內(nèi)生真菌菌株ycef199及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種內(nèi)生真菌菌株YCEF199，以及其在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和降低煙草吸收重金屬方面的用途，屬于微生物及微生物應(yīng)用領(lǐng)域。一種內(nèi)生真菌菌株P(guān)yrenochaetasp.YCEF199，保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)：CCTCC?NO:M2013596，保藏時(shí)間2013年11月24日。本發(fā)明所述內(nèi)生真菌菌株P(guān)yrenochaetasp.YCEF199對(duì)煙草具有明顯的促進(jìn)生長(zhǎng)作用，或增加植株的生物量，簡(jiǎn)稱促生作用。
【專利說(shuō)明】?jī)?nèi)生真菌菌株YCEF199及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種內(nèi)生真菌菌株YCEF199，以及其在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和降低煙草吸收重金屬方面的用途，屬于微生物及微生物應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]吸煙與健康是國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題，降低煙草制品有害成分是煙草行業(yè)科技發(fā)展的焦點(diǎn)。煙葉和煙氣中的重金屬是最重要的有害成分之一，另外煙草病害也嚴(yán)重影響煙草產(chǎn)量和烤煙品質(zhì)。而煙草農(nóng)業(yè)對(duì)煙葉有害成分和煙葉品質(zhì)具有重要影響，利用農(nóng)業(yè)生物技術(shù)進(jìn)行調(diào)控，盡量減少煙葉有害成分的本底含量，以達(dá)到降低煙草制品對(duì)人類健康危害的目的。
[0003]煙草中含有多種重金屬元素，如砷、鎘、鉛、汞等，在抽吸過(guò)程中，這些重金屬可通過(guò)主流煙氣進(jìn)入人體，對(duì)人體造成潛在的危害。煙草是對(duì)鎘轉(zhuǎn)移能力極強(qiáng)的作物，煙草中鎘含量比其生長(zhǎng)的土壤高出許多倍，鎘在成熟煙株的不同葉位含量幾乎相當(dāng)，而在根中最低，煙葉中鎘的積累量占總吸收量的79-96%。
[0004]內(nèi)生真菌(endophytic fungi)即至少生活史的一部分能侵染定殖在健康植物組織中，宿主無(wú)明顯病癥的一類真菌(Petrini，1991 ;Wilson，1995)，與菌根真菌只存在于植物根系不同，內(nèi)生真菌在植株的地下和地上部分的任何組織器官都能存在(Faeth &Fagan, 2002)。內(nèi)生真菌廣泛存在于植物組織內(nèi)，不受外界環(huán)境的影響，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育、抵抗病蟲害等具有廣泛的生物學(xué)作用，同時(shí)在一些植物及農(nóng)作物的廣泛應(yīng)用具有重要意義。隨著環(huán)境問(wèn)題的持續(xù)惡化，植物資源經(jīng)受著嚴(yán)峻的考驗(yàn)，而內(nèi)生真菌對(duì)植物的影響是多方面的，已經(jīng)成為當(dāng)今國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、生態(tài)保護(hù)、中藥資源開發(fā)、醫(yī)藥衛(wèi)生的發(fā)展都有重要的現(xiàn)實(shí)意義。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)在植物體存在有益的內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌，內(nèi)源性菌株對(duì)植物病害的防治作用及生物開發(fā)應(yīng)用已引起科學(xué)家的廣泛關(guān)注。植物內(nèi)生真菌主要分布于植物的種子、花、莖、葉和根系中，與植物的關(guān)系是互惠共生的，而且植物內(nèi)生真菌可以提供光合產(chǎn)物及礦物質(zhì)，內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物能夠刺激寄主植物的生長(zhǎng)發(fā)育，提高寄主植物的生物應(yīng)激和非生物脅迫抗性能力，即兩者之間存在物質(zhì)與能量的循環(huán)交流,植物內(nèi)生真菌對(duì)寄主植物的積極地促生效應(yīng),部分是通過(guò)植物內(nèi)生真菌分泌的活性物質(zhì)或者次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)植物的生長(zhǎng)作用的結(jié)果。目前研究較多的是根瘤共生體和菌根共生體，內(nèi)生真菌與植物的共生體是高等植物與微生物共生關(guān)系的又一種表現(xiàn)形式。
[0005]內(nèi)生真菌與植物的互作研究已日益受到研究者的關(guān)注，并成為內(nèi)生真菌研究領(lǐng)域的國(guó)際熱點(diǎn)。煙草作為我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占據(jù)著不可替代的地位，煙草產(chǎn)量和品質(zhì)的提高，是煙草產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的基礎(chǔ)。通過(guò)研究?jī)?nèi)生真菌與煙草的互作關(guān)系，對(duì)研究?jī)?nèi)生真菌與煙草的共生體系具有重大意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種內(nèi)生真菌菌株/7JreflocAaeiasp.YCEF199及其用途。
[0007]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種內(nèi)生真菌菌株P(guān)yrenochaetasv.YCEF199，保藏單位:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào):CCTCC Ν0:Μ 2013596，保藏時(shí)間 2013 年 11 月 24 日。
[0008]內(nèi)生真菌菌株YCEF199的特征為:該菌株生長(zhǎng)速度較慢，在PDA上25°C暗培養(yǎng)7天的菌落直徑為4cm ；PDA培養(yǎng)上初期白色，成熟培養(yǎng)物呈橄欖色或灰色，菌落質(zhì)地較為堅(jiān)硬；氣生菌絲稠密，菌絲有隔，無(wú)色，直徑約1.3-1.6 um。分生孢子器、分生孢子均未見。
[0009]菌株/sp.YCEF199來(lái)源于煙草的內(nèi)生真菌，屬于真菌界Fungi,子囊菌門Ascomycota,座囊菌綱Dothideomycetes,格孢腔菌目Pleosporales,格孢腔菌科Pleosporaceae,棘殼抱屬 Pyrenochaeta。
[0010]內(nèi)生真菌菌株YCEF199的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)核糖體DNA的全序列如SEQ ID NO:1所
/Jn ο
[0011]本發(fā)明還提供上述內(nèi)生真菌菌株/7JreflocAaeiasp.YCEFl99的用途:促進(jìn)植物生長(zhǎng)或增加生物量。
[0012]本發(fā)明所述的促進(jìn)植物的生長(zhǎng)或增加生物量包括煙草。
[0013]本發(fā)明所述內(nèi)生真菌菌株/YCEF199對(duì)煙草具有明顯的促進(jìn)生長(zhǎng)作用，或增加植株的生物量，簡(jiǎn)稱促生作用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為Pyrenochaetas1Q.YCEF199在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。
[0015]圖2為Pyrenochaetasp.YCEF199與云煙87共培養(yǎng)兩周的照片，與對(duì)照相比，Pyrenochaeiasp.YCEF199具有明顯的促生作用。
[0016]圖為Pyrenochaeta邠.YCEF199移入盆栽的生長(zhǎng)2個(gè)月的照片，與對(duì)照相比，Pyrenochaetas^.YCEF199具有明顯的促進(jìn)植物生長(zhǎng)作用或增加生物量。
[0017]生物保藏聲明
內(nèi)生真菌菌株/7JreflocAaeiasp.YCEF199,保藏單位:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào):CCTCC Ν0:Μ 2013596，保藏時(shí)間2013年11月24曰。
【具體實(shí)施方式】
[0018]參照上述附圖，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0019]備注說(shuō)明:下述所有的培養(yǎng)基使用前均需要按照常規(guī)方式進(jìn)行高溫高壓的滅菌處理(121°C、0.24 MPa、20 分鐘)。
[0020]實(shí)施例1、內(nèi)生真菌菌株YCEF199分離獲得
2%麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(malt extract agar, MEA):在麥芽浸出粉20g、瓊脂20g中加蒸餾水定容至1000 mL ;然后進(jìn)行常規(guī)的高溫滅菌(1.1個(gè)大氣壓，121°C下滅菌20min)。
[0021]馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar, PDA):在馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g中加蒸餾水定容至1000 mL ;然后進(jìn)行常規(guī)的高溫滅菌(1.1個(gè)大氣壓，121°C下滅菌 20min)。
[0022]以云南煙草品種園區(qū)采集TenneSSee86 (美國(guó)白肋煙栽培種)為植物材料，將采集的煙草用自來(lái)水漂洗干凈，煙草根莖在75% (v/v)酒精溶液中消毒30秒，然后在1% (v/v)次氯酸鈉溶液中消毒10分種，無(wú)菌水漂洗3次。用無(wú)菌刀片將根切成約0.6cm長(zhǎng)的片段，置于含50μ8.πι1-1氨芐青霉素和50μ8.πι1-1鏈霉素的2%麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(MEA)平皿上，25°C暗培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)出后，將菌絲頂端移接到PDA培養(yǎng)基；分離得到菌落，25°C暗培養(yǎng)，在PDA培養(yǎng)基上連續(xù)三次接種，確認(rèn)為單菌落，沒有其他真菌或者細(xì)菌共同生長(zhǎng)，認(rèn)為是獲得純培養(yǎng)，命名為YCEF199。
[0023]菌株編號(hào)為/YCEF199,保藏單位:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào):CCTCC NO:M 2013596，保藏時(shí)間2013年11月24曰。[0024]實(shí)施例2、內(nèi)生真菌菌株YCEF199的形態(tài)鑒定
本發(fā)明的/7JT洲ocAaeiasp.YCEF199 (即/YCEF199 CCTCC NO:M2013596)具有如下特性-.Pyrenochaeta鄧.YCEF199在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)如圖1所示。該內(nèi)生真菌在PDA培養(yǎng)基上的適宜生長(zhǎng)溫度為25°C，具有以下特征:該菌株屬于真菌界Fungi,子囊菌門 Ascomycota,座囊菌綱 Dothideomycetes,格抱腔菌目 Pleosporales,格抱腔菌科Pleosporaceae,棘殼孢屬。該菌株生長(zhǎng)速度較慢，在PDA上養(yǎng)?天的菌落直徑為4cm ；PDA培養(yǎng)上初期白色，成熟培養(yǎng)物呈橄欖色或灰色，菌落質(zhì)地較為堅(jiān)硬；氣生菌絲稠密，菌絲有隔，無(wú)色，直徑約1.3-1.6 um。分生孢子器、分生孢子均未見。
[0025]實(shí)施例3、內(nèi)生真菌菌株YCEF199的分子鑒定
用真菌基因的快速提取法提取DNA。采用ITS擴(kuò)增的通用引物ITS-4( ‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ )和 ITSl (5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ )進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)采用 50ul 的反應(yīng)體系:ddH2039.5ul、10*PCR Buffer (withMg2+) 5ul、lOmmol/L dNTP 0.4ul、20 μ mol/L Primer-F 0.8ul、20 μ mol/L Primer-R 0.5ul、DNA 模板3ul、5U/ul Taq聚合酶0.8ul。PCR體系為:PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性4min，94°C變性30s，59°C退火40s，72°C延伸608，35個(gè)循環(huán)后，721:延伸IOmin0反應(yīng)結(jié)束后用1.0%瓊脂糖凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物回收后經(jīng)上海生工生物工程有限公司測(cè)序，得到其ITS序列，內(nèi)生真菌菌株YCEF199的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)核糖體DNA的全序列如SEQ ID NO:1所示。測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索以進(jìn)一步確定其分類地位。
[0026]實(shí)施例4、內(nèi)生真菌菌株/YCEF199對(duì)植物的促生作用
MS培養(yǎng)基(IL):硝酸鉀1900mg/L，硝酸銨1650 mg/L，硫酸鎂370 mg/L，磷酸二氫鉀170 mg/L,氯化鈣440 mg/L,硫酸猛22.3 mg/L,硫酸鋅8.6 mg/L,硼酸6.2 mg/L,碘化鉀
0.83 mg/L，鑰酸鈉 0.25 mg/L，硫酸銅 0.025 mg/L，氯化鈷 0.025 mg/L，硫酸亞鐵 27.8 mg/L，Na2EDTA37.3 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，鹽酸硫胺素0.1 mg/L，鹽酸吡哆醇0.5 mg/L，煙酸
0.5 mg/L,肌醇 100 mg/L，30g 鹿糖，瓊脂粉 8g，H2O 定容至 IL ;pH 值 5.8。
[0027](I)選擇煙草品種云煙87的種子，無(wú)菌水浸泡48h后，搓種2(T30min。種子用70%的酒精滅菌lmin，2% (質(zhì)量％)的次氯酸鈉滅菌lOmin，無(wú)菌水沖洗5飛次后點(diǎn)在MS培養(yǎng)基上，于25°C、16h光照80 μ mm-2sec-l與22°C、8h黑暗交替下萌發(fā)兩周(約長(zhǎng)至4片葉)，備用。[0028](2)挑選大小一致煙草苗用于同供試菌株的共培養(yǎng)。將長(zhǎng)至4片葉的煙草幼苗轉(zhuǎn)移至10*10 (厘米)的方形1/2MS培養(yǎng)基上(3株/皿)，為保持煙草的良好長(zhǎng)勢(shì)，將莖葉部分的培養(yǎng)基去掉，根部舒展在1/2MS培養(yǎng)基上。挑取培養(yǎng)一周左右的內(nèi)生真菌菌絲,置于煙草苗根部下方Icm左右進(jìn)行共培養(yǎng)。空白對(duì)照不接菌絲，平皿封口后置于25°C、16h光照80ymm-2sec-l與22°C、8h黑暗的條件下培養(yǎng)兩周左右。備注說(shuō)明:1/2 MS培養(yǎng)基即為大量元素(硝酸鉀、硝酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣)減半，其余元素含量不變的MS培養(yǎng)基。
[0029](3)共培養(yǎng)兩周后，供試菌株表現(xiàn)出良好的促生效果(如圖2所示)。將煙草苗從平皿中取出，葉片和根部分開，分別置于1.5ml的離心管中，烘箱中烘干，精密天平稱重統(tǒng)計(jì)。
[0030]
【權(quán)利要求】
1.內(nèi)生真菌iFyrenochaetasi1.)菌株YCEF199,其特征是:該菌株的保藏名稱為:Pyrenochaeta^.YCEF199，保藏單位:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)；保藏日期:2013年11月24日，保藏編號(hào):CCTCC NO:M 2013596。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)生真菌菌株YCEF199的用途，其特征在于:該用途用于促進(jìn)煙草生長(zhǎng)或增加生物量。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK103834579SQ201410071743
【公開日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2014年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月28日
【發(fā)明者】徐清泉, 章初龍, 林福呈, 劉宏玉, 馮曉曉, 夏琛, 程昌合, 金慧清, 劉化冰, 張曉兵, 何文苗, 慕繼瑞 申請(qǐng)人:浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司