酸甲酯，底物初始 濃度對(duì)摩爾轉(zhuǎn)化率及S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的對(duì)應(yīng)體過剩值(ee% )的影響見表1。
表1底物初始濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率及S-(+)_3-羥基丁酸甲酯的影響
權(quán)利要求
1.一種微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的方法，其特征在于所述方法是以乙 酰乙酸甲酯為底物，以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No. 2266發(fā)酵獲得的 含酶菌體細(xì)胞為生物催化劑，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制得所述S-(+)-3-羥基丁酸甲酯。
2.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的方法，其特征在于 所述的方法為在PH 5. O 8. O的磷酸鹽緩沖液中，以乙酰乙酸甲酯為底物、以釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) CGMCC No. 2266發(fā)酵獲得的含酶菌體細(xì)胞為生物催化劑，于 25 45°C下轉(zhuǎn)化反應(yīng)8 40小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到所述S-(+)-3-羥 基丁酸甲酯。
3.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的方法，其特征在于所 述的乙酰乙酸甲酯在磷酸鹽緩沖液中的初始終濃度為0. 01 0. 10mol/Lo
4.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的方法，其特征在于所 述的磷酸鹽緩沖液中還添加有終濃度為10 150g/L的葡萄糖作為輔助底物。
5.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的方法，其特征在于所 述的含酶菌體細(xì)胞用量以細(xì)胞干重計(jì)為1 70g/g底物。
6.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的方法，其特征在于所 述的含酶菌體細(xì)胞按照以下方法制備將釀酒酵母CGMCC No. 2266接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中， 搖床轉(zhuǎn)速為150 200r/min，26 35°C下培養(yǎng)18 30h，將發(fā)酵液離心，制得含酶菌體細(xì) 胞。
7.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的方法，其特征在于 所述的S-(+)-3-羥基丁酸甲酯分離純化方法如下反應(yīng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液4000r/min離心 20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清液用等體積乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液， 在乙酸乙酯萃取液中加入無水硫酸鈉除去水分，抽濾，濾液蒸餾除去乙酸乙酯，即得所述 S-(+)-3-羥基丁酸甲酯。
8.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的方法，其特征在于 所述的方法按照以下步驟進(jìn)行(1)斜面培養(yǎng)將釀酒酵母CGMCC No. 2266接種到斜面培養(yǎng) 基，26 35°C培養(yǎng)4 6天得菌體斜面；(2)種子培養(yǎng)從菌體斜面取一接種環(huán)菌體轉(zhuǎn)接 到種子培養(yǎng)基，搖床轉(zhuǎn)速為150 200r/minJ6 35°C培養(yǎng)18 2 得種子液；(3)發(fā)酵 培養(yǎng)取種子液，以體積分?jǐn)?shù)10 20%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速為150 200r/minJ6 35°C培養(yǎng)18 30h，將發(fā)酵液離心分離得到所述含酶菌體細(xì)胞；(4)生物轉(zhuǎn) 化在pH5. 0 8. 0的磷酸鹽緩沖液中，添加終濃度為10 150g/L的葡萄糖作為輔助底 物，加入終濃度為0. 01 0. 10mol/L的乙酰乙酸甲酯，以及細(xì)胞干重質(zhì)量為乙酰乙酸甲酯 1 50倍的含酶菌體細(xì)胞，25 45°C下轉(zhuǎn)化反應(yīng)8 40小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束制得轉(zhuǎn)化液；(5) 分離純化轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液于4000r/min離心20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清液 用等體積乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入無水硫 酸鈉除去水分，抽濾，濾液蒸餾除去乙酸乙酯，即得所述S-(+)-3-羥基丁酸甲酯。
9.如權(quán)利要求2所述微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的方法，其特征在于所述 方法按如下步驟進(jìn)行(1)斜面培養(yǎng)將釀酒酵母CGMCC No. 2266接種到斜面培養(yǎng)基，26 35°C培養(yǎng)4 6天 得菌體斜面；所述的斜面培養(yǎng)基終濃度組成為麥芽汁5 15g/L，酵母粉2 4g/L，蛋白胨4 6g/L，葡萄糖7 12g/L，瓊脂15 25g/L，自然pH值，溶劑為水；(2)種子培養(yǎng)從菌體斜面取一接種環(huán)菌體轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基，^5 35°C，搖床轉(zhuǎn)速為 150 200r/min，培養(yǎng)18 2 得種子液；所述的種子培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖沈 32g/L，酵母粉 2 4g/L，硫酸銨 3 6g/L，無水 MgSO4 0. 2 0. 4g/L，K2HPO4 · 3Η20 0· 5 1. 5g/L，KH2PO4 0· 6 1. 5g/L，用NaOH或HCl溶液調(diào)整液體培養(yǎng)基的pH值為7. 0，溶劑為 水；(3)發(fā)酵培養(yǎng)取種子液，以體積分?jǐn)?shù)為10 20%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培 養(yǎng)溫度為沈 35°C，搖床轉(zhuǎn)速為150 200r/min，培養(yǎng)18 30h得到含有含酶菌體細(xì)胞 的發(fā)酵液，離心分離得到所述含酶菌體細(xì)胞；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖26 32g/L，酵母粉 2 4g/L，硫酸銨 3 6g/L，無水 MgSO4 0. 2 0. 4g/L，K2HPO4 · 3Η20 0· 5 1. 5g/L，KH2PO4 0· 6 1. 5g/L，用NaOH或HCl溶液調(diào)整液體培養(yǎng)基的pH值為7. 0，溶劑為 水；(4)生物轉(zhuǎn)化在pH5. 0 8. 0的磷酸鹽緩沖液中，加入0. 01 0. IOmol/L的乙酰乙 酸甲酯，添加終濃度為10 150g/L的葡萄糖作為輔助底物，以及以細(xì)胞干重質(zhì)量為乙酰乙 酸甲酯1 50倍的含酶菌體細(xì)胞，于25 45°C下轉(zhuǎn)化反應(yīng)8 40小時(shí)得轉(zhuǎn)化液；(5)分離純化反應(yīng)結(jié)束后將轉(zhuǎn)化液于4000r/min離心20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清 液用等體積乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入無水 硫酸鈉除去水分，抽濾，濾液蒸餾除去乙酸乙酯，即得所述S-(+)-3-羥基丁酸甲酯。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的方法在pH 5.0～8.0的磷酸鹽緩沖液中，以乙酰乙酸甲酯為底物、以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.2266發(fā)酵獲得的含酶菌體細(xì)胞為生物催化劑，于25～45℃下轉(zhuǎn)化反應(yīng)8～40h，反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到所述S-(+)-3-羥基丁酸甲酯；本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(1)生產(chǎn)菌株安全無毒，易于大規(guī)模培養(yǎng)；(2)可以獲得大量的生物催化劑，成本低廉；(3)反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好；(4)操作簡便，反應(yīng)過程中不需要添加價(jià)格昂貴的輔酶；(5)易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，摩爾轉(zhuǎn)化率高。
文檔編號(hào)C12R1/865GK102071227SQ201010567729
公開日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者歐志敏, 陳慶美, 隋志紅 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)