一種利用高產(chǎn)精氨酸脫羧酶的重組菌生產(chǎn)胍基丁胺的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用高產(chǎn)精氨酸脫羧酶的重組菌生產(chǎn)胍基丁胺的方法，屬于生物 工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 精氨酸脫羧酶（Argininedecarboxylase，ADC，EC4. 1. 1. 19)是依賴(lài)磷酸吡咳醛 (PLP)的一類(lèi)酶，廣泛存在于細(xì)菌、植物、動(dòng)物和人類(lèi)中。大腸桿菌中的ADC有兩種形式： BiodegradativeADC(由AdiA編碼）和BiosyntheticADC(由speA編碼），Biodegradative ADC在含精氨酸的營(yíng)養(yǎng)豐富的強(qiáng)酸性培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生，其主要作用是調(diào)控系統(tǒng)的pH 值。BiosyntheticADC在較寬范圍的pH條件下表達(dá)。
[0003] 胍基丁胺是Biosynthetic ADC(EC 4. 1. 1. 19)催化精氨酸脫羧基的產(chǎn)物，是一種 多胺，具有降血壓、抗抑郁、抗炎、鎮(zhèn)痛、抑制細(xì)胞增生等多種生理功能，是重要的醫(yī)藥中間 體。
[0004]目前，Agm的工業(yè)化生產(chǎn)主要依賴(lài)化學(xué)合成，是用1，4一丁二胺和S-甲基異硫脲反 應(yīng)，或用1，4一二溴丁烷與鄰苯二甲酰亞胺鉀反應(yīng)制得，主要以硫酸鹽的形式存在。由于化 學(xué)合成法存在生產(chǎn)步驟多，收率低，成本高，環(huán)境污染等問(wèn)題，因而ADC酶轉(zhuǎn)化法正在日益 受到重視，酶轉(zhuǎn)化法具有具有清潔、快速、高效等優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是極具應(yīng)用潛力的方法。
[0005]目前報(bào)道的表達(dá)精氨酸脫羧酶的重組菌，存在比酶活低的缺陷。同時(shí)已有的利用 固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)胍基丁胺的報(bào)道存在轉(zhuǎn)化時(shí)間長(zhǎng)、效率低的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服以上問(wèn)題，本發(fā)明提高了一種高產(chǎn)精氨酸脫羧酶的重組菌及其在轉(zhuǎn)化生 產(chǎn)胍基丁胺方面的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種高產(chǎn)精氨酸脫羧酶的重組菌，所述重組菌以 E.coli BL21(DE3)為宿主、pET20b(+)為表達(dá)載體，表達(dá)來(lái)源于Escherichia coli BL21的 精氨酸脫羧酶基因speA。
[0008] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述精氨酸脫羧酶基因speA的氨基酸序列如SEQID NO. 1所示。
[0009] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種利用所述的重組菌生產(chǎn)精氨酸脫羧酶的方法，是 將重組菌種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)至0D_為0. 7,然后加入終濃度為0. 4mmol/L的 IPTG誘導(dǎo) 4h。
[0010] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為S0C培養(yǎng)基。
[0011] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種所述重組菌在生產(chǎn)胍基丁胺方面的應(yīng)用。
[0012] 所述應(yīng)用是先誘導(dǎo)重組菌產(chǎn)精氨酸脫羧酶，然后以精氨酸為底物，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生 產(chǎn)胍基丁胺；所述全細(xì)胞轉(zhuǎn)化中，底物精氨酸濃度為15_25g/L，轉(zhuǎn)化溫度為35-40°C，轉(zhuǎn)化 時(shí)間4-7h。
[0013] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述全細(xì)胞轉(zhuǎn)化中，菌體細(xì)胞添加量為2. 5_4g/ L(以細(xì)胞干重計(jì)，DCW)。
[0014] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述菌體細(xì)胞添加量為3. 5g/L，底物精氨酸濃度為 20g/L，轉(zhuǎn)化溫度為35-40°C，轉(zhuǎn)化時(shí)間6h。
[0015] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述誘導(dǎo)重組菌產(chǎn)精氨酸脫羧酶是將重組菌培養(yǎng)至 0D6。。為0.7,然后加入終濃度為0.4mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4h。該條件下酶活可達(dá)0.53Umgi。
[0016] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述全細(xì)胞轉(zhuǎn)化是在緩沖體系中進(jìn)行，緩沖液為 Tris-HCl(pH7. 0,輔酶PLP濃度為 30mM，Mg2+濃度為 4mM)。
[0017] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用具體是：將重組菌株培養(yǎng)至0D6。。為0.7,用 終濃度為〇. 4mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h，然后收集菌體，用無(wú)菌生理鹽水洗滌菌體，再將 該菌體投入轉(zhuǎn)化液中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其中轉(zhuǎn)化條件為：底物精氨酸濃度為20g/L，細(xì)胞添加量為 3. 5g/L，轉(zhuǎn)化溫度為35-45°C，轉(zhuǎn)化時(shí)間6h，搖床轉(zhuǎn)速150rpm。
[0018] 本發(fā)明的有益效果：
[0019] 本發(fā)明的重組菌，精氨酸脫羧酶的比酶活可達(dá)0.53Umgi。利用本發(fā)明的重組菌， 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化精氨酸生產(chǎn)胍基丁胺，轉(zhuǎn)化6h的胍基丁胺的產(chǎn)量可達(dá)14. 3g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度可達(dá) 2. 38gAL?h)，轉(zhuǎn)化率可達(dá)為95. 6%。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單、易操作，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1 :酶法轉(zhuǎn)化L-精氨酸生產(chǎn)胍基丁胺示意圖；
[0021] 圖2 :胍基丁胺標(biāo)準(zhǔn)品和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物高效液相色譜圖；其中A標(biāo)準(zhǔn)品，B轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物驗(yàn)證及胍基丁胺產(chǎn)量檢測(cè)：
[0023] 以胍基丁胺硫酸鹽作為標(biāo)準(zhǔn)品配置標(biāo)準(zhǔn)溶液。將適度稀釋的轉(zhuǎn)化上清液和標(biāo)準(zhǔn)溶 液分別與0PA衍生，經(jīng)0. 22um微孔濾膜過(guò)濾后，用高效液相色譜法測(cè)定胍基丁胺含量。
[0024] 高效液相色譜條件：
[0025]色譜柱：Acclaim120C18 (250mmX4. 6mmX5ym) ?
[0026] 流動(dòng)相：流動(dòng)相A:10mMKH2P04緩沖液（pH5. 3);流動(dòng)相B:乙腈-甲醇-10mM KH2P04 (體積比為5:3:1)，用0. 22um濾膜過(guò)濾；
[0027] 柱溫：35°C
[0028] 檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)330nm，發(fā)射波長(zhǎng)465nm;
[0029] 進(jìn)樣量：12ul(8y1樣品+4y1 0PA衍生劑）；
[0030] 流速：lml/min。
[0031] 精氨酸脫羧酶酶活測(cè)定方法：
[0032]在 2mL反應(yīng)體系中，添加 50mMTris-HCLbuffer(pH7. 5)，ImMPLP，0.ImMDTT， 4mMMgS04,lOmML-Arg，40°C水浴，加入200yL菌體細(xì)胞破碎液后開(kāi)始反應(yīng)，15min后加入 1/5體積40%三氯乙酸終止反應(yīng)。用HPLC測(cè)定產(chǎn)物胍基丁胺含量。1個(gè)酶活力單位（U)定 義為：在40°C，pH7. 5條件下，每min生成lumol胍基丁胺所需的酶量為1個(gè)酶活力單位。 實(shí)施例1 :表達(dá)精氨酸脫羧酶的重組菌株的構(gòu)建
[0033] (1)用弓丨物 1:5，-CATGCCATGGCAATGTCTGACGACATGTCTATG-3，和弓丨物 2:5'-CCCAAGCTTGTTACTCATCTTCAAGATAAGTA-3 '將來(lái)自于E.coliBL21 的基因組進(jìn)行 PCR擴(kuò)增：擴(kuò)增體系中加入LAtaq酶，95°C預(yù)處理5min，95°C解鏈30s，55°C退火30s，72°C延 伸2min，30個(gè)循環(huán)；
[0034] (2)用限制性?xún)?nèi)切酶NcoI和HindIII將目的基因和表達(dá)載體pET-20b⑴37°C酶 切2h;
[0035] (3)用T4連接酶分別將酶切并膠回收后的目的基因和質(zhì)粒pET_20b⑴16°C連接 l〇h，用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株E.coliBL21中，并涂布于含有氨芐青霉素的LB平板中培 養(yǎng) 12h;
[0036] (4)將平板中長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行PCR及雙酶切驗(yàn)證，測(cè)序驗(yàn)證，篩選出陽(yáng)性克隆子， 獲得精氨酸脫羧酶重組菌株。
[0037] 實(shí)施例2 :利用重組菌轉(zhuǎn)化L-精氨酸生產(chǎn)胍基丁胺
[0038] 按以下方法生產(chǎn)胍基丁胺：
[0039] (1)將構(gòu)建的陽(yáng)性重組菌株接入LB斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)12h;
[0040] (2)接一環(huán)斜面種子到LB培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)6h;
[0041 ] (3)將種子液接入S0C發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)至0D_為0. 7,加入終濃度為0. 4mmol/ L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，4h后收集菌體，無(wú)菌生理鹽水洗滌菌體兩次；
[0042] (4)將菌體投入轉(zhuǎn)化液中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化條件為：底物精氨酸濃度為20g/L，細(xì) 胞濃度3. 5g/L，轉(zhuǎn)化溫度為35-45°C，轉(zhuǎn)化時(shí)間6h，搖床轉(zhuǎn)速150rpm。
[0043] 然后檢測(cè)上清中胍基丁胺含量，檢測(cè)方法：取轉(zhuǎn)化液lOOOOrpm離心2min，收集上 清液，并以胍基丁胺硫酸鹽作為標(biāo)準(zhǔn)品，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液；將適度稀釋后的上清液和標(biāo)準(zhǔn)溶液 分別與0PA衍生，經(jīng)0. 22um微孔濾膜過(guò)濾后，用高效液相色譜法測(cè)定。
[0044] 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化6h后，胍基丁胺的產(chǎn)量達(dá)到14. 3g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為2. 38gAL?h)， 對(duì)底物的摩爾轉(zhuǎn)化率為95. 6%。
[0045] 實(shí)施例3 :按以下方法轉(zhuǎn)化L-精氨酸生產(chǎn)胍基丁胺
[0046] 將重組菌培養(yǎng)至0D6。。為0. 7,加入終濃度為0. 4mmol/L的IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)酶，然后以 精氨酸為底物，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)胍基丁胺；其中轉(zhuǎn)化條件具體是：底物精氨酸濃度為15g/ L，菌體細(xì)胞添加量為2. 5g/L，轉(zhuǎn)化溫度為35°C，轉(zhuǎn)化時(shí)間5h。
[0047] 經(jīng)測(cè)定，胍基丁胺產(chǎn)量可達(dá)10. 4g/L，轉(zhuǎn)化率為93%，生產(chǎn)強(qiáng)度2. 08gAL?h)。
[0048] 實(shí)施例4 :按以下方法轉(zhuǎn)化L-精氨酸生產(chǎn)胍基丁胺
[0049] 將重組菌培養(yǎng)至0D6。。為0. 7,然后加入終濃度為0. 4mmol/L的IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)酶，然 后以精氨酸為底物，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)胍基丁胺；其中轉(zhuǎn)化條件具體是：底物精氨酸濃度為 25g/L，菌體細(xì)胞添加量為4g/L，轉(zhuǎn)化溫度為40°C，轉(zhuǎn)化時(shí)間4-7h。
[0050] 經(jīng)測(cè)定，轉(zhuǎn)化4h時(shí)，胍基丁胺產(chǎn)量可達(dá)9. 32g/L、生產(chǎn)強(qiáng)度2. 33gAL*h);轉(zhuǎn)化7h 時(shí)，胍基丁胺產(chǎn)量可達(dá)11. 4g/L。
[0051] 同時(shí)本發(fā)明還比較不同轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化6h可達(dá)到最 大產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率。
[0052] 雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高產(chǎn)精氨酸脫羧酶的重組菌，其特征在于，所述重組菌以E. coli BL21(DE3)為 宿主、pET20b(+)為表達(dá)載體，表達(dá)來(lái)源于Escherichia coli BL21的精氨酸脫羧酶基因 speA〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組菌，其特征在于，所述精氨酸脫羧酶基因speA的氨基酸 序列如SEQ ID NO. 1所示。3. -種利用權(quán)利要求1所述的重組菌生產(chǎn)精氨酸脫羧酶的方法，其特征在于，所述方 法是將重組菌種子液接種培養(yǎng)至OD 6。。為0. 7,加入終濃度為0. 4mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4h。4. 權(quán)利要求1所述重組菌在生產(chǎn)胍基丁胺方面的應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是先誘導(dǎo)重組菌產(chǎn)精氨酸脫羧 酶，然后以精氨酸為底物，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)胍基丁胺；所述全細(xì)胞轉(zhuǎn)化中，底物精氨酸濃度 為15-25g/L，轉(zhuǎn)化溫度為35-40°C，轉(zhuǎn)化時(shí)間4-7h。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述菌體細(xì)胞添加量為2. 5-4g/L。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述誘導(dǎo)重組菌產(chǎn)精氨酸脫羧酶是將重 組菌培養(yǎng)至OD6。。為0. 7,然后加入終濃度為0. 4mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4h。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述全細(xì)胞轉(zhuǎn)化中，菌體細(xì)胞添加量為 3. 5g/L，底物精氨酸濃度為20g/L，轉(zhuǎn)化溫度為35-40°C，轉(zhuǎn)化時(shí)間6h。9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述應(yīng)用得到的胍基丁胺。10. 權(quán)利要求9所述胍基丁胺在制備藥物方面的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用高產(chǎn)精氨酸脫羧酶的重組菌生產(chǎn)胍基丁胺的方法，屬于生物工程領(lǐng)域。本發(fā)明將來(lái)源于大腸桿菌Escherichia？coli？BL21中編碼精氨酸脫羧酶的基因(speA)過(guò)量表達(dá)于E.coli？BL21(DE3)中，獲得了一株含精氨酸脫羧酶重組菌株pET20b(+)-ADC。該酶在大腸桿菌內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)后，表現(xiàn)出較高的活性。發(fā)酵得到的菌體可直接用于轉(zhuǎn)化，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，在37℃條件下，轉(zhuǎn)化周期僅需要4-6h，胍基丁胺產(chǎn)量達(dá)到14.3g/L，轉(zhuǎn)化率為96.5％。本發(fā)明清潔安全，轉(zhuǎn)化率高，具有較好的科研價(jià)值和工業(yè)化應(yīng)用前景。
【IPC分類(lèi)】A61P9/12, C12P13/00, C12R1/19, C12N9/88, A61P29/00, C12N1/21, A61P25/24, A61K31/155
【公開(kāi)號(hào)】CN105062943
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510535382
【發(fā)明人】劉立明, 孫霞, 孫安然
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年11月18日
【申請(qǐng)日】2015年8月27日