一種螺內(nèi)酯衍生物及其微生物轉(zhuǎn)化制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種微生物轉(zhuǎn)化制備羥基螺內(nèi)酯的方法，所述方法為：以雅致小克銀漢霉（Cunninghamella?elegans）ATCC9245經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為催化劑，以螺內(nèi)酯為底物，以無水乙醇為助溶劑，于原發(fā)酵液或pH6.8的磷酸緩沖液中構(gòu)成轉(zhuǎn)化體系，在25～32℃、150～300r/min恒溫振蕩條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液分離純化，獲得12β-羥基-螺內(nèi)酯和2α-羥基-螺內(nèi)酯；本發(fā)明生物轉(zhuǎn)化法合成了2種羥基螺內(nèi)酯，利尿作用較原螺內(nèi)酯有一定的提高；用作生物催化劑的微生物菌株安全無毒，培養(yǎng)條件簡單，抗雜菌污染能力強(qiáng)，易于大規(guī)模培養(yǎng)；轉(zhuǎn)化操作簡便，反應(yīng)過程中不需要使用任何其他試劑，轉(zhuǎn)化收率高，成本低，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。
【專利說明】一種螺內(nèi)酯衍生物及其微生物轉(zhuǎn)化制備方法與應(yīng)用
(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種羥基螺內(nèi)酯的合成方法，特別涉及一種以雅致小克銀漢霉(Cunninghamella elegans)ATCC9245為生物催化劑，以螺內(nèi)酯為底物制備12 β -羥基-螺內(nèi)酯和2α-羥基-螺內(nèi)酯的新方法。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]螺內(nèi)酯(spironolactone),化學(xué)名為17 β -羥基_3_氧_7 α -(乙酰硫基)-17 α -孕甾-4-烯-21-羧酸-Y -內(nèi)酯,臨床藥物又稱安體舒通(antisterone),分子
結(jié)構(gòu)為式(ΠΙ)所示:
[0003]
【權(quán)利要求】
1.一種螺內(nèi)酯衍生物，其特征在于所述螺內(nèi)酯衍生物為式(I )所示12β-羥基-螺內(nèi)酯或式(II)所示2 a -羥基-螺內(nèi)酯:

2.一種微生物轉(zhuǎn)化法制備權(quán)利要求1所述螺內(nèi)酯衍生物的方法，其特征在于所述方法為:以雅致小克銀漢霉(Cunninghamella elegans) ATCC9245經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的含菌發(fā)酵液或發(fā)酵液離心后的濕菌體與PH6.8的磷酸緩沖液制成的含菌體懸液為生物催化劑，以螺內(nèi)酯為底物，以無水乙醇為助溶劑構(gòu)成反應(yīng)體系，在25~32°C、150~300r/min恒溫振蕩條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液分離純化，獲得12 β -羥基-螺內(nèi)酯和2 α -羥基-螺內(nèi)酯；所述生物催化劑的用量以含濕菌體重量計(jì)為30~40g/L轉(zhuǎn)化體系，所述底物的初始濃度為20~80mg/L轉(zhuǎn)化體系，所述無水乙醇的體積終濃度為0.2~0.8%。
3.如權(quán)利要求1所述微生物轉(zhuǎn)化法制備螺內(nèi)酯衍生物的方法，其特征在于所述生物催化劑的質(zhì)量用量以含濕菌體重量計(jì)為35g/L轉(zhuǎn)化體系，所述底物的初始濃度為60mg/L轉(zhuǎn)化體系，所述無水乙醇的體積終濃度為0.6%。
4.如權(quán)利要求2所述微生物轉(zhuǎn)化法制備螺內(nèi)酯衍生物的方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間為I~3天。
5.如權(quán)利要求2所述微生物轉(zhuǎn)化法制備螺內(nèi)酯衍生物的方法，其特征在于所述生物催化劑的制備方法為: (1)菌種活化培養(yǎng):將雅致小克銀漢霉ATCC9245接種到馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基，25~32°C培養(yǎng)2~4天，獲得雅致小克銀漢霉ATCC9245的孢子； (2)種子擴(kuò)大培養(yǎng):從步驟(1)經(jīng)活化培養(yǎng)的平板上用棉簽蘸取孢子轉(zhuǎn)接到馬鈴薯液體培養(yǎng)基，于25~32°C、150~300r/min振蕩培養(yǎng)2~3天，獲得種子液； (3)菌體發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(2)制備的種子液以體積濃度I~5%的接種量接種于馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，于25~32°C、150~300r/min振蕩培養(yǎng)2~4天，獲得含菌發(fā)酵液，將發(fā)酵液離心,去上清,收集沉淀即為濕菌體,將濕菌體懸浮于PH6.8的磷酸緩沖液制成含菌體懸液。
6.如權(quán)利要求2所述微生物轉(zhuǎn)化法制備螺內(nèi)酯衍生物的方法，其特征在于所述反應(yīng)液分離純化的方法為:將反應(yīng)液過濾，濾液用等體積的乙酸乙酯連續(xù)萃取2~3次，合并乙酸乙酯萃取液，減壓蒸餾除去乙酸乙酯后用無水甲醇溶解并過濾，濾液進(jìn)行MCI柱色譜分離，以體積濃度30~70%的乙醇水溶液作為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集體積濃度70%洗脫液的流出液，流出液減壓濃縮去除洗脫液，即可得到含12 β -羥基-螺內(nèi)酯和2 α -羥基-螺內(nèi)酯的混合液；將混合液進(jìn)行HPLC分離，以體積比1:1的甲醇和水混合溶液作為流動(dòng)相，流速lmL/min，檢測波長240nm，分別收集含目標(biāo)組分的流出液，將流出液分別減壓濃縮后真空干燥，分別獲得12 β -羥基-螺內(nèi)酯和2 α -羥基-螺內(nèi)酯。
7.一種權(quán)利要求1 所述式(I )所示12 β -羥基-螺內(nèi)酯或式(II)所示2 α -羥基-螺內(nèi)酯在制備利尿藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12P33/20GK103910776SQ201410106863
【公開日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月20日
【發(fā)明者】梅建鳳, 占紀(jì)勛, 王羅醫(yī), 王思淵, 張書偉 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)