Gata4基因snp位點(diǎn)的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了GATA4基因SNP位點(diǎn)的用途。本發(fā)明公開的用途是rs867858和／或rs904018在制備先天性心臟病易感性的診斷試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)位于GATA4基因SNP位點(diǎn)rs867858和rs904018與先心病室間隔缺損相關(guān)。因此可通過GATA4基因SNP位點(diǎn)rs867858和rs904018的基因型來預(yù)測患者的先心病室間隔缺損易感風(fēng)險(xiǎn)性。本發(fā)明的檢測試劑盒具有良好靈敏性、穩(wěn)定性和特異性。本發(fā)明的試劑盒對未出生胎兒進(jìn)行先心病室間隔缺損易感性的篩查，能有效起到風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警、早期診斷、降低人口出生缺陷率的作用。
【專利說明】GATA4基因SNP位點(diǎn)的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及GATA4基因SNP位點(diǎn)的用途及相關(guān)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]先天性心臟病(CHDs)是指在胎兒期心臟和(或)胸內(nèi)大血管就存在嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)異常，從而導(dǎo)致一系列血流動力學(xué)障礙或功能性障礙的一種出生缺陷性疾病，它是造成發(fā)展中國家兒童死亡最常見的原因之一，其國內(nèi)患病率為0.13% -1.38%,國外統(tǒng)計(jì)為0.4%-5%。先天性心臟病有很多類型，包括室間隔缺損(Ventricular septaldefect, VSD)、房間隔缺損(Atrial septal defect, ASD)、動脈導(dǎo)管未閉(Patent ductusafteriosus, PDA)、肺動脈瓣狹窄(Pulmonary stenosis, PS)、主動脈縮窄(Coarctationof aortic, CoA)、大動脈轉(zhuǎn)位(Transposition of the great arteries, TGA)、法洛四聯(lián)癥(Tetralogy of Fallot, T0F)、右室雙出口(Double—outlet right ventricle, D0RV)等。其中室間隔缺損居先天性心臟缺損首位。
[0003]室間隔缺損最早是Dalrymple在1847年報(bào)道的，它指心室的間隔部分因組織缺損形成異常開口而引起心室間異常血流交通，從而造成血液自左向右分流，導(dǎo)致血流動力學(xué)異常的一種先天性心臟缺損。正常情況下，右房收集來自全身各部位的氧含量較低的靜脈血(缺氧血)，流經(jīng)右室然后泵入肺中進(jìn)行氣體交換。經(jīng)過肺換氣后，來自肺臟中的氧含量較高的動脈血(充氧血) 流入左房，再流經(jīng)左室，然后通過大動脈被泵入到身體的其他區(qū)域，以供給身體各部位的正?；顒印．?dāng)出現(xiàn)室間隔缺損時(shí)，由于左室的壓力高，左室內(nèi)的充氧血就會通過間隔上的異常開口而進(jìn)入右室，這就導(dǎo)致額外的血液通過右室泵入肺中，從而造成肺充血。
[0004]單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotide polymorphism, SNP)是指存在于某一(些)群體、正常個(gè)體的基因組DNA中單堿基的序列差異，并且在人群中的分布頻率至少要在1%以上(Brookes AJ.Gene，1999，234 (2):177—186)，人類遺傳基因的多態(tài)性在遺傳信息上的本質(zhì)表現(xiàn)，90%以上是由SNP所引起的。因?yàn)槠涠鄳B(tài)信息量大，目前已成為繼限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)志和微衛(wèi)星即短串聯(lián)重復(fù)(STR)標(biāo)志后的第三代遺傳標(biāo)志。
[0005]從基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)到臨床醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，SNP都存在巨大的應(yīng)用價(jià)值。SNP的研究為基因診斷，尤其是疾病的早期診斷提供更多依據(jù)有重要意義。SNP由于其分布廣、密度高而被期望在諸如癌癥、糖尿病、高血壓、憂郁癥和哮喘等復(fù)雜疾病的研究中起重要作用，這些復(fù)雜疾病是多個(gè)遺傳變異位點(diǎn)與環(huán)境因子共同作用的結(jié)果，由于發(fā)病原因復(fù)雜，涉及的基因數(shù)量多，已成為國際上疾病基因組學(xué)研究的重點(diǎn)。目前已有實(shí)驗(yàn)將SNP應(yīng)用于腫瘤預(yù)后及易感性的判斷，例如肺癌致癌物的易感性存在個(gè)體差異，即肺癌的基因易感性，研究較多的是代謝酶基因多態(tài)性，如人細(xì)胞色素P450-CYP450和髓過氧化酶MPO等。法國研究者證實(shí)，MPO基因啟動子(463G / A)多態(tài)性導(dǎo)致該基因較低的表達(dá)，可以降低肺癌患病的危險(xiǎn)性(ChewierI，Stucker !,Houllier AM,et al.pharmacogenetics,2003,13(2):729-739)。日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)了 HER-2基因編碼區(qū)的一個(gè)SNP與胃癌的發(fā)展及惡性程度有關(guān)(Kuraoka K，Matsumura S, Hamai Y,et al.1ht J Cancer,2003,107(4):593-596)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為胎兒先心病室間隔缺損易感性的早期診斷提供一種檢測方法及相關(guān)試劑盒。
[0007]下述應(yīng)用都是本發(fā)明所要保護(hù)的內(nèi)容:
[0008]UGATA4基因SNP位點(diǎn)rs867858和/或rs904018在制備先天性心臟病易感性的診斷試劑盒中的應(yīng)用。其中，GATA4基因SNP位點(diǎn)rs867858的基因型為T / G時(shí)，先天性心臟病易感性增加；GATA4基因SNP位點(diǎn)rs904018的基因型為G / G時(shí)，先天性心臟病易感性降低。
[0009]2、GATA4基因SNP位點(diǎn)單倍型在制備先天性心臟病易感性的診斷試劑盒中的應(yīng)用。其中，單倍型為rs8678586 / rs904018G時(shí)，先天性心臟病易感性降低。
[0010]3、GATA4基因SNP位點(diǎn)rs867858在制備女性先天性心臟病易感性的診斷試劑盒中的應(yīng)用。其中，GATA4基因SNP位點(diǎn)rs867858的基因型為T / G時(shí)，女性先天性心臟病易感性增加。
[0011]4、GATA4基因SNP位點(diǎn)rs904018在制備男性先天性心臟病易感性的診斷試劑盒中的應(yīng)用。其中，GATA4基因SNP位點(diǎn)rs904018的基因型為G / G時(shí)，男性先天性心臟病易感性降低。
[0012]5、檢測GATA4基因SNP位點(diǎn)rs867858和/或rs904018的物質(zhì)在制備先天性心臟病易感性的診斷試劑盒中的應(yīng)用。其中，GATA4基因SNP位點(diǎn)rs867858的基因型為T / G時(shí)，先天性心臟病易感性增加；GATA4基因SNP位點(diǎn)rs904018的基因型為G / G時(shí)，先天性心臟病易感性降低。
[0013]6、檢測GATA4基因SNP位點(diǎn)rs867858的物質(zhì)在制備女性先天性心臟病易感性的診斷試劑盒中的應(yīng)用。其中，GATA4基因SNP位點(diǎn)rs867858的基因型為T / G時(shí)，女性先天性心臟病易感性增加。
[0014]7、檢測GATA4基因SNP位點(diǎn)rs904018的物質(zhì)在制備男性先天性心臟病易感性的診斷試劑盒中的應(yīng)用。其中，GATA4基因SNP位點(diǎn)rs904018的基因型為G / G時(shí)，男性先天性心臟病易感性降低。
[0015]上述任一所述應(yīng)用中，所述先天性心臟病的類型為室間隔缺損。
[0016]本領(lǐng)域技術(shù)人員能通過檢測SNP位點(diǎn)的任何方法或技術(shù)來檢測GATA4基因SNP位點(diǎn)。例如，Taqman法、質(zhì)譜法、DNA微陣列法、測序法、微測序、雜交、限制性片段分析、寡核苷酸連接檢測、等位基因特異性PCR-HRM或聯(lián)合應(yīng)用上述方法。
[0017]本發(fā)明還具體提供了一種先天性心臟病易感性的診斷試劑盒。
[0018]該診斷試劑盒，包括檢測GATA4基因SNP位點(diǎn)rs867858和/或rs904018的物質(zhì)。
[0019]其中，所述檢測GATA4基因SNP位點(diǎn)rs867858和/或rs904018的物質(zhì)包括基因組DNA抽提試劑、PCR擴(kuò)增引物對、PCR反應(yīng)體系試劑、和HRM熒光染料試劑。
[0020]所述PC`R 擴(kuò)增引物對如 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQID N0.4 和 SEQ ID N0.5所示。[0021]所述PCR反應(yīng)體系試劑包括dNTP、MgCl2, realstart酶、PCR反應(yīng)緩沖液；
[0022]所述HRM 突光染料選自 Eva Green、Syto9、Resol ight 和 SupperGreen ；
[0023]上述試劑盒中，所述先天性心臟病的類型為室間隔缺損。
[0024]上述任一所述試劑盒在制備先天性心臟病易感性的診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用、上述任一所述試劑盒在制備男性先天性心臟病易感性的診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用、或上述任一所述試劑盒在制備女性先天性心臟病易感性的診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用也都是本發(fā)明所要保護(hù)的內(nèi)容。
[0025]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為:本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)位于GATA4基因SNP位點(diǎn)rs867858和rs904018與先心病室間隔缺損相關(guān)。因此可通過GATA4基因SNP位點(diǎn)rs867858和rs904018的基因型來預(yù)測患者的先心病室間隔缺損易感風(fēng)險(xiǎn)性。本發(fā)明的檢測試劑盒具有良好靈敏性、穩(wěn)定性和特異性。本發(fā)明的試劑盒對未出生胎兒進(jìn)行先心病室間隔缺損易感性的篩查，能有效起到風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警、早期診斷、降低人口出生缺陷率的作用。
【具體實(shí)施方式】
[0026]以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
[0027]I材料與方法
[0028]1.1研究對象
[0029]收集2008年3月至 2009年9月甘肅省人民醫(yī)院心臟外科203位漢族先心病室間隔缺損的患者為病例組，所有患者均經(jīng)心外科富有經(jīng)驗(yàn)的專家通過其病史詢問、體格檢查、胸部X線檢查、12導(dǎo)聯(lián)心電圖檢查、彩色多普勒超聲心電圖檢查，最后經(jīng)手術(shù)確診。正常對照組201例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者或家屬均知情同意。
[0030]1.2主要試劑
[0031]全血基因組DNA提取試劑盒北京百泰克；QuickGene DNA whole blood kit SFujifilm ；Realstart Taq DNA poiymerase 南京 GenScript ；Pfu DNA Polymerase 南京 GenScript ；dNTP Mixture, IOmM each 南京 GenScript ；Taq DNA Polymerase 大連TaKaRa ;dNTP Mixture, 2.5mM each 大連 TaKaRa ;Hot Taq DNA Polvmerase BBI ；Taq DNAPolvmerase BBI ；Taq DNA Polvmerase 北京天根；HotStart Taq PCR MasterMix 北京天根；TrueStart Hot Start Taq DNA Polymerase Fermentas ；EvaGreen Dye (20 X) Biotium ；Fast EvaGreen Master Mix for qPCR and HRM Biotium ；SupperGreen Dye (20X)廈門百維信；LCGreen plus Dye(IOX)Idaho ；Anti—CCP ELISA kit 上海滬峰；Anti—MCV ELISAkit上海滬峰；Roche capillary Roche ；DNA marker BBI ；SDNAClear Nucleic Acid StainBBI ；Agarose上海生工；Water — DEPC上海生工；RF檢測試劑盒上海捷門；
[0032]1.3主要儀器
[0033]Rotor一Gene 6000 突光定量 PCR 儀 Corbett (澳大利亞);Lightcyclerl.5 突光定量PCR儀Roche (瑞士)；黑金剛梯度PCR儀北京東勝創(chuàng)新；QuickGene—Mini80核酸提取儀 Fujifilm(日本);Centrifuge5424 臺式高速離心機(jī) Eppendorf (德國);PE_2400PCR 儀PE (美國)；2F-258全自動凝膠成像系統(tǒng)上海嘉鵬；微量核酸電泳系統(tǒng)Bio — Rad(美國)；Nanodrop2000微量核酸蛋白檢測儀；Thermal scientific (美國)
[0034]實(shí)施例1、PCR — HRM檢測體系
[0035]1.1基因組DNA的提取(參考試劑盒說明書)
[0036]1.2引物設(shè)計(jì)與合成
[0037]選擇GATA4基因rs867858進(jìn)行PCR — HRM檢測體系的建立。通過美國國家醫(yī)學(xué)圖書館 Pubmed 引擎(http://www.ncb1.nlm.nih.gov / sites / snp)檢索到其側(cè)翼序列，在線軟件 Primer3 (http://frod0.w1.mit.edu/primer3)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。GATA4 基因引物:CCTAGACCGTGGGTTTTGCATTGTGTTTC /://genome, ucsc.edu)驗(yàn)證其特異性后交南京金斯特公司合成，引物濃度調(diào)整到20yM-20°C保存。另合成GATA4基因rs904018位點(diǎn)突變基因(長度80bp)作為陽性對照。
[0038]1.3檢測體系酶系統(tǒng)的選擇
[0039]酶系統(tǒng)分別以不同生物技術(shù)公司出售的Taq酶和hot Start Taq酶進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，以Biotium公司生產(chǎn)的HRM專用試劑盒Eva Green Master Mix作為對照進(jìn)行比對，在擴(kuò)增效率好，特異性高的基礎(chǔ)上，選擇成本較低酶系統(tǒng)。
[0040]1.4檢測體系熒光染料的選擇
[0041]PCR熒光染料的選擇是在PCR擴(kuò)增體系酶系統(tǒng)確定的基礎(chǔ)上進(jìn)行選擇，判斷依據(jù)是PCR擴(kuò)增效率(觀察熒光擴(kuò)增曲線的陡度和S曲線)、PCR產(chǎn)物的特異性(觀察熔解曲線和熔解峰并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證)。
[0042]1.5檢測體系PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化
[0043]A.Mg2+ 的優(yōu)化
[0044]Mg2+濃度從1.5mmol / L(mM)開始到4.0mM，每個(gè)梯度增加0.5mM，共有六個(gè)梯度即
1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM、3.5mM和4.0mM。最適Mg2+濃度依據(jù)PCR擴(kuò)增效率和產(chǎn)物的特異性進(jìn)行確定。
[0045]B.退火溫度的優(yōu)化
[0046]退火溫度從54°C開始，每次增加1°C，依據(jù)PCR擴(kuò)增效率和產(chǎn)物特異性進(jìn)行確定。
[0047]C.引物濃度的優(yōu)化
[0048] 引物濃度從0.2—0.9 μ M選擇三個(gè)點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化，一旦出現(xiàn)擴(kuò)增效率低，就需要進(jìn)行上下游引物比例的調(diào)整。
[0049]D.模板上樣量的優(yōu)化
[0050]按照模板不超過總體積I / 10的原則，選擇0.5—1.0μL進(jìn)行優(yōu)化，選擇擴(kuò)增效率最佳的模板濃度。必要時(shí)可稀釋模板。
[0051 ] Ε.PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化
[0052]首先進(jìn)行兩步法和三步法的選擇，再依據(jù)擴(kuò)增效率、產(chǎn)物特異性、產(chǎn)物熔解溫度和GC含量進(jìn)行優(yōu)化,必要時(shí)加入Enhancer。
[0053]1.6檢測體系HRM熔解條件的優(yōu)化
[0054]PCR后直接進(jìn)入HRM。在第一次擴(kuò)增后進(jìn)行普通熔解曲線(Melting:70~95°C )，判斷PCR產(chǎn)物Tm的范圍，以±3°C確定HRM的高分辨熔解范圍；第二次根據(jù)PCR產(chǎn)物高分辨溶解產(chǎn)生的雜合峰調(diào) HRM 條件(first hold temperature:10 ~120second, second holdtemperature:30 ~6Osecond, HRM:Tm-3<>C~Tm+3<>C )，最后確定 HRM 條件。
[0055]1.7PCR—HRM檢測體系的確定與驗(yàn)證
[0056]A.特異性
[0057]PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性通過溶解曲線峰的單一性、瓊脂糖電泳和測序進(jìn)行判斷。
[0058]B.批內(nèi)重復(fù)性 [0059]同一標(biāo)本在同一批檢測中重復(fù)檢測5 — 10次，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化熔解曲線的重合度以及Tm值的變異來判斷。(最終以能否正確進(jìn)行基因分型為標(biāo)準(zhǔn))
[0060]C.批間重復(fù)性(再現(xiàn)性)
[0061]同一標(biāo)本在不同批次檢測中重復(fù)檢測3次以上，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化熔解曲線和熔解分型的相似程度來判斷。(最終以能否正確進(jìn)行基因分型為標(biāo)準(zhǔn))
[0062]D.測序驗(yàn)證
[0063]將PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)公司測序，測序結(jié)果應(yīng)用Chromas軟件分析。
[0064]2、結(jié)果:
[0065](I)、酶系統(tǒng)
[0066]以biotium的Eva Green Master Mix作為參照，與天根生物技術(shù)公司的普通Taq酶進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)盡管天根Taq酶擴(kuò)增效率高，但其PCR產(chǎn)物特異性不如EvaGreen Mix,而且存在引物二聚體。說明在進(jìn)行PCR — HRM時(shí)，最好選擇熱啟動酶，以保證PCR產(chǎn)物的均一性。
[0067]熱啟動酶realstart在擴(kuò)增效率、PCR產(chǎn)物的特異性和產(chǎn)量方面都優(yōu)于Truestart,而后者無論在哪一方面都是低效,不能很好的與EvaGreen染料匹配。
[0068]相對而言，Realstart熱啟動酶與EvaGreen熒光染料匹配擴(kuò)增效率、PCR產(chǎn)物特異性，基本一致，但價(jià)格方面要低于EvaGreen Mix,所以將Realstart酶系統(tǒng)與EvaGreen匹配組合成PCR-HRM檢測系統(tǒng)是最佳選擇。
[0069](2)、熒光染料
[0070]三種突光染料EvaGreen、Supper Green和Lc Green與realstart酶系統(tǒng)結(jié)合進(jìn)行PCR — HRM，就其檢測效能而言，都能達(dá)到HRM技術(shù)的檢測要求，但三種染料的檢測分辨率依次增強(qiáng)，價(jià)格也是依次升高。所以同等條件下，Eva Green為最適選擇。
[0071]3、檢測體系PCR擴(kuò)增條件
[0072]A.Mg2+ 的優(yōu)化
[0073]從擴(kuò)增曲線和熔解曲線可以看出，突光染料EvaGreen除1.5mM的Mg2+不能擴(kuò)增出產(chǎn)物外，其余濃度均能擴(kuò)出PCR產(chǎn)物。其中2.5mM和3.0mM的擴(kuò)增效率、產(chǎn)物特異性和產(chǎn)量接近，處于最佳狀態(tài)。
[0074]從擴(kuò)增曲線和熔解曲線可以看出，突光染料Lc Green除2.0mM的Mg2+不能有效擴(kuò)增出產(chǎn)物，2.5mM的Mg2+擴(kuò)增效率、產(chǎn)物特異性和產(chǎn)量均優(yōu)于3.0mM的Mg2+，處于最佳狀態(tài)。
[0075]從擴(kuò)增曲線和熔解曲線可以看出，突光染料Supper Green除1.5mM-3.0mM的Mg2+均能有效擴(kuò)增出產(chǎn)物，但就擴(kuò)增效率、產(chǎn)物特異性和產(chǎn)量三個(gè)方面綜合考慮，1.5mM的Mg2+處于最佳狀態(tài)。
[0076]B.退火溫度的優(yōu)化
[0077]從梯度PCR結(jié)果可以看出60°C時(shí)目的條帶很亮，非特異帶沒有，僅見引物二聚體。同加入熒光染料進(jìn)行熔解曲線分析60°C時(shí)熔解峰最高，說明此溫度為最適退火溫度。
[0078]C.引物濃度的優(yōu)化
[0079]退火溫度優(yōu)化時(shí)的引物濃度是0.5 μ M，出現(xiàn)引物二聚體，故上qPCR時(shí)調(diào)整到0.3 μ M，擴(kuò)增效果極佳。
[0080]D.模板上樣量的優(yōu)化
[0081]從擴(kuò)增曲線和PCR產(chǎn)物的特異性來看，IOng模板量是足夠進(jìn)行10 μ L體系的PCR反應(yīng)。
[0082]Ε.PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化
[0083]PCR擴(kuò)增條件為預(yù)變性96 °C 3min,變性95 °C 6sec,退火60 °C 6sec,延伸72°C 15sec35 個(gè)循環(huán)。
[0084]4、檢測體系HRM熔解條件
[0085]通過不同的變性時(shí)間(holdl)和雜合退火時(shí)間(hold2)的摸索，發(fā)現(xiàn)變性時(shí)間大于30sec足以使PCR產(chǎn)物完全變性，除非PCR產(chǎn)物Tm值和產(chǎn)量均很高，適當(dāng)?shù)匮娱L時(shí)間。雜合退火時(shí)間30seC足夠形成容易辨認(rèn)的雜合，提高溫度雖然能形成更多的雜合，但雜合峰不易辨認(rèn)。故最終以變性 時(shí)間和雜合退火時(shí)間均為30sec作為首選。HRH的溫度范圍，在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)進(jìn)行70— 90°C的Melting尋找到PCR產(chǎn)物的Tm之后。
[0086]5、PCR — HRM檢測體系驗(yàn)證
[0087]A.批內(nèi)重復(fù)性
[0088]以富士核酸提取試劑盒提取的129號標(biāo)本為例對新建PCR — HRM檢測體系進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)(重復(fù)五次)，熔解曲線進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后完全重合，說明重復(fù)性極好，相對百泰克試劑盒而言，重合度更高，因此分辨率也就更高。Tm值的均值80.60 ± 0.049.[0089]B.批間重復(fù)性(再現(xiàn)性)
[0090]以富士核酸提取盒提取的四個(gè)標(biāo)本為例對新建的PCR — HRM檢測體系進(jìn)行批間重復(fù)性試驗(yàn)(重復(fù)三天)，熔解曲線的熔解峰型和標(biāo)準(zhǔn)化溶解曲線圖形基本沒有變化，基因分型結(jié)果完全一致。
[0091]C.測序驗(yàn)證
[0092]隨機(jī)抽取三種基因分型樣本每種各兩例進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果與PCR — HRM技術(shù)基因分型結(jié)果完全一致。
[0093]由此，我們可以獲得一種檢測試劑盒，包括基因組DNA抽提試劑、PCR反應(yīng)體系試劑和Eva Green熒光染料試劑，所述PCR反應(yīng)體系包括dNTP、MgCl2, realstart酶、PCR反應(yīng)緩沖液和針對SNP位點(diǎn)的特異性引物對。
[0094]實(shí)施例2
[0095]2.1基因組DNA的提取(參考試劑盒說明書)；
[0096]2.2引物設(shè)計(jì)與合成
[0097]針對GATA4基因SNP位點(diǎn)rs867858、rs904018應(yīng)用第一章建立的PCR — HRM檢測體系進(jìn)行類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的基因多態(tài)性檢測。通過美國國家醫(yī)學(xué)圖書館Pubmed引擎(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/sites / snp)檢索到每個(gè)位點(diǎn)的側(cè)翼序列,輸入在線軟件Primer3 (http://frod0.w1.mit.edu/primer3)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。通過UCSC—PCR(http://genome, ucsc.edu)驗(yàn)證其特異性后交上海生工生物技術(shù)公司合成，引物濃度調(diào)整到20μΜ-20?保存。各位點(diǎn)引物序列及PCR產(chǎn)物如下:
[0098]GATA4rs867858 位點(diǎn)
[0099]體及位置:8ρ23.I
[0100]位點(diǎn)多態(tài)性:A / C
[0101]引物:P1CCTAGACCGTGGGTTTTGCATTGTGTTTC(SEQIDN0.1)Tm:67°C GC%:48.3[0102]P2GATGCCGTCATTCGGGCTGGAG (SEQ ID N0.2) Tm:65.5°C GC%:63.6
[0103]PCR 產(chǎn)物:如 SEQ ID N0.3 所示。IOlbp Tm:90.9°C GC%:61.4%
[0104]GATA4 基因 rs904018
[0105]染色體及位置:8ρ23.I
[0106]位點(diǎn)多態(tài)性:A / G
[0107]引物:P1CCCTGCATCCCTAATACCAA(SEQID N0.4) Tm:56°C GC%:50
[0108]P2TAGCTCCCCAGGAAGTGTTC(SEQ ID N0.5) Tm:57.9°C GC%:55
[0109]PCR 產(chǎn)物:如 SEQID N0.6 所示。80bp Tm:82.5°C GC%:47.5
[0110]2.3PCR—HRM技術(shù)檢測基因多態(tài)性
[0111]采用實(shí)施例1建立的PCR—HRM檢測體系作為基礎(chǔ)進(jìn)行基因多態(tài)性檢測，引物濃度為0.3 μ M，反應(yīng)體系12 μ L，金斯特Taq酶系統(tǒng)組成為:0.2U熱啟動酶，2.5mM的Mg+，0.2mM的 dNTP, IXPCR Buffer，20 X EvaGreen，模板 0.5 μ L0 擴(kuò)增條件為預(yù)變性 96°C 3min，變性95°C 6sec,退火60°C 6sec,延伸72°C 15sec35個(gè)循環(huán)。EvaGreen Mix擴(kuò)增條件為預(yù)變性960C 3min，變性 96°C 6sec，退火 60°C 6sec，延伸 72°C 15sec35 個(gè)循環(huán)。高 GC 的 IL-6R-183擴(kuò)增條件為預(yù)變性96°C 3min，變性95°C lOsec，退火60°C lOsec，延伸72°C 15sec35個(gè)循環(huán)。高分辨熔解選擇HRM通道，按Rotor gene60(K)儀器默認(rèn)條件進(jìn)行。熔解溫度范圍按不同擴(kuò)增子Tm±3°C確定。
[0112]2.4基因分型及測序驗(yàn)證
[0113]基因分型依靠儀器分析軟件HRM標(biāo)準(zhǔn)化圖形，參考熔解圖和擴(kuò)增圖進(jìn)行判斷，對不同類型熔解曲線的標(biāo)本隨機(jī)抽樣2— 3份進(jìn)行測序驗(yàn)證，必要時(shí)雙相測序或復(fù)查。
[0114]2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理與分析
[0115]將檢測數(shù)據(jù)輸入Spssl3.0軟件，并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)算各SNP的基因型頻率和基因頻率以及單倍型和單倍組合，并應(yīng)用在線分析軟件SHESiS(http://analysis, bio-χ.cn/myAnalysis.php)與對照組進(jìn)行病例-對照分析。此外，還進(jìn)行性別分層分析。
[0116]結(jié)果:
[0117]一、
[0118]GATA4兩個(gè)位點(diǎn)在病例組和對照組基因型分布、等位基因分布、Hardy—Weinberg遺傳平衡(HWE)分析和單倍型分析分別見表1.1、表1.2、表1.3、表1.4和表1.5。rs867858位點(diǎn)基因型T / G在對照病例中分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，rs904018位點(diǎn)基因型GG和等位基因頻率在病例對照中均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在不同遺傳模式下兩個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型和等位基因分析中我們發(fā)現(xiàn)，rs867858位點(diǎn)在顯性遺傳模式下?lián)薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)rs904018位點(diǎn)在顯性遺傳模式因?yàn)榫哂薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HWE分析顯示GATA4兩個(gè)位點(diǎn)基因型頻率在對照組中達(dá)到遺傳平衡，說明對照組具備群體代表性，病例組本身屬于與選擇的人群不做HWE的檢測。單倍型分析顯示單倍型C-G頻率在兩組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異降低CHD患病風(fēng)險(xiǎn)(OR=0.748，P=0.039)
[0119]表1.1rs867858位點(diǎn)基因型和等位基因的分布
[0120]
【權(quán)利要求】
1.GATA4基因SNP位點(diǎn)rs867858和/或rs904018在制備先天性心臟病易感性的診斷試劑盒中的應(yīng)用。
2.GATA4基因SNP位點(diǎn)單倍型在制備先天性心臟病易感性的診斷試劑盒中的應(yīng)用。
3.GATA4基因SNP位點(diǎn)rs867858在制備女性先天性心臟病易感性的診斷試劑盒中的應(yīng)用； 或，GATA4基因SNP位點(diǎn)rs904018在制備男性先天性心臟病易感性的診斷試劑盒中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述先天性心臟病的類型為室間隔缺損。
5.檢測GATA4基因SNP位點(diǎn)rs867858和/或rs904018的物質(zhì)在制備先天性心臟病易感性的診斷試劑盒中的應(yīng)用； 或檢測GATA4基因SNP位點(diǎn)rs867858的物質(zhì)在制備女性先天性心臟病易感性的診斷試劑盒中的應(yīng)用； 或檢測GATA4基因SNP位點(diǎn)rs904018的物質(zhì)在制備男性先天性心臟病易感性的診斷試劑盒中的應(yīng)用。
6.一種先天性心臟病易感性的診斷試劑盒，包括檢測GATA4基因SNP位點(diǎn)rs867858和/或rs904018的物質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于:所述檢測GATA4基因SNP位點(diǎn)rs867858和/或rs904018的物質(zhì)包括基因組DNA抽提試劑、PCR擴(kuò)增引物對、PCR反應(yīng)體系試劑、和HRM熒光染料試劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增引物對如SEQID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.4 和 SEQID N0.5 所示。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8任一所述的試劑盒，其特征在于:所述PCR反應(yīng)體系試劑包括dNTP、MgCl2, realstart 酶、PCR 反應(yīng)緩沖液； 所述 HRM 突光染料選自 Eva Green、Syto9、Resolight 和 SupperGreen ； 所述先天性心臟病的類型為室間隔缺損。
10.權(quán)利要求6-9中任一所述試劑盒在制備先天性心臟病易感性的診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用或在制備男性先天性心臟病易感性的診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用或在制備女性先天性心臟病易感性的診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103667440SQ201310398808
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月5日
【發(fā)明者】謝小冬, 蘇剛, 李培強(qiáng), 吳驊, 李炯, 李靜 申請人:謝小冬