專利名稱：表達(dá)熱休克蛋白的溶瘤微生物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地講，本發(fā)明涉及腫瘤疫苗領(lǐng)域。本發(fā)明具體涉及可選擇性地在腫瘤細(xì)胞中生長的微生物、含有所述該微生物的藥物或藥物組合物，以及使用該微生物殺死局部的及轉(zhuǎn)移的腫瘤的方法。
背景技術(shù)：
目前，治療腫瘤最常用的還是傳統(tǒng)的腫瘤手術(shù)切除和放化療療法，它給患者帶來很大的痛苦和負(fù)擔(dān)。而且，對(duì)轉(zhuǎn)移性腫瘤患者而言，一方面很難將腫瘤徹底手術(shù)切除或通過放化療療法徹底殺滅；另一方面，切除原位腫塊，往往有引發(fā)腫瘤在身體其它部位生長的風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果反而加速了腫瘤的擴(kuò)散。
通過改變遺傳特性，人們創(chuàng)建了一些能夠選擇性地感染腫瘤細(xì)胞的病毒，例如單純皰疹病毒(HSV-1)，腺病毒(ONYX-015)，新城疫病毒(NDV)，水泡性口炎病毒(VSV)1-3。雖然這其中的某些病毒具備很強(qiáng)的抗腫瘤活性，在臨床試驗(yàn)中能夠使腫瘤體積變小甚至完全消除3，但存在的問題是對(duì)于轉(zhuǎn)移性腫瘤的抑制作用不強(qiáng)。原因在于雖然這種病毒通過裂解腫瘤細(xì)胞來使腫瘤消退，但實(shí)體瘤的病人體內(nèi)缺乏腫瘤特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)4。缺乏免疫反應(yīng)的原因可能是大部分腫瘤抗原是在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，而并不是釋放出來，發(fā)生壞死而釋放腫瘤抗原的腫瘤細(xì)胞數(shù)量也很有限，抗原提呈細(xì)胞吸納腫瘤抗原的幾率極小。即使在病毒介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞裂解后通過增強(qiáng)腫瘤抗原的釋放，呈遞“危險(xiǎn)信號(hào)”，來激發(fā)機(jī)體腫瘤特異性免疫反應(yīng)，但由于只有很少的一部分腫瘤抗原能夠被提呈，激發(fā)的免疫反應(yīng)也非常有限，仍然需要特殊的機(jī)制來進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤的免疫反應(yīng)。
用癌癥疫苗進(jìn)行腫瘤免疫治療的策略主要是將被殺死的腫瘤細(xì)胞或其裂解產(chǎn)物同時(shí)與佐劑或細(xì)胞因子共同使用。癌癥疫苗免疫能通過在腫瘤原位進(jìn)行接種從而激發(fā)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，這在腫瘤治療研究中將是一個(gè)重大的進(jìn)展。但是，在很多情況下，腫瘤抗原是弱免疫原，也即不能夠引起機(jī)體足夠的針對(duì)腫瘤抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)。現(xiàn)階段利用癌癥疫苗治療腫瘤的方式主要為用分離的腫瘤特異性抗原進(jìn)行免疫；或通過體外將腫瘤細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞融合后對(duì)病人進(jìn)行細(xì)胞治療。但是，因?yàn)椴煌∪舜嬖谥[瘤抗原的個(gè)體差異性；而且同一病人在腫瘤發(fā)展的不同階段，腫瘤細(xì)胞所表達(dá)的特異性抗原也不相同；即使在同一病人的腫瘤的某一發(fā)展時(shí)期，其腫瘤細(xì)胞內(nèi)也存在著多種腫瘤抗原。由于這種種限制，導(dǎo)致現(xiàn)階段用癌癥疫苗治療腫瘤存在著許多缺點(diǎn)必須針對(duì)每個(gè)病人設(shè)計(jì)相應(yīng)的腫瘤抗原，技術(shù)操作細(xì)節(jié)各不相同，操作環(huán)節(jié)多，每個(gè)環(huán)節(jié)的技術(shù)要求高，操作中容易造成污染；而且由于病人體內(nèi)多種抗原的動(dòng)態(tài)發(fā)展，使得這種體外操作技術(shù)不一定有效。在臨床治療實(shí)踐中，必須針對(duì)每個(gè)病人制備獨(dú)特的癌癥疫苗，難度大，費(fèi)用高，可行性差。
綜上所述，傳統(tǒng)的手術(shù)治療和放化療對(duì)機(jī)體本身造成傷害而且難以消除轉(zhuǎn)移性腫瘤?，F(xiàn)階段用病毒等作為載體對(duì)腫瘤進(jìn)行基因治療也只能針對(duì)局部腫瘤，對(duì)轉(zhuǎn)移性腫瘤也無能為力。用白介素，干擾素等細(xì)胞因子對(duì)腫瘤進(jìn)行免疫治療只能激發(fā)免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)和很少的CTL細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷效應(yīng)。最近發(fā)展的“癌癥疫苗”療法非常昂貴且沒有普遍適用性。因此，到目前為止，還缺乏一種高效低毒、給藥方便的腫瘤治療物質(zhì)，該物質(zhì)在被施用給腫瘤患者后能在體內(nèi)誘導(dǎo)出有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而將腫瘤，包括轉(zhuǎn)移性腫瘤有效的殺滅。
發(fā)明概述本發(fā)明總的目的在于找到一種能在腫瘤患者體內(nèi)誘導(dǎo)特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)的物質(zhì)，并將該物質(zhì)對(duì)腫瘤患者施用，從而不但將局部的腫瘤殺滅而且還可以將轉(zhuǎn)移的腫瘤殺滅。具體來講，本發(fā)明包括如下幾個(gè)方面本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種溶瘤微生物，其中該微生物表達(dá)能粘附腫瘤細(xì)胞抗原并被抗原提呈細(xì)胞所識(shí)別的蛋白，并且該微生物能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中生長以裂解腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明的再一目的在于提供一種治療腫瘤的藥物，其含有本發(fā)明的溶瘤微生物，其中該微生物表達(dá)能粘附腫瘤細(xì)胞抗原并被抗原提呈細(xì)胞所識(shí)別的蛋白，并且該微生物能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中生長以裂解腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種藥物組合物，其含有a)能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中生長的微生物；和b)能粘附腫瘤細(xì)胞抗原的并被抗原提呈細(xì)胞所識(shí)別的蛋白。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種治療腫瘤、特別是惡性腫瘤的方法，該方法包括給腫瘤患者施用免疫有效量的本發(fā)明的藥物或藥物組合物。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了提供一種溶瘤微生物，其中該微生物表達(dá)能粘附腫瘤細(xì)胞抗原并被抗原提呈細(xì)胞所識(shí)別的蛋白，而且該微生物能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中生長以裂解腫瘤細(xì)胞。所述的能粘附腫瘤細(xì)胞抗原并被抗原提呈細(xì)胞所識(shí)別的蛋白優(yōu)選是熱休克蛋白。該微生物能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中生長，從而將腫瘤細(xì)胞殺死。所述的熱休克蛋白能粘附腫瘤細(xì)胞溶解所釋放的腫瘤抗原并與抗原提呈細(xì)胞結(jié)合，從而誘導(dǎo)患者的抗腫瘤免疫反應(yīng)。所述微生物優(yōu)選為選擇性地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制的病毒或細(xì)菌。所述病毒實(shí)例是腺病毒、單純皰疹病毒、水泡性口炎病毒、新城疫病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒或其他能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中生長的病毒。所述細(xì)菌的實(shí)例包括傷寒沙門氏菌、雙岐桿菌、志賀氏菌、李斯特菌和鼠疫桿菌以及其他能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中生長的細(xì)菌。所述的熱休克蛋白來源于哺乳動(dòng)物(包括但不限于人、非人靈長類動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物)和病原微生物，所述的病原微生物包括但不限于結(jié)核分支桿菌、麻風(fēng)分支桿菌、克氏椎蟲和惡性瘧原蟲。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種治療腫瘤的藥物，其含有本發(fā)明的溶瘤微生物，該微生物表達(dá)能粘附腫瘤細(xì)胞抗原并被抗原提呈細(xì)胞所識(shí)別的蛋白。該微生物可進(jìn)一步含有編碼免疫增強(qiáng)分子的DNA序列。所述的藥物可進(jìn)一步含有可藥用載體。該發(fā)明的藥物可以單獨(dú)使用，也可以和其它形式的免疫治療劑聯(lián)合使用，包括細(xì)胞因子和傳統(tǒng)中藥。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其含有a)能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中生長的微生物；和b)能粘附腫瘤細(xì)胞抗原并被抗原提呈細(xì)胞所識(shí)別的蛋白。所述微生物優(yōu)選為選擇性地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制的病毒或細(xì)菌。該病毒或細(xì)菌還優(yōu)選進(jìn)一步含有編碼免疫增強(qiáng)分子的DNA序列。所述病毒的實(shí)例是腺病毒、單純皰疹病毒、水泡性口炎病毒、新城疫病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒或其他能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中生長的病毒。所述細(xì)菌的實(shí)例包括傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、李斯特菌和鼠疫桿菌以及其他能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中生長的細(xì)菌。所述的能粘附腫瘤細(xì)胞抗原并被抗原提呈細(xì)胞所識(shí)別的蛋白例如是來源于哺乳動(dòng)物(包括但不限于人、非人靈長類動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物)和病原微生物的熱休克蛋白。所述的病原微生物包括但不限于結(jié)核分支桿菌、麻風(fēng)分支桿菌、克氏椎蟲和惡性瘧原蟲。該熱休克蛋白能粘附腫瘤細(xì)胞溶解所釋放的腫瘤抗原并與抗原提呈細(xì)胞結(jié)合，從而誘導(dǎo)患者的抗腫瘤免疫反應(yīng)。本發(fā)明的藥物組合物還可進(jìn)一步含有可藥用的載體。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種治療腫瘤、特別是惡性腫瘤的方法，該方法包括給腫瘤患者施用免疫有效量的本發(fā)明的藥物或藥物組合物?？商娲?，也可對(duì)腫瘤患者施用抗原提呈細(xì)胞，其中所述的細(xì)胞已與粘附有腫瘤抗原的并對(duì)抗原提呈細(xì)胞具有親和性的蛋白接觸。所述的粘附有腫瘤抗原的并對(duì)抗原提呈細(xì)胞具有親和性的蛋白優(yōu)選為熱休克蛋白。該接觸可通過兩種途徑實(shí)現(xiàn)其一是使本發(fā)明的表達(dá)熱休克蛋白的能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中生長的微生物感染腫瘤細(xì)胞，然后將細(xì)胞裂解液與抗原提呈細(xì)胞接觸；其二是將熱休克蛋白和能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中生長的微生物同時(shí)注射到腫瘤中，然后分離、提取結(jié)合有熱休克蛋白的抗原提呈細(xì)胞。
本發(fā)明通過溶瘤微生物將腫瘤細(xì)胞裂解，同時(shí)溶瘤病毒所表達(dá)的熱休克蛋白對(duì)釋放的腫瘤抗原進(jìn)行吸附，并隨后由樹突狀細(xì)胞將腫瘤抗原加工提呈，來激發(fā)機(jī)體本身的腫瘤特異性免疫反應(yīng)；不但能夠溶解局部腫瘤，還可以進(jìn)一步抑制并殺滅轉(zhuǎn)移腫瘤。與單獨(dú)用溶瘤病毒進(jìn)行腫瘤治療相比，本發(fā)明突破原有技術(shù)只能治療局部腫瘤的局限性，不但能夠治療局部腫瘤，對(duì)轉(zhuǎn)移腫瘤同樣有效。
本發(fā)明中溶瘤微生物所表達(dá)的能粘附腫瘤細(xì)胞抗原的蛋白，能夠?qū)⒒颊咦陨砟[瘤細(xì)胞裂解后釋放的腫瘤特異性抗原實(shí)時(shí)提呈，并且不論腫瘤細(xì)胞所處的發(fā)展階段以及腫瘤抗原的種類是否相同，都能激發(fā)機(jī)體針對(duì)自身特定的腫瘤抗原有效的免疫反應(yīng)。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了在不同個(gè)體內(nèi)利用個(gè)體自身的抗原提呈細(xì)胞在體內(nèi)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的將其自身特異性的腫瘤抗原進(jìn)行加工和提呈，從而激發(fā)針對(duì)各自不同腫瘤抗原的特異性免疫反應(yīng)，達(dá)到了既簡單又有效的治療效果。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的由于腫瘤抗原的個(gè)體差異性，用“癌癥疫苗”進(jìn)行治療的主要缺陷例如，必須在得到病人自體的腫瘤細(xì)胞，并在體外進(jìn)行培養(yǎng)及一系列的實(shí)驗(yàn)操作，以及隨后的疫苗接種等種種缺陷。舉例來說，本發(fā)明通過溶瘤微生物將腫瘤細(xì)胞裂解，同時(shí)由溶瘤微生物所表達(dá)的對(duì)抗原提呈細(xì)胞具有親和性的蛋白或獨(dú)立地加入的對(duì)抗原提呈細(xì)胞具有親和性的蛋白對(duì)釋放的腫瘤抗原進(jìn)行吸附，并隨后由抗原提呈細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞將腫瘤抗原加工提呈，來激發(fā)機(jī)體本身的腫瘤特異性免疫反應(yīng)；不但能夠溶解局部腫瘤，還可以進(jìn)一步抑制并殺滅轉(zhuǎn)移腫瘤。
附圖簡述

圖1是本發(fā)明所構(gòu)建的表達(dá)熱休克蛋白的重組HSV-1病毒質(zhì)粒pHSV-HSP的圖。質(zhì)粒pHSV-HSP含有CMV啟動(dòng)子控制下的HSP70基因和SV40多聚腺苷酸序列(SV40poly(A))。該質(zhì)粒還包括選擇標(biāo)記、E.coli的復(fù)制起點(diǎn)(ColEl ori)、HSV順式調(diào)控序列，HSVψ(HSV切割和包裝信號(hào))和HSV ori(HSV的DNA復(fù)制起點(diǎn))。
圖2是顯示重組病毒HSV-HSP的體外細(xì)胞毒性效果的圖。其中將鼠腫瘤細(xì)胞CT26培養(yǎng)于24孔板(每孔1×105)并由HSV-HSP或HSV以不同的感染復(fù)數(shù)(0.01-10)感染。感染4天后用Promega試劑盒測(cè)定細(xì)胞毒性(％)。圖2中當(dāng)感染復(fù)數(shù)為1時(shí)，細(xì)胞毒性已達(dá)99％以上。
圖3表示重組的HSV-HSP在原位腫瘤內(nèi)注射后能抑制遠(yuǎn)端腫瘤的良好能力。在小鼠的肋部雙側(cè)對(duì)稱接種CT26細(xì)胞。當(dāng)腫瘤分別長到最大直徑為0.5cm時(shí)，僅在鼠的右側(cè)腫瘤瘤內(nèi)注射接種HSV-HSP(1×106)(以實(shí)心方塊表示)、HSV載體(1×106)(以實(shí)心菱形表示)或HSP70(以實(shí)心三角表示)作為對(duì)照(該日設(shè)為第0日)，過7天再進(jìn)行第二次接種(每組6只)。與對(duì)照組相比，經(jīng)瘤內(nèi)注射接種HSV-HSP的腫瘤和其對(duì)側(cè)未被接種的腫瘤在注入HSV-HSP后都會(huì)有顯著的癌癥生長減慢(p＜0.001，感染后25天，非配對(duì)的t檢驗(yàn))。HSV-HSP在抑制兩側(cè)的腫瘤生長顯著優(yōu)于HSV單獨(dú)使用(p＜0.001，感染后25天，非配對(duì)t檢驗(yàn))圖4是本發(fā)明所構(gòu)建的表達(dá)熱休克蛋白的重組pcDNA-HSP質(zhì)粒圖。將PCR擴(kuò)增得到的HSP基因通過平端連接連到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1上，重組質(zhì)粒pcDNA-HSP含有CMV啟動(dòng)子控制下的HSP70基因和BGH多聚腺苷酸序列(BGHpolyA)，該質(zhì)粒還包括選擇標(biāo)記以及復(fù)制起點(diǎn)SV40ori.。
圖5表示表達(dá)熱休克蛋白的沙門氏菌SL3261(pcDNA-HSP)在原位腫瘤內(nèi)注射后能抑制遠(yuǎn)端腫瘤的良好能力。在小鼠的肋部雙側(cè)對(duì)稱接種SMMC7721細(xì)胞。當(dāng)腫瘤分別長到最大直徑為0.5cm時(shí)，僅在鼠的右側(cè)腫瘤瘤內(nèi)注射接種含有質(zhì)粒pcDNA-HSP的沙門氏菌(aroA-)(1×107)(以實(shí)心方塊表示)、不含質(zhì)粒的沙門氏菌(aroA-)(1×107)(以實(shí)心菱形表示)或HSP70(以實(shí)心三角表示)作為對(duì)照(該日設(shè)為第0日)，過7天再進(jìn)行第二次接種(每組6只)。與對(duì)照組相比，在注入pcDNA-HSP的沙門氏菌(aroA-)后經(jīng)瘤內(nèi)注射接種含有質(zhì)粒pcDNA-HSP的沙門氏菌(aroA-)的腫瘤和其對(duì)側(cè)未被接種的腫瘤都會(huì)有顯著的癌癥生長減慢(p＜0.001，感染后25天，非配對(duì)的t檢驗(yàn))。HSV-HSP在抑制兩側(cè)的腫瘤生長顯著優(yōu)于HSV單獨(dú)使用(p＜0.001，感染后25天，非配對(duì)t檢驗(yàn))。
發(fā)明詳述在本專利申請(qǐng)的上下文中，采用的術(shù)語具有本領(lǐng)域中所熟知的一般含義。為清楚起見，本專利申請(qǐng)中的下列術(shù)語具有如下所說明的含義“溶瘤微生物”這一術(shù)語在此定義為經(jīng)過遺傳改造的一類能夠進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，并通過選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞裂解死亡的微生物。溶瘤微生物的實(shí)例包括如下定義的溶瘤病毒和溶瘤細(xì)菌。
“溶瘤病毒”這一術(shù)語在此定義為一種經(jīng)過遺傳改造的病毒，該病毒能夠選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并殺死腫瘤細(xì)胞而不論腫瘤細(xì)胞的p53或其它蛋白是否突變。溶瘤病毒的實(shí)例包括單純皰疹病毒(HSV-1)，腺病毒(ONYX-015)，新城疫病毒(NDV)，水泡性口炎病毒(VSV)等。
“溶瘤細(xì)菌”這一術(shù)語在此定義為一種經(jīng)過遺傳改造的細(xì)菌，該細(xì)菌能夠在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并殺死腫瘤細(xì)胞。已知一些細(xì)菌的突變株可以作為腫瘤的基因治療載體20。例如，沙門氏菌中編碼嘌呤(pur)或芳香族氨基酸(aroA)的基因突變后，不能自己合成這些對(duì)其必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)。這些物質(zhì)在正常細(xì)胞中并不存在，而腫瘤細(xì)胞由于遺傳特性的改變可以提供這些營養(yǎng)物質(zhì)。所以這些營養(yǎng)缺陷型細(xì)菌能夠選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增而使其裂解，如Salmonellatyphimurium YS72(pur-)在荷瘤鼠腹膜接種2天后，可檢測(cè)到在腫瘤細(xì)胞中與在正常肝細(xì)胞中的比例為9000∶120。將表達(dá)熱休克蛋白的基因引入這些細(xì)菌突變株，再利用突變型細(xì)菌能夠在腫瘤細(xì)胞中富集并使其裂解的這種特性，這些細(xì)菌完全可以作為本發(fā)明的溶瘤微生物使用。
“粘附腫瘤抗原的并被抗原提呈細(xì)胞所識(shí)別的蛋白”這一術(shù)語在此定義為一類蛋白，該蛋白能夠通過吸附、粘附或結(jié)合等作用與腫瘤特異抗原多肽連接而形成蛋白-多肽復(fù)合物，并通過抗原肽伴侶轉(zhuǎn)移作用將抗原提交給樹突狀細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞，抗原被加工提呈，激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)。這類蛋白的實(shí)例包括以熱休克蛋白為主的分子伴侶蛋白。
“熱休克蛋白”這一術(shù)語在此定義為一族高度保守具有ATP酶活性的分子，包括只是保守替換和/或修飾的熱休克蛋白變體。熱休克蛋白在所有的原核生物以及大多數(shù)真核細(xì)胞中都存在；無論是否存在外界壓力，其在蛋白質(zhì)代謝中都起著重要作用，包括在蛋白質(zhì)從頭合成途徑中蛋白質(zhì)的折疊和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)以及錯(cuò)誤折疊后的蛋白的降解。所述熱休克蛋白，包括從腫瘤細(xì)胞和細(xì)菌感染的細(xì)胞中得到的hsp70和grp94/gp96，他們都能夠激發(fā)細(xì)胞性的免疫反應(yīng)?！白魟笔且活惡涂乖餐褂没蚱浔旧砭湍軌虺洚?dāng)抗原來能夠增強(qiáng)免疫反應(yīng)的物質(zhì)。
“抗原”這一術(shù)語在此定義為能激發(fā)免疫應(yīng)答的一種分子。免疫反應(yīng)包括產(chǎn)生抗體，具備特異的免疫活性細(xì)胞的活化，或兩者的組合。抗原可以產(chǎn)生于生物體、蛋白或抗原的亞單位、被殺死或被去活化的全細(xì)胞或裂解物?！鞍┌Y”這一術(shù)語在此定義為一種惡性的細(xì)胞性腫瘤并能夠侵襲其它細(xì)胞。其實(shí)例包括但并不限于乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，子宮癌，皮膚癌，胰腺癌，結(jié)腸癌和肺癌。
“癌癥疫苗”這一術(shù)語在此定義腫瘤特異性抗原分子或接觸過腫瘤細(xì)胞的免疫細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞所表達(dá)的，使腫瘤細(xì)胞具有免疫原性從而能被免疫系統(tǒng)識(shí)別的蛋白質(zhì)為腫瘤特異性抗原，通過體外制備該抗原蛋白質(zhì)或其具有免疫效應(yīng)的抗原表位多肽；或通過體外免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞接觸使免疫細(xì)胞能夠識(shí)別該種抗原，上述蛋白或多肽或免疫細(xì)胞即可作為治療性的癌癥疫苗?！皻缒[瘤”這一術(shù)語在此定義為能夠有效地抑制腫瘤的擴(kuò)增和浸潤與轉(zhuǎn)移以及使腫瘤消退或轉(zhuǎn)化成良性。
“表達(dá)”這一術(shù)語在此定義為由其啟動(dòng)子啟動(dòng)的一段特定序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
“主要組織相容性復(fù)合物”或“MHC”這一術(shù)語在此定義為一簇特殊的基因，其中大部分編碼在細(xì)胞表面進(jìn)行抗原提呈的蛋白，其中對(duì)決定組織相容性最重要的包括I類組織相容性復(fù)合物，或MHCI，其功能主要是將抗原提呈給CD8T淋巴細(xì)胞；II類組織相容性復(fù)合物，或MHCII，其功能主要是將抗原提呈給CD4T淋巴細(xì)胞。
“啟動(dòng)子”這一術(shù)語在此定義為一段核酸序列，能夠調(diào)控一段特殊的核酸序列的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子這一術(shù)語包括增強(qiáng)子、沉默子和其它順式調(diào)控原件?！癟淋巴細(xì)胞”在此定義為胸腺來源的能夠參與一系列的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的一類細(xì)胞。
“抗原提呈細(xì)胞”在此定義為功能為加工提呈抗原給T細(xì)胞和B細(xì)胞的一類細(xì)胞，該類細(xì)胞包括樹突狀細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞。
“免疫增強(qiáng)分子”在此定義能增強(qiáng)免疫作用的分子，包括IL-2、IL-12、TNF、IFN、GM-CSF、趨化因子等在內(nèi)的細(xì)胞因子和免疫共刺激分子如免疫共刺激分子B7等。
“免疫有效量”這一術(shù)語在此定義為能夠有效地激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抑制或殺死腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)的劑量。
在本發(fā)明中，我們采用的策略是用表達(dá)能粘附腫瘤細(xì)胞抗原的并被抗原提呈細(xì)胞所識(shí)別的蛋白的溶瘤微生物感染局部腫瘤，該溶瘤微生物在腫瘤細(xì)胞中生長而在正常細(xì)胞中基本上不生長。溶瘤微生物在腫瘤細(xì)胞中生長的同時(shí)，表達(dá)能粘附腫瘤細(xì)胞抗原的并被抗原提呈細(xì)胞所識(shí)別的蛋白，而且由于溶瘤微生物在腫瘤細(xì)胞中的生長，腫瘤細(xì)胞裂解，釋放出各種腫瘤細(xì)胞的抗原。這些抗原與溶瘤微生物所表達(dá)的能粘附腫瘤細(xì)胞抗原的并被抗原提呈細(xì)胞所識(shí)別的蛋白結(jié)合，形成抗原一蛋白復(fù)合物。該復(fù)合物進(jìn)一步被抗原提呈細(xì)胞識(shí)別，經(jīng)抗原提呈細(xì)胞加工后提呈給細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中我們采用表達(dá)熱休克蛋白的溶瘤微生物感染局部腫瘤。表達(dá)的熱休克蛋白能夠結(jié)合腫瘤抗原通過癌癥疫苗免疫的方式起到免疫調(diào)節(jié)的作用。在本發(fā)明中，熱休克蛋白在原位腫瘤的表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)具備復(fù)制能力的溶瘤微生物對(duì)轉(zhuǎn)移腫瘤的抗瘤活性。在本發(fā)明中，將表達(dá)熱休克蛋白的溶瘤微生物給予患者后使原位腫瘤細(xì)胞裂解，從而使腫瘤相關(guān)抗原釋放，我們?cè)诓恍枰w外制備腫瘤抗原以及預(yù)先知道患者的特異性腫瘤抗原的情況下，利用表達(dá)的熱休克蛋白能夠和釋放的腫瘤抗原結(jié)合的特性，進(jìn)一步引發(fā)或增強(qiáng)對(duì)腫瘤抗原的免疫反應(yīng)。在存在或缺乏佐劑或抗原提呈細(xì)胞的情況下，都能通過給予患者表達(dá)熱休克蛋白的溶瘤微生物來治療腫瘤。所述溶瘤微生物優(yōu)選為選擇性地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制的病毒或細(xì)菌。所述病毒的實(shí)例是腺病毒如ONYX-015、單純皰疹病毒如HSV-1、水泡性口炎病毒、新城疫病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒或其他能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中生長的病毒。所述細(xì)菌的實(shí)例包括傷寒沙門氏菌、雙岐桿菌、志賀氏菌、李斯特菌和鼠疫桿菌以及其他天然存在和經(jīng)誘變篩選后能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中生長的細(xì)菌。
本發(fā)明中溶瘤微生物所表達(dá)的一類蛋白為能夠粘附腫瘤抗原并對(duì)抗原提呈細(xì)胞有親和性的蛋白，這類蛋白能夠結(jié)合腫瘤特異抗原多肽形成蛋白-多肽復(fù)合物，并通過抗原肽伴侶轉(zhuǎn)移作用將抗原提交給樹突狀細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞，抗原被加工提呈，激發(fā)機(jī)體特異性CTL免疫反應(yīng)。這類蛋白的實(shí)例包括以熱休克蛋白為主的分子伴侶蛋白。熱休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSP)是一類高度保守并具有ATP酶活性的蛋白家族，在所有的原核生物以及大多數(shù)真核細(xì)胞中都存在。無論是否存在外界壓力，熱休克蛋白在蛋白質(zhì)代謝中都起著重要作用，包括在蛋白質(zhì)從頭合成途徑中蛋白質(zhì)的折疊和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)以及錯(cuò)誤折疊后的降解5。熱休克蛋白，包括從腫瘤細(xì)胞和細(xì)菌感染的細(xì)胞中得到的hsp70和grp94/gp96，都能夠激發(fā)細(xì)胞性的免疫反應(yīng)6-7。熱休克蛋白的免疫原性主要是由結(jié)合到其分子上的多肽所產(chǎn)生8。產(chǎn)生的熱休克蛋白-抗原多肽通過一種不表達(dá)內(nèi)生性抗原的特異性細(xì)胞將抗原呈遞給T淋巴細(xì)胞后，從而激活免疫系統(tǒng)。這些結(jié)果表明熱休克蛋白作為分子伴侶能夠?qū)⒖乖缘亩嚯某蔬f給抗原提呈細(xì)胞，可能是通過使這些多肽與MHCI和MHCII分子結(jié)合而進(jìn)入MHCI和MHCII呈遞抗原途徑；這些抗原多肽會(huì)進(jìn)一步被提呈給CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞和CD4+輔助性T細(xì)胞。
各種熱休克蛋白、其片斷或各種修飾(包括但不限于一個(gè)或多個(gè)氨基酸地添加、缺失和/或替換等)變體均可用于本發(fā)明，只要該熱休克蛋白、片段或變體保持與腫瘤細(xì)胞抗原多肽結(jié)合的能力即可。同理，本發(fā)明的溶瘤微生物也包括各種變體，只要該微生物具有選擇性地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制和生長從而將腫瘤細(xì)胞裂解的能力即可。因此，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到，將編碼能粘附腫瘤抗原的并被抗原提呈細(xì)胞所識(shí)別的蛋白如熱休克蛋白的基因引入溶瘤微生物的基因組或表達(dá)質(zhì)粒中，只要保證所述的基因與調(diào)控序列如啟動(dòng)子和終止子有效地連接，所述的溶瘤微生物如HSV-1或ONYX-015就可以表達(dá)能粘附腫瘤抗原的并被抗原提呈細(xì)胞所識(shí)別的蛋白如熱休克蛋白。在不背離本發(fā)明的范圍和精神情況下，可對(duì)本發(fā)明申請(qǐng)中各種實(shí)例進(jìn)行不同改變或修改，這一點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是很顯而易見的。
在本發(fā)明的一個(gè)更為具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了能夠表達(dá)熱休克蛋白的溶瘤病毒，其能夠殺死局部腫瘤并通過釋放腫瘤抗原來激發(fā)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。編碼熱休克蛋白HSP70的基因被置于啟動(dòng)子CMV啟動(dòng)子的控制之下。在所有的應(yīng)用中，“溶瘤病毒”這一術(shù)語是指能夠在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并將其殺死的任何病毒，例如單純皰疹病毒(HSV-1)，腺病毒(ONYX-015)，新城疫病毒(NDV)，水泡性口炎病毒(VSV)1-3。其中的一個(gè)例子ONYX-015為一種能夠選擇性的在p53功能缺陷的腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的減毒腺病毒9-14。在臨床試驗(yàn)中，這種病毒表現(xiàn)非常強(qiáng)的抗腫瘤活性，能夠有效的使腫瘤體積減小甚至消除。
在一個(gè)具體的實(shí)施例中，采用的溶瘤病毒是單純皰疹病毒。一種具備復(fù)制能力的單純皰疹病毒的突變株經(jīng)過大量的不同種的動(dòng)物模型試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)為非病原性的16并被用于人的原發(fā)性腦部腫瘤治療的臨床試驗(yàn)。這種單純皰疹病毒突變株在分裂細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能夠?qū)е录?xì)胞死亡，其在非分裂細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力則非常弱16。這種單純皰疹病毒突變株在接種到荷瘤鼠后能夠選擇性的在腫瘤內(nèi)復(fù)制，從而抑制原位腫瘤的生長并延長荷瘤鼠的生存期15-17。這種病毒突變株能夠攜帶編碼熱休克蛋白HSP70的擴(kuò)增質(zhì)粒。
應(yīng)用于單純皰疹病毒表達(dá)熱休克蛋白增強(qiáng)免疫反應(yīng)的熱休克蛋白是來源于人的，包括人的HSP70和HSP96。可以替代的熱休克蛋白也可以來源于病原微生物，包括結(jié)核分支桿菌(M.tuberculosis)，麻風(fēng)分支桿菌(M.leprae)，克氏錐蟲(Trypanoma cruzi)，惡性瘧原蟲(Plasmodium falcipaum)；以及其它物種如靈長類，鼠等哺乳動(dòng)物。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，使用HSP70。HSP70的cDNA是從人的cDNA文庫中通過PCR擴(kuò)增得到并進(jìn)行了DNA序列測(cè)定。用Klenow酶補(bǔ)平上述PCR產(chǎn)物的DNA片段兩端，然后平末端插入連接于質(zhì)粒pHSV中的SpeI位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pHSV-HSP。
在另一個(gè)具體的實(shí)施例中，采用的溶瘤病毒是腺病毒。所采用的腺病毒突變株能夠選擇性的在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制而使細(xì)胞裂解死亡，其在正常細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力則非常弱10。這種腺病毒突變株在接種到荷瘤鼠后能夠選擇性的在腫瘤內(nèi)復(fù)制，從而抑制原位腫瘤的生長并延長荷瘤鼠的生存期9-11。這種病毒突變株能夠攜帶編碼熱休克蛋白HSP70的擴(kuò)增質(zhì)粒。應(yīng)用于腺病毒表達(dá)熱休克蛋白增強(qiáng)免疫反應(yīng)的熱休克蛋白是來源于人的，包括人的HSP70和HSP96?？梢蕴娲臒嵝菘说鞍滓部梢詠碓从诓≡⑸?，包括結(jié)核分支桿菌(M.tuberculosis)，麻風(fēng)分支桿菌(M.leprae)，克氏錐蟲(Trypanomacruzi)，惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)；以及其它物種如靈長類，鼠等哺乳動(dòng)物。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，使用HSP70。HSP70的cDNA是從人的cDNA文庫中通過PCR擴(kuò)增得到。用XhoI，SalI和EcoRV限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒pAdIR-BG，瓊脂糖電泳分離酶切片段，回收5.3kb大片段，用Klenow酶補(bǔ)平片段兩端，此為片段pAd-RSV。用Klenow酶補(bǔ)平PCR產(chǎn)物的DNA片段兩端，與片段pAd-RSV正向平端連接，得到質(zhì)粒pAd-RSV-HSP70。
在本發(fā)明中，編碼熱休克蛋白70的序列受溶瘤病毒HSV的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。“啟動(dòng)子”是指能被細(xì)胞自體的或引入的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物所識(shí)別的DNA序列，其對(duì)于一個(gè)基因地轉(zhuǎn)錄起始是必須的。對(duì)于啟動(dòng)子是如何組織的，人們通過分析多種不同病毒如CMV(巨細(xì)胞病毒)，HSV胸苷激酶(tk)和SV40的啟動(dòng)子來進(jìn)行研究。近來的研究表明，啟動(dòng)子由不連續(xù)的功能調(diào)控元件組成，每個(gè)約7-20bpDNA，并且包括一個(gè)或更多的由轉(zhuǎn)錄活化或抑制蛋白的識(shí)別位點(diǎn)。其它類型的啟動(dòng)子例如增強(qiáng)子能夠調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始的頻率。典型的啟動(dòng)子序列都是位于起始位點(diǎn)上游30-110bp處，盡管現(xiàn)在表明有包含在起始位點(diǎn)下游的調(diào)控元件的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子各元件之間的距離通常是可改變的，所以當(dāng)某些元件被插入或移去時(shí)仍能保持啟動(dòng)子的正常功能。在tk啟動(dòng)子中，在保持活性的前提下，啟動(dòng)子各元件之間的距離最多可以增加到50bp。根據(jù)各啟動(dòng)子類型不同，各元件可互相協(xié)同或獨(dú)立的活化轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
一個(gè)啟動(dòng)子可以是一個(gè)基因或一段序列自身的，即從編碼區(qū)和/或外顯子的上游5’端非編碼序列得到。這樣的啟動(dòng)子為“內(nèi)源性”啟動(dòng)子。我們同樣可以得到這個(gè)基因或這段序列上游或下游的增強(qiáng)子。可替代的，將并非基因或序列自身的啟動(dòng)子也即重組或異源啟動(dòng)子置于編碼序列的上游進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控會(huì)有特殊優(yōu)勢(shì)。重組或異源的啟動(dòng)子包括并非在自然環(huán)境中與基因或序列相關(guān)的增強(qiáng)子。這種啟動(dòng)子和增強(qiáng)子可包括其它基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，以及從原核生物，病毒或真核細(xì)胞中分離的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，或者并非“天然存在”的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，例如不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的不同調(diào)控元件的組合，和/或引入能夠影響功能的突變。而且在合成啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列時(shí)，還可以使用重組克隆和/或包括PCR在內(nèi)的核酸擴(kuò)增技術(shù)。而且，也可以使用其它細(xì)胞器如線粒體，葉綠體的能夠調(diào)控轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)的序列。
在實(shí)施例中所采用的為巨細(xì)胞病毒(CMV)的前早期啟動(dòng)子序列。這個(gè)啟動(dòng)子屬于組成型的強(qiáng)啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)其下游序列的高水平表達(dá)。同時(shí)，也可使用其它組成型的啟動(dòng)子猴病毒SV40前早期啟動(dòng)子，小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子，人免疫缺陷病毒(HIV)長末端重復(fù)序列(LTR)啟動(dòng)子，鼠病毒啟動(dòng)子，鳥白血病病毒啟動(dòng)子，EB病毒前早期啟動(dòng)子，勞氏肉瘤病毒啟動(dòng)子，以及人類基因啟動(dòng)子，例如(但不限于)肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，肌球蛋白啟動(dòng)子，血紅蛋白啟動(dòng)子，肌酸啟動(dòng)子。而且本發(fā)明并不僅限于用組成型啟動(dòng)子，也可以選用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。本發(fā)明中誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的使用提供了在需要時(shí)能打開其相連的下游核酸序列表達(dá)的分子開關(guān)，并在不需要其表達(dá)時(shí)將其關(guān)閉。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括但并不局限于金屬硫蛋白啟動(dòng)子，糖皮質(zhì)激素啟動(dòng)子，孕酮啟動(dòng)子，四環(huán)素啟動(dòng)子。而且，本發(fā)明還包括使用組織特異性啟動(dòng)子，其轉(zhuǎn)錄活化只能在特定組織內(nèi)進(jìn)行。組織特異性啟動(dòng)子包括但不限于現(xiàn)在已知的如HER-2啟動(dòng)子，PSA相關(guān)啟動(dòng)子序列。
對(duì)于熱休克蛋白的表達(dá)，需要一個(gè)典型的多聚腺苷酸信號(hào)來完成轉(zhuǎn)錄的正確多聚腺苷酸加尾反應(yīng)。多聚腺苷酸的性質(zhì)對(duì)于成功的實(shí)施本發(fā)明并不是至關(guān)重要的，任何類型的中止序列都可以使用。優(yōu)選的實(shí)施例包括SV40多聚腺苷酸信號(hào)，LTR多聚腺苷酸信號(hào)和/或牛生長激素多聚腺苷酸信號(hào)，對(duì)于不同的靶向細(xì)胞應(yīng)以方便原則和/或已知能在其中正確行施功能的原則選擇多聚腺苷酸信號(hào)。也可以選用轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn)來中止轉(zhuǎn)錄。這些元件應(yīng)能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的翻譯中止水平和/或避免通讀到其它序列。重要的一點(diǎn)是，本發(fā)明中溶瘤病毒正確進(jìn)行蛋白表達(dá)并不需要病毒整合到受體細(xì)胞的基因組中。病毒載體可以以游離體狀態(tài)存在于靶細(xì)胞中。例如，在某些類型的細(xì)胞中病毒載體表達(dá)目標(biāo)蛋白并不需要病毒的復(fù)制。這些細(xì)胞例如肌肉細(xì)胞通常是不能正常復(fù)制的，被導(dǎo)入非分裂細(xì)胞的表達(dá)載體在載體本身不復(fù)制的情況下能夠表達(dá)目的蛋白。
本發(fā)明的一個(gè)應(yīng)用是將表達(dá)人熱休克蛋白的皰疹病毒或腺病毒直接加入到瘤內(nèi)，從而引發(fā)機(jī)體針對(duì)腫瘤抗原的特異性免疫反應(yīng)，殺死局部腫瘤和轉(zhuǎn)移的腫瘤。給予表達(dá)熱休克蛋白的皰疹病毒或腺病毒進(jìn)行治療可以單獨(dú)使用，也可以和其它形式的免疫治療劑聯(lián)合使用，包括細(xì)胞因子和傳統(tǒng)中藥。在許多實(shí)際應(yīng)用中，免疫調(diào)節(jié)劑如佐劑或稱為免疫刺激劑被用來增強(qiáng)免疫反應(yīng)。殺死局部腫瘤并誘發(fā)免疫反應(yīng)包括將表達(dá)HSP的溶瘤病毒直接或間接的給予到機(jī)體的腫瘤內(nèi)。大量研究表明，同時(shí)給予細(xì)胞因子或表達(dá)細(xì)胞因子的質(zhì)粒能夠增強(qiáng)抗腫瘤的免疫活性。一個(gè)本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易認(rèn)識(shí)到可以將細(xì)胞因子的核酸序列和HSP的核酸序列放入同一載體來共同應(yīng)用，這樣就避免使用兩個(gè)表達(dá)載體。本研究領(lǐng)域的技術(shù)人員從本發(fā)明中可以認(rèn)識(shí)到溶瘤病毒可以應(yīng)用于腫瘤的治療。對(duì)于腫瘤治療來說，一個(gè)技術(shù)人員能認(rèn)識(shí)到溶瘤病毒必須攜帶熱休克蛋白的基因并且基因與啟動(dòng)子是有效的連接的。另外，一個(gè)本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易認(rèn)識(shí)到，為了提高熱休克蛋白在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量可以將多個(gè)拷貝的HSP基因引入同一載體中。
在另一個(gè)具體實(shí)施例中，采用能夠特異性的在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的細(xì)菌作為表達(dá)熱休克蛋白的載體，因?yàn)樗玫纳抽T氏菌為aroA缺陷型19，其所需要的營養(yǎng)只能由腫瘤細(xì)胞提供，在正常細(xì)胞中不能夠復(fù)制生長。所以該突變株能夠選擇性的在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并通過其增殖使腫瘤細(xì)胞裂解死亡。沙門氏菌表達(dá)的熱休克蛋白能夠結(jié)合腫瘤細(xì)胞裂解所釋放的抗原并將其傳送給抗原提呈細(xì)胞，從而激發(fā)了CTL介導(dǎo)的能夠特異性殺死腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)，從而抑制了腫瘤的生長，延長了荷瘤鼠的生存期。
在適當(dāng)?shù)那闆r下，重組病毒或細(xì)菌可根據(jù)其給予的途徑不同被加工成固體，半固體，液體或氣霧劑形式。可以利用已知的方法來阻止組合物在到達(dá)靶器官前被釋放和吸收。本發(fā)明中可采用任何一個(gè)可以接受的藥劑形式保證本發(fā)明組分的有效性。在制劑時(shí)，本發(fā)明中的微生物可以單獨(dú)使用，也可和其它的藥學(xué)上活性組分以適當(dāng)?shù)谋壤Y(jié)合/配合使用。應(yīng)保證在給藥時(shí)有足夠多量的含有表達(dá)能粘附腫瘤抗原的并被抗原提呈細(xì)胞所識(shí)別的蛋白如熱休克蛋白的核酸序列的溶瘤微生物如溶瘤病毒或溶瘤細(xì)菌，從而其基因產(chǎn)物能提供藥學(xué)上有效的劑量。表達(dá)熱休克蛋白的溶瘤病毒或溶瘤細(xì)菌可以單獨(dú)使用也可以和不同的佐劑共同配制。
通常，可將本發(fā)明的溶瘤微生物以免疫有效量通過本領(lǐng)域已知的各種常規(guī)的和可接受的方式單獨(dú)或與其它治療劑一起聯(lián)合給藥。免疫有效量將根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度、個(gè)體的年齡和相對(duì)健康狀況、所用微生物的效力以及其它因素有很大變化。通常，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以根據(jù)個(gè)人知識(shí)以及本申請(qǐng)所公開的內(nèi)容確定出用于治療給定腫瘤時(shí)的本發(fā)明的微生物的免疫有效量?？梢院捅景l(fā)明的微生物共同使用的佐劑包括(但不限于)弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、氫氧化鋁、卡介苗(BCG)、脂多糖(LPS)、脂質(zhì)A類似物、胞壁酰二肽(MDP)及其類似物、內(nèi)毒素(LT)和霍亂毒素(CT)。
本發(fā)明的微生物可以以藥物組合物的形式通過下列途徑之一給藥瘤內(nèi)注射、口服、全身性給藥(例如，經(jīng)皮、鼻內(nèi)或通過栓劑給藥)或胃腸外給藥(例如，肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)。組合物可以是片劑、丸劑、膠囊、半固體、散劑、緩釋制劑、溶液劑、混懸劑、氣霧劑的形式或是任何其它適宜的組合物，并且通常由本發(fā)明溶瘤微生物以及至少一種可藥用賦形劑組成。可藥用賦形劑是無毒的、對(duì)所述微生物的活性沒有實(shí)質(zhì)性損害的、有助于給藥的并且不會(huì)對(duì)其他活性成分的免疫或治療效果產(chǎn)生不利影響物質(zhì)。所述賦形劑可以是任何固體、液體、半固體，或者在氣霧劑組合物的情況下，可以是氣體賦形劑。這些賦形劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員易于得到的。
固體藥物賦形劑包括淀粉、纖維素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、氯化鈉、脫脂奶粉等。液體和半固體賦形劑可以選自水、乙醇、甘油、丙二醇和各種油，包括來源于石油、動(dòng)物、植物或合成的油(例如，花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等)。優(yōu)選的液體載體，特別是用于可注射溶液的液體載體包括水、鹽水、葡萄糖水溶液和二甘醇。
組合物中本發(fā)明微生物的量可以根據(jù)制劑的種類、單位劑量的大小、賦形劑的種類以及藥學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它因素有很大變化。而且，實(shí)際的劑量和治療方案會(huì)根據(jù)其它因素如該發(fā)明的組分是否和其它治療組分結(jié)合，個(gè)體的藥物動(dòng)力學(xué)，藥物分布和代謝等各不相同而有所變化。而且，加入細(xì)胞的病毒量也隨著插入載體的治療基因的長度、穩(wěn)定性，和序列的性質(zhì)而不同，是一個(gè)由經(jīng)驗(yàn)決定的變量，很可能被非本發(fā)明中方法之外的其它因素所改變。一個(gè)本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)具體情況的出現(xiàn)很容易的進(jìn)行調(diào)整。
雖然以上說明書是以表達(dá)能粘附腫瘤抗原的并被抗原提呈細(xì)胞所識(shí)別的蛋白的重組溶瘤微生物來進(jìn)行說明的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員完全可以認(rèn)識(shí)到，也可以將溶瘤微生物與粘附腫瘤抗原的并被抗原提呈細(xì)胞所識(shí)別的蛋白如熱休克蛋白組合在一起使用，而不需對(duì)溶瘤微生物進(jìn)行進(jìn)一步的遺傳改造。下面以實(shí)施例的方式具體描述本發(fā)明。以下的實(shí)施例是舉例性的，因此不能將這些實(shí)施例看成是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例實(shí)施例1人熱休克蛋白(HSP70)基因的擴(kuò)增及克隆利用PCR方法從人腫瘤細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞的cDNA中擴(kuò)增HSP70基因。上游引物序列為GGT ATG GAA GAT CCC TCG AGA TC，下游引物序列為TACTA ATC TAC CTC CTC AAT GGT GGG.使用PE公司的PCR儀，反應(yīng)條件是每個(gè)反應(yīng)的引物終濃度是30pM，dNTP為100mM，模板DNA為100ng，Taq DNA聚合酶為2.5個(gè)單位。其他反應(yīng)條件依照GeneAmp DNA擴(kuò)增試劑盒中的使用說明進(jìn)行，每個(gè)反應(yīng)總體積為100微升。每份反應(yīng)混合物上覆蓋以75微升礦物油。擴(kuò)增共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)包括變性步驟92℃1分鐘，退火步驟50℃1分鐘，延長步驟72℃2分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，使用Qiagen公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化所得產(chǎn)物。
溶瘤病毒-單純皰疹病毒的構(gòu)建我們采用的是具備復(fù)制能力的、突變型I型單純皰疹病毒(HSV-1)15-18。其中γ34.5基因被缺失。HSV突變株在分裂型細(xì)胞中的復(fù)制會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡；其在非分裂型細(xì)胞中的生長能力顯著減弱16。這種單純皰疹病毒突變株在接種到荷瘤鼠后能夠選擇性的在腫瘤內(nèi)復(fù)制，從而抑制原位腫瘤的生長并延長荷瘤鼠的生存期16。HSV被用來在腫瘤內(nèi)投遞熱休克蛋白。HSV病毒包含編碼HSP70的質(zhì)粒和HSV輔助病毒17。因?yàn)椴《净蚪MDNA(～153KB)被包裝的，每個(gè)病毒顆粒包含15個(gè)HSP70基因的拷貝，并且能夠高效的轉(zhuǎn)染分裂和非分裂的細(xì)胞。病毒DNA并不整合到被感染的細(xì)胞的基因組中，有CMV啟動(dòng)子調(diào)控HSP70蛋白的表達(dá)，屬于瞬時(shí)高表達(dá)。鼠HSP70的cDNA是從人的cDNA文庫中通過PCR擴(kuò)增得到并進(jìn)行了DNA序列測(cè)定。用Klenow酶補(bǔ)平上述PCR產(chǎn)物的DNA片段兩端，然后平末端插入連接于質(zhì)粒pHSV中的SpeI位點(diǎn)。使用這個(gè)質(zhì)粒DNA和單純皰疹病毒輔助病毒DNA共轉(zhuǎn)染皰疹病毒宿主細(xì)胞，在HSV輔助病毒存在的條件下，通過同源重組，HSP70基因插入到單純皰疹病毒的基因組中，并被包裝于單純皰疹病毒的外殼中，這樣就產(chǎn)生了帶有HSP70基因的重組單純皰疹病毒(如圖1所示)。γ34.5基因被缺失的HSV-1突變株，作為輔助病毒來生產(chǎn)重組病毒HSV-HSP。對(duì)HSV-HSP進(jìn)行了序列測(cè)定，其序列列于序列表中。
單純皰疹病毒的滴度測(cè)定用脂質(zhì)體lipofectAMINE(Life Technologies產(chǎn)品)將純化的擴(kuò)增質(zhì)粒DNA(pHSP70)和HSV病毒共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，然后在34.5℃溫育培養(yǎng)，直到細(xì)胞表現(xiàn)出完全的細(xì)胞病變效應(yīng)。從Vero細(xì)胞中收獲重組病毒并按1∶5比例稀釋培養(yǎng)，直到觀察到輔助病毒的復(fù)制被抑制。含有pHSP70質(zhì)粒的HSV被命名為HSV-HSP。經(jīng)過凍融和超聲以及低速離心(2000×g，4℃10分鐘)去除細(xì)胞碎片，測(cè)定重組病毒的滴度。病毒滴度以病毒在34.5℃培養(yǎng)的Vero細(xì)胞中形成的溶斑形成單位(PFUs)來表示。對(duì)于HSV-HSP來說，其滴度決定著HSP70的表達(dá)量，以及最高的培養(yǎng)水平。HSV-HSP的病毒滴度為5×107PFU/ml。同樣，測(cè)定HSV-1的滴度，其制值為6×107PFU/ml。
HSV-HSP的體外溶瘤活性HSV-1能夠在很多類型的腫瘤細(xì)胞中都能夠復(fù)制。人們發(fā)現(xiàn)鼠的結(jié)腸癌細(xì)胞系CT26易受HSV感染的影響。這種細(xì)胞系免疫原性很弱并且不能激發(fā)可檢測(cè)到的腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。CT26型腫瘤經(jīng)細(xì)胞因子治療后仍然容易復(fù)發(fā)?，F(xiàn)已證明CT26的MHC-I限制性優(yōu)勢(shì)免疫抗原是一個(gè)九肽，來源于內(nèi)生性親嗜性鼠白血病前病毒的膜蛋白(gp70)。研究已證實(shí)了誘導(dǎo)產(chǎn)生的腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)對(duì)皮下接種的CT26腫瘤的抗瘤效果。其中將鼠腫瘤細(xì)胞CT26培養(yǎng)于24孔板(每孔1×105)并由HSV-HSP或HSV以不同的感染復(fù)數(shù)(0.01-10)感染。在感染復(fù)數(shù)(MOI)0.1時(shí)，用HSV-HSP或HSV對(duì)CT26細(xì)胞感染，感染4天后導(dǎo)致70％的腫瘤細(xì)胞的死亡。在感染復(fù)數(shù)(MOI)為1時(shí)，用HSV-HSP或HSV對(duì)CT26細(xì)胞感染，感染4天后導(dǎo)致99％的腫瘤細(xì)胞的死亡(如圖2所示)。感染的腫瘤細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后，用放射性標(biāo)記及免疫沉淀/SDS-PAGE可以檢測(cè)到HSP70的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明插入的HSP70并沒有降低HSV的復(fù)制能力和細(xì)胞毒性。
HSV-HSP抑制遠(yuǎn)端腫瘤的生長同系的BALB/c小鼠上進(jìn)一步評(píng)價(jià)HSV-HSP對(duì)CT26腫瘤的治療效果。BALB/c來自于Charles River(Wilmington，MA，USA)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都經(jīng)動(dòng)物關(guān)心和使用委員會(huì)(Animal Care and Use Committee)批準(zhǔn)。將動(dòng)物分成3組，第一和第二組作為實(shí)驗(yàn)組，第三組作為對(duì)照組。將小鼠用CT26腫瘤細(xì)胞(1×105)在小鼠肋部對(duì)稱部位分別進(jìn)行皮下注射。將這些小鼠作為患有轉(zhuǎn)移性腫瘤的動(dòng)物的模型。當(dāng)皮下注射的腫瘤迅速生長(最大直徑達(dá)到5毫米)時(shí)，將第一組每只動(dòng)物非對(duì)稱(右面)的瘤內(nèi)接種HSV-HSP(1×106PFU)，并于第一次接種7天后進(jìn)行第二次接種。將第二組每只動(dòng)物非對(duì)稱(右面)的瘤內(nèi)接種HSV-1(1×106PFU，并于第一次接種7天后進(jìn)行第二次接種。HSV-1作為接種HSV-HSP的對(duì)照以評(píng)價(jià)病毒因素的影響。將第三組小鼠每只動(dòng)物非對(duì)稱(右面)的瘤內(nèi)接種熱休克蛋白HSP70，并于第一次接種7天后進(jìn)行第二次接種，來評(píng)價(jià)熱休克蛋白本身的作用。腫瘤體積用卡尺測(cè)量，體積的計(jì)算公式(V＝h×w×d)。如果小鼠垂死或其腫瘤直徑超過18毫米，將被處死，并記錄下日期來研究其存活率。用非配對(duì)法t檢驗(yàn)進(jìn)行方差統(tǒng)計(jì)，軟件為StaView4.5(Abacus Concepts，Berkeley，CA)。用HSV-HSP接種能引起非常顯著的抗腫瘤效果，無論是被注射一側(cè)的腫瘤，還是同只動(dòng)物身體上未經(jīng)注射的對(duì)稱端的腫瘤的生長都明顯受到抑制(如圖3所示)。經(jīng)注射HSV-HSP的小鼠身上的腫瘤無論在注射側(cè)還是在非注射側(cè)都已經(jīng)消退得無法檢測(cè)到。而注射HSV-1只能引起經(jīng)過注射的腫瘤生長的抑制，對(duì)于未被注射的對(duì)側(cè)腫瘤僅有一定的影響(如圖3所示)。僅注射HSP70的對(duì)照組顯示出在對(duì)注射側(cè)和非注射側(cè)的腫瘤都沒有影響。這些結(jié)果表明重組的HSV通過表達(dá)HSP70能夠激發(fā)強(qiáng)的免疫應(yīng)答從而抑制了遠(yuǎn)端腫瘤的生長。
實(shí)施例2帶有HSP70基因的重組腺病毒9-14的構(gòu)建用XhoI，SalI，和EcoRV限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒pAdIR-BG，瓊脂糖電泳分離酶切片段，回收5.3kb大片段，用Klenow酶補(bǔ)平片段兩端，此為片段pAd-RSV。采用實(shí)施例1中所述的用Klenow酶補(bǔ)平的PCR產(chǎn)物的DNA片段兩端，與片段pAd-RSV正向平端連接。得到質(zhì)粒pAd-RSV-HSP70。用10微克質(zhì)粒pAd-RSV-HSP70和14微克質(zhì)粒pBHG10共轉(zhuǎn)染單層培養(yǎng)于直徑10厘米培養(yǎng)皿中的293細(xì)胞，并覆蓋瓊脂糖培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)于37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱中。9天后出現(xiàn)噬斑，挑取單個(gè)噬斑，感染293細(xì)胞擴(kuò)增重組腺病毒，HindIII內(nèi)切酶分析重組腺病毒DNA，得到正確的重組腺病毒Ad-HSP70。
體外溶瘤活性和腫瘤抑制能力采用與實(shí)施例1相似的步驟，進(jìn)行體外溶瘤試驗(yàn)和在動(dòng)物模型上的抑瘤試驗(yàn)，取得了相似的試驗(yàn)結(jié)果。重組腺病毒通過表達(dá)HSP70能夠激發(fā)潛在的免疫應(yīng)答從而抑制了遠(yuǎn)端腫瘤的生長。
實(shí)施例3表達(dá)熱休克蛋白的沙門氏菌的構(gòu)建我們采用鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)SL3261，其中芳香族氨基酸aroA突變，其所需要的營養(yǎng)物質(zhì)只有腫瘤細(xì)胞才能夠提供，所以突變株能夠選擇性的侵襲腫瘤細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞裂解死亡；而在正常細(xì)胞中SL3261則不能夠生存。通過將HSP70序列插入到pcDNA3.1質(zhì)粒中構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pcDNA-HSP質(zhì)粒，如圖4所示。由CMV啟動(dòng)子調(diào)控HSP70蛋白的表達(dá)，屬于瞬時(shí)高表達(dá)。
抑瘤活性在同系的BALB/c小鼠上評(píng)價(jià)表達(dá)熱休克蛋白的鼠傷寒沙門氏菌SL3261對(duì)腫瘤的治療效果。將動(dòng)物分成3組，第一和第二組作為實(shí)驗(yàn)組，第三組作為對(duì)照組。用SMMC7721腫瘤細(xì)胞(1×105)在小鼠肩部對(duì)稱部位分別進(jìn)行皮下注射。將這些小鼠作為患有轉(zhuǎn)移性腫瘤的動(dòng)物的模型。當(dāng)皮下注射的腫瘤迅速生長(最大直徑達(dá)到5毫米)時(shí)，將第一組每只動(dòng)物非對(duì)稱(右面)的瘤內(nèi)接種攜帶表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-HSP的SL3261(1×107PFU)，并于第一次接種7天后進(jìn)行第二次接種。將第二組每只動(dòng)物非對(duì)稱(右面)的瘤內(nèi)接種SL3261(1×106PFU)，并于第一次接種7天后進(jìn)行第二次接種，作為對(duì)照以評(píng)價(jià)細(xì)菌本身因素的影響。將第三組小鼠每只動(dòng)物非對(duì)稱(右面)的瘤內(nèi)接種熱休克蛋白HSP70，并于第一次接種7天后進(jìn)行第二次接種，來評(píng)價(jià)熱休克蛋白本身的作用。腫瘤體積用卡尺測(cè)量，體積的計(jì)算公式(V＝h×w×d)。如果小鼠垂死或其腫瘤直徑超過18毫米，將被處死，并記錄下日期來研究其存活率。用非配對(duì)法t檢驗(yàn)進(jìn)行方差統(tǒng)計(jì)，軟件為StaView4.5(Abacus Concepts，Berkeley，CA)。用表達(dá)熱休克蛋白的鼠傷寒沙門氏菌SL3261接種能引起非常顯著的抗腫瘤效果，無論是被注射的一側(cè)腫瘤，還是同只動(dòng)物身體上未經(jīng)注射的對(duì)稱端的腫瘤的生長都明顯收到抑制(如圖5所示)。而注射鼠傷寒沙門氏菌SL3261只能引起經(jīng)過注射的腫瘤生長的抑制，對(duì)于未被注射的對(duì)側(cè)腫瘤的影響甚微(如圖5所示)。這些結(jié)果表明傷寒沙門氏菌SL3261也能夠通過表達(dá)HSP70能夠激發(fā)潛在的免疫應(yīng)答從而抑制了遠(yuǎn)端腫瘤的生長。
本專利申請(qǐng)將下列文獻(xiàn)以其全文引入作為參考。
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序列表<110>chen，siyi(陳思毅)hu，fang(胡放)<120>expressing HSP oncolytic microorganisms and usethereof(表達(dá)熱休克蛋白的溶瘤微生物及其應(yīng)用)<130><140>pct<141>2001-10-08<160>3<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>1ggtatggaag atccctcgag atc 23<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>2tactaatcta cctcctcaat ggtggg 26<210>3<211>10494<212>DNAgggccgccgg gtaaaagaag tgagaacgcg aagcgttcgc acttcgtccc aatatatata 120tattattagg gcgaagtgcg agcactggcg ccgggatcca aatgagtctt cggacctcgc 180gggggccgct taagcggtgg ttagggtttg tctgacgcgg ggggaggggg aaggaacgaa 240acactctcat tcggaggcgg ctcggggttt ggtggttacc tggggctgtg cggttgggac 300ggcgcccgtg ggcccgggcg gccgggggcg gcgggggccg gcatggcggc gcggcgggcc 360atggagacag agagcgtgcc ggggtggtag agtttgacag gcaagcatgt gcgtgcagag 420gcgagtagtg cttgcctgtc taactcgctc gtctcggccg cggggggccc gggctgcgcc 480gccgcgcttt aaagggccgc gcgcgacccc cggggggtgt gtttcggggg gggcccgttt 540tcgctcctcc ccccgctcct ccccccgctc ctccccccgc tcctcccccc gctcctcccc 600ccgctcctcc 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1.一種溶瘤微生物，其中該微生物表達(dá)能粘附腫瘤細(xì)胞抗原的并被抗原提呈細(xì)胞所識(shí)別的蛋白，并且該微生物能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中生長以裂解腫瘤細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的微生物，其中所述的能粘附腫瘤細(xì)胞抗原的蛋白是熱休克蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的溶瘤微生物，其中所述的熱休克蛋白來源于哺乳動(dòng)物或病原微生物。
4.如權(quán)利要求3所述的微生物，其中所述的哺乳動(dòng)物是人。
5.如權(quán)利要求4所述的溶瘤微生物，其中所述的熱休克蛋白為來源于人的熱休克蛋白Hsp70、Hsp96、Hsp90或其他的熱休克蛋白。
6.如權(quán)利要求2所述的溶瘤微生物，其中所述的熱休克蛋白來源于病原微生物，所述的病原微生物包括結(jié)核分支桿菌、麻風(fēng)分支桿菌、克氏椎蟲和惡性瘧原蟲。
7.如權(quán)利要求1所述的溶瘤微生物，其中所述的微生物是病毒。
8.如權(quán)利要求7所述的溶瘤微生物，其中所述的病毒包括腺病毒、單純皰疹病毒、水泡性口炎病毒、新城疫病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、EB病毒以及其他能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中生長的病毒。
9.如權(quán)利要求8所述的溶瘤微生物，其中所述的病毒為腺病毒。
10.如權(quán)利要求9所述的溶瘤微生物，其中所述的熱休克蛋白為來源于人的熱休克蛋白Hsp70、Hsp96、Hsp90或其他的熱休克蛋白。
11.如權(quán)利要求8所述的溶瘤微生物，其中所述的病毒為單純皰疹病毒。
12.如權(quán)利要求11所述的溶瘤微生物，其中所述的熱休克蛋白為來源于人的熱休克蛋白Hsp70、Hsp96、Hsp90或其他的熱休克蛋白。
13.如權(quán)利要求1所述的溶瘤微生物，其中所述的微生物是細(xì)菌。
14.如權(quán)利要求13所述的溶瘤微生物，其中所述的細(xì)菌包括傷寒沙門氏菌、雙歧桿菌、志賀氏菌、李斯特菌和鼠疫桿菌以及其他能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中生長的細(xì)菌。
15.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的溶瘤微生物，其中所述的微生物進(jìn)一步含有編碼免疫增強(qiáng)分子的DNA序列。
16.一種治療腫瘤的藥物，其含有權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的微生物。
17.權(quán)利要求16所述的藥物，其中所述的微生物進(jìn)一步含有編碼免疫增強(qiáng)分子的DNA序列。
18.權(quán)利要求16或17所述的藥物，其進(jìn)一步含有可藥用載體。
19.一種藥物組合物，其含有a.能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中生長的微生物；和b.能粘附腫瘤細(xì)胞抗原的并被抗原提呈細(xì)胞所識(shí)別的蛋白。
20.權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其中所述的微生物是腺病毒、單純皰疹病毒、水泡性口炎病毒、新城疫病毒或其他能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中生長的病毒。
21.權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其中所述的微生物是傷寒沙門氏菌、雙歧桿菌、志賀氏菌、李斯特菌、鼠疫桿菌或其他能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中生長的細(xì)菌。
22.權(quán)利要求19-21中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述的能粘附腫瘤細(xì)胞抗原的并被抗原提呈細(xì)胞所識(shí)別的蛋白是來源于哺乳動(dòng)物或病原微生物的熱休克蛋白。
23.如權(quán)利要求22所述的藥物組合物，其中所述的哺乳動(dòng)物是人。
24.如權(quán)利要求23所述的藥物組合物，其中所述的熱休克蛋白為來源于人的熱休克蛋白Hsp70、Hsp96、Hsp90或其他的熱休克蛋白。
25.如權(quán)利要求22所述的藥物組合物，其中所述的熱休克蛋白來源于病原微生物，所述的病原微生物包括結(jié)核分支桿菌、麻風(fēng)分支桿菌、克氏椎蟲和惡性瘧原蟲。
26.一種治療腫瘤的方法，包括給腫瘤患者施用一種免疫有效量的權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)所述的藥物。
27.一種治療腫瘤的方法，包括給腫瘤患者施用一種免疫有效量的權(quán)利要求19-25中任一項(xiàng)所述的藥物組合物。
28.權(quán)利要求26或27所述的治療腫瘤的方法，其中所述的腫瘤包括良性腫瘤和惡性腫瘤。
29.權(quán)利要求28所述的治療腫瘤的方法，其中所述的惡性腫瘤包括黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、宮頸癌和白血病。
30.權(quán)利要求26或27所述的治療腫瘤的方法，其中所述的施用是通過腫瘤內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、口服、粘膜內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥、直腸內(nèi)給藥方式完成的。
全文摘要
本發(fā)明提供了表達(dá)熱休克蛋白的溶瘤微生物、含有該微生物的藥物或藥物組合物，以及使用該微生物殺死局部的及轉(zhuǎn)移的腫瘤的方法。所述的溶瘤微生物包括能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中生長從而將腫瘤細(xì)胞溶解的病毒和細(xì)菌。給腫瘤患者施用本發(fā)明的微生物后，所述微生物在溶解腫瘤細(xì)胞的同時(shí)還表達(dá)熱休克蛋白。所表達(dá)的熱休克蛋白與腫瘤細(xì)胞溶解所釋放的腫瘤抗原粘附，并與抗原提呈細(xì)胞結(jié)合，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞特異性的免疫反應(yīng)，從而殺死轉(zhuǎn)移的腫瘤。
文檔編號(hào)A61K35/76GK1412295SQ0114169
公開日2003年4月23日 申請(qǐng)日期2001年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月9日
發(fā)明者陳思毅, 胡放 申請(qǐng)人:杭州康科生物技術(shù)有限公司