本發(fā)明涉及生物防治技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及生防菌株HZ-9及其在防治大豆孢囊線蟲中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

大豆孢囊線蟲(Soybean cyst nematode,SCN)主要寄生在大豆(Glycine maxL.)上，Ichinohe于1952年首次將此線蟲與其他孢囊線蟲進(jìn)行形態(tài)學(xué)比較，并將其命名為大豆孢囊線蟲(Heterodera glycines Ichinohe)。

至今，大豆孢囊線蟲已蔓延至世界上主要的大豆種植區(qū)，也是危害美國經(jīng)濟(jì)最重要的植物病原生物(Wrather J A,Koenning S R.Estimates of disease effects on soybean yields in the United States 2003to 2005[J].Journal of Nematology,2006,38(2):173-180)，在日本和中國東北部的大豆產(chǎn)區(qū)危害非常嚴(yán)重(簡恒.植物線蟲學(xué)[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2011:89-94)。

在大豆孢囊線蟲的防治措施中，最基礎(chǔ)也是最經(jīng)濟(jì)的防治方法是農(nóng)業(yè)防治。種植抗病品種是國內(nèi)外控制大豆孢囊線蟲危害，降低大豆產(chǎn)量損失的有效方法(De Bruin J L,Pedersen P.Response of old and new soybean cultivars to Heteroder aglycines Ichinohe[J].Agronomy Journal,2008,100(5):1347-1353)，目前我國已獲得一些抗病大豆品種，如抗線1號、抗線2號、齊黃25、嫩豐15等(孔祥超,李紅梅,耿甜,黃文坤,彭德良.大豆種質(zhì)資源對大豆孢囊線蟲3號和4號生理小種的抗性鑒定[J].植物保護(hù),2012,38(1):146-150；徐文平,申宏波,苗興芬,姚文秋.大豆胞囊線蟲抗病種質(zhì)鑒定[J].大豆科學(xué),2007,26(3):377-380)。但是，如果在同一地區(qū)連續(xù)種植同一抗病品種，SCN毒性增強(qiáng)而導(dǎo)致大豆品種喪失抗性，

大豆種衣劑作為一種化肥和農(nóng)藥復(fù)合劑，常被用于防治苗期大豆孢囊線蟲的危害(韓曉增,許艷麗.大豆連作減產(chǎn)主要障礙因素的研究Ⅱ.連作大豆土壤有害生物的障礙效應(yīng)[J].大豆科學(xué),1999,18(1):48-53；賈玉芹，蔣光勝，王曉彤.幾種種衣劑的應(yīng)用效果[J].現(xiàn)代化農(nóng)業(yè),1995,(12):10-11)。由于這些化學(xué)藥劑一般毒性較高，在土壤中殘留時(shí)間較長，會(huì)對環(huán)境、人畜安全、糧食安全等一系列的副作用，同時(shí)，還會(huì)使大豆孢囊線蟲產(chǎn)生抗藥性，現(xiàn)在大都被禁用。。

植物線蟲的生物防治研究起步早，發(fā)展慢，目前大豆孢囊線蟲的生物防治的研究主要集中在真菌、細(xì)菌和抑制性土壤等幾個(gè)領(lǐng)域(尉文彬,武玉環(huán),黃建明,鄭志興.大豆孢囊線蟲生物防治研究進(jìn)展[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,17(5):56-58+99)。

目前關(guān)于大豆孢囊線蟲研究較多的是生防真菌，由于其種類多、易分離的特點(diǎn)，一些生防真菌成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，并被商品化應(yīng)用于大田。

自1984年最早由Morganjones等人從大豆孢囊線蟲孢囊上分離到生防真菌以來，人們對篩選出的SCN的生防真菌的分類和防效做了大量研究(Morganjones G,Rodriguezkabana R,Tovar J G.Fungi associated with cysts of Heteroder aglycinesin the Cauca Valley,Colombia[J].Nematropica,1984,14(2):173-177)。

Carris等描述了定殖于大豆孢囊線蟲孢囊上的80種真菌，美國也已報(bào)道近百種的食線蟲真菌(Carris L M,Glawe D A,Smyth C A,Edwards D I.Fungi associated with populations of Heteroderaglycinesin 2illinois soybean fields[J].Mycologia,1989,81(1):66-75)；而Chen等從孢囊上分離到了至少168種真菌(Chen F J,Chen S Y.Mycofloras in cysts,females,and eggs of the soybean cyst nematode in Minnesota[J].Applied Soil Ecology,2002,19(1):35-50)。

我國從不同地區(qū)的SCN的孢囊上分離到生防真菌共30個(gè)屬51種，其中以厚垣輪枝菌(V.chlamydosporium)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、淡紫擬青霉菌(P.lilacinus)等出現(xiàn)頻率最高(李進(jìn)榮,段玉璽,陳立杰,薛春生.大豆根瘤內(nèi)生細(xì)菌對大豆胞囊線蟲影響研究[J].大豆科學(xué),2005,24(2):154-156；林茂松.真菌寄生大豆孢囊線蟲的初步研究[J].生物防治通報(bào),1990,6(1):38-41；劉杏忠,劉文敏,張東升.定殖于大豆胞囊線蟲的淡紫擬青霉生物學(xué)特性研究[J].中國生物防治,1995,11(2):23-27)。隨著近幾年對植物寄生線蟲的生防真菌研究的不斷深入，有研究者將食線蟲真菌分為捕食線蟲真菌、內(nèi)寄生真菌、機(jī)會(huì)真菌和產(chǎn)毒真菌等(Barron G L.NematophagousHyphomycetes-new species of Harposporium[J].Antonie Van Leeuwenhoek Journal of Microbiology and Serology,1972,38(2):217-222)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種生防菌株HZ-9及其在防治大豆孢囊線蟲中的應(yīng)用，該生防菌株HZ-9能夠有效防治大豆孢囊線蟲病。

所述的生防菌株HZ-9，命名為鉤狀木霉菌(Trichoderma hamatum)HZ-9，保藏編號為CCTCC NO:M 2016207，保藏時(shí)間為2016年4月19日，保藏地址為：中國武漢市武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

該生防菌株HZ-9的生物學(xué)特征為：呈絨毛狀菌落，菌絲不發(fā)達(dá)，分生抱子梗透明，壁光滑，主軸直，頂端逐漸變細(xì)，分生孢子綠色，橢圓形，長×寬大小范圍大為3.5-4.9μm×2.6-3.4μm。

生防菌株HZ-9的ITS序列如SEQ ID NO.1所示；生防菌株HZ-9的eEF1a1序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明還提供了所述生防菌株HZ-9在防治農(nóng)作物孢囊線蟲中的應(yīng)用。

所述的農(nóng)作物為大豆。

具體地，所述大豆的品種為合豐55。

所述的應(yīng)用，包括：

(1)制備所述生防菌株HZ-9的生防菌劑；

(2)將所述的生防菌劑施用在所述的農(nóng)作物上。

所述生防菌劑為生防菌株的孢子懸浮液、孢子懸浮液的稀釋液或生防菌株的發(fā)酵液。

作為優(yōu)選，所述的生防菌劑中，所述生防菌株HZ-9的濃度為10⁶～10⁹CFU/mL。

具體地，以1升計(jì)，所述發(fā)酵液的液體培養(yǎng)基為玉米粉30g，葡萄糖20g，蒸餾水1000ml。

以1升計(jì)，所述孢子懸浮液的固體培養(yǎng)基為去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml。

所述發(fā)酵液制備過程中的發(fā)酵條件為：28℃，100rpm振蕩培養(yǎng)10d。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明的生防菌株HZ-9為鉤狀木霉菌，其孢子懸浮液對大豆孢囊線蟲病有較好的防治效果，當(dāng)孢子濃度達(dá)10⁹cfu/ml，孢囊抑制率達(dá)到87.5％以上。

(2)本發(fā)明的生防菌株HZ-9菌落與大豆孢囊線蟲接觸48h后，幼蟲即失去活性；生防菌株HZ-9的發(fā)酵液能夠抑制孢囊或雌蟲內(nèi)卵的孵化。

(3)本發(fā)明生防菌株HZ-9的孢子懸浮液和發(fā)酵液均能促進(jìn)大豆的生長。

附圖說明

圖1為菌株培養(yǎng)濾液對卵孵化的影響。

圖2為菌株HZ-9的形態(tài)圖；

A.菌落特征；B-D.分生孢子梗和分生孢子。

圖3為菌株HZ-9的ITS區(qū)和eEF1a1區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；

圖4為菌株HZ-9基于木霉屬ITS和eEF1a1合并序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，分支上數(shù)字表示大于50％的Bootstrap檢驗(yàn)值(1000次重復(fù))。

圖5為菌株孢子懸浮液對不同線蟲的校正死亡率(％)。

圖6為不同濃度的孢子懸浮液對大豆孢囊線蟲病的防治效果。

圖7為盆栽試驗(yàn)50d時(shí)，大豆孢囊線蟲在大豆根部的發(fā)育；

A，B：處理組；C，D：對照組。

圖8為菌株HZ-9不同濃度孢子懸浮液對大豆根鮮重和株高的影響。

圖9為溫度對菌株HZ-9的菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響。

圖10為光照對菌株HZ-9的菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響。

圖11為pH值對菌株HZ-9菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響。

圖12為碳源對菌株HZ-9的菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響。

圖13為氮源對菌株HZ-9的菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡釋。

實(shí)施例1 大豆孢囊線蟲生防真菌的分離與篩選

一、大豆孢囊線蟲孢囊、二齡幼蟲和卵懸液的獲得

大豆孢囊線蟲采自浙江省杭州市、山西省太谷縣和安徽省宿州市大豆孢囊線蟲危害嚴(yán)重的地塊。

1、獲取大豆孢囊線蟲孢囊

將采集到的大豆根和病土放入淘洗桶中，充分混合后，加入適量的水淘洗均勻，使土樣完全溶解，靜置約10-20秒后，把懸浮液倒入在雙層篩子上(上層為20目，下層為100目)，用強(qiáng)水流沖洗篩子。倒去上層20目網(wǎng)篩上的殘余物，用細(xì)水流把100目網(wǎng)篩上的沉積物中的泥沙沖去，剩余物用緩慢水流收集在一個(gè)干凈的燒杯中。在解剖鏡下用鑷子從中挑取新鮮飽滿的棕色孢囊，放入4℃冰箱備用。

將獲得的孢囊置于孵化池中，放在28℃生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵化，5天后將孵化池中的懸浮液通過500目篩，即可獲得較干凈的J2懸浮液。

2、獲取大豆孢囊線蟲二齡幼蟲和卵懸液

將上述收集好的孢囊置于一個(gè)直徑約3cm的小容器中，用玻璃棒底部將孢囊輕輕壓碎，然后倒在雙層目篩上(上層為100目，下層為500目)用強(qiáng)水流將卵和二齡幼蟲沖洗到下層篩子，收集下層篩子上的液體至50ml離心管中，并加入適量76％的現(xiàn)配的蔗糖溶液，2000rpm離心2min，然后將上層懸浮液倒在500目篩子上，用水流輕輕沖洗以除掉蔗糖即可獲得大豆孢囊線蟲卵的懸浮液，然后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?Acedo J R,Dropkin V H.Technique for obtaining eggs and juveniles of Heterodera glycines[J].Journal of Nematology,1982,14(3):418-420.)。

二、大豆孢囊線蟲生防真菌的分離

1、根際土壤中大豆孢囊線蟲寄生真菌的分離

每份土壤樣品稱取1g加入盛有99ml無菌水的三角瓶中置于搖床上200rpm，60min后，制備成土壤懸液，然后進(jìn)行10^-2、10^-4、10^-6和10^-8的梯度稀釋，每個(gè)稀釋度吸取200μl土壤懸液在無菌條件下采用涂布法接種于含有100mg/L氨芐和硫酸鏈霉素的PDA培養(yǎng)基上，涂布均勻后，將平板倒置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。每個(gè)稀釋度重復(fù)3次，待菌落長出后進(jìn)行分離純化(楊蕾,梁軍,周國英,倪楊,呂全,張星耀.土壤中楊樹潰瘍病生防菌的分離鑒定[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2015,51(4):116-124.)。

通過上述方法，得知當(dāng)土壤混合液稀釋至10^-6時(shí)，即可在PDA上發(fā)現(xiàn)單菌落，挑取新長出的新鮮菌絲轉(zhuǎn)移到新的PDA培養(yǎng)基上，進(jìn)行純化培養(yǎng)；共獲得30個(gè)菌分離物，經(jīng)保存后備用。

2、大豆孢囊線蟲孢囊上寄生真菌的分離

將上文收集到的孢囊用0.5％的次氯酸鈉消毒3min后，用無菌水沖洗三遍，在無菌培養(yǎng)皿底部墊上一張滅過菌的圓形定性濾紙，在濾紙上放置孢囊，封好皿蓋，并做好標(biāo)記，25℃下保濕培養(yǎng)3d。3d后，挑出表面長有菌絲的孢囊，放在含硫酸鏈霉素和氨芐霉素的PDA固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)。待長出菌落后，用挑針切取菌落邊緣的菌絲體轉(zhuǎn)至新的培養(yǎng)基平板中，25℃純化培養(yǎng)三次。通過上述方法，共篩選出34株真菌，經(jīng)純化培養(yǎng)后，保存?zhèn)溆谩?/p>

3、大豆孢囊線蟲二齡幼蟲和卵上寄生真菌的分離

將上文中收集到的二齡幼蟲和卵先用0.5％的次氯酸鈉消毒3min后，用無菌水清洗三 遍，制備二齡幼蟲和卵的懸浮液，然后進(jìn)行10倍，100倍，1000倍稀釋。分別取原懸浮液、10倍稀釋液、100倍稀釋液、1000倍稀釋液200μl均勻涂布在含硫酸鏈霉素和氨芐霉素的PDA固體平板上，3d后挑取單菌落的菌絲置于新的平板上，25℃純化培養(yǎng)三次。通過上述方法，共分離出81株真菌，經(jīng)純化培養(yǎng)后，保存?zhèn)溆谩?/p>

上述三種方法篩選出的真菌，如下表1所示。

表1 大豆孢囊線蟲寄生真菌的分離

4、生防真菌的保存

挑取純化后的菌株，置于含硫酸鏈霉素和氨芐霉素的PDA斜面上培養(yǎng)2周后放于4℃冰箱進(jìn)行短期保存；同時(shí)長期保存使用超低溫保存法，用1.5mL冷凍管滅菌后加入1mL冷凍保存液備用。從生長旺盛的菌落邊緣挑取約為0.5cm²的菌塊若干塊，直接放入冷凍保存管中。

加入菌塊的冷凍管先置于4℃冰箱預(yù)冷30min，再放入-20℃冰箱30-40min，再轉(zhuǎn)入-75℃冰箱保存?zhèn)溆?。冷凍保存液的配方如?1L)：15％甘油(v/v)，葡萄糖10g，酵母提取物1g，酪蛋白水解物1g，高壓滅菌后備用。

三、生防菌株的篩選(HZ-9來自大豆根際土壤)

1、菌株對大豆孢囊線蟲孢囊的寄生性

對挑取出的菌株，選取菌落形態(tài)不同的真菌，進(jìn)行大豆孢囊線蟲孢囊寄生性的鑒定，按上文的方法獲得孢囊，用0.5％NaClO表面消毒3min，用無菌水清洗三遍。

將純化后的菌株轉(zhuǎn)至PDA培養(yǎng)基上，待菌落直徑長至培養(yǎng)皿1/2-3/4時(shí)，將消毒后的孢囊放入PDA培養(yǎng)基上新鮮菌絲的邊緣，每皿放置10個(gè)孢囊，每個(gè)菌株設(shè)置三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。放置在25℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d，將孢囊輕輕挑出(注意不要弄破孢囊)，用0.5％NaClO表面消毒3min，無菌水清洗三遍，每個(gè)孢囊放于一個(gè)滅菌的濾紙片上，保濕培養(yǎng)5d。5d后觀察濾紙片上長菌的情況，記錄孢囊被寄生的情況。

從篩選出的145株真菌菌株中，選取菌落形態(tài)和孢子形態(tài)不一致的33株真菌進(jìn)行回接孢囊的實(shí)驗(yàn)，測定所篩選的菌株對孢囊的寄生性。

所選取的33株真菌中，大部分真菌菌株都能進(jìn)行回接孢囊，其中侵染率達(dá)到100％的菌株有7株，分別是：HZ-L9,TG-9,HZ-7,HZ-L21，TG-L37，TG-3和AH-8；侵染率大于90％的菌株有10株，分別為：HZ-3,HZ-4,HZ-5,HZ-L23,HZ-L26,TG-13,TG-17,AH-3,TG-1和HZ-9；侵染率大于80％的菌株有11株，分別為：HZ-L25,HZ-L18,HZ-L7,HZ-L5,AH-L16,TG-15,TG-L8,AH-L7,AH-L6,HZ-1和HZ-9；侵染率小于80％的有5株，分別為HZ-L4,AH-1, TG-L5，AH-L15和TG-6。

2、菌株對大豆孢囊線蟲二齡幼蟲毒性的初步測定

將純培養(yǎng)的菌株接種在含硫酸鏈霉素和氨芐霉素的PDA固體培養(yǎng)基平板上(90mm無菌培養(yǎng)皿)，25℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3d后，在菌落邊緣接入20μL二齡幼蟲懸浮液(約200條)，分別于24h，48h后顯微鏡下觀察被菌絲粘著和穿透及隨后被消化的情況，同時(shí)在不接菌的PDA培養(yǎng)基上也接入同樣多的線蟲作為對照，每個(gè)處理設(shè)置三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

對上述菌株進(jìn)行大豆孢囊線蟲二齡幼蟲致病性的初步篩選，結(jié)果顯示，進(jìn)行測定的33株菌株中，其中HZ-4,HZ-9,HZ-L9,TG-1，TG-15,TG-L37及AH-8菌株對大豆孢囊線蟲二齡幼蟲的活動(dòng)能力有影響，蟲體接觸菌絲后，線蟲行動(dòng)自由度降低；HZ-L9及HZ-9菌落與幼蟲接觸后，幼蟲在24h后即失去活性，48h以后被菌絲覆蓋；TG-1，TG-15及AH-8在菌絲接觸蟲體48h后線蟲蟲體才開始僵直，而其他菌株菌絲對大豆孢囊線蟲二齡幼蟲沒有毒殺作用，蟲體48h后仍能活動(dòng)自由。

3、菌株發(fā)酵液對孢囊或雌蟲內(nèi)卵孵化的影響

將菌株接種于盛有150ml玉米粉液體培養(yǎng)基的250ml的三角瓶中，28℃、100rpm振蕩培養(yǎng)10d，培養(yǎng)液經(jīng)滅菌的雙層擦鏡紙過濾除去菌絲團(tuán)，然后4℃12000rpm離心20min，上清液通過直徑0.22um的微孔濾膜，即得菌株發(fā)酵液，保存在4℃冰箱備用。

在24孔培養(yǎng)基中每孔加入1ml的菌株發(fā)酵液，另加入5個(gè)雌蟲，無菌水做對照，每個(gè)菌株的發(fā)酵液及對照均設(shè)6個(gè)重復(fù)，將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板放置在28℃生化培養(yǎng)箱中，稀釋0x、5x、10x、20x五個(gè)濃度梯度，每皿加入500μL，用無菌水做對照，重復(fù)三次，并用封口膜封嚴(yán)，防止水分蒸發(fā)和雜菌污染。置于25℃培養(yǎng)箱中10d。觀察記錄孵化出的線蟲數(shù)，計(jì)算孵化相對抑制率。

采用上述方法檢測菌株發(fā)酵液對大豆孢囊線蟲卵孵化的影響，首先分別用33株菌株的發(fā)酵液原液測定其對大豆孢囊線蟲卵孵化的影響，結(jié)果可知，菌株HZ-L9，HZ-9，HZ-L26，AH-1，AH-L6，TG-L5，TG-16對大豆孢囊線蟲孢囊或雌蟲內(nèi)卵的孵化有抑制作用，其中菌株HZ-L9和菌株HZ-9的發(fā)酵液原液基本不能使孢囊或雌蟲內(nèi)的卵孵化(圖1)。

通過對菌株HZ-L9和菌株HZ-9的發(fā)酵液原液進(jìn)行5x，10x，20x稀釋，以無菌水作對照，再次測定其稀釋液對卵孵化的影響，發(fā)現(xiàn)所獲取的兩株目的菌株的發(fā)酵液對大豆孢囊線蟲卵的孵化有一定的抑制作用(見表2和3)，并且各稀釋濃度的發(fā)酵液以及無菌水處理之間，對線蟲孵化影響差異顯著，其中發(fā)酵液原液處理，幾乎沒有線蟲孵化；20x稀釋時(shí)，兩菌株對孢囊或雌蟲內(nèi)卵的孵化抑制率分別達(dá)到47.75％和45.87％，顯示較好的抑制作用。

表2 HZ-L9發(fā)酵液不同稀釋倍數(shù)對大豆孢囊線蟲卵孵化的影響

注:不同大、小寫英文字母分別表示差異極顯著(P≤0.01)和差異顯著(P≤0.05)，字母相同者為差異不顯著。

表3 鉤狀木霉(HZ-9)發(fā)酵液不同稀釋倍數(shù)對大豆孢囊線蟲卵孵化的影響

注:不同大、小寫英文字母分別表示差異極顯著(P≤0.01)和差異顯著(P≤0.05)，字母相同者為差異不顯著。

實(shí)施例2 生防菌株的鑒定

一、形態(tài)鑒定

將保存于4℃PDA培養(yǎng)斜面中的菌株移入直徑90mm的PDA平板上，28℃生化培養(yǎng)箱中活化3-5d，用直徑14mm的打孔器在菌落邊緣切取菌塊，轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上，28℃生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，3次重復(fù)。逐日觀察記錄菌落形態(tài)、顏色及生長狀況。

待上述菌落培養(yǎng)3d后，用電子顯微鏡(LEICA DMI 3000B，德國徠卡)觀察菌絲、分生孢子梗、分生孢子等的形態(tài)特征，統(tǒng)計(jì)100個(gè)孢子的長、寬，計(jì)算其長寬比。根據(jù)木霉屬真菌菌落形態(tài)、孢子特征，對其進(jìn)行初步鑒定。

菌株HZ-9在PDA呈絨毛狀菌落，菌絲不發(fā)達(dá)，分生抱子梗透明，壁光滑，主軸直，頂端逐漸變細(xì)，分生孢子綠色，橢圓形，長×寬大小范圍大約3.5-4.9μm×2.6-3.4μm(圖2)。

二、分子生物學(xué)鑒定

1、DNA的提取方法

用解剖刀刮取PDA平板上25℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)了3d的菌絲，將其放置于含有石英砂的振蕩管中，每管加入800μl CTAB抽提液，用振蕩器震蕩90s，65℃水浴孵育1-2h，加入等體積的氯仿-異戊醇(24:1)混勻，10000rpm離心15min，取上清液(約750μl)轉(zhuǎn)入2ml離心管中，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇(25:24:1)混勻，12000rpm離心20min，取上清液(約450μl)至1.5ml離心管中，加入2/3體積的異丙醇混勻5min，12000rpm離心10min，棄上清，加入200μl 70％的乙醇清洗，12000rpm離心1-2min，倒光液體，晾干沉淀，加入30μl TE水懸浮溶解沉淀，即可獲得DNA。

2、ITS序列和eEF1a1片段的擴(kuò)增

以基因組DNA為模板，用真菌通用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增ITS區(qū)的片段以及引物tef71f和tef997R擴(kuò)增eEF1a1片段(Shoukoui E,Bissett J.Preferred primers for sequencing 50end of the translation elongation factor 1-alpha gene(EF1-a1)and subnit 2of the RNA ploymerase B gene(RPB2)ISTH available from:http://isth.info/methods,2008.)。

實(shí)驗(yàn)所用PCR擴(kuò)增試劑盒購自大連寶生物工程有限公司(Takara)。引物均由英濰捷基 (上海)貿(mào)易有限公司合成。

PCR擴(kuò)增采用50μl反應(yīng)體系，各試劑用量如下：

引物序列：

ITS1 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’

ITS4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

tef71f5’-CAAA ATG GGT AAG GAG GAS AAGAC-3’

tef997R5’-CA GTA CCG GCR GCR ATR ATS AG-3’

擴(kuò)增ITS區(qū)的反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，8℃永久保存。

擴(kuò)增eEF1a1片段采用‘touchdown’擴(kuò)增程序：首先94℃預(yù)變性4min，然后4個(gè)循環(huán)：94℃變性1min，70℃退火1min30s，72℃延伸1min30s；26個(gè)循環(huán)：94℃變性1min，68℃(每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)降低0.5℃)退火1min30s，72℃延伸1min30s；12個(gè)循環(huán)：94℃變性1min，55℃退火1min30s，72℃延伸1min30s；72℃延伸7min，8℃保存。

PCR程序完成后取2μl PCR產(chǎn)物加入3μl 6×Loding buffer混勻后，用1.0％的瓊脂糖凝膠電泳分離(120V，400mA，25min)。電泳后經(jīng)EB染色10-15min，在紫外檢測儀上觀察和拍照。

3、PCR產(chǎn)物的純化

選用浙江愛思進(jìn)生物技術(shù)公司(AxyGen)的AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收、純化。

4、純化產(chǎn)物的連接

PCR純化產(chǎn)物可直接與pUCM-T連接，采用10μl反應(yīng)體系，依次加入：

12000rpm離心10秒，置4℃連接過夜或16℃連接4小時(shí)。

5、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

(1)從-70℃冰箱中取100μl大腸桿菌DH 5α感受態(tài)，1min冰上解凍；

(2)向離心管中加入10μl的上述連接溶液，輕輕攪拌均勻，冰上放置20-30min；

(3)42℃水浴中熱擊90s，熱擊后迅速置于冰上冷卻5min；

(4)向管中加入1ml LB液體培養(yǎng)基(不含Amp)，混勻后37℃振蕩培養(yǎng)40min；

(5)1500rpm離心2min，去上清800μl，吹打混勻剩余液體，吸取200μl涂布于含Amp，X-gal和IPTG篩選平板上，正面向上放置半小時(shí)，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)16-24h。

6、重組質(zhì)粒的PCR鑒定

將菌液直接用于PCR鑒定，步驟如下：

(1)100ml LB液體培養(yǎng)基中加入100μl氨芐霉素(100mg/ml)

(2)用0.2μl無菌eppendorf管挑取白色單菌落接種到含有氨芐霉素的2ml LB培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)(37℃，180rpm)約12h；

(3)取2μl上清用于PCR鑒定(25μl反應(yīng)體系)。

7、DNA序列測定與分析

每個(gè)平板挑取3個(gè)陽性克隆送生工生物(上海)科技有限公司測序。測序結(jié)果用DNAstar進(jìn)行編輯，運(yùn)用木霉鑒定在線網(wǎng)站(http://www.isth.info)上的7Hc/70KEY和TWcABLAST對序列進(jìn)行比對分析。

菌株HZ-9的rDNA–ITS(SEQ ID NO.1)和eEF1a1片段(SEQ ID NO.2)經(jīng)PCR克隆、測序，結(jié)果如圖3，菌株HZ-9的rDNA–ITS(SEQ)和eEF1a1片段大小分別為600bp和760bp，運(yùn)用木霉菌鑒定在線網(wǎng)站(http://www.isth.info)上的7Hc/70KEY和TWcABLAST對序列進(jìn)行比對分析可知，菌株HZ-9的兩個(gè)片段均與Trichoderma hamatum有高度同源性。

三、系統(tǒng)發(fā)育分析

將由DNAStar軟件編輯后的序列在GenBank中進(jìn)行Blast比對，根據(jù)序列同源性下載相關(guān)序列。下載的序列用Mega 6.0軟件Clustal W程序進(jìn)行多序列聯(lián)配，對聯(lián)配結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，以鄰接法(N-J)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，用Bootstrap對系統(tǒng)樹進(jìn)行檢驗(yàn)，1000次重復(fù)。

選擇GenBank中Trichoderma屬已公布的種的ITS序列和eEF1a1序列(見表4)，用Mega 6.0軟件對rDNA–ITS和eEF1a1片段合并后序列進(jìn)行聚類分析，并分別以鉤狀木霉Trichoderma hamatum、里氏木霉Hypocrea lixii作為外群，經(jīng)Clustal W匹配排列后，用Mega6.0軟件N–J法分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從圖4可知菌株HZ-9與Trichoderma hamatum在同一分支，親緣關(guān)系最近。

表4 用于多基因序列分析的木霉屬菌株

綜上所述，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，將菌株HZ-9鑒定為鉤狀木霉(T.hamatum)。

將上述菌株HZ-9進(jìn)行菌種保藏，該生防菌株命名為鉤狀木霉菌(Trichoderma hamatum)HZ-9，保藏編號為CCTCC NO:M 2016207，保藏時(shí)間為2016年4月19日，保藏地址為：中國武漢市武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

實(shí)施例3 生防菌株孢子懸浮液對不同線蟲的毒殺作用

南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)二齡幼蟲(juvenile 2)為長期在番茄上純培養(yǎng)獲得，挑取番茄根部南方根結(jié)線蟲的卵囊置于孵化器中進(jìn)行孵化，兩天后即可獲得大量干凈的 南方根結(jié)線蟲(J2)懸浮液，然后配成每10ul含100條J2的懸浮液4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

甘薯莖線蟲(Ditylenchus destructor)、松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)、水稻干尖線蟲(Aphelenchoides bessyi)均為長期培養(yǎng)在灰葡萄菌上的半寄生性線蟲，將線蟲接種在長滿灰葡萄菌的PDA培養(yǎng)基上，一個(gè)月后，向皿中加入5ml無菌水即可獲得干凈的線蟲濾液，然后配成每10μl含100條J2的線蟲懸浮液4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1、菌株孢子懸浮液的制備及計(jì)數(shù)

從保存菌株的斜面上用滅菌的挑針挑取菌絲接種到含有硫酸鏈霉素和氨芐霉素的PDA平板中央，置于28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周后，加入6ml滅菌水到PDA平板表面，用滅過菌的三角棒刮取菌株的菌絲和孢子，所獲得的懸浮液通過滅過菌的雙層紗布過濾除去菌絲即得干凈的孢子懸浮液。

用型號為XB-K-25的血球計(jì)數(shù)板對孢子懸浮液進(jìn)行計(jì)數(shù)，將孢子懸浮液充分混勻，根據(jù)實(shí)際情況稀釋10倍到100倍或不稀釋，首先將混勻后的孢子懸浮液用滴管滴在中央平臺(tái)上，蓋上蓋玻片，在低倍鏡下找到方格網(wǎng)后，轉(zhuǎn)換至高倍鏡下進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)，通常檢查5個(gè)中格內(nèi)的孢子數(shù)，5個(gè)中格分別在四個(gè)角上和中央，計(jì)數(shù)的方格多分布在不同的方位上，可以避免孢子在各個(gè)方位上分布不均所造成的誤差。計(jì)數(shù)后，用無菌水調(diào)至所需濃度放于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2、生防菌株孢子懸浮液(濃度為10⁸/ml)對線蟲毒殺作用的測定

將大豆孢囊線蟲二齡幼蟲的懸浮液配成每10μl含100條J2的懸浮液，用無菌的24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿，加入500μl事先準(zhǔn)備好的孢子懸浮液，以無菌水做對照，每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每孔中加入10μl配置好的J2懸浮液或者其他供試線蟲懸浮液，48h后觀察并計(jì)算擊倒率。

菌株HZ-9對供試的幾種植物病原線蟲均具有一定的活性，其對大豆孢囊線蟲校正死亡率達(dá)到83.3％；對松材線蟲校正死亡率達(dá)到85.6％；對甘薯莖線蟲和南方根結(jié)線蟲的毒殺作用相對較差，校正死亡率分別為64.0％和58.3％(圖5)。

實(shí)施例4 生防菌株的盆栽防效試驗(yàn)及其生物學(xué)特性

一、實(shí)驗(yàn)材料

(1)菌株：HZ-9；

(2)供試大豆品種：大豆孢囊線蟲感病品種合豐55；

(3)供試大豆孢囊線蟲：采自安徽省宿州市大豆孢囊線蟲危害嚴(yán)重的地塊，經(jīng)多年純培養(yǎng)獲得；

(4)半乳糖、可溶性淀粉、蔗糖、甘露糖、果糖、麥芽糖、葡萄糖、山梨醇、蔗糖；氯化銨、谷氨酰胺、胰蛋白胨、牛肉浸膏、硝酸鈉、酵母膏、脯氨酸、甘氨酸、硫酸銨購買于生工生物(上海)科技有限公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

制備生防菌株HZ-9的孢子懸浮液(方法同實(shí)施例2)，用無菌水分別把菌株的孢子懸浮液稀釋成10⁹cfu/ml、10⁸cfu/ml、10⁶cfu/ml、10⁴cfu/ml、10²cfu/ml的不同梯度。

大豆種子放入0.5％次氯酸鈉溶液中，用玻璃棒攪拌4min，然后用無菌水徹底沖洗3次后，將大豆在無菌水中浸泡1h以去除殘留的次氯酸鈉，然后置于放有一層無菌濾紙的大培養(yǎng)皿中(直徑15cm)，大豆上再覆蓋一張浸濕無菌濾紙，蓋好培養(yǎng)皿后置于25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。

期間每天用無菌水沖洗大豆并注意保濕培養(yǎng)，培養(yǎng)箱中溫度設(shè)置在25℃，16h光照，8h黑暗處理，濕度60％，光照100％。5天后，當(dāng)根大約4-5cm長時(shí)，挑選長勢一致的幼芽移栽到盛有350cm³無菌細(xì)沙的塑料杯中(直徑12cm)，然后將所有的塑料杯都放入塑料箱中(550×350×90mm)培養(yǎng)。

待幼苗長出3天后，每個(gè)杯中接入15ml所設(shè)定的不同濃度的孢子懸浮液。接種菌懸液2d后接種線蟲，每株接種1500個(gè)卵。用直徑0.5cm的玻璃棒在大豆根部周圍土壤打3-4個(gè)3cm深的小洞。將配制好的含1500個(gè)卵的線蟲懸浮液4ml注入小洞中，并用沙子封上。每個(gè)菌懸液濃度處理重復(fù)4次，以無菌水代替菌懸液作對照處理。

接種線蟲后，每隔7天澆一次設(shè)定濃度的孢子懸浮液(10⁹cfu/ml、10⁸cfu/ml、10⁶cfu/ml、10⁴cfu/ml、10²cfu/ml)或發(fā)酵液原液。50天后計(jì)數(shù)大豆根部和土壤中雌蟲數(shù)量以及根上線蟲數(shù)，計(jì)算孢囊抑制率。

接種線蟲50d后，采用次氯酸鈉-酸性品紅染色方法，對大豆根部線蟲進(jìn)行染色。將洗凈的病根放入150ml的小燒杯中，在燒杯中加入50ml蒸餾水，并加入適量5.25％的次氯酸鈉(次氯酸鈉的用量取決于根組織的幼嫩程度)，用玻璃棒不斷攪拌4min后取出根，用水流沖洗45s，將根組織浸泡在蒸餾水中15min，以徹底去除次氯酸鈉，倒去蒸餾水，將根組織放在盛有30-50ml蒸餾水的燒杯中，并加入1ml的酸性品紅溶液，微波爐中煮沸30s，冷卻后，用蒸餾水漂洗根組織，將根組織放入20-30ml酸性甘油(在純甘油中滴加2-3滴5mol/L的鹽酸)中煮沸使根組織褪色(注意不要煮沸過度，否則根組織易變黃)，待冷卻后，取出根組織在體視顯微鏡下觀察。

待大豆苗生長50d后，調(diào)查大豆根部的孢囊數(shù)量，并計(jì)算不同處理對大豆孢囊線蟲的抑制率：孢囊抑制率(％)＝(對照組孢囊數(shù)量－處理組孢囊數(shù)量)/對照組孢囊數(shù)量×100％。

大豆根部孢囊數(shù)量的調(diào)查結(jié)束后，測量全部植株的株高和根鮮重。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SAS軟件和Excel 2013軟件統(tǒng)計(jì)，并采用單因素方差分析(One Way ANOVA)進(jìn)行差異顯著性分析。

1、溫度對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

采用菌碟接種法，即用直徑為14mm的打孔器，從培養(yǎng)了3d的PDA平板上的菌落邊緣打出菌碟，將菌碟接種于新的PDA平板上，分別置于15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、35℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每個(gè)溫度為1個(gè)處理，每個(gè)處理4次重復(fù)，培養(yǎng)2d后觀察菌落生長狀況，十字交叉法測量菌落直徑，并于5d后檢查其產(chǎn)孢量。

2、光照對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

打取菌碟后，接種于PDA平板上，28℃下分別置于24h光、12h光12h暗、24h暗下培養(yǎng)，每種光照條件為1個(gè)處理，每個(gè)處理4次重復(fù)。培養(yǎng)2d后觀察菌落生長狀況，十字交叉法測量菌落直徑，并于5d后檢查其產(chǎn)孢量。

3、pH對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

將高壓滅菌后的PDA培養(yǎng)基在超凈工作臺(tái)中，用l mol·L^-1的HCl和lmol·L^-1的NaOH配置pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的PDA培養(yǎng)基，制成90mm的平板，打取菌碟放在平板中央，每個(gè)pH值為1個(gè)處理，每個(gè)處理4次重復(fù)。培養(yǎng)2d后觀察菌落生長狀況，十字交叉法測量菌落直徑，5d后檢查其產(chǎn)孢量。

4、不同碳源對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

以查氏培養(yǎng)基(NaNO₃ 2.00g，K₂HPO₄ 1.00g，KCl 0.50g，MgSO₄·7H₂O 0.50g，F(xiàn)eSO₄0.01g，蔗糖30.00g，加水定容至1000ml)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。以NaNO₃為氮源，測定半乳糖、可溶性淀粉、甘露醇、果糖、麥芽糖、葡萄糖、山梨醇、蔗糖對菌株生長的影響，以無碳源查氏培養(yǎng)基為對照，每個(gè)處理4次重復(fù)。培養(yǎng)2d后觀察菌落生長狀況，十字交叉法測量菌落直徑，5d后檢查其產(chǎn)孢量。

5、不同氮源對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。以蔗糖為碳源，測定甘氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、酵母膏、硫酸銨、牛肉浸膏、胰蛋白胨、氯化銨、硝酸鉀對菌株生長的影響，以無氮源查氏培養(yǎng)基為對照，每個(gè)處理4次重復(fù)。培養(yǎng)2d后觀察菌落生長狀況，十字交叉法測量菌落直徑，5d后檢查其產(chǎn)孢量。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、生防菌株孢子懸浮液或發(fā)酵液原液對大豆孢囊線蟲病的防治效果

在盆栽大豆苗根部土壤中施用不同濃度的孢子懸浮液50d后，統(tǒng)計(jì)大豆根部和土壤中的白雌蟲和孢囊數(shù)量，計(jì)算目的生防真菌對大豆孢囊線蟲引起的大豆孢囊線蟲病的孢囊抑制率；通過酸性品紅染色法統(tǒng)計(jì)大豆根部不同齡期的線蟲數(shù)，觀察處理組與對照組根部線蟲減少情況。

圖6為生防真菌鉤狀木霉(HZ-9)對大豆孢囊線蟲病防治效果的評估。

與對照相比，鉤狀木霉(HZ-9)孢子懸浮液濃度在10⁶-10⁹時(shí)，防治效果較好，且孢囊抑制率最高達(dá)到87.5％。

圖7為盆栽試驗(yàn)50d后，孢子懸浮液處理與用無菌水處理的大豆孢囊線蟲侵染的大豆根部線蟲侵染狀況，，與對照相比，根上線蟲最高減少96％，說明所篩選出的生防菌株的孢子懸浮液在盆栽試驗(yàn)中對大豆孢囊線蟲具有抑制作用。

2、生防菌株不同濃度孢子懸浮液對大豆株高和根鮮重的影響

對50d后大豆的根鮮重和大豆株高進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，來衡量目的生防真菌對大豆長勢的影響。

鉤狀木霉(HZ-9)不同濃度孢子懸浮液對感染了大豆孢囊線蟲病的大豆根鮮重和株高的 影響結(jié)果(圖8)。

施用鉤狀木霉孢子懸浮液處理組與對照組相比，大豆植株的根鮮重和植株高度會(huì)有不同程度的增加。

總之，生防菌株在盆栽試驗(yàn)中對大豆孢囊線蟲的孢囊和二齡幼蟲均有抑制作用，且對大豆的生長有一定的促進(jìn)作用。

3、生防菌株HZ-9發(fā)酵液對大豆孢囊線蟲病的防治效果以及對大豆株高和根鮮重的影響如表5所示，菌株HZ-9的發(fā)酵液對大豆孢囊線蟲病有較好的防治效果，將發(fā)酵液原液施用于大豆盆栽試驗(yàn)中，孢囊抑制率最高達(dá)到88.9％，根上線蟲數(shù)量與對照相比最高減少75％，同時(shí)，與對照相比，大豆的株高有一定的增加，處理組根鮮重與對照組相當(dāng)。

表5 生防菌株HZ-9發(fā)酵液對大豆孢囊線蟲病的防治效果以及對大豆株高和根鮮重的影響

4、溫度對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

溫度對鉤狀木霉HZ-9菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響，如圖9所示。

溫度對菌株HZ-9的生長影響有一定的差異，其中，菌株HZ-9在溫度為35℃時(shí)不生長，在溫度為25-28℃時(shí)生長最好，但在溫度為15℃和35℃時(shí)均不產(chǎn)孢，溫度為28℃時(shí)產(chǎn)孢量最大。

5、光照對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

圖10為光照條件對鉤狀木霉HZ-9菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響。

光照條件對鉤狀木霉菌絲生長的影響不大，但對產(chǎn)孢量有一定影響，24h全光照時(shí)，產(chǎn)孢量最大，達(dá)到2.4×10⁹個(gè)，而光照和黑暗交替培養(yǎng)時(shí)，最不利于鉤狀木霉產(chǎn)孢。

6、pH值對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

圖11為不同pH值對鉤狀木霉HZ-9菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響。

鉤狀木霉在pH值為6時(shí)，生長和繁殖達(dá)到最佳，但鉤狀木霉的產(chǎn)孢對堿性環(huán)境較為敏感，在pH值為11.0時(shí)基本上不產(chǎn)孢。

7、碳源對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

圖12為碳源對鉤狀木霉HZ-9的菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響。

8種碳源與無碳對照相比菌絲生長和產(chǎn)孢量均有一定的差異，不同碳源對菌絲生長只存在很小的差異，鉤狀木霉在以可溶性淀粉作為碳源的培養(yǎng)基上生長最快，同時(shí)在以半乳糖為碳源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大，達(dá)到4.8×10⁸個(gè)。

8、氮源對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

圖13為氮源對鉤狀木霉(HZ-9)菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響。鉤狀木霉在以酵母膏為氮源的培養(yǎng)基上生長和繁殖最好，5d時(shí)其產(chǎn)孢量最高能達(dá)到0.4×10⁸個(gè)。