專利名稱：檢測免疫反應(yīng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測化合物的免疫反應(yīng)的方法，尤其是在篩選用于治療疾病的化合物中。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)上，轉(zhuǎn)化的永生免疫細(xì)胞系一直用作藥物篩選的效應(yīng)物。例如，巨噬細(xì)胞系(RAW 264.7)在免疫調(diào)節(jié)和抗癌藥物篩選領(lǐng)域中是一種最常用的細(xì)胞系。然而，這種方案可能忽視重要的原則廣譜免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)的開始要求巨噬細(xì)胞，B細(xì)胞和T細(xì)胞的間接相互作用。結(jié)果，具有潛力擔(dān)當(dāng)免疫調(diào)節(jié)藥的化學(xué)物和/或藥物在這些“傳統(tǒng)的”篩選體系中會輕易地得出不能誘導(dǎo)癌細(xì)胞系的凋亡和/或抗癌細(xì)胞因子(例如，TNF-α)的分泌，因為它們的活化途徑中缺乏一些必要組分。因此，它們不能顯示出作為免疫調(diào)節(jié)藥物的真正潛力。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)所述的至少一種或多種問題。最低程度，本發(fā)明的目的是給公眾提供一種有用的選擇。
發(fā)明概述本發(fā)明提供檢測物質(zhì)的免疫反應(yīng)的方法，包括將所述化合物與有生存能力的脾細(xì)胞溫育的步驟。
優(yōu)選地，有生存能力的脾細(xì)胞抽提自大鼠。
優(yōu)選地，所述物質(zhì)與脾細(xì)胞在緩沖液中于約20-40℃，更優(yōu)選約37℃下溫育。
另外，與有生存能力的脾細(xì)胞溫育的物質(zhì)通過兩維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2DE)進(jìn)行分析，優(yōu)選以檢測至少一種下列蛋白的產(chǎn)量TNF-α，IFN-γ和iNOS，hoemotic蛋白LH-2，細(xì)胞色素C氧化酶多肽IV前體，DNA聚合酶β，鳥嘌呤核苷酸-結(jié)合蛋白G，T-細(xì)胞表面糖蛋白CD5前體以及α-甘露糖苷酶II。
優(yōu)選地，所述物質(zhì)與脾細(xì)胞在緩沖液中于pH約5-9，更優(yōu)選于pH約7下溫育。
附圖簡述本發(fā)明優(yōu)選的實施方案通過實施例方式并參照附圖現(xiàn)將加以解釋，在附圖中

圖1利用Wright-Giemsa染色(X1000)示出分離的脾細(xì)胞；圖2示出Rg1對TNF-α，IFN-γ分泌和iNOS合成的影響，圖2A，2B和2C分別示出Rg1處理后TNF-α，IFN-γ分泌和iNOS合成的免疫印跡；圖3示出采用和沒采用Rg1(5μg/ml)處理后從脾細(xì)胞中分泌TNF-α和IFN-γ的時程；圖4示出通過“二位一體(Two-in-One)凝膠”比較，在Rg1存在或缺乏下，脾細(xì)胞中的差異蛋白表達(dá)。Rg1處理樣品示于左邊，而對照樣品示于右邊。4A示出pH 4-5.5的樣品，而4B示出pH 5.5-7的樣品；圖5示出通過總結(jié)Rg1對脾細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響，Rg1對脾細(xì)胞中蛋白表達(dá)的影響，以及涉及Rg1對脾細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性的可能的調(diào)節(jié)機(jī)理。
優(yōu)選實施方案的詳述本發(fā)明參照附圖通過實施例方式在以下段落中加以描述。
本發(fā)明的目的，特征和方面在下文中公開，或者從下文中顯而易見。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，下文僅是對示例性實施方案的描述，并非旨在限制本發(fā)明的范圍，更寬的范圍體現(xiàn)在代表性解釋中。
在本發(fā)明中，與傳統(tǒng)利用細(xì)胞系的方法相反，脾細(xì)胞原始培養(yǎng)物用于藥物篩選中。這種脾細(xì)胞培養(yǎng)物含有全部3種對起始廣譜免疫反應(yīng)所必需的免疫細(xì)胞(約30％B淋巴細(xì)胞，60％CD3+T淋巴細(xì)胞和5％巨噬細(xì)胞)。這類脾細(xì)胞可抽提自任何適于藥物篩選的哺乳動物，例如大鼠，狗，貓，小鼠，豚鼠，牛，鹿，猴子等。
為了實施藥物篩選功能，脾細(xì)胞必須是有生存能力的。術(shù)語“有生存能力”在此表示脾細(xì)胞仍是活的，對此現(xiàn)有技術(shù)能夠操作。這種有生存能力的細(xì)胞在細(xì)胞和0.4％w/v臺盼藍(lán)溶液1∶1的混合物中不會被臺盼藍(lán)染色。有生存能力的脾細(xì)胞可采用已知方法從動物中去除，合適的實施例將在下文中進(jìn)行描述。非生存能力的細(xì)胞在篩選平臺上不可用作效應(yīng)物，因為它們不能被藥物候選物刺激，和/或彼此有效相互作用。有生存能力的脾細(xì)胞通?？稍趧游锛?xì)胞培養(yǎng)工作所常用的大多數(shù)培養(yǎng)基中令人滿意地加以培育。然而，脾細(xì)胞不可經(jīng)受極端溫度范圍(即低于20℃和高于40℃)。有生存能力的脾細(xì)胞的最適溫度為37℃。此外，如果培養(yǎng)基處于極端pH(即高于pH 9和低于pH 5)下，脾細(xì)胞的生存力也將下降。
待檢測的化合物一般以溶液的形式存在，然后通過多種方法將其施用給有生存能力的脾細(xì)胞。例如，化合物(沒有內(nèi)毒素污染)可被直接添加到有生存能力的脾細(xì)胞上。這當(dāng)然會隨待檢測化合物的不同而不同，但是將化合物添加給脾細(xì)胞不是本發(fā)明的主題。
在檢測人參Rg1的免疫反應(yīng)中采用有生存能力的脾細(xì)胞將在下文詳細(xì)描述。
實施例高度純化的Rg1為人參中一種主要的皂角苷，已經(jīng)顯示可抑制癌細(xì)胞的生長。其刺激DNA，蛋白和脂類在動物組織中的生化合成。Rg1還顯示擔(dān)當(dāng)免疫調(diào)節(jié)劑，使得內(nèi)皮細(xì)胞中一氧化氮產(chǎn)量在Rg1誘導(dǎo)后增加，T輔助細(xì)胞活性，細(xì)胞因子IL-1以及自然殺傷細(xì)胞的產(chǎn)量增加。其他屬性包括選擇性增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的增殖和IL-2的產(chǎn)生。假設(shè)人參苷(ginsenoside)抗致癌效應(yīng)可能與或通過胱冬肽酶(caspase)3和/或由活性氧起始的凋亡效應(yīng)相關(guān)。盡管對人參效應(yīng)的研究歷史悠久，但其作用的分子機(jī)理大部分仍知之甚少。
材料和方法動物周齡8-10、體重200g的雄性Sprague Dawley大鼠由香港理工大學(xué)應(yīng)用生物和化學(xué)技術(shù)系動物中心(the animal holding center of theDepartment of Applied Biology and Chemical Technology，The HongKong Polytechnic University)提供。所有研究都是根據(jù)最新公布的對實驗室動物護(hù)理和使用的NIH指南(the NIH Guide for the Care and Useof Laboratory Animals)中所述的原理和程序進(jìn)行的。動物倫理學(xué)批文已從香港理工大學(xué)動物倫理學(xué)分委員會獲得。
制備大鼠脾細(xì)胞將大鼠在醚深度麻醉下放置，并經(jīng)腹部大動脈放血。通過無菌技術(shù)移出脾臟，接著在10ml含有1000U/ml青霉素-鏈霉素(PS)(Gibco，USA)的RPMI-1640(Gibco，USA)培養(yǎng)基中洗滌兩次。把脾臟切成小塊后，在塑料注射器中用柱塞上下抽吸。制備單個細(xì)胞懸浮液，并放置在含有1000U/ml PS和5％檸檬酸葡萄糖的同樣培養(yǎng)基中。然后通過梯度離心將單細(xì)胞懸浮液分層到Ficoll-Pague Plus梯度(Amersham Bioscience，H.K.Ltd.)上而分離脾細(xì)胞，室溫下以400g離心35分鐘。收集含脾細(xì)胞的組分。室溫下加入4倍體積的冰冷氯化銨溶液(pH 7.4)而裂解紅細(xì)胞5分鐘，將脾細(xì)胞在普通培養(yǎng)基中洗滌兩次。淋巴細(xì)胞用Wright-Giema著色劑染色后，再在光學(xué)顯微鏡下檢查。臺盼藍(lán)染色后，經(jīng)光學(xué)顯微鏡檢查細(xì)胞生存力和數(shù)目。將脾細(xì)胞(1×106)培養(yǎng)在含有1000U/ml PS、補(bǔ)充有2g/L碳酸鈉的完全RPMI-1640培養(yǎng)基上。24小時溫育后，使細(xì)胞重懸浮在含有10％FCS(Gibco，USA)的同樣培養(yǎng)基上，并進(jìn)行多種處理。
用Rg1刺激脾細(xì)胞將Rg1(常用劑量5μg/ml)加入到位于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)6孔平底板(Nunc Maxisorp，USA)上脾細(xì)胞的PBS緩沖液中。在不同時間點(12-72小時)從溫育混合物中采集條件培養(yǎng)基的樣品。這些樣品儲存在-80℃?zhèn)溆谩悠繁４娌怀^兩個月。此外，在Rg1處理的脾細(xì)胞的樣品(間隔12和24小時)中使用2-DE分析也進(jìn)行全蛋白的表達(dá)。與PBS溫育24小時的細(xì)胞用作對照。
Western印跡和免疫檢測在不同時間點采集與Rg1溫育和沒有與Rg1溫育的脾細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液，并且用于檢測TNF-α和IFN-γ。同樣，脾細(xì)胞裂解液用于檢測iNOS的表達(dá)。上清液/裂解液中的蛋白含量通過Bradford方法(Bio-Rad Laboratory，USA)確定。對于各個分析，通過12.5％還原性SDS-PAGE膠在恒壓(150V)下電泳1小時，分析350μg蛋白。蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Millipore，USA)上。洗滌和封閉后，以1∶500的稀釋度，對這些膜用下列探針進(jìn)行檢查兔抗大鼠iNOS(Transduction Laboratories，USA)，兔抗大鼠TNF-α(PropTech，USA)或兔抗大鼠IFN-γ(PropTech，USA)。室溫溫育2小時后，洗滌這些膜，然后與1∶20,000稀釋的結(jié)合有IgG(Sigma，USA)的山羊抗兔辣根過氧化物酶(HRP)溫育。使用SuperSignal West PicoChemiluminescent試劑盒(Pierce，USA)檢測陽性結(jié)合，而使用分子動力學(xué)密度儀(Molecular Dynamics Densitometer)(Bio-RadLaboratories，USA)掃描曝光的X線膠片(Kodak)。
ELISA測定使用OptEIATM大鼠IFN-γ和TNF-α試劑盒(Pharmigen，USA)進(jìn)行IFN-γ以及TNF-αELISA測定。對使用或沒用Rg1刺激的脾細(xì)胞進(jìn)行檢測。在這些試劑盒中，單克隆抗大鼠IFN-γ或TNF-α抗體用作一級抗體，而生物素酰化的單克隆抗大鼠IFN-γ或TNF-α抗體用作二級抗體。加入親和素-HRP結(jié)合物后，再加入2，2-Azin-bis-3-thylbenzthiazoline-6-sulfonic acid顯色，并且采用微滴定板讀數(shù)儀(Bio-Rad Laboratories，USA)在吸光度405nm處監(jiān)測顏色變化。與標(biāo)準(zhǔn)相比，計算IFN-γ和TNF-α的量。
2-DE分析脾細(xì)胞裂解液樣品制備在與或不與Rg1溫育后，將培養(yǎng)皿上的脾細(xì)胞以RPMI-1640沖洗一遍。隨后，加入含有0.2g/L EDTA的0.5g/L胰蛋白酶，溫育3分鐘。以1000g離心5分鐘收集細(xì)胞，并用PBS(pH 7.2)洗滌兩次。然后將脾細(xì)胞用最低量的含有4％Triton X-100，9M尿素和1mMPMSF的裂解緩沖液(通常200μl)在冰上裂解10分鐘。以3000g離心10分鐘收集上清液，采用Bio-Rad Laboratories，USA的蛋白分析試劑盒通過改進(jìn)的Bradford法測量蛋白含量。經(jīng)同樣處理的不同動物的細(xì)胞裂解液以1∶1的蛋白比率合并在一起，并用作2-DE分析。120μl的脾細(xì)胞裂解液[在含有9M尿素，2％w/v Triton X-100，0.5％w/vDDT(Sigma，USA)，0.4％v/v IPG緩沖液4-7(Amersham PharmaciaBiotech，Uppsala，Sweden)和痕量溴酚蘭的緩沖液中至終體積300μl中]用于膠內(nèi)樣品再水合。
2-DE把樣品上樣到IPG膠條pH 4-7(3×170mm，Bio-RadLaboratories，USA)。使用Protean IEF儀(Bio-Rad Laboratories，USA)或IPGphor(Amersham Biosciences，USA)進(jìn)行再水合和隨后的等電聚焦。室溫下在覆蓋有低粘度石蠟油的IPG膠條固定器上以50V進(jìn)行再水合16小時。然后依序使用500V(1小時)，1000V(1小時)，4000V(2小時)和8000V(2小時)進(jìn)行等電聚焦。膠條平衡在pH 6.8，含有1％(w/v)DTT(Sigma，USA)、9M尿素、30％v/v甘油、2％w/vSDS和痕量溴酚蘭的50mM Tris-HCl平衡緩沖液中10分鐘。平衡后，IPG膠條轉(zhuǎn)移至12.5％SDS-PAGE凝膠(1600×1600×1mm)，用于在Protean VI電泳槽中室溫下以恒電流30mA/凝膠電泳進(jìn)行第二維分離。隨后，使用與MALDI-TOF分析相容的方法對膠銀染。銀染的膠以分子動力學(xué)密度儀(Bio-Rad Laboratories，USA)掃描。所得2-DE形式采用軟件Melanie III(Bio-Rad Laboratories，USA)加以分析。在銀染蛋白點中以體積百分比變化的基礎(chǔ)上，對相對量的變化進(jìn)行評價。目的點變化在多凝膠上測試用于重現(xiàn)性。
銀染使蛋白顯現(xiàn)按本發(fā)明人使用MALDI-TOF質(zhì)譜儀的制造商Bruker Deltonics(USA)所建議的質(zhì)譜儀相容的方案進(jìn)行銀染。簡而言之，首先將凝膠在含有50％v/v甲醇，12％v/v乙酸，0.0375％v/v甲醛的固定溶液中固定2小時。隨后用50％甲醇另洗滌凝膠20分鐘。洗滌步驟重復(fù)兩次。凝膠在含有0.05％硫代硫酸二鈉的溶液中氧化1分鐘，接著用milli-Q水洗滌(三次，每次20分鐘)。把凝膠在含有0.0375％甲醛的0.2％硝酸銀中溫育20分鐘。再次用milli-Q水洗滌凝膠三次，每次20分鐘。然后在含有0.0375％甲醛和0.004％硫代硫酸二鈉的15％碳酸鈉溶液中使凝膠顯色，直到凝膠達(dá)到所需量的染色。該過程不應(yīng)長于10分鐘。最后，用含有12％乙酸的25％甲醇終止反應(yīng)。
蛋白鑒定或通過軟件Melanie III(Bio-Rad，USA)進(jìn)行圖像分析，或直接利用如前所述的“二位一體”膠法(Wang，A.Y.Y.，Cheung，B.Y.，Wong，M.S.，Lo，S.C.L.兩維電泳后“二位一體”凝膠用于點匹配，Proteomics2003，3，580-583)加以比較，而將不同處理后差異表達(dá)的蛋白定位于2-DE凝膠上。使用MALDI-TOF-MS(Autoflex，Bruker Daltonics，Germany)通過肽質(zhì)量指紋識別選擇和鑒定若干種差異表達(dá)的蛋白點。含有差異表達(dá)的蛋白點的膠塞從2-DE凝膠上切去，并用胰蛋白酶消化(采用由Bruker Daltonics，Germany建議的方案，該方案是如先前由Shevchenko等(Shevchenko A，Wilm M，Vorm O，Mann M.質(zhì)譜測序蛋白銀染的聚丙烯酰胺凝膠。Aanl.Chem.68850-8，1996)所述方法的改進(jìn))。簡而言之，膠塞被切成小塊，用milli-Q水洗滌兩次，接著用25mM碳酸氫銨的50％乙腈洗滌。樣品中的半胱氨酸殘基用10mMDTT還原，并用55mM碘代乙酰胺處理而衍生化。乙腈再水合和干燥后，樣品用胰蛋白酶(5ng/μl胰蛋白酶的25mM碳酸氫銨)37℃下消化過夜。消化樣品用50％乙腈/1％三氟乙酸通過超聲抽提。收集含有消化的肽的上清液。消化的肽(0.5μl-1.5μl)與1-2μl的α-氰基-4-羥基肉桂酸(10mg/ml的50％乙腈，0.1％三氟乙酸)基質(zhì)和100fM促腎上腺皮質(zhì)激素(ATCH)片段18-39混合作為內(nèi)標(biāo)。儀器以陽離子反射方式在20kV加速壓下操作。所得肽質(zhì)量指紋使用矩陣科學(xué)(Matrix Science)的MSCOT搜索引擎對Swiss-Prot進(jìn)行檢索。所有檢索都使用1-100kDa的質(zhì)量窗以質(zhì)量公差±100ppm進(jìn)行。每個樣品允許有一個失誤切割，而半胱氨酸假定是氨基甲酰胺基甲基化的，以及甲硫氨酸為氧化形式。
結(jié)果脾細(xì)胞分離如上文方法所述制備脾細(xì)胞，并在Wright-Giemsa染色后檢查細(xì)胞。采用Leica Q500MC成像處理和分析系統(tǒng)(Leica，Germany)，分離的脾細(xì)胞(大和小淋巴細(xì)胞)圖像示于圖1中。未見紅細(xì)胞污染。臺盼藍(lán)染色證實95％以上的分離細(xì)胞是有生存能力的。由于大和小淋巴細(xì)胞皆存在，該制備物可用作研究Rg1的免疫調(diào)節(jié)活性的效應(yīng)物。
根據(jù)IFN-γ，TNF-α和iNOS產(chǎn)量測定Rg1對脾細(xì)胞的影響在成功制備有生存能力的脾細(xì)胞之后，加入Rg1作為刺激物以研究這些脾細(xì)胞可能的反應(yīng)。Western印跡檢測IFN-γ和TNF-α在培養(yǎng)基中的分泌。iNOS的表達(dá)也在脾細(xì)胞裂解液中加以測試。大多數(shù)藥理學(xué)研究Rg1所用的濃度為5-20μg/ml。一方面，預(yù)備研究利用5μg/ml的Rg1，導(dǎo)致在IFN-γ和TNF-α試驗中的陽性結(jié)果。因此，5μg/ml的Rg1用于本發(fā)明人試驗中。IFN-γ，TNF-α和iNOS在不同時間間隔處Rg1誘導(dǎo)時Western印跡的結(jié)果示于圖2(2A為TNF-α，2B為IFN-γ，而2C為iNOS)中。沒有Rg1處理的脾細(xì)胞用作比較用對照。結(jié)果顯示，對照組在72小時的溫育過程中，細(xì)胞培養(yǎng)基或脾細(xì)胞裂解液均未檢測到IFN-γ，TNF-α和iNOS。另一方面，當(dāng)用5μg/ml Rg1刺激時，可檢測到兩個細(xì)胞因子和iNOS。TNF-α在間隔24小時和48小時皆被檢測到，而IFN-γ在24小時被檢測到。誘導(dǎo)的NOS在用Rg1溫育后12小時和24小時被檢測到。隨后，利用ELISA對培養(yǎng)基的系列樣品進(jìn)行這些抗癌細(xì)胞因子(IFN-γ和TNF-α)的定量記錄。各個條件重復(fù)測定三次，結(jié)果示于圖3中。兩個細(xì)胞因子的分泌方式誘導(dǎo)后很相似。這些細(xì)胞因子的數(shù)量在Rg1誘導(dǎo)后增加1000倍以上，而其水平在溫育24小時時達(dá)到最高。24小時后，兩個細(xì)胞因子分泌水平隨著溫育時間延長開始下降。該結(jié)果也與Western印跡的結(jié)果一致，在Western印跡中，最高的IFN-γ和TNF-α分泌出現(xiàn)在Rg1誘導(dǎo)后24小時處。
Rg1對蛋白表達(dá)的影響由于Rg1發(fā)現(xiàn)在溫育24小時后誘導(dǎo)IFN-γ和TNF-α生產(chǎn)，因此在溫育24小時后還研究了Rg1對脾細(xì)胞蛋白質(zhì)組(proteome)的影響。同樣處理的樣品以1∶1的蛋白比率合并，并用于如材料和方法中所述的2-DE分析。無論在PBS還是在含有Rg1的PBS中，全部樣品皆在溫育24小時后采集。與PBS溫育的樣品用作比較用對照。為了便于鑒定差異表達(dá)的蛋白，如前所述(Wang等，2003)進(jìn)行“二位一體”凝膠方法。簡而言之，樣品第一維IEF(使用或沒用Rg1溫育)分開在不同Protean IEF細(xì)胞中但同時進(jìn)行。IEF完成后，將IEF膠條切成等半。半份IEF膠條對應(yīng)于同樣的pH范圍，但以不同樣品(有或無Rg1溫育)電泳，并排放到Protean VI電泳裝置中制備的第二維SDS-PAGE的頂部。所得對照樣品的凝膠和Rg1處理樣品的凝膠在銀染后利用Melanin III加以比較。圖4表明蛋白表達(dá)在正常樣品和Rg1處理樣品中的差異。在用正常樣品電泳的一半凝膠中約有102個蛋白點被檢測，而在用Rg1處理的樣品電泳的另一半凝膠中有122個蛋白點被檢測。
蛋白鑒定在凝膠內(nèi)胰蛋白酶消化后，MALDI-TOF-MS用于鑒定差異表達(dá)的蛋白。7個差異表達(dá)的蛋白點通過MASCOT搜索引擎得以成功鑒定。6個蛋白被上調(diào)，包括細(xì)胞色素C氧化酶，homeotic蛋白LH-2，T細(xì)胞表面糖蛋白CD5，DNA聚合酶β，α-甘露糖苷酶II以及鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白G。其他蛋白發(fā)現(xiàn)是下調(diào)的，并且被鑒定為假設(shè)的抗增殖因子。7個鑒定的蛋白的詳情匯總在表1中。
表I.脾細(xì)胞的差異表達(dá)的蛋白點的身份。
討論大鼠脾細(xì)胞由巨噬細(xì)胞，T細(xì)胞和B細(xì)胞組成。這群細(xì)胞用作效應(yīng)物對Rg1是否存在免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行測試。利用Western印跡和ELISA，發(fā)現(xiàn)Rg1刺激了脾細(xì)胞的IFN-γ，TNF-α和iNOS的產(chǎn)生。Rg1誘導(dǎo)后，IFN-γ和TNF-α的產(chǎn)量在24小時達(dá)到峰值。本發(fā)明人的結(jié)果與Gao等(Gao H.，Wang，F(xiàn).，Lien，E.J.，Trousdale M.D.PharmaceuticalResearch 1996，13，1196-200)的報道相似，其中在用三七(Panaxnotoginseng)的粗制品對分離自小鼠脾臟的淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)后24小時和48小時檢測到最高量的IFN-γ和TNF-α。在本發(fā)明人的試驗中，對IFN-γ和TNF-α的產(chǎn)生達(dá)到其峰值的時間較短。這可能是由于下列事實純化的Rg1而非粗制品用于本發(fā)明人的研究中。
另一方面，Rg1對分子水平的作用方式可能已被揭示出來，這在其他研究中尚未發(fā)現(xiàn)。脾細(xì)胞中的差異蛋白表達(dá)通過Rg1誘導(dǎo)加以研究?；谥苯颖容^“二位一體”凝膠的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了蛋白表達(dá)在正常樣品和Rg1處理樣品之間的顯著變化。有87個蛋白發(fā)現(xiàn)是上調(diào)的，而另有38個蛋白發(fā)現(xiàn)是下調(diào)的。還有38個點沒有任何顯著的變化。
胰蛋白酶消化后，利用MALDI-TOF-MS對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了選擇和鑒定。有7個蛋白成功地得以鑒定，其中6個是上調(diào)蛋白。它們是細(xì)胞色素C氧化酶，homeotic蛋白LH-2，T細(xì)胞表面糖蛋白CD5，DNA聚合酶β，α-甘露糖苷酶II以及鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白G。剩余蛋白點(假設(shè)的抗增殖因子)發(fā)現(xiàn)是下調(diào)的。從文獻(xiàn)中可知，DNA聚合酶β相關(guān)于DNA合成。其上調(diào)表明Rg1刺激DNA合成。該刺激是否通過類固醇激素依賴的或不依賴的途徑介導(dǎo)現(xiàn)在還未知。Rg1對DNA合成的刺激效果也在大鼠和小鼠骨髓細(xì)胞中被觀察到。另一方面，還有兩個上調(diào)蛋白homeotic蛋白LH-2和T細(xì)胞表面糖蛋白CD5已知參與B細(xì)胞和T細(xì)胞增殖。據(jù)報道，homeotic蛋白LH-2是B淋巴細(xì)胞分化的早期標(biāo)記，也參與控制B細(xì)胞分化(Xu，Y.，Baldassare，M.，F(xiàn)isher，P.，Rathbun，G.，Oltz，E.M.，Yancopoulos，G.D.，Jessell，T.M.，Alt，F(xiàn).W.Proc Natl Acad Sci USA.，1993，90，227-31)。T細(xì)胞表面糖蛋白CD5為一跨膜蛋白，已知在調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖中擔(dān)當(dāng)受體(Vermeer，L.A.，deBoer，N.K.，Bucci，C.，Bos，N.A.，Kroese，F(xiàn).G.，Alberti，S.Eur.J.Immunol.1994，24，585-92)。另兩個鑒定的上調(diào)蛋白細(xì)胞色素C氧化酶和α-甘露糖苷酶II可能參與細(xì)胞代謝過程。細(xì)胞色素C氧化酶是一種參與呼吸鏈的氧化性磷酸化作用的線粒體膜酶(Kadenbach，B.Biochim.Biophys.Acta 2003，1604，77-94)。由于ATP是呼吸過程的終產(chǎn)物之一，當(dāng)細(xì)胞色素C增加時ATP的合成也很可能增加。已知細(xì)胞內(nèi)高的ATP含量歸功于細(xì)胞生長和增殖用的能量供應(yīng)。細(xì)胞色素C氧化酶還參與cAMP生成的跨膜信號傳導(dǎo)途徑(Frizzell，R.A.Am J Respir Crit Care Med.1995，151，S54-8)。α-甘露糖苷酶II為高爾基膜蛋白，控制甘露糖轉(zhuǎn)化為復(fù)合的N-glycon。其可能參與溶酶體合成，因為注定為溶酶體的蛋白在高爾基體內(nèi)通過加入6-磷酸甘露糖被共價修飾。然而，其真正的功能還不清楚。
鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白G是另一上調(diào)蛋白，為膜相關(guān)蛋白，其將許多類型的膜受體連接到多種第二信使系統(tǒng)上(Gilman，A.G.Ann.Rev.Biochem.1987，56，615-49)。β和γ亞基為把α亞基(一種外周蛋白)固定至質(zhì)膜上的疏水整合膜蛋白。已知G蛋白的一個組分Gsα·GTP能夠結(jié)合到腺苷?；h(huán)化酶，這刺激cAMP的產(chǎn)生(Lania，A.，Mantovani，G.，Spada，A.Eur.J.Endocrin.2001，145，543-559)。據(jù)報道，Rg1可增加老年動物中胞內(nèi)cAMP和cGMP，導(dǎo)致白介素2(IL-2)的表達(dá)以及脾細(xì)胞增殖(Liu M.，Zhang J.T.Yao Xue Xue Bao，1996，31，95-100)。因此，鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白G的上調(diào)可能暗示cAMP水平相應(yīng)的增加，而這又誘導(dǎo)IL-2表達(dá)和脾細(xì)胞增殖的相應(yīng)增加。假設(shè)的抗增殖因子，盡管其真正的功能還未確立，但據(jù)信抑制細(xì)胞增殖。因此，這種蛋白在Rg1處理后的下調(diào)表明細(xì)胞增殖的機(jī)會增加。
上述結(jié)果還顯示，Rg1處理后12小時和24小時檢測到iNOS。誘導(dǎo)的NOS已知產(chǎn)生一氧化氮，其在諸如血管舒張、抑制血小板聚集和神經(jīng)傳遞的不同生理過程中起重要作用。一氧化氮也已知擔(dān)當(dāng)細(xì)胞毒介導(dǎo)劑，并且歸功于巨噬細(xì)胞的殺菌和殺腫瘤活性[36]。因此，iNOS的上調(diào)可用于評價細(xì)胞的殺菌活性。這種酶的產(chǎn)生可能受到細(xì)胞因子(IFN-γ和TNF-α)的調(diào)節(jié)。Karupiah等報道了病毒復(fù)制受到IFN-γ誘導(dǎo)的NOS的抑制(Karupiah，G.，Xie，Q.W.，Buller，R.M.，Nathan，C.，Duarte，C.，MacMicking，J.D.Science 1993，261，1445-48)。這些研究人員提出了誘導(dǎo)NOS對于IFN-γ的實際抗病毒效果是必需和足夠的。文獻(xiàn)中還清楚記載了IFN-γ可與TNF-α協(xié)同作用，促進(jìn)iNOS的基因表達(dá)。此外，細(xì)胞色素C氧化酶和ATP在Rg1處理后的增加可能還增加iNOS的生成。蛋白激酶C(PKC)活性對于iNOS表達(dá)是必要的，其中PKC在結(jié)合到膜受體的過程中需要ATP。還已知PKC-介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)刺激G蛋白的活性。因此，iNOS的增加也會導(dǎo)致IL-2，IFN-γ和TNF-α的量的增加。7種鑒定的蛋白以及IL-2，IFN-γ，TNF-α和iNOS可能的相互作用所顯現(xiàn)出的免疫調(diào)節(jié)效果匯總在圖5中。
總之，免疫調(diào)節(jié)是一復(fù)雜的活動，涉及多種蛋白和細(xì)胞組分之間的相互作用。使用脾細(xì)胞對Rg1免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行篩選已證明在了解涉及Rg1免疫調(diào)節(jié)的機(jī)理方面是成功的。本發(fā)明可提供大規(guī)模篩選免疫調(diào)節(jié)用TCM以及癌癥治療新藥物的構(gòu)思。
盡管本發(fā)明的優(yōu)選實施方案已通過實施例詳細(xì)描述，但是顯而易見，本領(lǐng)域技術(shù)人員會對此進(jìn)行修飾和改進(jìn)。另外，本發(fā)明的實施方案不應(yīng)解釋為僅受到實施例或附圖的限制。然而，特別值得注意的是，這些修飾和改進(jìn)也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)，正如權(quán)利要求書所述。例如，作為一個實施方案的部分所述的特征可用于另一實施方案中從而產(chǎn)生其他實施方案。因此，本發(fā)明旨在覆蓋如同在權(quán)利要求的范圍內(nèi)的這些修飾和變化及其等同物。
權(quán)利要求
1.一種檢測物質(zhì)對生物體的工作機(jī)理的方法，包括將該化合物與有生存能力的脾細(xì)胞溫育的步驟。
2.權(quán)利要求1的方法，其中有生存能力的脾細(xì)胞抽提自大鼠。
3.權(quán)利要求1的方法，其中該物質(zhì)與脾細(xì)胞在緩沖液中約20-40℃下溫育。
4.權(quán)利要求3的方法，其中該物質(zhì)與脾細(xì)胞在緩沖液中約37℃下溫育。
5.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括通過兩維聚丙烯酰胺凝膠電泳分析與有生存能力的脾細(xì)胞溫育的物質(zhì)的步驟。
6.權(quán)利要求5的方法，其進(jìn)一步包括檢測至少一種下列蛋白和/或其前體和/或其分解產(chǎn)物產(chǎn)量的步驟TNF-α，IFN-γ和iNOS，hoemotic蛋白LH-2，細(xì)胞色素C氧化酶多肽IV前體，DNA聚合酶β，鳥嘌呤核苷酸-結(jié)合蛋白G，T-細(xì)胞表面糖蛋白CD5前體以及α-甘露糖苷酶II。
7.權(quán)利要求1的方法，其中該物質(zhì)與脾細(xì)胞在緩沖液中pH約5-9下溫育。
8.權(quán)利要求7的方法，其中該物質(zhì)與脾細(xì)胞在緩沖液中pH約7下溫育。
9.權(quán)利要求1的方法，其中工作機(jī)理為免疫反應(yīng)。
全文摘要
傳統(tǒng)上，轉(zhuǎn)化的永生免疫細(xì)胞系一直用作藥物篩選的效應(yīng)物。這種方案可能忽視重要的原則廣譜免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)的開始要求巨噬細(xì)胞，B細(xì)胞和T細(xì)胞的間接相互作用。本發(fā)明利用有生存能力的脾細(xì)胞提供檢測物質(zhì)的免疫反應(yīng)的方法。
文檔編號A61P37/00GK1645143SQ20051000420
公開日2005年7月27日 申請日期2005年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月14日
發(fā)明者盧俊立, 黃文秀, 王淵淵 申請人:香港理工大學(xué)