專利名稱：賴氨酸、復(fù)合酶的發(fā)酵及包被的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于氨基酸的發(fā)酵領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及發(fā)酵制備L-賴氨酸制品的方法，其包括發(fā)酵產(chǎn)生L-賴氨酸發(fā)酵液，該發(fā)酵液可以與可發(fā)酵獲得的耐高溫脫水的木聚糖酶和纖維素酶混合，高溫干燥后用脂肪包被。另外，本發(fā)明還提供了所述方法生產(chǎn)的產(chǎn)品
坐寸ο
背景技術(shù)：
木聚糖酶和纖維素酶能夠有效降解含木質(zhì)素和纖維素的物質(zhì)(如，飼料)，因此在飼料中添加木聚糖酶和纖維素酶能夠增強(qiáng)飼料的吸收利用率，從而節(jié)約飼養(yǎng)成本。例如，中國專利96196760. 9公開了反芻動(dòng)物飼料的酶添加物，其包含木聚糖酶和纖維素酶。 L-賴氨酸是重要的氨基酸原料，可以作為調(diào)味品、食品、飼料添加劑使用，也可以作為保健品、藥品中的有效或輔料成分，廣泛應(yīng)用于食品業(yè)、飼料業(yè)、制藥業(yè)及其他化學(xué)工業(yè)中。當(dāng)前，L-賴氨酸的生產(chǎn)主要是通過微生物的發(fā)酵生產(chǎn)的，如可以利用棒狀桿菌生產(chǎn)。然而，當(dāng)賴氨酸作為飼料的時(shí)候，由于其屬于小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，很快就能釋放到動(dòng)物體內(nèi)，尤其在大量攝取時(shí)，影響了動(dòng)物吸收利用的效率。通常解決的方法是少量多次地喂食動(dòng)物，但是這將增加動(dòng)物飼養(yǎng)的工作量。因此，本發(fā)明提出了直接用賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)液制備包被的賴氨酸制品的方法，可以有效減緩賴氨酸在動(dòng)物體內(nèi)釋放的速度。常規(guī)地，包被的賴氨酸制品可以和含木聚糖酶和纖維素酶的酶添加劑在喂飼時(shí)一起混合入動(dòng)物飼料中。這樣使用中比較麻煩，而且容易混合不均勻，可能會(huì)使相應(yīng)的利用率低。本發(fā)明人設(shè)想，在制備包被的賴氨酸制品的過程中將木聚糖酶和/或纖維素酶與賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)液直接混合，可以混合地很均勻，然后進(jìn)行包被，然而卻發(fā)現(xiàn)受制于包被中要經(jīng)歷的高溫以及干燥過程，常規(guī)的酶活性將極大地削弱，甚至完全喪失。令人意外地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一株耐熱且耐旱的霉菌菌株，經(jīng)過艱苦深入細(xì)致的研究，其中分離的木聚糖酶經(jīng)歷高溫干燥后仍舊能夠保持高木聚糖酶活性，因此適于在其中方便地使用，減少了喂飼時(shí)使用的麻煩。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供新的發(fā)酵制備L-賴氨酸制品的方法，其包括發(fā)酵產(chǎn)生L-賴氨酸發(fā)酵液，該發(fā)酵液可以與可發(fā)酵獲得的耐高溫脫水的木聚糖酶和纖維素酶混合，高溫干燥后用脂肪包被。另外，本發(fā)明還提供了所述方法生產(chǎn)的產(chǎn)品等。具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了發(fā)酵制備L-賴氨酸制品的方法，包括，發(fā)酵產(chǎn)生L-賴氨酸發(fā)酵液，該發(fā)酵液可以與耐高溫脫水的木聚糖酶和耐高溫脫水的纖維素酶混合，經(jīng)高溫干燥后收集的顆粒用脂肪包被。因此，本發(fā)明第一方面的方法發(fā)酵制備的L-賴氨酸制品分兩層，外層包裹內(nèi)層，其中外層是脂肪，而內(nèi)層含有L-賴氨酸、耐高溫脫水的木聚糖酶和耐高溫脫水的纖維素酶。該L-賴氨酸制品能夠減緩賴氨酸在動(dòng)物體內(nèi)釋放的速度，而且能夠具有木聚糖酶和纖維素酶活性。該制品優(yōu)選是飼料添加劑。更具體地，在第一方面，本發(fā)明提供了發(fā)酵制備L-賴氨酸制品的方法，其包括(I)在發(fā)酵條件下培養(yǎng)導(dǎo)入了編碼吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶的多核苷酸的產(chǎn)L-賴氨酸的菌，獲得發(fā)酵液，過濾后保留濾液；(2)在發(fā)酵條件下培養(yǎng)導(dǎo)入了編碼耐高溫脫水的木聚糖酶的多核苷酸的分泌表達(dá)菌，過濾后保留上清液；(3)在發(fā)酵條件下培養(yǎng)導(dǎo)入了編碼耐高溫脫水的纖維素酶的多核苷酸的分泌表達(dá)菌，過濾后保留上清液；(4)混合步驟⑴獲得的濾液、步驟(2)獲得的上清液和步驟(3 )獲得的上清液，得到混合液；(5)對(duì)步驟(4)獲得的混合液高溫噴霧干燥，并任選進(jìn)行篩分和/或破碎，收集顆粒；和(6)將步驟(5)收集的顆粒用脂肪包被。脂肪包被顆?？梢酝ㄟ^流化制粒包衣機(jī)將熔化的脂肪噴涂在顆粒表面上來實(shí)現(xiàn)，因此優(yōu)選脂肪是室溫狀態(tài)下為固態(tài)而熔點(diǎn)略高于室溫(如，45-80°C，優(yōu)選50-65°C )的脂肪。優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，脂肪優(yōu)選是分餾棕櫚脂肪，更優(yōu)選是百佳能(BergaFat)，其可以通過商業(yè)途徑方便地獲取。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，包被所用的脂肪是百佳能HTL316。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，脂肪層包被(噴涂)得越厚，制備得到的L-賴氨酸制品的抗降解能力越強(qiáng)。優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，在步驟￠)中，步驟(5)獲得的顆粒和脂肪的重量比為2 8 8 2，優(yōu)選為3 7 7 3，更優(yōu)選為5 6. 5 5 3. 5。在步驟(5)中，對(duì)于其中干燥得到的粒徑分布不均勻，可以進(jìn)行篩分，收集一定粒徑范圍的顆粒；和/或?qū)τ诟稍锖?或篩分得到的粒徑較大的顆粒，可以進(jìn)行粉碎，然后繼續(xù)進(jìn)行篩分，收集一定粒徑范圍的顆粒。優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，收集的顆粒的粒徑小于O. 8mm,優(yōu)選小于O. 5mm。大于O. 5mm的顆粒。另外優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，高溫噴霧干燥可以在流化床干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行。為了使最終顆粒的形狀更為均勻，流化床干燥機(jī)內(nèi)尾氣溫度不宜過高，通常不高于100°〇，優(yōu)選不高于851，更優(yōu)選保持在80±31。因此，優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，步驟(5)中，高溫為60-100°C，優(yōu)選為65-90°C，更優(yōu)選為 75-85 °C。賴氨酸作為小分子化合物，高溫脫水干燥對(duì)其不會(huì)產(chǎn)生過多不利影響；而木聚糖酶作為大分子蛋白質(zhì)，經(jīng)高溫和/或脫水，有可能使其降解和/或變性，從而導(dǎo)致其酶活性的顯著降低或喪失，無法起到相應(yīng)作用。因此本發(fā)明可以采用了耐高溫脫水的木聚糖酶和耐高溫脫水的纖維素酶，其中高溫為60-100°C，優(yōu)選為65-90°C，更優(yōu)選為75_85°C。優(yōu)選在作為飼料添加劑使用時(shí)，由于木聚糖酶和/或纖維素酶的需要量少于賴氨酸的，因此本發(fā)明第一方面的方法發(fā)酵制備的L-賴氨酸制品中優(yōu)選賴氨酸含量高，而同時(shí)木聚糖酶和/或纖維素酶含量低，可以低至滿足飼料所需木聚糖酶和/或纖維素酶的活性。優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，步驟(I)獲得的濾液、步驟(2)獲得的上清液和步驟(3)獲得的上清液的體積比為10 0.01-10 O. 01-10，優(yōu)選為10 O. 05-5 O. 1-5，更優(yōu)選為 10 : O. 1-1 O.5-2。
多核苷酸可以通過各種本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方式被導(dǎo)入菌中，使該菌表達(dá)所述多核苷酸編碼的酶，如吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶、木聚糖酶和/或纖維素酶。所述多核苷酸可以直接被導(dǎo)入，例如利用微粒體、基因槍等導(dǎo)入細(xì)胞；也可以間接被導(dǎo)入，例如可以通過構(gòu)建在質(zhì)粒載體上導(dǎo)入細(xì)胞。導(dǎo)入的所述多核苷酸可以整合在細(xì)胞的基因組上表達(dá)，也可以游離表達(dá)。優(yōu)選本發(fā)明第一方面的方法中，編碼酶的多核苷酸可以利用穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入菌中，如編碼吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶的多核苷酸可以利用大腸桿菌-棒狀桿菌穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入產(chǎn)L-賴氨酸的菌(如棒狀桿菌)中，又如編碼木聚糖酶或纖維素酶的多核苷酸可以利用大腸桿菌-酵母菌穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入分泌表達(dá)菌(如畢氏酵母)中。L-賴氨酸的發(fā)酵有許多現(xiàn)有技術(shù)可供本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇，例如可以利用野生型吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶或其變體。野生型吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的，其包括α亞基和β亞基，其中α亞基和β亞基的序列分別如NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih. gov)蛋白和基因登錄號(hào)NP416120. I和AAC74674. I所示。優(yōu)選的變體可以是中國專利201110065683. 5所公開的吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶變體，在實(shí)際生產(chǎn)中增加了賴氨酸的產(chǎn)量(也可參見中國專利201110151495. 4)，其包括α亞基變體和β亞基變體，其中α亞基變體相對(duì)于野生型α亞基在Μ102、L127或Q322的位置上被其他天然氨基酸替換，優(yōu)選替換是 M102L、L127R和Q322K ； β亞基變體相對(duì)于野生型β亞基在Α398或D400的位置上被其他天然氨基酸替換，優(yōu)選替換是A398S和D400H。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，采用吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶變體，其是由如SEQ ID No 9所示的核苷酸序列編碼的。本發(fā)明第一方面的方法中，耐高溫脫水的木聚糖酶優(yōu)選是本發(fā)明人令人意外地發(fā)現(xiàn)的菌株產(chǎn)生的木聚糖酶，該木聚糖酶與現(xiàn)有已知的木聚糖酶同源性很低，而且具有耐高溫脫水的優(yōu)勢(shì)，經(jīng)證實(shí)即使被高溫蒸發(fā)干燥后，仍舊能保留80%以上的酶活性，從而使得本發(fā)明第一方面的方法能夠得以順利實(shí)施。優(yōu)選本發(fā)明第一方面的方法中，耐高溫脫水的木聚糖酶的氨基酸序列(I)如 SEQ ID No 2 所示；或(2)是對(duì)SEQ ID No 2缺失、添加和/或取代一個(gè)或幾個(gè)(優(yōu)選不超過7個(gè)，更優(yōu)選不超過5個(gè)，如不超過3個(gè))氨基酸殘基而獲得的保留SEQ ID No :2活性的序列。本發(fā)明第一方面的方法中，耐高溫脫水的纖維素酶優(yōu)選也是本發(fā)明人令人意外地發(fā)現(xiàn)的菌株產(chǎn)生的纖維素酶，該纖維素酶與現(xiàn)有已知的纖維素酶同源性很低，而且具有耐高溫脫水的優(yōu)勢(shì)，經(jīng)證實(shí)即使被高溫蒸發(fā)干燥后，仍舊能保留90%以上的酶活性，從而使得本發(fā)明第一方面的方法能夠得以順利實(shí)施。優(yōu)選本發(fā)明第一方面的方法中，耐高溫脫水的纖維素酶的氨基酸序列(I)如 SEQ ID No 4 所示；或(2)是對(duì)SEQ ID No 4缺失、添加和/或取代一個(gè)或幾個(gè)(優(yōu)選不超過7個(gè)，更優(yōu)選不超過5個(gè)，如不超過3個(gè))氨基酸殘基而獲得的保留SEQ ID No :4活性的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過重組DNA技術(shù)，能夠制備出經(jīng)缺失、添加和/或取代氨基酸殘基而獲得的變體蛋白。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，木聚糖酶是由如SEQ ID Νο:1所示的核苷酸序列編碼的；纖維素酶是由如SEQ ID No :3所示的核苷酸序列編碼的。在步驟⑵和/或(3)中，過濾除去菌體而保留上清液,其中優(yōu)選使用O. 22μηι濾膜進(jìn)行過濾。上清液可以提純和/或濃縮，也可以直接用于本發(fā)明第一方面的方法中，優(yōu)選是后者。優(yōu)選本發(fā)明第一方面的方法中，在步驟(2)中，上清液的木糖酶酶活性不小于1000IU/L，優(yōu)選不小于5000IU/L，更優(yōu)選不小于10000IU/L，例如不小于15000IU/L。本發(fā)明的耐高溫脫水的木聚糖酶經(jīng)高溫脫水干燥，仍舊能基本保留原酶活性。優(yōu)選的步驟(2)中的在發(fā)酵條件下培養(yǎng)的方法包括(i)將分泌表達(dá)耐高溫脫水的木聚糖酶的菌(如，酵母菌)接入液體培養(yǎng)基中，于28-33 °C 培養(yǎng)至 0D600 達(dá)到 3. 0-8. O ；(ii)將步驟⑴獲得的培養(yǎng)液以3-7% (體積)的接種量接種于液體培養(yǎng)基中，于28-33 °C培養(yǎng)20-28小時(shí)；(iii)將甲醇以O(shè). 3-0. 7% (體積)的接入量加入步驟(ii)獲得的培養(yǎng)液中，誘導(dǎo)培養(yǎng)6-12天，期間每24小時(shí)補(bǔ)加O. 3-0. 7% (體積)接入量的甲醇，通氣控制溶氧大于20%，并控制 pH 為 5. 8-6.4。 優(yōu)選本發(fā)明第一方面的方法中，在步驟(3)中，上清液的纖維素酶活性不小于1000IU/L，優(yōu)選不小于5000IU/L，更優(yōu)選不小于8000IU/L，例如不小于12000IU/L。本發(fā)明的耐高溫脫水的纖維素酶經(jīng)高溫脫水干燥，仍舊能基本保留原酶活性。優(yōu)選的步驟(2)中的在發(fā)酵條件下培養(yǎng)的方法包括(i)將分泌表達(dá)耐高溫脫水的纖維素酶的菌(如，酵母菌)接入液體培養(yǎng)基中，于28-33 °C 培養(yǎng)至 0D600 達(dá)到 3. 0-8. O ；(ii)將步驟⑴獲得的培養(yǎng)液以3-7% (體積)的接種量接種于液體培養(yǎng)基中，于28-33 °C培養(yǎng)20-28小時(shí)；(iii)將甲醇以O(shè). 3-0. 7% (體積)的接入量加入步驟(ii)獲得的培養(yǎng)液中，誘導(dǎo)培養(yǎng)3-8天，期間每24小時(shí)補(bǔ)加O. 3-0. 7% (體積)接入量的甲醇，通氣控制溶氧大于20%，并控制 pH 為 5. 8-6. 4。在本文中，接種量或接入量具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所能常規(guī)理解的含義，具體在以體積百分比表示的時(shí)候，指的是菌體培養(yǎng)液(接入的菌液)或接入的其他液體體積相對(duì)于被接入的培養(yǎng)基體積的百分比量。其中，液體培養(yǎng)基是能使分泌表達(dá)耐高溫脫水的木聚糖酶和/或纖維素酶的菌(如，酵母菌)生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)劑。步驟(i)和步驟(ii)中的液體培養(yǎng)基可以是相同的，也可以使不同，優(yōu)選是相同的，如可以是BMGY液體培養(yǎng)基，其配方為IOOmM磷酸鉀緩沖液(pH6. O)中，含1% (重量)酵母提取物、2% (重量)蛋白胨，酵母含氮堿基I. 34% (重量)，生物素4*10_5% (重量)，葡萄糖2% (重量)，甘油1% (體積)。在步驟(I)中，過濾除去菌體而保留濾液，其中優(yōu)選使用超濾膜進(jìn)行過濾。濾液可以提純和/或濃縮，也可以直接用于本發(fā)明第一方面的方法中，優(yōu)選是后者。優(yōu)選本發(fā)明第一方面的方法中，在步驟(I)中，濾液中L-賴氨酸的含量高于50g/L，優(yōu)選高于70g/L，更優(yōu)選高于90g/L。這可以利用許多現(xiàn)有技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，包括菌種的改良和/或發(fā)酵流程的改良。示例性的步驟(I)中的在發(fā)酵條件下培養(yǎng)的方法包括(a)將產(chǎn)L-賴氨酸的菌接入第一發(fā)酵罐于31_38°C培養(yǎng)10-20小時(shí)；(b)將步驟(a)獲得的培養(yǎng)液以3-7% (體積)的接種量接種于第二發(fā)酵罐，于36-40°C培養(yǎng)3-8小時(shí)；
(c)向第二發(fā)酵罐持續(xù)流加糖，其中糖的每小時(shí)流加量為第二發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液量m O. 2-0. 35% (重量)，進(jìn)行 10-18 小時(shí);(d)向第二發(fā)酵罐持續(xù)流加糖和氮源，其中糖的每小時(shí)流加量為第二發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液量的O. 3-0.5% (重量)，而且氮源的每小時(shí)流加量為第二發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液量的O. 1-0. 25% (重量)，進(jìn)行30-65小時(shí)，優(yōu)選50-55小時(shí)。在本文中，“第一”和“第二”在修飾發(fā)酵罐的時(shí)候，是為了區(qū)分所修飾的發(fā)酵罐，SP第一發(fā)酵罐和第二發(fā)酵罐是不同的。其中，優(yōu)選第一發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基配方為每18立方米培養(yǎng)基中含，葡萄糖500-750公斤，甘蔗糖蜜50-300公斤，玉米漿400-600公斤，KH2PO430-80 公斤，MgSO4 · 7H20 3-15 公斤，F(xiàn)eSO4 · 7Η200· 1-1 公斤，MnSO4 · 7Η20 O. 1-1 公斤，生物素5-30克，和葉酸3-10克，和/或，優(yōu)選第二發(fā)酵罐的培養(yǎng)基配方為每315立方米培養(yǎng)基中含，葡萄糖10000-15000公斤，甘蔗糖蜜50-3000公斤，玉米漿10000-15000公斤，KH2PO4700-1200 公斤，MgSO4 · 7Η20 5-220 公斤，F(xiàn)eSO4 · 7Η20 5-25 公斤，MnSO4 · 7Η20 5-220 公斤，生物素150-300克，和葉酸50-120克。
步驟(c)和(d)的部分培養(yǎng)條件(如，溫度，pH等)與步驟(b)的可以相同，也可以不同。步驟(b)中，不進(jìn)行流加操作；而在步驟(c)和(d)中，pH維持在6.5至7.8之間，這可以簡(jiǎn)單地通過流加堿或酸來實(shí)現(xiàn)。在本文中，流加量具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所能常規(guī)理解的含義，具體在以重量百分比表示的時(shí)候，指的是加入物質(zhì)的重量占被加入物質(zhì)(如，培養(yǎng)液)的重量的百分比量。優(yōu)選步驟(C)和(d)中的糖是葡萄糖。在步驟(C)中，葡萄糖的每小時(shí)流加量為第二發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液量的O. 2-0. 35% (重量)，優(yōu)選為O. 27-0. 33% (重量)。在步驟(d)中，葡萄糖的每小時(shí)流加量為第二發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液量的O. 3-0. 5% (重量)，優(yōu)選為O. 42-0. 48% (重量)O優(yōu)選步驟(d)中的氮源是無機(jī)氮源，優(yōu)選是硫酸氨或氯化銨，如硫酸氨。在步驟(d)中，硫酸氨的每小時(shí)流加量為第二發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液量的O. 1-0. 25% (重量)，優(yōu)選為
O.17-0. 23% (重量)。在第二方面，本發(fā)明提供了 L-賴氨酸制品(如，飼料添加劑)，其包括用脂肪包裹的顆粒，其中顆粒包含L-賴氨酸、耐高溫脫水的木聚糖酶和耐高溫脫水的纖維素酶，優(yōu)選耐高溫脫水的木聚糖酶和耐高溫脫水的纖維素酶分別是本發(fā)明人令人意外地發(fā)現(xiàn)的菌株產(chǎn)生的木聚糖酶和纖維素酶。優(yōu)選在本發(fā)明第二方面的制品是由本發(fā)明第一方面的方法發(fā)酵制備的。在第三方面，本發(fā)明提供了耐高溫脫水的木聚糖酶和耐高溫脫水的纖維素酶聯(lián)用于制備飼料或飼料添加劑中的用途。為了便于理解，以下將通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對(duì)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。另外，本發(fā)明引用了公開文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)而明確記載過一樣。
具體實(shí)施方式
以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容。如未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段和市售的常用儀器、試劑，可參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第3版)》(科學(xué)出版社)、《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(第4版)》(高等教育出版社)以及相應(yīng)儀器和試劑的廠商說明書等參考。實(shí)施例I耐熱且耐失水的木聚糖酶基因的表達(dá)構(gòu)建體的制備根據(jù)我們發(fā)現(xiàn)的菌株，委托中國科學(xué)院微生物研究所，進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)了新的木聚糖酶基因，其核苷酸序列如序列表的SEQ ID No :1所示，所編碼的木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。然后，根據(jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》以及所用商品化試劑的操作指南構(gòu)建分泌表達(dá)的酵母，簡(jiǎn)而言之，即將編碼該木聚糖酶的基因用正向引物如序列表的SEQID No 5所示(引入了 EcoR I內(nèi)切酶位點(diǎn))、反向引物如序列表的SEQ ID No 6所示(引入了 Not I內(nèi)切酶位點(diǎn))擴(kuò)增后用EcoR I和Not I雙酶切，并與經(jīng)這兩個(gè)內(nèi)切酶酶切的 PPIC3. 5質(zhì)粒(可購自Invitrogen公司)用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α中。挑出陽性克隆，抽提出其中的質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后，將陽性質(zhì)粒用Sal I酶切線性化后，通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化入畢氏酵母GSl 15株，在含G418的平板上挑出陽性酵母轉(zhuǎn)化株，寄回。實(shí)施例2耐熱且耐失水的木聚糖酶的發(fā)酵制備及活性測(cè)定將實(shí)施例I獲得的陽性酵母轉(zhuǎn)化株接種到50ml BMGY液體培養(yǎng)基(IOOmM磷酸鉀緩沖液(pH6. O)，其中含1%酵母提取物、2%蛋白胨，酵母含氮堿基I. 34%，生物素4*10_5(%，葡萄糖2%，甘油1% )中，于30°C、200rpm培養(yǎng)至0D600達(dá)到5. O。將上述培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到IL BMGY液體培養(yǎng)基中，于30°C、200rpm培養(yǎng)24小時(shí)，加入5ml甲醇,然后繼續(xù)于30°C、200rpm培養(yǎng)8天,期間每24小時(shí)補(bǔ)加5ml甲醇,通氣控制溶氧(DO)大于20%,并控制pH為6. O (用氣水調(diào)節(jié))。培養(yǎng)完成后，用O. 22 μ m濾 旲過濾并保留上清液，該上清液經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)其中富含木聚糖酶對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)，由此發(fā)酵得到木聚糖酶上清液。取新鮮的上清液，分成三份，一份冷藏待用(A)，一份冷凍干燥至固體后用磷酸鉀緩沖液(ΡΗ6.0)重新溶解(B)，一份于80°C烘箱中蒸發(fā)干燥至固體后用磷酸鉀緩沖液(pH6. O)重新溶解(C);對(duì)照采用5000IU/g規(guī)格的市售木聚糖酶(可購自江蘇省奧谷生物科技有限公司)，用磷酸鉀緩沖液(PH6.0)溶解后分成三份，一份冷藏待用(CA)，另兩份分別冷凍干燥(CB)和80°C烘箱蒸發(fā)干燥(CC)，然后重溶于磷酸鉀緩沖液(pH6. O)。分別測(cè)定這些木聚糖酶活性，換算成原單位體積上清液或單位重量的酶活，計(jì)算由于高溫脫水造成的酶活損失率，結(jié)果如表I所示，表明相對(duì)于市售產(chǎn)品幾乎喪失了酶活的情況，本發(fā)明的木聚糖酶耐高溫脫水，即便經(jīng)過高溫脫水，仍舊能夠保留80%以上的活性，基本保留原酶活功倉泛。表I本發(fā)明和市售的木聚糖酶的高溫脫水酶活損失率
權(quán)利要求
1.發(fā)酵制備L-賴氨酸制品的方法，包括，發(fā)酵產(chǎn)生L-賴氨酸發(fā)酵液，該發(fā)酵液可以與耐高溫脫水的木聚糖酶和耐高溫脫水的纖維素酶混合，經(jīng)高溫干燥后收集的顆粒用脂肪包被。
2.權(quán)利要求I所述的方法，其包括 (1)在發(fā)酵條件下培養(yǎng)導(dǎo)入了編碼吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶的多核苷酸的產(chǎn)L-賴氨酸的菌，獲得發(fā)酵液，過濾后保留濾液； (2)在發(fā)酵條件下培養(yǎng)導(dǎo)入了編碼耐高溫脫水的木聚糖酶的多核苷酸的分泌表達(dá)菌，過濾后保留上清液； (3)在發(fā)酵條件下培養(yǎng)導(dǎo)入了編碼耐高溫脫水的纖維素酶的多核苷酸的分泌表達(dá)菌，過濾后保留上清液； (4)混合步驟(I)獲得的濾液、步驟(2)獲得的上清液和步驟(3)獲得的上清液，得到混合液； (5)對(duì)步驟(4)獲得的混合液高溫噴霧干燥，并任選進(jìn)行篩分和/或破碎，收集顆粒；和 (6)將步驟(5)收集的顆粒用脂肪包被。
3.權(quán)利要求I或2所述的方法，其中步驟(6)中，步驟(5)收集的顆粒和脂肪的重量比為2-8 8-2，優(yōu)選為3-7 7-3，更優(yōu)選為5-6. 5 5-3. 5 ;和/或步驟(5)中，脂肪是分餾棕櫚脂肪，更優(yōu)選是百佳能，最優(yōu)選是百佳能HTL316。
4.權(quán)利要求I或2所述的方法，其中步驟(5)中，高溫為60-100°C，優(yōu)選為65-90°C，更優(yōu)選為75-85°C ;和/或，步驟(5)中，收集的顆粒的粒徑小于O. 8mm，優(yōu)選小于O. 5mm。
5.權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟(4)中，步驟(I)獲得的濾液、步驟(2)獲得的上清液和步驟(3)獲得的上清液的體積比為10 0.01-10 O. 01-10，優(yōu)選為10 O. 05-5 O. 1-5，更優(yōu)選為 10 O. 1-1 0.5-2。
6.權(quán)利要求I或2所述的方法，其中耐高溫脫水的木聚糖酶的氨基酸序列 (1)如SEQ ID No 2 所示；或 (2)是對(duì)SEQID No :2缺失、添加和/或取代一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基而獲得的保留SEQID No 2活性的序列。
7.權(quán)利要求I或2所述的方法，其中耐高溫脫水的纖維素酶的氨基酸序列 (1)如SEQ ID No 4 所示；或 (2)是對(duì)SEQID No :4缺失、添加和/或取代一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基而獲得的保留SEQID No 4活性的序列。
8.權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟(I)中，濾液中L-賴氨酸的含量高于50g/L，優(yōu)選高于70g/L,更優(yōu)選高于90g/L。
9.權(quán)利要求I或2所述的方法，其中制品是飼料添加劑。
10.制品，優(yōu)選是飼料添加劑，其包括用脂肪包裹的顆粒，其中顆粒包含L-賴氨酸、耐高溫脫水的木聚糖酶和耐高溫脫水的纖維素酶，優(yōu)選其是由權(quán)利要求1-9之任一所述的方法制備的。
全文摘要
本發(fā)明提供了發(fā)酵制備L-賴氨酸制品的方法，其包括發(fā)酵產(chǎn)生L-賴氨酸發(fā)酵液，可以與可發(fā)酵獲得的耐高溫脫水的復(fù)合酶混合，高溫干燥后用脂肪包被。另外，本發(fā)明還提供了所述方法生產(chǎn)的產(chǎn)品等。
文檔編號(hào)C12R1/15GK102894190SQ20121018588
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月7日
發(fā)明者馬吉銀, 陳崇安, 孟剛, 曹洪, 程耀東, 劉鑫 申請(qǐng)人:寧夏伊品生物科技股份有限公司