專利名稱：含有人干擾素的藥物組合物在制備預(yù)防或/和治療呼吸道病毒感染疾病藥物方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有人干擾素的藥物組合物在制備預(yù)防或/和治療呼吸道病毒感染疾病藥物方面的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
干擾素(interferons，IFNs)是一類(lèi)至少在同種細(xì)胞上有廣譜抗病毒、抗細(xì)胞分裂、免疫調(diào)節(jié)活性和在不同途徑上影響細(xì)胞的代謝、生長(zhǎng)和分化的蛋白質(zhì)，其活性的發(fā)揮需新合成RNA和蛋白質(zhì)。它是一類(lèi)重要的細(xì)胞素.經(jīng)近30多年的臨床研究和應(yīng)用，說(shuō)明它是一種重要的廣譜抗病毒、抗腫瘤治療藥物。
迄今所知，人干擾素存在多個(gè)型別干擾素-α，β，δ，γ，ε，κ，λ，τ和ω等型別，它們的主要特點(diǎn)和可能的臨床應(yīng)用見(jiàn)下表

目前，研究較多并用于臨床治療的有α、β、γ；其它型別干擾素的臨床應(yīng)用價(jià)值尚在研究之中。
干擾素目前主要用于抗病毒和腫瘤治療方面，具有相當(dāng)明顯的療效，尤其在肝炎的治療方面被認(rèn)為是首選藥物。鑒于干擾素的廣譜抗菌作用，很有希望用于SARS及其它呼吸道病毒感染疾病的治療，因而，在呼吸道病毒感染疾病方面進(jìn)行干擾素的應(yīng)用研究十分必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種含有人干擾素的藥物組合物在制備預(yù)防或/和治療呼吸道病毒感染疾病藥物方面的用途。
所述的呼吸道病毒可以是濾泡性口腔炎病毒(VSV)，禽流感病毒，SARS冠狀病毒，鼻病毒，麻疹病毒，腸道病毒，腺病毒，皰疹病毒，漢坦病毒。
所述的禽流感病毒可以是低致病性禽流感H9H2或高致病性禽流感H5N1。
所述的鼻病毒可以是鼻病毒14型。
所述的皰疹病毒可以是單純皰疹病毒-1(HSV-1)或單純皰疹病毒-2(HSV-2)。
所述的腸道病毒可以是腸道病毒CoxB1。
所述的腺病毒可以是腺病毒7型。
上述藥物組合物含有如下重量份的組分人干擾素 1-99其它輔料 1-99。
所述的重量份可以是斤、兩、g、Kg等藥劑學(xué)上常用的計(jì)量單位。
本發(fā)明藥物組合物通過(guò)進(jìn)一步的處理，可以制成藥劑學(xué)上可接受的各種劑型，優(yōu)選為注射劑、噴(氣)霧劑、凍干粉針等。
輔料含有保護(hù)劑、緩沖溶液。
其中，為了不影響干擾素的活性發(fā)揮，組分中保護(hù)劑的含量應(yīng)不高于0.2％，一般應(yīng)控制在0.1-0.2％之間。
緩沖溶液的用量應(yīng)在10-50mmol/L之間，優(yōu)選含量為15-25mmol/L。
上述的人干擾素優(yōu)選人干擾素α2b、α1b、β，還可以是其它I型干擾素，如干擾素ω、干擾素κ、干擾素λ、干擾素ε、即所有人I型干擾素。
上述人干擾素可以是重組人干擾素，也可以是用其他方法制備的人干擾素，如提取的自然人干擾素。
上述的重組人干擾素可以是采用原核表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)或真核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)制備的重組人干擾素。
上述人干擾素優(yōu)選為人干擾素α2b或重組人干擾素α2b。
上述保護(hù)劑可以是人白蛋白、牛血清白蛋白、甘露醇、氯化鈉、聚糖、麥芽糖、苯甲醇、聚乙烯醇、甘油等可用的物質(zhì)。
緩沖溶液優(yōu)選磷酸緩沖液。
可以選擇其中的全部或部分使用，用量為藥劑學(xué)上的有效劑量，以實(shí)現(xiàn)緩沖、穩(wěn)定、防腐作用。
上述人干擾素可以通過(guò)發(fā)酵工程制備得到，也可通過(guò)商購(gòu)得到。
上述組合物劑型中，按照實(shí)際用量的需要，人干擾素的活性可以是0.1-500萬(wàn)IU/mL或0.1-500萬(wàn)IU/g。
干擾素噴霧劑要求干擾素必須達(dá)到一定濃度才能有好的效果，而提高干擾素的濃度卻使噴霧劑的穩(wěn)定性變差，因此制備高濃度的干擾素噴霧劑是一個(gè)需要突破的技術(shù)問(wèn)題。
本發(fā)明研究人員發(fā)現(xiàn)，在輔料中選用麥芽糖可以很好的增加制劑的穩(wěn)定性，特別是使噴霧劑的穩(wěn)定性得以增強(qiáng)。
上述劑型的制備方法可以是藥劑學(xué)上的通用方法。
所制得的藥物制劑可以用來(lái)預(yù)防、治療、預(yù)防和治療呼吸道病毒感染藥物，特別是用來(lái)制備預(yù)防、治療、預(yù)防和治療SARS病毒、副流感病毒或流感病毒等引起的呼吸道感染藥物。
從實(shí)驗(yàn)室研究、猴體試驗(yàn)和較大規(guī)模的臨床驗(yàn)證研究已經(jīng)獲得的大量數(shù)據(jù)證明本發(fā)明噴霧劑預(yù)防SARS病毒、副流感病毒、流感病毒等引起的呼吸道感染有較確切的流行病學(xué)效果。
本發(fā)明研究人員發(fā)現(xiàn)重組人干擾素α2b以及其它類(lèi)型的干擾素在細(xì)胞培養(yǎng)上可以抑制SARS病毒的繁殖。
本發(fā)明研究人員采用經(jīng)典的干擾素活性測(cè)定方法，采用SARS病毒-RDa細(xì)胞(人橫紋肌瘤細(xì)胞株)系統(tǒng)，將生長(zhǎng)在10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基的RDa細(xì)胞按1×105/ml接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔體積100μl，過(guò)夜培養(yǎng)后加入100μl系列稀釋的干擾素α2b、α1b、β、ω(各三個(gè)平行孔)，作用12小時(shí)后棄培養(yǎng)液，重新加入用含2％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋的50×TCID50的SARS病毒150μl(中國(guó)疾控中心病毒病所分離、培養(yǎng))，24小時(shí)后觀察病變，待病毒對(duì)照完全病變后，目測(cè)記錄抑制50％細(xì)胞病變(CPE)的干擾素的最小量，結(jié)果證實(shí)重組人干擾素a2b、a1b、β在RDa細(xì)胞培養(yǎng)上對(duì)SARS病毒(冠9株)有明顯的抑制作用。
本發(fā)明所述的藥物組合物對(duì)預(yù)防或/和治療呼吸道病毒感染疾病有著很好的效果，而且藥物的副作用小，有利于病患者使用。


圖1正常對(duì)照組 HE染色 10×40 鼻腔部上皮組織未見(jiàn)增厚，組織結(jié)構(gòu)正常圖2給藥組 HE染色 10×40 上皮組織未見(jiàn)增生，角化不過(guò)度，組織結(jié)構(gòu)正常圖3正常對(duì)照組 HE染色 10×40 肌肉組織未見(jiàn)有腫脹，未見(jiàn)有炎癥圖4給藥組 HE染色 10×40 肌肉組織未見(jiàn)有腫脹圖5正常對(duì)照組 HE染色 10×40 血管內(nèi)有輕度淤血圖6給藥組 HE染色 10×40 血管內(nèi)有輕度淤血圖74種重組人干擾素抑制SARS病毒在Rda細(xì)胞系培養(yǎng)上50％病變的最小干擾素單位(n＝4)(各組之間顯著性測(cè)定P值均＞0.1)圖84種感染素抑制SARS病毒引起的50％病變的最小干擾素蛋白質(zhì)量(n＝4)在rIFN-a2b、IFN-w1b與rIFN-a1b之間，P＜0.02；其余各組間P＞0.05圖9微陣列基因芯片技術(shù)檢測(cè)SARS病毒在不同條件下的RNA轉(zhuǎn)錄水平。
AIFN-0表示沒(méi)有預(yù)先用干擾素α2b處理的SARS病毒各個(gè)基因的RNA水平；BIFN-1-100和CIFN-10000分別表示預(yù)先用干擾素α2b 100和10000IU處理細(xì)胞的條件下SARS病毒各個(gè)基因的RNA水平。
圖10重組人干擾素a2b抑制多種病毒在細(xì)胞培養(yǎng)上繁殖相對(duì)活性的比較(以抑制VSV引起病變的50％為1與其它病毒進(jìn)行比較)1VSV，2H9N2，3H5N1，4SARS，5MV，6CoxB1，7Ad-7，8HSV-1，9HSV-2，10EHFV，11RV圖11本發(fā)明產(chǎn)品抑制多種病毒在細(xì)胞培養(yǎng)上繁殖相對(duì)活性的比較(以抑制VSV引起病變的50％為1與其它病毒進(jìn)行比較)1VSV，2H9N2，3H5N1，4SARS，5MV，6CoxB1，7Ad-7，8HSV-1，9HSV-2，10EHFV，11RV圖12對(duì)照#0401肺組織局灶間質(zhì)性炎，局灶肺間隔增厚圖13對(duì)照組#0402肺組織間質(zhì)性炎，肺間隔增厚伴炎細(xì)胞浸潤(rùn)圖14試驗(yàn)組#0407肺組織形態(tài)基本正常圖15試驗(yàn)組#0408肺間質(zhì)性炎，增厚肺間隔內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)圖16試驗(yàn)組#0409肺間質(zhì)性炎，肺間隔融合伴炎細(xì)胞浸潤(rùn)圖17試驗(yàn)組#0410肺組織形態(tài)基本正常圖18干擾素組和對(duì)照組中和抗體滴度的幾何均數(shù)圖19SARS病毒攻擊后27天干擾素組和對(duì)照組IgG抗體滴讀的幾何均數(shù)圖20對(duì)照組和感染素組在SARS病毒攻擊后不同時(shí)間內(nèi)猴咽拭子病毒基因拷貝數(shù)的消長(zhǎng)情況(real-timePCR結(jié)果)?？v坐標(biāo)為SARS病毒攻擊后天數(shù)；縱坐標(biāo)為病毒基因拷貝數(shù)(log)圖21干擾素-α2b噴霧劑對(duì)SARS接觸者的預(yù)防感染效果(1,730例)(SARS-CoV-IgG抗體陽(yáng)性率)圖22第一階段實(shí)驗(yàn)兩組血清三種呼吸道病毒IgM檢測(cè)情況(927人)圖23第二階段實(shí)驗(yàn)兩組血清三種呼吸道病毒IgM檢測(cè)情況(558人)圖24第一、二階段實(shí)驗(yàn)兩組血清三種呼吸道病毒IgM檢測(cè)情況(1485人)圖25對(duì)照組與干擾素組免疫后陽(yáng)性標(biāo)本中的麻疹病毒基因拷貝數(shù)的比較圖26對(duì)照組與干擾素組免疫后陽(yáng)性標(biāo)本的風(fēng)疹病毒基因拷貝數(shù)的比較圖27對(duì)照組與干擾素組免疫后陽(yáng)性標(biāo)本中的麻疹病毒基因拷貝數(shù)的比較圖28對(duì)照組與干擾素組免疫后陽(yáng)性標(biāo)本的風(fēng)疹病毒基因拷貝數(shù)的比較圖29Ct值的確定圖30熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖31對(duì)照組與干擾素組免疫后陽(yáng)性標(biāo)本中的麻疹病毒基因拷貝數(shù)的比較圖32Ct值的確定圖33熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖34對(duì)照組與干擾素組免疫后陽(yáng)性標(biāo)本的風(fēng)疹病毒基因拷貝數(shù)的比較
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1按照藥劑學(xué)上的方法，制備噴霧劑，每瓶裝量為3.65毫升，其中重組人干擾素-α2b(北京遠(yuǎn)策藥業(yè)有限責(zé)任公司)活性含量為300萬(wàn)IU/毫升，人白蛋白含量為0.5％，苯甲醇含量為0.5％，聚糖含量為0.1％，磷酸緩沖液濃度為20mmol/L。
本實(shí)施例產(chǎn)品每瓶為300萬(wàn)IU/mL*3.65mL，一個(gè)預(yù)防療程為1瓶，使用3-5天，既保證了干擾素局部使用的有效劑量，又可限定用量。
對(duì)動(dòng)物進(jìn)行了試驗(yàn)，其對(duì)黏膜、皮損皮膚的刺激性與生理鹽水相似，未發(fā)現(xiàn)有嚴(yán)重副反應(yīng)，與美國(guó)IntronA粉針劑比較，其副作用為中度，而本實(shí)施例產(chǎn)品副作用可忽略不計(jì)，可見(jiàn)本發(fā)明產(chǎn)品噴霧劑的具有明顯的副作用小的優(yōu)點(diǎn)。
中藥研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行小鼠鼻咽給藥的安全性試驗(yàn)，結(jié)果表明噴霧劑未見(jiàn)明顯的鼻腔呼吸部的刺激癥狀，組織結(jié)構(gòu)正常。
實(shí)施例2按照注射劑的制備方法，將重組人干擾素-α1a(北京遠(yuǎn)策藥業(yè)有限責(zé)任公司)加入pH為7的磷酸緩沖溶液，使干擾素活性含量為100萬(wàn)IU/mL，加入苯甲醇作為防腐劑，重量含量為0.5％。
實(shí)施例3參照實(shí)施例2的方法，將得到的注射液分裝入西林瓶中，每瓶1.5毫升，冷凍干燥，得到凍干粉針劑。
實(shí)施例4取重組人干擾素-β(北京遠(yuǎn)策藥業(yè)有限責(zé)任公司)1000萬(wàn)IU，7.8g氯化鈉，3.5g Na2HPO4·12H2O，4.4g聚糖，加入注射用水，配制成1000mL溶液，使用H3PO4調(diào)節(jié)pH為7.0，制得水針劑，人干擾素-β活性含量為1萬(wàn)IU/mL。
實(shí)施例5取重組人干擾素-α2b(北京遠(yuǎn)策藥業(yè)有限責(zé)任公司)1000萬(wàn)IU，8.5g氯化鈉，1.7gNaH2PO4·2H2O，5.0g聚糖，加入注射用水，配制成1000mL溶液，使用NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0，制得水針劑，人干擾素-α2b活性含量為1萬(wàn)IU/mL。
實(shí)施例6按照實(shí)施例4的方法，將調(diào)節(jié)pH值后的溶液冷凍干燥，制備凍干粉針劑20支，每支人干擾素-β活性含量為50萬(wàn)IU/mL。
實(shí)施例7參照實(shí)施例1的制備過(guò)程，將其中的聚糖替換為麥芽糖，制得噴霧劑。
比較例將實(shí)施例1的產(chǎn)品和實(shí)施例7的產(chǎn)品進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性測(cè)試，兩者外觀、澄明度、pH沒(méi)有明顯變化，生物活性的穩(wěn)定性表明，實(shí)施例1和實(shí)施例7的噴霧劑在4-8℃放置24個(gè)月活性沒(méi)有明顯下降，其他各項(xiàng)指標(biāo)均符合質(zhì)量要求；在20℃下放置11個(gè)月實(shí)施例1產(chǎn)品干擾素效價(jià)沒(méi)有改變，實(shí)施例7產(chǎn)品在14個(gè)月后效價(jià)沒(méi)有改變，說(shuō)明本發(fā)明噴霧劑穩(wěn)定性很好。
實(shí)驗(yàn)例1本實(shí)驗(yàn)例通過(guò)對(duì)實(shí)施例1鼻腔噴霧劑對(duì)小白鼠的鼻粘膜刺激作用實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行噴霧劑安全性研究。
1、儀器自動(dòng)脫水機(jī)日本Sakura切片機(jī)德國(guó)Leitz自動(dòng)染色機(jī)日本Sakura RSH-100光學(xué)顯微鏡日本Nikon自動(dòng)照相生物顯微鏡日本Olympus BH-22、方法2003年6月17日送檢鼠11只，正常對(duì)照組5只，給藥組6只。動(dòng)物處死后解剖，肉眼觀察，立即取外鼻部、鼻粘膜，固定于10％甲醛溶液中，取材后流水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲笨透明，浸蠟包埋，切片，HE染色，光學(xué)樹(shù)脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察，照相。各組均附顯微照相彩色照片。
3、觀察結(jié)果(1)肉眼觀察結(jié)果正常對(duì)照組5只小鼠的鼻外膜未見(jiàn)有充血、水腫，未見(jiàn)有潰爛，也未見(jiàn)有明顯的病理形態(tài)學(xué)變化。給藥組6只小鼠的鼻外膜基本同正常對(duì)照組，未見(jiàn)有充血、水腫，未見(jiàn)有潰爛，未見(jiàn)有明顯的病理形態(tài)學(xué)變化。給藥組6只小鼠的鼻外膜基本同正常對(duì)照組，未見(jiàn)有充血、y網(wǎng)中，未見(jiàn)有潰(2)鏡下觀察結(jié)果5只正常對(duì)照組小鼠的鼻上皮丈膜未見(jiàn)有增厚，腔呼吸部表面角化不過(guò)度，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。粘膜下層肌肉組織未見(jiàn)有腫脹，有一只小鼠上皮下血管內(nèi)有淤血，組織結(jié)構(gòu)正常。
6只給藥組所送小鼠的鼻腔呼吸部上皮層粘膜未見(jiàn)有增厚，表面角化不過(guò)度，未見(jiàn)炎癥細(xì)脂浸潤(rùn)，粘膜下肌肉組織未見(jiàn)有腫脹，上皮下有兩只小鼠血管內(nèi)有淤血，其它組織結(jié)構(gòu)正常。
4、結(jié)論所送檢的動(dòng)物給藥組與正常對(duì)照組相比，未見(jiàn)有明顯的鼻腔呼吸部的刺激癥狀，組織結(jié)構(gòu)正常。
5、參考資料(1)《實(shí)用組織學(xué)》杜卓民主編 人民衛(wèi)生出版社 1998，P48(2)《實(shí)用外科病理學(xué)》陳忠年主編 上海醫(yī)科大學(xué)出版社 1997，P513-536(3)《研究用生物顯微鏡》余炳生 張儀編著 1989，P53-547、小鼠鼻咽部給藥刺激實(shí)驗(yàn)病理組織切片照片，見(jiàn)圖1-6。
實(shí)驗(yàn)例2本發(fā)明產(chǎn)品抗SARS病毒的實(shí)驗(yàn)室研究具體數(shù)據(jù)如下表4種重組人干擾素抑制SARS病毒在Rda細(xì)胞系培養(yǎng)上50％病變的最小干擾素單位(n＝4)

注各型干擾素均由大腸桿菌產(chǎn)生，純度均大于95％。各組之間顯著性測(cè)定P值均＞0.14種重組人干擾素抑制SARS病毒在Rda細(xì)胞系培養(yǎng)上50％病變的最小干擾素單位(n＝4)(各組之間顯著性測(cè)定P值均＞0.1)，見(jiàn)圖7。
4種干擾素在Rda細(xì)胞系培養(yǎng)上抑制SARS病毒引起50％病變的最小干擾素蛋白量(n＝4)，在rIFN-a2b、IFN-w1b與rIFN-a1b之間，P＜0.02；其余各組間P＞0.05，見(jiàn)下表

4種感染素抑制SARS病毒引起的50％病變的最小干擾素蛋白質(zhì)量(n＝4)在rIFN-a2b、IFN-w1b與rIFN-a1b之間，P＜0.02；其余各組間P＞0.05，見(jiàn)圖8。
SARS病毒全基因組cDNA微陣列生物芯片圖見(jiàn)下表

微陣列基因芯片技術(shù)檢測(cè)SARS病毒在不同條件下的RNA轉(zhuǎn)錄水平見(jiàn)圖9，其中AIFN-0表示沒(méi)有預(yù)先用干擾素α2b處理的SARS病毒各個(gè)基因的RNA水平；BIFN-1-100和CIFN-10000分別表示預(yù)先用干擾素α2b 100和10000IU處理細(xì)胞的條件下SARS病毒各個(gè)基因的RNA水平。
實(shí)驗(yàn)例3本發(fā)明產(chǎn)品抑制多種呼吸道病毒的研究(1)鼻病毒除冠狀病毒外，引起感冒的病原主要是鼻病毒，所以我們采用三種人二倍體細(xì)胞，研究了重組人α2b型干擾素抗14型鼻病毒的敏感性，結(jié)果表明本發(fā)明產(chǎn)品抑制鼻病毒繁殖的活性十分強(qiáng)烈，見(jiàn)下表重組人α2b型干擾素抗鼻病毒的敏感性試驗(yàn)

干擾素在VSV/WISH測(cè)定系統(tǒng)上效價(jià)為500000IU/ml作為1計(jì)算，表中所列為2次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，每次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)均為2次測(cè)試的平均數(shù)。由上表可見(jiàn)，鼻病毒-14(RV14)對(duì)干擾素是十分敏感的，它與對(duì)干擾素最敏感的VSV病毒相比幾乎接近。
(2)11種病毒在不同細(xì)胞上對(duì)重組人干擾素α2b的敏感性比較。
采用上述同樣的方法，在不同的細(xì)胞系統(tǒng)上，比較研究了重組人α2b型干擾素對(duì)禽流感強(qiáng)毒株H5N1、弱毒株H9N2，SARS病毒北京分離株，麻疹病毒，柯薩奇病毒CoxB1，7型腺病毒，單純皰疹病毒1和II型，出血熱病毒和鼻病毒等的相對(duì)抑制能力，結(jié)果見(jiàn)圖10。
圖10結(jié)果表明，本發(fā)明產(chǎn)品的抗病毒活性是廣譜的，其中對(duì)鼻病毒、SARS病毒，禽流感病毒尤其敏感。
實(shí)驗(yàn)例4本發(fā)明產(chǎn)品對(duì)低和高致病性禽流感等11種病毒在細(xì)胞培養(yǎng)上的抑制病毒試驗(yàn)?zāi)康脑诓煌?xì)胞培養(yǎng)上研究干擾素α2b多種病毒的抑制作用方法病毒株濾泡性口腔炎病毒(VSV)，低致病性禽流感H9H2，高致病性禽流感H5N1，SARS冠狀病毒病毒所株及香港株，麻疹病毒，腸道病毒CoxB1，腺病毒7型，單純皰疹病毒-1，2(HSV-1，2)，漢坦病毒，鼻病毒14型均由病毒所毒種室提供。
細(xì)胞系MDCK細(xì)胞系檢測(cè)H9N2和H5N1；WISH細(xì)胞系測(cè)定干擾素活性；人橫紋肌瘤(Rda)細(xì)胞系SARS病毒；原代地鼠腎細(xì)胞檢測(cè)漢坦病毒；二倍體細(xì)胞株(WI38)檢測(cè)其它病毒。
敏感性比較由于干擾素有很?chē)?yán)格的種屬特異性，同一干擾素在不同種屬的細(xì)胞培養(yǎng)上有不同的活性，因此所有比較均以VSV病毒在所用細(xì)胞培養(yǎng)上的干擾素活性為1進(jìn)行比較，相對(duì)活性愈小愈敏感。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
結(jié)果11種病毒在不同細(xì)胞上對(duì)重組人干擾素α2b的敏感性比較見(jiàn)圖11。由圖11可見(jiàn)，人干擾素α2對(duì)SARS病毒，禽流感病毒，鼻病毒均很敏感。
實(shí)驗(yàn)例5本實(shí)驗(yàn)例為實(shí)施例1產(chǎn)品鼻腔噴霧劑預(yù)防和治療恒河猴感染SARS-CoV病毒感染的效果試驗(yàn)。
由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所恒河猴作為SARS-CoV病毒感染動(dòng)物模型。
本研究的試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源于昆明中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所；種屬品系恒河猴；動(dòng)物級(jí)別SPF級(jí)；體重2.4-4.2kg；年齡3歲。共10只恒河猴，雌雄兼用，隨機(jī)分為2組，每組5只。分別為試驗(yàn)組(實(shí)施例1)和對(duì)照組(空白干擾素噴霧劑)。病毒株為PUMC01(Sino-3)株SARS-CoV；病毒滴度為5.08LgCCID50/ml，-80℃保存，攻擊病毒量為105TCID50，1.0ml/只，經(jīng)鼻腔噴霧吸入。
分別在攻毒前19h和1h，攻毒后7h、23h、31h、47h、55h、71h、95h和119h經(jīng)鼻腔不同時(shí)間經(jīng)鼻腔噴霧干擾素-α2b，每次0.4ml/只。按計(jì)劃定時(shí)取咽拭子做real-time PCR檢測(cè)和病毒分離；取靜脈血做病毒分離檢測(cè)、中和抗體、IgG抗體、血常規(guī)、血生化和血凝指標(biāo)以及大體解剖和組織病理檢查。
10只動(dòng)物隨機(jī)分為2組，5只/組。分別為試驗(yàn)組(實(shí)施例1)和對(duì)照組(空白干擾素)。分別在攻毒前19h和1h，攻毒后7h、23h、31h、47h、55h、71h、95h和119h不同時(shí)間經(jīng)鼻吸入受試物，0.4ml/只。按計(jì)劃定時(shí)取咽拭子做real-time PCR檢測(cè)和病毒分離；取靜脈血做病毒分離檢測(cè)、中和抗體、IgG、血常規(guī)、血生化和血凝指標(biāo)。
結(jié)果1.對(duì)照組全部動(dòng)物咽拭子標(biāo)本經(jīng)real-time PCR均檢出SARS-CoV病毒，持續(xù)時(shí)間從攻毒后2天至8天。攻毒后2天3只、5天1只、7天2只，其咽拭子標(biāo)本中病毒分離陽(yáng)性，攻毒后，誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的中和抗體和IgG，證實(shí)病毒感染。大體解剖全部動(dòng)物肺臟為灰白色，有大面積出血，2只動(dòng)物肺臟與胸壁有粘連。病理結(jié)果顯示2只動(dòng)物有肺間質(zhì)性炎，其中#0402病變范圍較#0401廣，表現(xiàn)為以肺間隔增厚、單核樣細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)為主要特征的肺部病變，病變較單一；其它各受檢臟器均未見(jiàn)明顯異常。2.試驗(yàn)組和對(duì)照組相同時(shí)取的咽拭子等標(biāo)本中，real-time PCR檢測(cè)和病毒分離均未檢出病毒。攻毒后病毒導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體和IgG抗體的反應(yīng)很弱。3.血常規(guī)、血生化和血凝指標(biāo)結(jié)果表明干擾素試驗(yàn)組動(dòng)物攻毒后各項(xiàng)指標(biāo)較試驗(yàn)前比較沒(méi)有顯著性改變；大體解剖動(dòng)物肺臟為灰粉色，4只動(dòng)物肺臟有少量出血，其中1只動(dòng)物肺臟與胸壁有粘連。病理結(jié)果顯示2只動(dòng)物肺組織形態(tài)基本正常，2只動(dòng)物有肺間質(zhì)性炎，表現(xiàn)為以肺間隔增厚、單核樣細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)為主要特征的肺部病變，病變較單一，其中1只增厚的肺間隔有局灶相互融合，這2例肺部病變與對(duì)照組的病變表現(xiàn)一致，而病變累及范圍較模型組?。黄渌魇軝z臟器均未見(jiàn)明顯異常。
結(jié)論本發(fā)明實(shí)施例1可以有效阻斷或減弱SARS-CoV病毒對(duì)恒河猴的感染。對(duì)恒河猴有保護(hù)作用。臨床觀察無(wú)不良反應(yīng)。
目的評(píng)價(jià)重組人干擾素α2b鼻腔噴霧劑對(duì)預(yù)防治療SARS-CoV病毒感染恒河猴的作用受試物1.名稱本發(fā)明實(shí)施例1腔噴霧劑用于試驗(yàn)組干擾素含量300萬(wàn)單位/毫升，每瓶3.65毫升，共1095萬(wàn)單位制備方法大腸桿菌生產(chǎn)，高度純化(＞95％)保存條件4℃溶劑磷酸緩沖液、人白蛋白、甘露醇、氯化鈉、苯甲醇2.名稱空白干擾素鼻腔噴霧劑，用于對(duì)照組干擾素含量無(wú)制備方法以生理鹽水替代干擾素保存條件4℃溶劑磷酸緩沖液、人白蛋白、甘露醇、氯化鈉、苯甲醇3.攻擊用毒種名稱PUMC01(Sino-3)株SARS-CoV提供單位中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所病毒滴度5.08LgCCID50/ml保存條件-80℃動(dòng)物來(lái)源中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所種屬品系恒河猴動(dòng)物級(jí)別SPF級(jí)合格證號(hào)滇實(shí)動(dòng)證第2003006體重2.4-4.2kg年齡3歲每組動(dòng)物數(shù)5只性別雌雄兼用飼養(yǎng)條件動(dòng)物飼養(yǎng)在BSL-III實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，隔離柜單籠飼養(yǎng)，壓差-20Pa，溫度20±1℃，換氣次數(shù)為14-17次/小時(shí)，每日飼喂2次混合顆粒飼料。試驗(yàn)前動(dòng)物適應(yīng)1周，檢查動(dòng)物的血常規(guī)、血凝指標(biāo)、血生化、抗SARS抗體等各項(xiàng)指標(biāo)，擇其正常，健康，雌性無(wú)孕的動(dòng)物作為受試動(dòng)物。
飼料種類(lèi)猴膨化飼料供給單位軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心合格證號(hào)SCXK-(軍)2002-001動(dòng)物分組及劑量

分組方法隨機(jī)分組動(dòng)物攻毒劑量105TCID50，1.0ml/只動(dòng)物攻毒途徑經(jīng)鼻吸入給受試物途徑與臨床擬用途徑一致經(jīng)鼻吸入實(shí)驗(yàn)室中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所生物安全三級(jí)防護(hù)實(shí)驗(yàn)室(BSL-III)。
許可證號(hào)SYXK(京)2003-0004試驗(yàn)方法10只動(dòng)物隨機(jī)分為2組，5只/組。分別為試驗(yàn)組(重組人干擾素α2b鼻腔噴霧劑)和對(duì)照組(空白干擾素)。共給予10次受試物，分別為攻毒前19h和1h，攻毒后7h、23h、31h、47h、55h、71h、95h和119h。經(jīng)鼻吸入受試物，0.4ml/只(0.2ml/鼻孔)。攻毒后1-8天每天取咽拭子做real-timePCR檢測(cè)；攻毒后2天、5天、7天咽拭子和血漿做病毒分離；攻毒后3天、7天、11天、15天、19天、23天和27天取血測(cè)血常規(guī)、血生化和血凝指標(biāo)；攻毒后11天、19天和27天取血測(cè)IgG；攻毒后19、27天取血測(cè)中和抗體。
觀察指標(biāo)1.一般狀態(tài)的觀察。
2.中和抗體攻毒后19、27天。
3.IgG試驗(yàn)前及攻毒后3天、7天、11天、15天、19天、23天和27天。
4.real-time PCR檢測(cè)咽拭子攻毒后1-8天。
5.病毒分離(咽拭子和血漿)攻毒后2天、5天、7天。
6.血常規(guī)攻毒后3天、7天、11天、15天、19天、23天和27天。
7.血生化攻毒后3天、7天、11天、15天、19天、23天和27天。
8.血凝攻毒后3天、7天、11天、15天、19天、23天和27天。
9.臟器系數(shù)。
10.大體解剖。
11.組織病理。
結(jié)果一.一般狀態(tài)的觀察對(duì)照組動(dòng)物攻毒后1-2天時(shí)體溫一過(guò)性升高，第3天全部動(dòng)物出現(xiàn)精神欠佳、活動(dòng)減少、攝食量減少，3只動(dòng)物出現(xiàn)呼吸短促等臨床癥狀，到攻毒后第7天有所緩解。干擾素試驗(yàn)組動(dòng)物未見(jiàn)異常。
試驗(yàn)組體溫在攻毒后7天和11天與對(duì)照組比較有顯著性降低，P＜0.05，對(duì)照組攻毒0天、3天和11天與試驗(yàn)前比較有顯著性升高，P＜0.05。結(jié)果見(jiàn)下表動(dòng)物體溫結(jié)果，n＝5，單位℃

#表示與試驗(yàn)前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。
二.中和抗體動(dòng)物攻毒后19天，試驗(yàn)組動(dòng)物中和抗體水平很低，1∶5-10，GMT為7.6，與對(duì)照組比較有非常顯著性差異，P＜0.01；對(duì)照組動(dòng)物中和抗體滴度1∶20-80，GMT為45.9。攻毒后27天，試驗(yàn)組動(dòng)物中和抗體仍然處于低水平，滴度為1∶5-10，GMT為10.0，與對(duì)照組比較有顯著性差異，P＜0.05；對(duì)照組動(dòng)物中和抗體滴度1∶10-80，GMT為40.0。中和抗體結(jié)果見(jiàn)下表


血清1∶5開(kāi)始對(duì)倍稀釋，終濃度到1∶640，GMT為幾何均數(shù)。
*表示試驗(yàn)組動(dòng)物明顯低于對(duì)照組動(dòng)物，且經(jīng)t檢驗(yàn)，與對(duì)照組有顯著性差異，P＜0.05；**表示試驗(yàn)組與對(duì)照組比較有非常顯著性差異，P＜0.01。
三.IgG試驗(yàn)組動(dòng)物從攻毒后15天到第27天，產(chǎn)生低水平抗體或未有抗體產(chǎn)生；此期間對(duì)照組動(dòng)物產(chǎn)生較高抗體，并持續(xù)到27天安樂(lè)死。結(jié)果見(jiàn)下表

四.real-time PCR對(duì)照組全部動(dòng)物咽拭子均檢出SARS-CoV病毒，持續(xù)時(shí)間從攻毒后2天至8天。試驗(yàn)組動(dòng)物咽拭子未檢出病毒?？截悢?shù)目見(jiàn)下表

五.病毒分離對(duì)照組動(dòng)物咽拭子攻毒后2天3只為陽(yáng)性，5天1只為陽(yáng)性，7天2只為陽(yáng)性。試驗(yàn)組動(dòng)物咽拭子和所有動(dòng)物血漿均為陰性。病毒分離結(jié)果見(jiàn)下表

六.血常規(guī)動(dòng)物攻毒后3天、7天，試驗(yàn)組與對(duì)照組比較RBC、HgB有顯著性升高，P＜0.05；攻毒后11天、15天和19天試驗(yàn)組和對(duì)照組與攻毒前比較有顯著性降低，P＜0.05。結(jié)果見(jiàn)表6～表13。
表6試驗(yàn)前血常規(guī)，n＝5

試驗(yàn)組與對(duì)照組比較，未見(jiàn)顯著性改變。
表7攻毒3天血常規(guī)，n＝5

*表示試驗(yàn)組動(dòng)物明顯低于對(duì)照組動(dòng)物，且經(jīng)t檢驗(yàn)，與對(duì)照組有顯著性差異，P＜0.05。
表8攻毒7天血常規(guī)，n＝5


*表示試驗(yàn)組動(dòng)物明顯低于對(duì)照組動(dòng)物，且經(jīng)t檢驗(yàn)，與對(duì)照組有顯著性差異，P＜0.05；#表示與試驗(yàn)前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示與試驗(yàn)前自身比較有非常顯著性差異，P＜0.01。
表9攻毒11天血常規(guī)，n＝5

#表示與試驗(yàn)前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示與試驗(yàn)前自身比較有非常顯著性差異，P＜0.01。
表10攻毒15天血常規(guī)，n＝5

#表示與試驗(yàn)前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示與試驗(yàn)前自身比較有非常顯著性差異，P＜0.01。
表11攻毒19天血常規(guī)，n＝5

#表示與試驗(yàn)前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示與試驗(yàn)前自身比較有非常顯著性差異，P＜0.01。
表12攻毒23天血常規(guī)，n＝5

#表示與試驗(yàn)前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。
表13攻毒27天血常規(guī)，n＝5


#表示與試驗(yàn)前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示與試驗(yàn)前自身比較有非常顯著性差異，P＜0.01。
七.血生化對(duì)照組動(dòng)物攻毒后ALT、AST、CK、UREA、ALP與試驗(yàn)前比較顯著性升高，P＜0.05。試驗(yàn)組動(dòng)物ALP、LDH、CK與試驗(yàn)前比較顯著性升高，P＜0.05。結(jié)果見(jiàn)表14～表21。
表14試驗(yàn)前血生化，n＝5

試驗(yàn)組與對(duì)照組比較，未見(jiàn)顯著性改變。
表15攻毒3天血生化，n＝5

**表示試驗(yàn)組與對(duì)照組有非常顯著性差異P＜0.01。#表示與試驗(yàn)前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示與試驗(yàn)前自身比較有非常顯著性差異，P＜0.01。
表16攻毒7天血生化，n＝5


#表示與試驗(yàn)前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示與試驗(yàn)前自身比較有非常顯著性差異，P＜0.01。試驗(yàn)組與對(duì)照組比較，未見(jiàn)顯著性改變。
表17攻毒11天血生化，n＝5

#表示與試驗(yàn)前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示與試驗(yàn)前自身比較有非常顯著性差異，P＜0.01。試驗(yàn)組與對(duì)照組比較，未見(jiàn)顯著性改變。
表18攻毒15天血生化，n＝5

#表示與試驗(yàn)前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示與試驗(yàn)前自身比較有非常顯著性差異，P＜0.01。試驗(yàn)組與對(duì)照組比較，未見(jiàn)顯著性改變。
表19攻毒19天血生化，n＝5


#表示與試驗(yàn)前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示與試驗(yàn)前自身比較有非常顯著性差異，P＜0.01。試驗(yàn)組與對(duì)照組比較，未見(jiàn)顯著性改變。
表20攻毒23天血生化，n＝5

#表示與試驗(yàn)前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示與試驗(yàn)前自身比較有非常顯著性差異，P＜0.01。試驗(yàn)組與對(duì)照組比較，未見(jiàn)顯著性改變。
表21攻毒27天血生化，n＝5

#表示與試驗(yàn)前自身比較有顯著性差異，P＜0.05.##表示與試驗(yàn)前自身比較有非常顯著性差異，P＜0.01。試驗(yàn)組與對(duì)照組比較，未見(jiàn)顯著性改變。
八.血凝指標(biāo)攻毒后19天試驗(yàn)組與對(duì)照組比較，APTT顯著性升高，P＜0.05；攻毒后23天試驗(yàn)組與對(duì)照組比較，TT顯著性降低，P＜0.05；但與試驗(yàn)前比較，均無(wú)顯著性改變。試驗(yàn)組APTT與攻毒前比較有顯著性下降，P＜0.05。結(jié)果見(jiàn)表22～表29。
表22試驗(yàn)前血凝指標(biāo)，n＝5

*表示試驗(yàn)組動(dòng)物明顯低于對(duì)照組動(dòng)物，且經(jīng)t檢驗(yàn)，與對(duì)照組有顯著性差異，P＜0.05；**表示試驗(yàn)組與對(duì)照組有非常顯著性差異P＜0.01。
表23攻毒3天血凝指標(biāo)，n＝5


試驗(yàn)組與對(duì)照組比較，未見(jiàn)顯著性改變。
表24攻毒7天血凝指標(biāo)，n＝5

*表示試驗(yàn)組動(dòng)物明顯低于對(duì)照組動(dòng)物，且經(jīng)t檢驗(yàn)，與對(duì)照組有顯著性差異，P＜0.05；#表示與試驗(yàn)前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示有非常顯著性差異P＜0.01。
表25攻毒11天血凝指標(biāo)，n＝5

#表示與試驗(yàn)前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示有非常顯著性差異P＜0.01。
表26攻毒15天血凝指標(biāo)，n＝5

#表示與試驗(yàn)前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示有非常顯著性差異P＜0.01。
表27攻毒19天血凝指標(biāo)，n＝5

*表示試驗(yàn)組動(dòng)物明顯低于對(duì)照組動(dòng)物，且經(jīng)t檢驗(yàn)，與對(duì)照組有顯著性差異，P＜0.05；表28攻毒23天血凝指標(biāo)，n＝5

*表示試驗(yàn)組動(dòng)物明顯低于對(duì)照組動(dòng)物，且經(jīng)t檢驗(yàn)，與對(duì)照組有顯著性差異，P＜0.05；#表示與試驗(yàn)前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。
表29攻毒27天血凝，n＝5

試驗(yàn)組與對(duì)照組比較，未見(jiàn)顯著性改變。
九.臟器系數(shù)表30臟器系數(shù)結(jié)果，n＝5


試驗(yàn)組與對(duì)照組比較，未見(jiàn)顯著性改變。
十.大體解剖對(duì)照組全部動(dòng)物肺臟為灰白色，有大面積出血，其中2只動(dòng)物肺臟與胸壁有粘連。
試驗(yàn)組動(dòng)物肺臟為灰粉色，4只動(dòng)物肺臟有少量出血，其中1只動(dòng)物肺臟與胸壁有粘連。
十一.組織病理對(duì)照組恒河猴#0401、#0402有肺間質(zhì)性炎，其中#0402病變范圍較#0401廣，表現(xiàn)為以肺間隔增厚、單核樣細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)為主要特征的肺部病變，病變較單一；其它各受檢臟器均未見(jiàn)明顯異常。
試驗(yàn)組恒河猴#0407、#0410肺組織形態(tài)基本正常，#0408、#0409有肺間質(zhì)性炎，表現(xiàn)為以肺間隔增厚、單核樣細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)為主要特征的肺部病變，病變較單一，#0409增厚的肺間隔有局灶相互融合，#0408、#0409肺部病變與對(duì)照組的病變表現(xiàn)一致，而病變累及范圍較模型組??；其它各受檢臟器均未見(jiàn)明顯異常。
見(jiàn)圖12-17。
病理結(jié)果顯示對(duì)照組恒河猴2例動(dòng)物肺病理變化顯示肺間質(zhì)性炎改變，說(shuō)明模型成立。受試物干擾素α2b可使試驗(yàn)組動(dòng)物的病變范圍減少或不發(fā)病。
研究結(jié)論如下1.PCR檢測(cè)、病毒分離結(jié)果表明實(shí)施例1噴霧劑可以有效阻斷SARS-CoV病毒對(duì)恒河猴的呼吸道感染。
2.中和抗體和IgG檢測(cè)結(jié)果表明實(shí)施例1噴霧劑能有效抑制了病毒的感染和復(fù)制，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體和IgG抗體的水平降低，對(duì)照組動(dòng)物由于沒(méi)有干擾素保護(hù)，病毒感染機(jī)體后，在體內(nèi)大量復(fù)制，誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的中和抗體和IgG抗體，證實(shí)病毒感染。
3.血常規(guī)、血生化和血凝指標(biāo)結(jié)果表明試驗(yàn)組動(dòng)物攻毒后各項(xiàng)指標(biāo)較試驗(yàn)前比較沒(méi)有顯著性改變，證明重組人干擾素α2b鼻腔噴霧劑對(duì)恒河猴無(wú)不良反應(yīng)。
4.病理結(jié)果顯示對(duì)照組恒河猴2例動(dòng)物肺病理變化顯示肺間質(zhì)性炎改變，與建立SARS動(dòng)物模型時(shí)的結(jié)果一致，說(shuō)明模型成立。受試物干擾素-α2b可使試驗(yàn)組動(dòng)物的病變范圍減少或不發(fā)病。
本實(shí)驗(yàn)例的主要數(shù)據(jù)見(jiàn)圖18-20。
猴體試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明鼻腔噴霧劑預(yù)防和治療恒河猴SARS冠狀病毒感染的效果是明顯的。
實(shí)驗(yàn)例6本發(fā)明噴霧劑預(yù)防SARS及其它呼吸道病毒感染的流行病學(xué)效果評(píng)價(jià)研究經(jīng)過(guò)SFDA批準(zhǔn)，并由科技部SARS公關(guān)組立項(xiàng)委托廣州第一軍醫(yī)大學(xué)流行病教研室由俞守義教授負(fù)責(zé)承擔(dān)觀察和驗(yàn)證本發(fā)明噴霧劑預(yù)防SARS病毒感染的安全性和流行病學(xué)效果評(píng)價(jià)研究。采用實(shí)驗(yàn)流行病學(xué)的方法，總觀察對(duì)象為15,611人；為分兩個(gè)階段開(kāi)展評(píng)價(jià)研究。第一階段在2003年5-6月期間進(jìn)行，在高危人群中采用多中心、整群抽樣和分組同期平行的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)照為空白對(duì)照。第二階段在2003年12月-2004年2月進(jìn)行，在人群中采用雙盲、安慰劑對(duì)照和隨機(jī)分組的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在預(yù)防SARS病毒感染的流行病學(xué)效果評(píng)價(jià)研究的同時(shí)，經(jīng)SFDA批準(zhǔn)，還對(duì)幾種常見(jiàn)呼吸道病毒感染的預(yù)防效果同時(shí)進(jìn)行了流行病學(xué)預(yù)防效果的觀察。
2003年5月下旬至6月中旬在6個(gè)現(xiàn)場(chǎng)同時(shí)鋪開(kāi)工作，研究對(duì)象共14391人，分布于六個(gè)省(直轄市市)21個(gè)單位。其中8881人為用藥組，5510人為對(duì)照組(空白對(duì)照)，收集調(diào)查表13254份，脫落1137人，完成研究應(yīng)答率92.1％，共采血約6892人份(雙份血清)。
2003年12月～2004年2月又選擇對(duì)SARS易感、隨訪觀察研究對(duì)象共1220人，其中實(shí)驗(yàn)組545人，對(duì)照組675人。共采血約共271人份(雙份血清)。
1、本發(fā)明噴霧劑(實(shí)施例1)的安全性共觀察14472人。實(shí)驗(yàn)組用藥的第二天，觀察到一些較輕的流感樣不良反應(yīng)，發(fā)生的高峰在第三天(個(gè)別在第二天或第四天)但所有癥狀均為可逆性反應(yīng)，停藥后消失。未見(jiàn)有其它嚴(yán)重不良反應(yīng)的發(fā)生。
用藥組出現(xiàn)的常見(jiàn)不良反應(yīng)有頭痛、頭暈、乏力、肌肉酸痛、咽干、咽痛、等，但主要出現(xiàn)在用藥的前3天；不良反應(yīng)在停藥后顯著下降，其發(fā)生率甚至顯著低于對(duì)照組。在觀察期間始終未發(fā)現(xiàn)在接受干擾素噴霧劑的人員中出現(xiàn)有血涕副反應(yīng)。
2、對(duì)SARS發(fā)病的保護(hù)效果觀察(1)兩個(gè)階段兩組觀察人群均沒(méi)有發(fā)生SARS病例，故未能評(píng)價(jià)本藥物對(duì)SARS發(fā)病的直接保護(hù)效果。
(2)對(duì)SARS病毒感染的保護(hù)率抽取了接觸SARS病人機(jī)會(huì)相等的1,730人的雙份血清，其中試驗(yàn)組930人；對(duì)照組800人，同時(shí)間內(nèi)進(jìn)行SARS病毒IgG抗體檢測(cè)，結(jié)果表明試驗(yàn)組的總抗體陽(yáng)性率為2.15％，對(duì)照組為3.50％，對(duì)照組較試驗(yàn)組高，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性要求(p＞0.05)。另一方面，在當(dāng)時(shí)SARS流行的特定情況下，研究組無(wú)法保證對(duì)照組人員不私下使用其它免疫制劑、干擾素或其它的抗病毒藥物。
實(shí)施例1噴霧劑對(duì)SARS接觸者的預(yù)防感染效果(1,730例)(SARS-CoV-IgG抗體陽(yáng)性率)見(jiàn)圖21。
待檢的雙份血清同時(shí)采用SARS-CoV-IgG抗體ELISA試劑盒進(jìn)行篩檢，篩檢陽(yáng)性者再重做一次，兩次陽(yáng)性者則確定為陽(yáng)性。試劑盒采用北京華大吉比愛(ài)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的“冠狀病毒IgG抗體檢測(cè)試劑盒”。方法按使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
(3)病人和接觸者使用干擾素的回顧性調(diào)查結(jié)果對(duì)2003年1月份以來(lái)在廣州軍隊(duì)醫(yī)院住院的SARS確診病人149人以及疑似病人14人進(jìn)行了流行病學(xué)回顧性調(diào)查表明，所有上述病例在發(fā)病前10天均未用過(guò)任何干擾素制劑。而這些醫(yī)院接觸SARS的醫(yī)務(wù)人員中，使用自制的α干擾素或其他干擾素滴鼻液者共1020人，無(wú)一人發(fā)生SARS、疑似SARS和流感病例。
以上結(jié)果說(shuō)明實(shí)施例1噴霧劑預(yù)防SARS病毒感染的可行性是明顯的。
3、對(duì)呼吸道其它病毒感染的保護(hù)效果觀察在兩個(gè)階段的安全性試驗(yàn)中，盡管在用藥期間實(shí)驗(yàn)組觀察到出現(xiàn)咽干等癥狀較對(duì)照組高，但停藥后有關(guān)癥狀消減。用藥5天后停藥繼續(xù)觀察5天，對(duì)照組的上呼吸道癥狀反而顯著高于服藥組，就已經(jīng)提示本藥物可能對(duì)一般上呼吸病毒道感染有一定的預(yù)防作用。為此，對(duì)2003年5月～6月和2003年12月～2月進(jìn)行了兩次系統(tǒng)的人群實(shí)驗(yàn)，抽取了部分人群的血清以檢測(cè)常見(jiàn)呼吸道病毒感染情況。我們重點(diǎn)以1-3型副流感病毒、B型流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒(3，7型)等常見(jiàn)的呼吸道病毒感染為觀察指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)本藥物對(duì)病毒性呼吸道感染的保護(hù)作用。
待檢血清采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對(duì)副流感病毒(1、2、3型混合)、腺病毒(3、7型)、呼吸道合胞病毒和B型流感病毒IgM抗體進(jìn)行篩檢，篩檢陽(yáng)性者再重做一次，兩次陽(yáng)性者則確定為陽(yáng)性。試劑盒采用深圳賽爾生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的“呼吸道感染病毒IgM/抗體EIA試劑盒(96T/48T)”。方法按使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
第一階段實(shí)驗(yàn)兩組血清三種呼吸道病毒IgM檢測(cè)情況(927人)見(jiàn)下表

第一階段實(shí)驗(yàn)兩組血清三種呼吸道病毒IgM檢測(cè)情況(927人)見(jiàn)圖22。
第二階段實(shí)驗(yàn)兩組血清三種呼吸道病毒IgM檢測(cè)情況(558人)見(jiàn)下表

第二階段實(shí)驗(yàn)兩組血清三種呼吸道病毒IgM檢測(cè)情況(558人)見(jiàn)圖23。
第一、二階段實(shí)驗(yàn)兩組血清三種呼吸道病毒IgM檢測(cè)情況(1485人)見(jiàn)圖24。
以上結(jié)果表明，在第一階段927例雙份血清試驗(yàn)中，試驗(yàn)組的副流感病毒、B型流感病毒和呼吸道合胞病毒的IgM陽(yáng)性率顯著低于對(duì)照組，P值分別為＜0.01，＝0.05和＜0.05。在第二階段558例雙份血清試驗(yàn)中，試驗(yàn)組的副流感病毒、B型流感病毒的IgM陽(yáng)性率也顯著低于對(duì)照組，P值分別為＜0.01和＜0.05。這說(shuō)明本發(fā)明噴霧劑對(duì)副流感病毒1-3型、乙型流感病毒等常見(jiàn)呼吸道病毒感染有一定預(yù)防效果。
以上副流感病毒和B型流感病毒均為兒童和成年人呼吸道感染的常見(jiàn)病原；而呼吸道合胞病毒和3，7型腺病毒為兒童時(shí)期的呼吸道感染的常見(jiàn)病原。
這一情況與上述以成人為對(duì)象的研究結(jié)果是吻合的。詳細(xì)資料如下2003年3月我國(guó)突發(fā)SARS流行，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)于同年4月同意批準(zhǔn)北京遠(yuǎn)策藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的本發(fā)明噴霧劑開(kāi)展預(yù)防SARS病毒感染的流行病學(xué)效果評(píng)價(jià)研究。為了觀察和驗(yàn)證實(shí)施例1噴霧劑預(yù)防SARS病毒感染的安全性和預(yù)防效果，我們采用實(shí)驗(yàn)流行病學(xué)的方法，總觀察對(duì)象為15,611人為分二個(gè)階段開(kāi)展評(píng)價(jià)研究。第一階段在2003年5-6月期間進(jìn)行，在高危人群中采用多中心、整群抽樣和分組同期平行的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)照為空白對(duì)照。第二階段在2003年12月-2004年2月進(jìn)行，在人群中采用雙盲、安慰劑對(duì)照和隨機(jī)分組的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在預(yù)防SARS病毒感染的流行病學(xué)效果評(píng)價(jià)研究的同時(shí)，經(jīng)SFDA批準(zhǔn)，還對(duì)幾種常見(jiàn)呼吸道病毒感染的預(yù)防效果同時(shí)進(jìn)行了流行病學(xué)預(yù)防效果的觀察，評(píng)估研究結(jié)果如下第一部分 實(shí)驗(yàn)現(xiàn)場(chǎng)、人群和方法第一階段現(xiàn)場(chǎng)工作(準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)研究)研究開(kāi)始時(shí)正值我國(guó)2003年SARS流行的中、后期，按照臨床試驗(yàn)的要求和規(guī)范以及當(dāng)時(shí)SARS流行的嚴(yán)重性和特殊性以及SARS預(yù)防的實(shí)際情況(國(guó)家要求零病例措施！)開(kāi)展研究，因此不可能采用評(píng)估新藥效果應(yīng)當(dāng)采用的隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照方法，只能采用準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)研究(非雙盲、非隨機(jī)分組對(duì)照)方法進(jìn)行效果評(píng)估。
現(xiàn)場(chǎng)河南、北京、天津、河北、內(nèi)蒙和廣東六省市。
研究對(duì)象入選標(biāo)準(zhǔn)SARS發(fā)生較多地區(qū)的重點(diǎn)人群，能夠理解并能按要求用藥和填寫(xiě)調(diào)查表的成年人，知情同意，自愿參加。
研究對(duì)象排除標(biāo)準(zhǔn)疑似或確診的SARS病人，有干擾素過(guò)敏史的人，患有腫瘤、糖尿病、慢性肝炎等免疫力低下的病人，孕婦及哺乳期婦女。
剔除標(biāo)準(zhǔn)對(duì)已被選入本臨床研究，屬于以下情況之一者，作為剔除對(duì)象。
1.不符合納入標(biāo)準(zhǔn)，或符合排除標(biāo)準(zhǔn)者2.一次藥未用者3.無(wú)任何記錄者脫落(退出)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)已被選入本臨床研究，屬于以下情況之一者，作為脫落者。
1.受試者依從性差，不能按時(shí)按量用藥。
2.受試者不愿意繼續(xù)進(jìn)行臨床試驗(yàn)，向研究者提出退出者。
用藥方法1.藥物名稱和規(guī)格名稱本發(fā)明實(shí)施例1噴霧劑研制單位北京遠(yuǎn)第藥業(yè)有限責(zé)任公司規(guī)格3.65×300萬(wàn)IU/ml，每噴一下0.1ml保存2～8℃避光保存2.用量和方法每天噴兩次，每次分別噴左右鼻腔、咽喉各一下(即60萬(wàn)IU/天)，連用五天(共1000萬(wàn)IU)。
觀察內(nèi)容和方法1.調(diào)查內(nèi)容調(diào)查表內(nèi)容包括一般情況(姓名、年齡、性別、噴藥前兩周及噴藥期間服用藥物情況等)和使用干擾素噴霧劑后常見(jiàn)的不良反應(yīng)(體溫、咳嗽、咳痰、頭痛、頭暈、乏力、肌肉酸痛、鼻塞、打噴嚏、咽痛、咽干、腹瀉、腹痛和皮疹等)。
方法給每個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)象發(fā)調(diào)查表，由其從試驗(yàn)的第一天開(kāi)始每晚自填研究開(kāi)始后十天的反應(yīng)。
2.干擾素噴霧劑應(yīng)用情況學(xué)校和戰(zhàn)士研究開(kāi)始后，對(duì)實(shí)驗(yàn)組發(fā)放調(diào)查表和干擾素噴霧劑，以學(xué)員隊(duì)為單位統(tǒng)一管理。每天中午12:30和下午19:00由班長(zhǎng)發(fā)放干擾素噴霧劑，學(xué)員按照說(shuō)明書(shū)使用，噴完后由班長(zhǎng)統(tǒng)一收集，放回隊(duì)部配有的專用冰箱中進(jìn)行保存。
醫(yī)院、賓館和其他人群干擾素發(fā)給每個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)象，由其自己保存(存放于單位或家中的冰箱里)，每天中午和晚上使用。
對(duì)照組人群每天晚上填表，但不用干擾素噴霧劑。
3.觀察項(xiàng)目和時(shí)間觀察項(xiàng)目不良反應(yīng)、SARS發(fā)病情況、SARS感染情況(SARS病毒IgG抗體陽(yáng)性為標(biāo)準(zhǔn))和影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的其他干擾因素。
觀察時(shí)間10天，前5天用藥，停藥后繼續(xù)觀察至第十天。
4.血清采集研究開(kāi)始時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組所有人員抽血，當(dāng)天分離出血清保存于4℃冰箱內(nèi)，20天后抽第二次血，分離血清，雙份血清均在-20℃保存。
血清學(xué)檢測(cè)1.血清抗SARS-CoV-IgG抗體的檢測(cè)待檢的雙份血清同時(shí)采用SARS-CoV-IgG抗體ELISA試劑盒進(jìn)行篩檢，篩檢陽(yáng)性者再重做一次，兩次陽(yáng)性者則確定為陽(yáng)性。
試劑盒采用北京華大吉比愛(ài)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的“冠狀病毒IgG抗體檢測(cè)試劑盒”。方法按使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
(2)呼吸道病毒血清IgM抗體的檢測(cè)待檢血清采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對(duì)副流感病毒(1、2、3型混合)、腺病毒(3、7型)、呼吸道合胞病毒和B型流感病毒IgM抗體進(jìn)行篩檢，篩檢陽(yáng)性者再重做一次，兩次陽(yáng)性者則確定為陽(yáng)性。
試劑盒采用深圳賽爾生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的“呼吸道感染病毒IgM/抗體EIA試劑盒(96T/48T)”。方法按使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
安全性評(píng)價(jià)對(duì)用藥期間出現(xiàn)的所有不良反應(yīng)和不良事件均進(jìn)行記錄和分析。
預(yù)防效果評(píng)價(jià)對(duì)兩組人群SARS發(fā)病情況進(jìn)行比較，對(duì)接觸SARS的高危人群(醫(yī)務(wù)人員)用藥前后的血清進(jìn)行檢測(cè)，分析SARS病毒IgG抗體陽(yáng)性率的變化情況。同時(shí)觀察對(duì)常見(jiàn)呼吸道病毒血清IgM抗體的變化情況。
統(tǒng)計(jì)分析本研究的數(shù)據(jù)處理和分析工作由暨南大學(xué)經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院負(fù)責(zé)進(jìn)行，用Epidata2.1軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，所有調(diào)查表均由專人負(fù)責(zé)錄入、檢查錯(cuò)誤和整理。由專人用SPSS10.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。
質(zhì)量控制(1)統(tǒng)一方法(2)開(kāi)展研究前對(duì)研究人員集中進(jìn)行培訓(xùn)(3)研究開(kāi)始前在參試人員中開(kāi)設(shè)講座，說(shuō)明重組人干擾素α-2b噴霧劑的作用、可能的不良反應(yīng)、使用方法和調(diào)查表的內(nèi)容及填寫(xiě)方式。
(4)研究期間派專人對(duì)各個(gè)現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行監(jiān)察訪問(wèn)，保證各現(xiàn)場(chǎng)按照研究計(jì)劃進(jìn)行。
(5)隨訪期間每天由專人督促服藥和填表，確保漏服率＜5％，失訪率＜10％。
2003年5月下旬至6月中旬在6個(gè)現(xiàn)場(chǎng)同時(shí)鋪開(kāi)工作，研究對(duì)象共14391人，分布于六個(gè)省(直轄市市)21個(gè)單位。其中8881人為用藥組，5510人為對(duì)照組(空白對(duì)照)，收集調(diào)查表13254份，脫落1137人，完成研究應(yīng)答率92.1％，共采血約6892人份(雙份血清)。
第二階段現(xiàn)場(chǎng)工作(雙盲、安慰劑對(duì)照隨機(jī)試驗(yàn))；2003年12月～2004年2月進(jìn)行，選擇對(duì)SARS易感、便于隨訪觀察研究對(duì)象共1220人，其中實(shí)驗(yàn)組545人，對(duì)照組675人。
研究人群1廣州省軍區(qū)教導(dǎo)大隊(duì)新兵連，研究對(duì)象共221人，其中實(shí)驗(yàn)組111人，安慰劑組110人。血清共221人份。
研究人群2珠海警備區(qū)新兵團(tuán)，研究對(duì)象共549人，實(shí)驗(yàn)組234人，安慰劑組315人。血清兩組共回收50人份。
研究人群3廣州市槎頭野生動(dòng)物市場(chǎng)從業(yè)人員，研究對(duì)象450人，實(shí)驗(yàn)組200人，對(duì)照組250人。
采用完全隨機(jī)方法分組，雙盲實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組采用外形與藥物完全相同但不含藥物成分的安慰劑。
除了隨機(jī)分組、雙盲和安慰劑對(duì)照外，研究方法如研究對(duì)象的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)、服藥和隨訪方法、評(píng)價(jià)指標(biāo)和方法、資料分析和統(tǒng)計(jì)方法、質(zhì)量控制方法均同第一階段實(shí)驗(yàn)。
本階段研究對(duì)象1220人中，脫落僅2人，完成研究應(yīng)答率為99.99％。
兩階段研究合計(jì)脫落1139人，脫落率合計(jì)為7.3％。
第二部分 研究結(jié)果1、研究對(duì)象脫落情況本研究中，兩階段段研究合計(jì)有7.3％的研究對(duì)象脫落，其中第一階段脫落率為7.9％，第二階段僅為0.16％。對(duì)第一階段廣州點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組105名脫落研究對(duì)象進(jìn)行了調(diào)查，脫落的原因構(gòu)成如下表


調(diào)查表明因用藥后感到不適而停止用藥的人僅占很小的比例。
2、本發(fā)明噴霧劑的安全性實(shí)驗(yàn)組用藥的第二天，觀察到一些較輕的流感樣不良反應(yīng)，發(fā)生的高峰在第三天(個(gè)別在第二天或第四天)但所有癥狀均為可逆性反應(yīng)，停藥后消失。未見(jiàn)有其它嚴(yán)重不良反應(yīng)的發(fā)生，見(jiàn)下表

兩階段用藥組和對(duì)照組隨訪第3天(或發(fā)生率最高的時(shí)間)不良反應(yīng)發(fā)生率比較(14472人)※第2天※※第4天第一階段實(shí)驗(yàn)時(shí)，與對(duì)照組比較，用藥組體溫未見(jiàn)異常；用藥期間用藥組出現(xiàn)的不良反應(yīng)如頭痛、頭暈、乏力、肌肉酸痛、咽干、咽痛、腹痛、腹瀉等的發(fā)生率雖然高于對(duì)照組，但主要出現(xiàn)在用藥的前3天，見(jiàn)下表

第一階段實(shí)驗(yàn)隨訪第3天時(shí)(或發(fā)生率最高的時(shí)間)兩組不良反應(yīng)發(fā)生率比較(13,254人)※第2天※※第4天不良反應(yīng)在停藥后顯著下降，其發(fā)生率甚至顯著低于對(duì)照組。在觀察期間始終未發(fā)現(xiàn)在接受干擾素噴霧劑的人員中出現(xiàn)有血涕副反應(yīng)。
第二階段用藥期間，與對(duì)照組比較，用藥組體溫也未見(jiàn)異常，對(duì)照組體溫異常率反而高于用藥組；用藥期間用藥組的不良反應(yīng)只有乏力和咽干顯著高于對(duì)照組(率差分別為2.12％和3.87％，見(jiàn)下表


第二階段實(shí)驗(yàn)隨訪第3天時(shí)兩組不良反應(yīng)發(fā)生率比較(1218人)。
與第一階段實(shí)驗(yàn)相同，不良反應(yīng)主要出現(xiàn)在用藥的前3天，停藥后顯著下降，其發(fā)生率甚至顯著低于對(duì)照組。
與第一階段一樣，在觀察期間始終未發(fā)現(xiàn)在接受干擾素噴霧劑的人員中出現(xiàn)有血涕副反應(yīng)。
上述第一、二階段現(xiàn)場(chǎng)安全性研究結(jié)果表明重組人干擾素α-2b噴霧劑(遠(yuǎn)策素噴霧劑)的安全性是良好的，使用者是可以耐受的。始終未發(fā)現(xiàn)在接受干擾素噴霧劑的人員中出現(xiàn)有血涕副反應(yīng)。
2、對(duì)SARS發(fā)病的保護(hù)效果觀察(1)對(duì)SARS發(fā)病的保護(hù)率兩個(gè)階段兩組觀察人群均沒(méi)有發(fā)生SARS病例，故未能評(píng)價(jià)本藥物對(duì)SARS發(fā)病的保護(hù)效果。
(2)對(duì)SARS病毒感染的保護(hù)率抽取了接觸SARS病人機(jī)會(huì)相等的1,730人的雙份血清，其中試驗(yàn)組930人；對(duì)照組800人，同時(shí)間內(nèi)進(jìn)行SARS病毒IgG抗體檢測(cè)，結(jié)果表明試驗(yàn)組的總抗體陽(yáng)性率為2.15％，對(duì)照組為3.50％，對(duì)照組較試驗(yàn)組高，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性要求(p＞0.05)。另一方面，在當(dāng)時(shí)SARS流行的特定情況下，研究組無(wú)法保證對(duì)照組人員不私下使用其它免疫制劑、干擾素或其它的抗病毒藥物。
(3)病人和接觸者使用干擾素調(diào)查情況對(duì)2003年1月份以來(lái)在廣州軍隊(duì)醫(yī)院住院的SARS確診病人149人以及疑似病人14人進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查表明，所有上述病例在發(fā)病前10天均未用過(guò)任何干擾素制劑。而這些醫(yī)院接觸SARS的醫(yī)務(wù)人員中，使用自制的α干擾素或其他干擾素滴鼻液者共1020人，無(wú)一人發(fā)生SARS、疑似SARS和流感。
根據(jù)以上結(jié)果，可以認(rèn)為，重組人干擾素α-2b噴霧劑(遠(yuǎn)策素噴霧劑)可能對(duì)SARS病毒感染有保護(hù)作用。
3、對(duì)呼吸道其它病毒感染的保護(hù)效果觀察(1)兩個(gè)階段的實(shí)驗(yàn)均表明，盡管在用藥期間實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)咽干等癥狀較對(duì)照組高，但停藥后有關(guān)癥狀消減。用藥5天后停藥繼續(xù)觀察5天，對(duì)照組的上呼吸道癥狀反而顯著高于服藥組，提示本藥物可能對(duì)一般上呼吸病毒道感染有一定的預(yù)防作用。
(2)對(duì)2003年5月～6月和2003年12月～2月兩次的人群實(shí)驗(yàn)，抽取了部分人群的血清以檢測(cè)常見(jiàn)呼吸道病毒感染情況。。我們重點(diǎn)以1-3型副流感病毒、B型流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒(3，7型)等常見(jiàn)的呼吸道病毒感染為觀察指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)本藥物對(duì)病毒性呼吸道感染的保護(hù)作用。
第一階段實(shí)驗(yàn)兩組血清三種呼吸道病毒IgM檢測(cè)情況(927人)見(jiàn)下表

第二階段實(shí)驗(yàn)兩組血清三種呼吸道病毒IgM檢測(cè)情況(558人)見(jiàn)下表


以上結(jié)果表明，在第一階段927例雙份血清試驗(yàn)中，試驗(yàn)組的副流感病毒、B型流感病毒和呼吸道合胞病毒的IgM陽(yáng)性率顯著低于對(duì)照組，P值分別為＜0.01，＝0.05和＜0.05。在第二階段558例雙份血清試驗(yàn)中，試驗(yàn)組的副流感病毒、B型流感病毒的IgM陽(yáng)性率也顯著低于對(duì)照組，P值分別為＜0.01和＜0.05。
這說(shuō)明本發(fā)明噴霧劑對(duì)常見(jiàn)呼吸道病毒感染有一定預(yù)防效果。
以上副流感病毒和B型流感病毒均為兒童和成年人呼吸道感染的常見(jiàn)病原；而呼吸道合胞病毒和3，7型腺病毒為兒童時(shí)期的呼吸道感染的常見(jiàn)病原。這一情況與上述結(jié)果也是吻合的。
實(shí)驗(yàn)例7本發(fā)明噴霧劑預(yù)防SARS及其它呼吸道病毒感染的人體安全性2003年4月24日SFDA批準(zhǔn)重組人干擾素a2b噴霧劑進(jìn)行預(yù)防SARS的臨床研究，主要由由廣州第一軍醫(yī)大學(xué)負(fù)責(zé)，評(píng)估遠(yuǎn)策素噴霧劑預(yù)防SARS及其它呼吸道病毒感染的效果和安全性；與此同時(shí)，北京遠(yuǎn)策藥業(yè)有限責(zé)任公司也組織力量，就藥物的安全性和效果進(jìn)行臨床研究。遠(yuǎn)策藥業(yè)已發(fā)放約10萬(wàn)瓶，用于下列人群1.北京地區(qū)專收SARS病人的醫(yī)院的一、二線人員包括中日友好醫(yī)院；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形醫(yī)院；2.寧夏疾病預(yù)防和控制中心的一、二線人員；3.內(nèi)蒙古呼而浩特一線人員；(廣州俞守義教授提供，用以對(duì)比)4.華南某高校一線人員；(廣州俞守義教授提供，用以對(duì)比)5.北京SARS高流行區(qū)的重點(diǎn)人群；6.2004年4月病毒所實(shí)驗(yàn)室SARS病毒泄露的一、二線人員。
獲得如下結(jié)論(1)連續(xù)使用1-2瓶無(wú)嚴(yán)重副反應(yīng)，使用者主訴有鼻、咽干燥、打噴嚏、鼻塞、乏力、頭暈等副反應(yīng)，基本上與廣州研究組的結(jié)果一致，實(shí)施例1噴霧劑是安全的，未發(fā)現(xiàn)有血涕副反應(yīng)。
在SARS流行期間使用實(shí)施例1噴霧劑的副反應(yīng)見(jiàn)下表統(tǒng)計(jì)

注一線直接接觸SARS病人二線間接接觸SARS患者；一般人群SARS流行區(qū)流行期間的人群。
(1)使用1瓶噴霧劑；(2)使用2瓶噴霧劑；(3)每人1-3瓶(47人使用3瓶，3610人使用2瓶，其余使用1瓶)。
*數(shù)據(jù)來(lái)源于廣州俞教授，用以對(duì)比。
(2)回顧性流行病學(xué)調(diào)查表明，凡接受用藥的人群未發(fā)現(xiàn)發(fā)燒病例、疑似病例或可能病例。
(3)2004年4月病毒所發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室泄露SARS病毒后，全所所有人員約400人(隔離前和隔離后)使用了2瓶實(shí)施例1噴霧劑，在用藥后18天后檢測(cè)受試者的血清SARS病毒IgG抗體和IgM抗體均未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性者；也未發(fā)現(xiàn)有SARS可能病例。
實(shí)驗(yàn)例8本發(fā)明噴霧劑干預(yù)麻疹、風(fēng)疹和腮腺炎病毒減毒活疫苗鼻腔接種后的免疫效果的初步研究(江蘇省疾病預(yù)防和控制中心(JS-CDC)。
2004年初經(jīng)過(guò)SFDA批準(zhǔn)由江蘇省疾病預(yù)防和控制中心承擔(dān)初步探討重組人干擾素a2b干預(yù)麻疹、風(fēng)疹和腮腺炎病毒減毒活疫苗(原為注射用)鼻腔接種后免疫效果的干預(yù)作用，以期間接說(shuō)明重組人干擾素a2b預(yù)防麻疹、風(fēng)疹和腮腺炎病毒感染有無(wú)預(yù)防效果。
在江蘇省CDC的組織下，選擇計(jì)劃免疫較差的地區(qū)，麻疹抗體水平低于800者約100余人，參加研究。
使用的疫苗為麻疹、風(fēng)疹減毒活疫苗，由北京生物制品研究所產(chǎn)品。麻風(fēng)腮三聯(lián)減毒活疫苗由法國(guó)Aventis Pastuer公司生產(chǎn)，均使用注射的同樣劑量，但改為滴鼻接種。
隨機(jī)分為對(duì)照組和干擾素組.干擾素組使用實(shí)施例1噴霧劑(3.65ml1095MIU)。對(duì)照藥使用不含重組人干擾素α2b，但含其它成份的噴霧劑。
干擾素組在疫苗接種前2天，開(kāi)始噴干擾素，連續(xù)用藥10天；第三天進(jìn)行疫苗接種。每日噴2次，每次每個(gè)鼻孔各噴一下、咽喉一下，每噴一下為0.1ml。
在活疫苗接種后第3天取咽拭子測(cè)定干擾素組和對(duì)照組人群病毒基因的拷貝數(shù)；在疫苗接種后21天、28天各采取三份血清，以備檢測(cè)抗體水平之用。
1.應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)評(píng)估本發(fā)明噴霧劑在人群中對(duì)麻疹病毒減毒活疫苗的干預(yù)作用對(duì)照組共有7人，在鼻腔免疫后每人取咽拭子標(biāo)本共7份，4份檢測(cè)為陽(yáng)性；陽(yáng)性率為57.1％；干擾素組也共有7人，在鼻腔免疫后每人取咽拭子標(biāo)本共7份，3份標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，陽(yáng)性率為42.9％。由于樣本數(shù)量小，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是，在病毒基因陽(yáng)性標(biāo)本中，兩組病毒基因的拷貝數(shù)的比較卻有明顯的差別，見(jiàn)圖25和下表對(duì)照組與干擾素組免疫后陽(yáng)性標(biāo)本的麻疹病毒基因拷貝數(shù)的比較

上述有限樣本初步說(shuō)明，干擾素組麻疹病毒基因拷貝數(shù)比對(duì)照組的病毒基因拷貝數(shù)要低4.4倍，可以初步看出人重組干擾素a2b噴霧劑在一定程度上可以抑制麻疹病毒減毒活疫苗在上呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)的繁殖。
接種風(fēng)疹疫苗的對(duì)照組共有22人，其中男5人、女17人，平均年齡19.4歲，疫苗鼻腔免疫后72小時(shí)每人采集咽拭子標(biāo)本共22份，僅3份檢測(cè)為陽(yáng)性；干擾素組共有8人，全為女性，平均年齡為21.4歲，疫苗鼻腔免疫后72小時(shí)每人采集咽拭子標(biāo)本共8份，僅2份檢測(cè)為陽(yáng)性。兩組陽(yáng)性標(biāo)本中病毒基因拷貝數(shù)的比較見(jiàn)圖26和下表對(duì)照組與干擾素組免疫后陽(yáng)性標(biāo)本的風(fēng)疹病毒基因拷貝數(shù)的比較

從上表和圖26中，可以發(fā)現(xiàn)干擾素組病毒拷貝數(shù)比對(duì)照組的要低兩個(gè)數(shù)量級(jí)，初步說(shuō)明人重組干擾素a2b在一定程度上是可以抑制風(fēng)疹病毒的繁殖。
2.重組人干擾素a2b噴霧劑在人群中對(duì)風(fēng)疹、麻疹和腮腺炎減毒活疫苗鼻腔接種后免疫效果的干預(yù)作用(1)實(shí)施例1噴霧劑干預(yù)麻疹病毒減毒活疫苗鼻腔接種后免疫反應(yīng)的結(jié)果ELISA測(cè)定結(jié)果見(jiàn)下表干擾素噴霧劑干預(yù)麻疹病毒減毒活疫苗鼻腔接種后免疫反應(yīng)的結(jié)果

比較免前與免后21天和28天平均P/N值的差數(shù)，兩組有顯著差異，從有限樣本來(lái)說(shuō)，初步表明實(shí)施例1噴霧劑能干預(yù)麻疹病毒減毒活疫苗鼻腔接種后加腔免疫的免疫反應(yīng)。
(2)實(shí)施例1噴霧劑干預(yù)風(fēng)疹病毒減毒活疫苗鼻腔接種后免疫反應(yīng)的結(jié)果風(fēng)疹病毒血凝抑制反應(yīng)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)下表干擾素噴霧劑干預(yù)風(fēng)疹病毒減毒活疫苗鼻腔接種后免疫反應(yīng)的結(jié)果


比較免前與免后21天和28天血清風(fēng)疹病毒血凝抑制滴度平均增加倍數(shù)，兩組有差異，從有限樣本來(lái)說(shuō)，初步表明干擾素鼻腔噴霧在一定程度上干預(yù)風(fēng)疹病毒減毒活疫苗鼻腔接種后加腔免疫的免疫反應(yīng)。
(3)重組人干擾素α2b鼻腔噴霧劑干預(yù)風(fēng)風(fēng)腮三聯(lián)病毒減毒活疫苗鼻腔接種后免疫反應(yīng)的結(jié)果風(fēng)疹血凝抑制反應(yīng)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5.比較免前與免后21天血清血凝抑制滴度平均增加倍數(shù)，兩組有差異，但是28天結(jié)果無(wú)差別；腮腺炎血凝抑制反應(yīng)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)下表干擾素噴霧劑干預(yù)麻風(fēng)腮病毒減毒活疫苗鼻腔接種后免疫反應(yīng)的結(jié)果

比較免前與免后21天血清血凝抑制滴度平均增加倍數(shù)，兩組無(wú)差異，但是28天結(jié)果有輕微差別；從有限樣本來(lái)說(shuō)，初步表明干擾素鼻腔噴霧干預(yù)麻風(fēng)腮三聯(lián)疫苗鼻腔接種加腔免疫的免疫反應(yīng)不如單價(jià)疫苗明顯。
3.研究結(jié)論及分析1.有限樣本數(shù)的初步結(jié)果表明，使用干擾素噴霧劑組的風(fēng)疹病毒和麻疹病毒陽(yáng)性標(biāo)本中病毒基因拷貝數(shù)均比對(duì)照組要低，麻疹組低4.4倍，風(fēng)疹組低兩個(gè)數(shù)量級(jí)。因此可見(jiàn)，人重組干擾素a2b噴霧劑在一定程度上可以抑制麻疹病毒和風(fēng)疹病毒減毒活疫苗在上呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)的繁殖。但是，在麻疹和風(fēng)疹的對(duì)照組和干擾素組中，在病毒活疫苗接種后第3天采取的咽拭子樣本中，病毒檢出陽(yáng)性率均太低麻疹噴霧免疫組的對(duì)照組病毒陽(yáng)性率僅為57.1％；干擾素組的陽(yáng)性率僅為42.9％；風(fēng)疹噴霧免疫組的病毒陽(yáng)性率更低；可能的原因是所選擇的對(duì)象均曾經(jīng)感染過(guò)麻疹和風(fēng)疹，均不是初次免疫，上呼吸道已經(jīng)有低水平抗體存在，這些低水平的特異性抗體可以掩蓋干擾素非特異性抗病毒活性，所以，病毒攻擊后的病毒檢出率太低。
2.由于選擇的人群是麻疹抗體低水平人群，雖然樣本小，但已經(jīng)可以看到重組人干擾素α2b鼻腔噴霧劑對(duì)麻疹減毒活疫苗鼻腔接種后的再次免疫效果確有一定的干預(yù)作用，在免疫后第21天，干擾素組與對(duì)照組的平均P/N值的差異有顯著詫異(P＝0.025)；這與病毒基因拷貝數(shù)的減少是相吻合的。
3.麻疹和風(fēng)疹減毒活疫苗原為注射免疫接種，現(xiàn)在改為鼻腔噴霧接種，這次研究雖然沒(méi)有同時(shí)比較注射免疫與鼻腔免疫的效果，但是，從有限的初步的結(jié)果來(lái)看，鼻腔噴霧1次加強(qiáng)免疫后，血清抗體水平平均增加2.28(血凝抑制抗體)-3.58倍(ELISA)，這說(shuō)明進(jìn)行鼻腔噴霧加強(qiáng)免疫有一定作用。但是麻風(fēng)腮三聯(lián)疫苗鼻腔接種的效果不明顯，可能的原因是，麻風(fēng)腮三種病毒在上呼吸道同時(shí)繁殖相互有干擾作用。
4.鑒于很難選擇麻疹低抗體人群；關(guān)于選擇風(fēng)疹低抗體人群，因無(wú)試劑無(wú)法選擇。所以，這一技術(shù)路線擬不再繼續(xù)，改為在雙盲、隨機(jī)的人群中使用干擾素噴霧劑和不含干擾素的噴霧劑，在一定期間內(nèi)檢測(cè)呼吸道病毒IgM抗體差異的方法來(lái)評(píng)估干擾素噴霧劑的抗病毒效果。
實(shí)驗(yàn)例9本實(shí)驗(yàn)例初步探討本發(fā)明噴霧劑干預(yù)麻疹、風(fēng)疹和腮腺炎病毒減毒活疫苗鼻腔接種后免疫效果的作用，間接說(shuō)明重組人干擾素a2b噴霧劑預(yù)防麻疹、風(fēng)疹和腮腺炎病毒感染的效果。
目標(biāo)1.驗(yàn)證原為皮下注射的風(fēng)疹和麻疹減毒活疫苗改為鼻腔接種的毒副反應(yīng)；2.檢驗(yàn)該地區(qū)上述人群對(duì)接種該病毒疫苗的血清抗體的本底情況和鼻腔接種加強(qiáng)免疫后的反應(yīng)性；3.初步探討干擾素噴霧劑干預(yù)病毒減毒活疫苗的作用。
地區(qū)選擇江蘇省計(jì)劃免疫較差的地區(qū)。
人群的入選標(biāo)準(zhǔn)(1)年齡20-25歲，男女不限；(2)非過(guò)敏體質(zhì)的健康人；(3)無(wú)慢性呼吸道疾??；(4)體溫正常；
(5)選擇麻疹抗體水平低于800者。
人群排除標(biāo)準(zhǔn)(1)對(duì)干擾素和疫苗中任何成份有過(guò)敏史者；(2)慢性呼吸道疾病患者，鼻咽部黏膜有病理改變者；(3)妊娠期或哺乳期婦女；或在近幾個(gè)月內(nèi)有可能懷孕的婦女；(4)患有心、腎等重要臟器嚴(yán)重器質(zhì)性疾患；(5)患有血液病、糖尿病等疾病；(6)患有嚴(yán)重的神經(jīng)、精神病、癲癇病史者；(7)入組前3個(gè)月內(nèi)參加過(guò)其他臨床試驗(yàn)者；(8)拒絕合作者。
中止臨床研究的標(biāo)準(zhǔn)(1)因嚴(yán)重不良反應(yīng)不能完成觀察者，應(yīng)納入不良反應(yīng)統(tǒng)計(jì)，但不計(jì)入療效統(tǒng)計(jì)；(2)在試驗(yàn)過(guò)程中違背研究計(jì)劃或者使用不利于觀察藥物療效的藥物者；(3)拒絕在知情同意書(shū)上簽字者；(4)違約或失防的病人，拒絕抽血者；(5)依從性差者。
研究方法(一)藥品及來(lái)源1.試驗(yàn)用藥實(shí)施例1產(chǎn)品，其質(zhì)量已經(jīng)中國(guó)藥品和生物制品研究所檢定。
2.對(duì)照藥使用不含重組人干擾素α2b，但含其它成份的噴霧劑。
3.疫苗麻疹、風(fēng)疹減毒活疫苗北京生物制品研究所產(chǎn)品。麻風(fēng)腮三聯(lián)減毒活疫苗(Aventis Pastuer)均使用同樣劑量，改為滴鼻接種。
(二)試驗(yàn)方法1.預(yù)防人群數(shù)共用2種疫苗，檢測(cè)2種呼吸道病毒，每種疫苗用藥組和對(duì)照組各20例。
2.療程疫苗接種均為滴鼻接種，在疫苗接種前2天，開(kāi)始噴藥，連續(xù)用藥10天；第三天進(jìn)行疫苗接種。
3.給藥途徑每日噴2次，每次每個(gè)鼻孔各噴一下、咽喉一下，每噴一下為0.1ml。
4.每位觀察者在病毒疫苗接種前和接種后21天、28天各采取三份血清，以備檢測(cè)抗體水平之用。
觀察指標(biāo)1.對(duì)2種病毒抗體的檢測(cè)在開(kāi)始用藥之日和在病毒活疫苗接種后21天和28天各采血1次，分離血清，檢測(cè)2種病毒抗體的增長(zhǎng)幅度。
2.病毒檢測(cè)在病毒疫苗接種后5天，取咽拭子.采用定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)2種病毒基因的拷貝數(shù)。
3.副反應(yīng)觀察在使用A或B藥期間，每日記錄可能產(chǎn)生的副反應(yīng)，包括癥狀和體征(體溫)。
在用藥前后由耳鼻喉科醫(yī)生對(duì)試驗(yàn)者進(jìn)行鼻粘膜檢測(cè)各1次。
療效評(píng)價(jià)1、用干擾素組的疫苗病毒血清抗體滴度比對(duì)照組有顯著性降低為有效。
2、用干擾素組的咽拭子疫苗病毒定量PCR檢測(cè)，試驗(yàn)組量與對(duì)照組相比有顯著性降低為有效。
藥物安全性評(píng)價(jià)1、參加試驗(yàn)的醫(yī)生認(rèn)真觀察及記錄不良事件，及時(shí)填寫(xiě)不良事件報(bào)告表，并由主管醫(yī)生簽字。
2、對(duì)不良事件應(yīng)及時(shí)處理，對(duì)危及患者生命的不良事件應(yīng)立即進(jìn)行搶救，對(duì)患者不能耐受的不良事件應(yīng)及時(shí)停藥，并進(jìn)行處理，輕度不良事件可繼續(xù)觀察。
3、不良事件與藥物的關(guān)系分析(1)肯定有關(guān)在用藥的相應(yīng)期間出現(xiàn)明顯的藥物反應(yīng)，停藥后反應(yīng)消失，再次用藥反應(yīng)再現(xiàn)。
(2)可能有關(guān)明顯的藥物反應(yīng)，停藥后反應(yīng)消失，但不能用病人本病的癥狀作出相應(yīng)的解釋。
(3)可能無(wú)關(guān)與用藥有密切的時(shí)間關(guān)系，但存在其他有關(guān)的因素。
(4)肯定無(wú)關(guān)疾病本身的反應(yīng)、或用藥前即存在的癥狀、或伴隨疾病的表現(xiàn)。
(5)無(wú)法判定。
研究結(jié)果(一)應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)評(píng)估人重組干擾素a2b噴霧劑在人群中對(duì)麻疹病毒減毒活疫苗的干預(yù)作用對(duì)照組共有7人，在鼻腔免疫后每人取咽拭子標(biāo)本共7份，4份檢測(cè)為陽(yáng)性；陽(yáng)性率為57.1％；干擾素組也共有7人，在鼻腔免疫后每人取咽拭子標(biāo)本共7份，3份標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，陽(yáng)性率為42.9％。由于樣本數(shù)量小，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是，在病毒基因陽(yáng)性標(biāo)本中，兩組病毒基因的拷貝數(shù)的比較卻有明顯的差別，見(jiàn)圖27和下表對(duì)照組與干擾素組免疫后陽(yáng)性標(biāo)本的麻疹病毒基因拷貝數(shù)的比較

上述有限樣本初步說(shuō)明，干擾素組麻疹病毒基因拷貝數(shù)比對(duì)照組的病毒基因拷貝數(shù)要低4.4倍，可以初步看出人重組干擾素a2b噴霧劑在一定程度上可以抑制麻疹病毒減毒活疫苗在上呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)的繁殖。
(二)應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)評(píng)估人重組干擾素a2b噴霧劑在人群中對(duì)風(fēng)疹病毒減毒活疫苗的干預(yù)作用對(duì)照組共有22人，其中男5人、女17人，平均年齡19.4歲，疫苗鼻腔免疫后72小時(shí)每人采集咽拭子標(biāo)本共22份，僅3份檢測(cè)為陽(yáng)性；干擾素組共有8人，全為女性，平均年齡為21.4歲，疫苗鼻腔免疫后72小時(shí)每人采集咽拭子標(biāo)本共8份，僅2份檢測(cè)為陽(yáng)性。兩組陽(yáng)性標(biāo)本中病毒基因拷貝數(shù)的比較見(jiàn)圖28和下表對(duì)照組與干擾素組免疫后陽(yáng)性標(biāo)本的風(fēng)疹病毒基因拷貝數(shù)的比較

可以發(fā)現(xiàn)干擾素組病毒拷貝數(shù)比對(duì)照組的要低兩個(gè)數(shù)量級(jí)，初步說(shuō)明人重組干擾素a2b在一定程度上是可以抑制風(fēng)疹病毒的繁殖。
(三)人重組干擾素a2b噴霧劑在人群中對(duì)風(fēng)疹、麻疹和腮腺炎減毒活疫苗鼻腔接種后免疫效果的干預(yù)作用1、重組人干擾素α2b鼻腔噴霧劑干預(yù)麻疹病毒減毒活疫苗鼻腔接種后免疫反應(yīng)的結(jié)果ELISA測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3.比較免前與免后21天和28天平均P/N值的差數(shù)，兩組有顯著差異，從有限樣本來(lái)說(shuō)，初步表明重組人干擾素α2b鼻腔噴霧劑能干預(yù)麻疹病毒減毒活疫苗鼻腔接種后加腔免疫的免疫反應(yīng)。
干擾素噴霧劑干預(yù)麻疹病毒減毒活疫苗鼻腔接種后免疫反應(yīng)的結(jié)果見(jiàn)下表

2.重組人干擾素α2b鼻腔噴霧劑干預(yù)風(fēng)疹病毒減毒活疫苗鼻腔接種后免疫反應(yīng)的結(jié)果風(fēng)疹病毒血凝抑制反應(yīng)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。比較免前與免后21天和28天血清風(fēng)疹病毒血凝抑制滴度平均增加倍數(shù)，兩組有差異，從有限樣本來(lái)說(shuō)，初步表明干擾素鼻腔噴霧在一定程度上干預(yù)風(fēng)疹病毒減毒活疫苗鼻腔接種后加腔免疫的免疫反應(yīng)。
干擾素噴霧劑干預(yù)風(fēng)疹病毒減毒活疫苗鼻腔接種后免疫反應(yīng)的結(jié)果見(jiàn)下表

3.重組人干擾素α2b鼻腔噴霧劑干預(yù)風(fēng)風(fēng)腮三聯(lián)病毒減毒活疫苗鼻腔接種后免疫反應(yīng)的結(jié)果風(fēng)疹血凝抑制反應(yīng)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。比較免前與免后21天血清血凝抑制滴度平均增加倍數(shù)，兩組有差異，但是28天結(jié)果無(wú)差別，腮腺炎血凝抑制反應(yīng)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)下表干擾素噴霧劑干預(yù)麻風(fēng)腮病毒減毒活疫苗鼻腔接種后免疫反應(yīng)的結(jié)果


比較免前與免后21天血清血凝抑制滴度平均增加倍數(shù)，兩組無(wú)差異，但是28天結(jié)果有輕微差別；從有限樣本來(lái)說(shuō)，初步表明干擾素鼻腔噴霧干預(yù)麻風(fēng)腮三聯(lián)疫苗鼻腔接種加腔免疫的免疫反應(yīng)不如單價(jià)疫苗明顯。研究結(jié)論及分析1、限樣本數(shù)的初步結(jié)果表明，使用干擾素噴霧劑組的風(fēng)疹病毒和麻疹病毒陽(yáng)性標(biāo)本中病毒基因拷貝數(shù)均比對(duì)照組要低，麻疹組低4.4倍，風(fēng)疹組低兩個(gè)數(shù)量級(jí)。因此可見(jiàn)，人重組干擾素a2b噴霧劑在一定程度上可以抑制麻疹病毒和風(fēng)疹病毒減毒活疫苗在上呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)的繁殖。但是，在麻疹和風(fēng)疹的對(duì)照組和干擾素組中，在病毒活疫苗接種后第3天采取的咽拭子樣本中，病毒檢出陽(yáng)性率均太低麻疹噴霧免疫組的對(duì)照組病毒陽(yáng)性率僅為57.1％；干擾素組的陽(yáng)性率僅為42.9％；風(fēng)疹噴霧免疫組的病毒陽(yáng)性率更低；可能的原因是所選擇的對(duì)象均曾經(jīng)感染過(guò)麻疹和風(fēng)疹，均不是初次免疫，上呼吸道已經(jīng)有低水平抗體存在，這些低水平的特異性抗體可以掩蓋干擾素非特異性抗病毒活性，所以，病毒攻擊后的病毒檢出率太低。
2、由于選擇的人群是麻疹抗體低水平人群，雖然樣本小，但已經(jīng)可以看到重組人干擾素α2b鼻腔噴霧劑對(duì)麻疹減毒活疫苗鼻腔接種后的再次免疫效果確有一定的干預(yù)作用，在免疫后第21天，干擾素組與對(duì)照組的平均P/N值的差異有顯著詫異(P＝0.025)；這與病毒基因拷貝數(shù)的減少是相吻合的。
3、麻疹和風(fēng)疹減毒活疫苗原為注射免疫接種，現(xiàn)在改為鼻腔噴霧接種，這次研究雖然沒(méi)有同時(shí)比較注射免疫與鼻腔免疫的效果，但是，從有限的初步的結(jié)果來(lái)看，鼻腔噴霧1次加強(qiáng)免疫后，血清抗體水平平均增加2.28(血凝抑制抗體)-3.58倍(ELISA)，這說(shuō)明進(jìn)行鼻腔噴霧加強(qiáng)免疫有一定作用。但是麻風(fēng)腮三聯(lián)疫苗鼻腔接種的效果不明顯，可能的原因是，麻風(fēng)腮三種病毒在上呼吸道同時(shí)繁殖相互有干擾作用。
4、鑒于很難選擇麻疹低抗體人群；關(guān)于選擇風(fēng)疹低抗體人群，因無(wú)試劑無(wú)法選擇。所以，這一技術(shù)路線擬不再繼續(xù)，改為在雙盲、隨機(jī)的人群中使用干擾素噴霧劑和不含干擾素的噴霧劑，在一定期間內(nèi)檢測(cè)呼吸道病毒IgM抗體差異的方法來(lái)評(píng)估干擾素噴霧劑的抗病毒效果。
實(shí)驗(yàn)例10應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)評(píng)估本發(fā)明噴霧劑在人群中對(duì)麻疹病毒減毒活疫苗的干預(yù)作用本實(shí)驗(yàn)例的目的在于研究人重組干擾素a2b噴霧劑在人群中對(duì)麻疹病毒減毒活疫苗的抑制作用，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR的方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組所采集的咽拭子樣本進(jìn)行檢測(cè)，判斷麻疹病毒陽(yáng)性標(biāo)本并得出陽(yáng)性標(biāo)本的病毒拷貝數(shù)。結(jié)果的有限樣本初步說(shuō)明，干擾素組麻疹病毒拷貝數(shù)比對(duì)照組的病毒的拷貝數(shù)要低4.4倍。結(jié)論人重組干擾素a2b噴霧劑在一定程度上可以抑制麻疹病毒在上呼吸道的繁殖。
麻疹病毒(Measles virus)是一種導(dǎo)致麻疹的副粘病毒科麻疹病毒屬的單股負(fù)鏈RNA病毒。麻疹是兒童最常見(jiàn)一種急性呼吸道傳染病。臨床上以發(fā)熱、上呼吸道炎癥、結(jié)膜炎、口腔粘膜斑及全身丘疹為特征。麻疹病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)包括病毒分離、分子雜交直接檢測(cè)病毒RNA、RT-PCR、血清學(xué)診斷等。
重組人干擾素a2b噴霧劑是用于鼻腔噴霧的一種干擾素劑型。干擾素具有廣譜抗病毒、抗細(xì)胞分裂、免疫調(diào)節(jié)活性的蛋白質(zhì)，在經(jīng)過(guò)近半個(gè)世紀(jì)的臨床研究和應(yīng)用，說(shuō)明它是一種重要的廣譜抗病毒、抗腫瘤治療藥物，并且有研究表明干擾素a2b在細(xì)胞水平上抑制病毒的復(fù)制。
實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是體外酶促核酸擴(kuò)增的一項(xiàng)技術(shù)革命，在近年來(lái)發(fā)展迅速。特別是在微生物的檢測(cè)上，具有高靈敏度、高特異性、高效快速、防污染以及易于標(biāo)準(zhǔn)化的特點(diǎn)。它可以分為探針?lè)ê蜔晒鈸饺敕?，其中探針?lè)矫婵晒┻x擇的有TaqMan探針、FRET探針以及分子信標(biāo)(molecular beacon)，這種方法存在特異性高的優(yōu)點(diǎn)，但是設(shè)計(jì)合成困難、成本高、價(jià)格貴。而熒光摻入法是利用DNA結(jié)合染料SYBR GreenI可以特異性結(jié)合雙鏈DNA的特性進(jìn)行熒光檢測(cè)，它價(jià)格低廉，可以發(fā)展成一種能廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)價(jià)格低廉的病毒定量診斷方法。
本實(shí)驗(yàn)例的目的是采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)評(píng)估本發(fā)明噴霧劑在人群中對(duì)麻疹病毒減毒活疫苗的干預(yù)作用。
材料與方法1、人群選擇和臨床方案江蘇省徐州市唯唯豆奶集團(tuán)20-25歲的初次篩選麻疹低抗體的人群，共30人，分為兩組。一組為對(duì)照組噴鼻接種麻風(fēng)腮三聯(lián)減毒活疫苗(美國(guó)默沙東公司)一次，噴鼻接種量為說(shuō)明書(shū)疫苗的接種量。接種前采集一次咽拭子(免前標(biāo)本)，接種后三天再采集一次咽拭子(免后標(biāo)本)。另一組為干擾素組先連續(xù)使用重組人干擾素a2b噴霧劑(北京遠(yuǎn)策藥業(yè)有限責(zé)任公司)噴鼻10天，第二天接種同樣劑量的麻風(fēng)腮三聯(lián)減毒活疫苗。接種前采集一次咽拭子(免前標(biāo)本)，接種后三天再采集一次咽拭子(免后標(biāo)本)。
2.重組人干擾素a2b噴霧劑由北京遠(yuǎn)策藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。每瓶3.65毫升，每毫升含300萬(wàn)國(guó)際單位重組人干擾素a2b。干擾素組每日噴鼻、咽2次，每次左右鼻腔和咽部各1下，每噴霧1下為0.1毫升。
3.病毒RNA的提取病毒RNA提取采用Invitrogen公司的TRIZOL提取試劑盒，具體操作根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)。
4.病毒標(biāo)準(zhǔn)品RNA的確定用分光光度計(jì)測(cè)定疫苗中的麻疹病毒RNA的純度和濃度，共測(cè)定五次，求出平均值。通過(guò)一定的數(shù)學(xué)公式，將病毒的濃度換算成病毒的拷貝數(shù)。再將標(biāo)準(zhǔn)品病毒RNA進(jìn)行一系列的10倍稀釋，用于real-timePCR中標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定。
5.Real-time PCR法靶序列的選擇在麻疹病毒保守的matrix基因區(qū)。正鏈引物序列為5’-ATAGTTGTTAGACGTACAGCAGGG-3’；負(fù)鏈引物序列為5’-ACCGC ATTGC ACACT TGGTT-3’。One-stepRT-PCR試劑盒為QIGEN公司產(chǎn)品。SYBR Green I(20×Concentration，用于real-time PCR)購(gòu)自上海開(kāi)放科技公司。實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，包括10ul的水、5ul的buffer、1ul的Enzyme Mixture、1uldNTP、引物各為1ul、1ul的SYBR Green I、5ul的樣品RNA，共25ul體系。反應(yīng)條件為反轉(zhuǎn)錄50℃30min，95℃ 15min，1個(gè)循環(huán)；PCR 94℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 15s，40個(gè)循環(huán)；在50℃-99℃做溶解曲線，最后降溫至37℃保存。所用儀器為Rotergene公司RG-3000熒光定量PCR儀。
6.定量結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用Rotergene Version 4.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，采用對(duì)數(shù)平均值計(jì)算病毒的拷貝數(shù)。
結(jié)果一、麻疹病毒標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立用分光光度計(jì)測(cè)定病毒RNA的濃度后，將其進(jìn)行一系列的10倍稀釋將其換算為病毒的拷貝數(shù)。在real-time PCR完成后，以每個(gè)稀釋度熒光的對(duì)數(shù)值(y軸)對(duì)出現(xiàn)的循環(huán)數(shù)(x軸)作圖，如圖29。圖中的水平線位于熒光背景之上，與曲線的交點(diǎn)可以確定每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即Ct值。
通過(guò)圖29，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值，如圖30。標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.9937，表明相關(guān)性非常高。標(biāo)準(zhǔn)曲線在107-104copies/reaction這一很大的范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系。并且最小可以檢測(cè)到100個(gè)病毒拷貝。
二、樣品中陽(yáng)性樣本的判斷將兩組免疫前和免疫后的標(biāo)本進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)，在對(duì)標(biāo)本結(jié)果的判斷中，采用是否存在Ct值，并且結(jié)合擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值進(jìn)行判斷。因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)中，使用的是SYBR Green I，它能非特異性的嵌合于雙鏈DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的小溝中，但是存在的缺陷是SYBR Green I能與所有的雙鏈DNA結(jié)合，包括擴(kuò)增的產(chǎn)物、非特異產(chǎn)物、引物二聚體?？梢酝ㄟ^(guò)溶解曲線分析來(lái)確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。在PCR完成后，在50℃-99℃之間作溶解曲線，溫度每秒上升0.2℃直到99℃，并且持續(xù)的進(jìn)行熒光記錄，得出溶解曲線，如圖31。某一特定的PCR產(chǎn)物的Tm值由其片段長(zhǎng)度和GC含量決定的，可以通過(guò)Tm值的不同來(lái)區(qū)分非特異產(chǎn)物、引物二聚體和特異性產(chǎn)物。麻疹病毒引物二聚體的Tm值在83.1-84.0℃之間，而特異性產(chǎn)物的Tm值在85.6-86.4℃之間。
三、對(duì)照組和干擾素組病毒基因拷貝數(shù)的比較對(duì)照組共有7人，在鼻腔免疫后每人取咽拭子標(biāo)本共7份，4份檢測(cè)為陽(yáng)性；陽(yáng)性率為57.1％；干擾素組也共有7人，在鼻腔免疫后每人取咽拭子標(biāo)本共7份，3份標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，陽(yáng)性率為42.9％。由于樣本數(shù)量小，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是，在病毒基因陽(yáng)性標(biāo)本中，兩組病毒基因的拷貝數(shù)的比較卻有明顯的差別，見(jiàn)圖31和下表對(duì)照組與干擾素組免疫后陽(yáng)性標(biāo)本的麻疹病毒基因拷貝數(shù)的比較

所以，從對(duì)照組與干擾素組免疫后陽(yáng)性標(biāo)本的麻疹病毒基因拷貝數(shù)的比較上，有限樣本初步說(shuō)明，干擾素組麻疹病毒基因拷貝數(shù)比對(duì)照組的病毒基因拷貝數(shù)要低4.4倍，可以初步看出本發(fā)明噴霧劑在一定程度上可以抑制麻疹病毒減毒活疫苗在上呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)的繁殖。
實(shí)驗(yàn)例11本實(shí)驗(yàn)例的目的是評(píng)估本發(fā)明噴霧劑在人群中對(duì)風(fēng)疹病毒減毒活疫苗的干預(yù)作用。
方法通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR的方法，對(duì)干擾素組和對(duì)照組所采集的減毒活疫苗免疫后的咽拭子樣本進(jìn)行檢測(cè)，判斷風(fēng)疹病毒陽(yáng)性標(biāo)本并得出陽(yáng)性標(biāo)本的病毒拷貝數(shù)。結(jié)果有限樣本數(shù)的初步結(jié)果表明，干擾素組的風(fēng)疹病毒陽(yáng)性標(biāo)本中病毒基因拷貝數(shù)比對(duì)照組要低兩個(gè)數(shù)量級(jí)。結(jié)論人重組干擾素a2b噴霧劑在一定程度上可以抑制風(fēng)疹病毒減毒活疫苗在上呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)的繁殖。
風(fēng)疹病毒(rubella virus，RUV)是一種能引起人類(lèi)疾病的披膜病毒科風(fēng)疹病毒屬的單鏈RNA病毒。在大多數(shù)情況下，風(fēng)疹病毒的感染屬于一過(guò)性和無(wú)臨床癥狀的亞臨床型感染，僅有少數(shù)被感染者會(huì)發(fā)生較嚴(yán)重的并發(fā)癥。但孕婦感染風(fēng)疹病毒后，特別是懷孕3個(gè)月以內(nèi)的孕婦，可以引起胎兒畸形。而且孕婦感染風(fēng)疹病毒的時(shí)間越早，致畸的可能性越大。血清學(xué)研究表明，感染過(guò)風(fēng)疹病毒的育齡婦女即使再被感染，懷孕后也會(huì)對(duì)胎兒造成危害[1]。風(fēng)疹病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)包括病毒分離、病毒特異性IgM的檢測(cè)、分子雜交直接檢測(cè)病毒RNA、RT-PCR、RT-nested PCR(RT-nPCR)等等。
重組人干擾素-α2b噴霧劑是干擾素-α2b鼻給藥的一種劑型。干擾素是一種具有廣譜抗病毒、抗細(xì)胞分裂、免疫調(diào)節(jié)活性的蛋白質(zhì)，在經(jīng)過(guò)近半個(gè)世紀(jì)的臨床研究和應(yīng)用，說(shuō)明它是一種重要的廣譜抗病毒、抗腫瘤治療藥物。并且有研究表明干擾素a2b在細(xì)胞水平上抑制病毒的復(fù)制。
實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是體外酶促核酸擴(kuò)增的一項(xiàng)技術(shù)革命，在近年來(lái)發(fā)展迅速。特別是在微生物的檢測(cè)上，具有高靈敏度、高特異性、高效快速、防污染以及易于標(biāo)準(zhǔn)化的特點(diǎn)。它可以分為探針?lè)ê蜔晒鈸饺敕?，其中探針?lè)矫婵晒┻x擇的有TaqMan探針、FRET探針以及分子信標(biāo)(molecular beacon)，這種方法存在特異性高的優(yōu)點(diǎn)，但是設(shè)計(jì)合成困難、成本高、價(jià)格貴。而熒光摻入法是利用DNA結(jié)合染料SYBR GreenI可以特異性結(jié)合雙鏈DNA的特性進(jìn)行熒光檢測(cè)，它價(jià)格低廉，可以發(fā)展成一種能廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)價(jià)格低廉的病毒定量診斷方法。
本研究的目的是評(píng)估人重組干擾素a2b噴霧劑在人群中對(duì)風(fēng)疹病毒減毒活疫苗的干預(yù)作用。材料與方法1.群選擇和臨床方案江蘇省徐州市唯唯豆奶集團(tuán)20-25歲的初次篩選風(fēng)疹病毒抗體低下的人群，共30人，分為兩組對(duì)照組噴鼻接種風(fēng)疹減毒活疫苗(北京天壇生物制品股份有限公司)一次，噴鼻接種量為說(shuō)明書(shū)疫苗的接種量。接種前采集一次咽拭子(免前標(biāo)本)，接種后三天再采集一次咽拭子(免后標(biāo)本)。另一組為干擾素組，先連續(xù)使用重組人干擾素a2b噴霧劑(北京遠(yuǎn)策藥業(yè)有限責(zé)任公司)噴鼻10天，第二天接種風(fēng)疹減毒活疫苗。接種前采集一次咽拭子(免前標(biāo)本)，接種后三天再采集一次咽拭子(免后標(biāo)本)。
2.重組人干擾素a2b噴霧劑由北京遠(yuǎn)策藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。每瓶3.65毫升，每毫升含300萬(wàn)國(guó)際單位重組人干擾素a2b。干擾素組每日噴鼻、咽2次，每次左右鼻腔和咽部各1下，每噴霧1下為0.1毫升。
3.病毒RNA的提取病毒RNA提取采用Invitrogen公司的TRIZOL提取試劑盒，具體操作根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)。
4.病毒標(biāo)準(zhǔn)品RNA的確定用分光光度劑測(cè)定風(fēng)疹減毒活疫苗中的風(fēng)疹病毒減毒活疫苗的RNA純度和濃度，共測(cè)定五次，求出平均值。通過(guò)一定的數(shù)學(xué)公式，將病毒RNA的濃度換算成病毒基因的拷貝數(shù)。再將標(biāo)準(zhǔn)品病毒RNA進(jìn)行一系列的10倍稀釋，用于real-time PCR中標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定。
5.Real-time PCR法靶序列的選擇在風(fēng)疹病毒保守的E1基因區(qū)。正鏈引物序列為5’-CAACACGCCGCACGGACAAC-3’；負(fù)鏈引物序列為5’-GGACTGCTGATTGCCGGTGTAATT-3’。One-step RT-PCR試劑盒為QIGEN公司產(chǎn)品。SYBR Green I(20×Concentration，用于real-time PCR)購(gòu)自上海開(kāi)放科技公司。實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，包括10ul的水、5ul的buffer、1ul的EnzymeMixture、1ul dNTP、引物各為1ul、1ul的SYBR Green I、5ul的樣品RNA，共25ul體系。反應(yīng)條件為反轉(zhuǎn)錄50℃ 30min，95℃ 15min，1個(gè)循環(huán)；PCR 94℃1 5s，60℃ 15s，72℃ 15s，40個(gè)循環(huán)；在50℃-99℃做溶解曲線，最后降溫至37℃保存。所用儀器為Rotergene公司RG-3000熒光定量PCR儀。
6.定量結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用Rotergene Version 4.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，采用對(duì)數(shù)平均值計(jì)算病毒基因的拷貝數(shù)。
結(jié)果一、風(fēng)疹病毒標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立用分光光度計(jì)測(cè)定的病毒RNA的濃度后，進(jìn)行一系列的10倍稀釋，將其換算為病毒基因的拷貝數(shù)。在real-time PCR完成后，以每個(gè)稀釋度熒光的對(duì)數(shù)值(y軸)對(duì)出現(xiàn)的循環(huán)數(shù)(x軸)作圖，如圖32。圖中的水平線位于熒光背景之上，與曲線的交點(diǎn)可以確定每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即Ct值。
通過(guò)圖32，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值，如圖33，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.99885，表明相關(guān)性非常高。標(biāo)準(zhǔn)曲線在1010-106copies/reaction這一很大的范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系。并且最小可以檢測(cè)到100個(gè)病毒基因拷貝。
二、樣品中陽(yáng)性樣本的判斷將兩組免疫前和免疫后的標(biāo)本進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)，在對(duì)標(biāo)本結(jié)果的判斷中，采用是否存在Ct值，并且結(jié)合擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值進(jìn)行判斷。因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)中，使用的是SYBR Green I，它能非特異性的嵌合于雙鏈DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的小溝中，但是存在的缺陷是SYBR Green I能與所有的雙鏈DNA結(jié)合，包括擴(kuò)增的產(chǎn)物、非特異產(chǎn)物、引物二聚體?？梢酝ㄟ^(guò)溶解曲線分析來(lái)確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。在PCR完成后，在50℃-99℃之間作溶解曲線，溫度每秒上升0.2℃直到99℃，并且持續(xù)的進(jìn)行熒光記錄，得出溶解曲線，如圖34。某一特定的PCR產(chǎn)物的Tm值由其片段長(zhǎng)度和GC含量決定的，可以通過(guò)Tm值的不同來(lái)區(qū)分非特異產(chǎn)物、引物二聚體和特異性產(chǎn)物。風(fēng)疹病毒引物二聚體的Tm值在86.1-86.6℃之間，而特異性產(chǎn)物的Tm值在87.6-88.6℃之間。
三、對(duì)照組和干擾素組風(fēng)疹病毒基因拷貝數(shù)的比較對(duì)照組共有22人，其中男5人、女17人，平均年齡19.4歲，疫苗鼻腔免疫后72小時(shí)每人采集咽拭子標(biāo)本共22份，僅3份檢測(cè)為陽(yáng)性；干擾素組共有8人，全為女性，平均年齡為21.4歲，疫苗鼻腔免疫后72小時(shí)每人采集咽拭子標(biāo)本共8份，僅2份檢測(cè)為陽(yáng)性。兩組陽(yáng)性標(biāo)本中病毒基因拷貝數(shù)的比較見(jiàn)圖34和下表對(duì)照組與干擾素組免疫后陽(yáng)性標(biāo)本的風(fēng)疹病毒基因拷貝數(shù)的比較

從上表和圖34中，可以發(fā)現(xiàn)干擾素組病毒拷貝數(shù)比對(duì)照組的要低兩個(gè)數(shù)量級(jí)，初步說(shuō)明人重組干擾素a2b在一定程度上是可以抑制風(fēng)疹病毒的擴(kuò)增的。
討論實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，因?yàn)槠胀≒CR在擴(kuò)增完成后，必須打開(kāi)試管進(jìn)行樣品檢測(cè)，增加了污染的可能；而實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)和結(jié)果分析在密閉的一個(gè)試管中進(jìn)行，可以減少污染，準(zhǔn)確性更高。近年來(lái)，實(shí)時(shí)定量PCR在病毒的臨床的檢測(cè)上發(fā)展迅速，如HBV、SARS、HCV、HIV、細(xì)小病毒B19等等。
SYBR Green I是一種不對(duì)稱的箐類(lèi)熒光素，它能非特異性的嵌合于雙鏈DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的小溝中，結(jié)合狀態(tài)的熒光強(qiáng)度較游離狀態(tài)的熒光增強(qiáng)千倍。與TaqMan探針和分子信標(biāo)相比，其具有價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。因?yàn)門(mén)aqMan探針和分子信標(biāo)需要針對(duì)待測(cè)病毒設(shè)計(jì)特異性的探針，并且需要熒光標(biāo)記，不僅操作麻煩，而且價(jià)格昂貴，而SYBR Green I只需在擴(kuò)增體系中直接加入，即可進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，避免了設(shè)計(jì)、標(biāo)記探針，適用任何擴(kuò)增體系。非常適用于發(fā)展成一種能廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)價(jià)格低廉的病毒定量診斷方法[11]。但是存在的缺陷是SYBR Green I能與所有的雙鏈DNA結(jié)合，包括擴(kuò)增的產(chǎn)物、非特異產(chǎn)物、引物二聚體?？梢酝ㄟ^(guò)兩種方法來(lái)克服這種缺陷，一、使用熱啟動(dòng)的Taq酶進(jìn)行熱啟動(dòng)擴(kuò)增，減少非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的出現(xiàn)。二、通過(guò)溶解曲線分析來(lái)確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，來(lái)避免假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)[8]。在實(shí)驗(yàn)中我們使用的QIGEN公司的One-step RT-PCR試劑盒含有熱啟動(dòng)Taq酶；并且通過(guò)溶解曲線可以很好的區(qū)分非特異產(chǎn)物、引物二聚體和特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。
人重組干擾素a2b噴霧劑在人群中對(duì)風(fēng)疹病毒減毒活疫苗的抑制的研究中，由于所選取的人群均為低抗體人群，所以活疫苗接種后72小時(shí)，PCR檢測(cè)出的病毒陽(yáng)性率很低，雖在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)意義，但是在有限的病毒基因陽(yáng)性的標(biāo)本中，我們發(fā)現(xiàn)干擾素組病毒基因拷貝數(shù)比對(duì)照組的要低兩個(gè)數(shù)量級(jí)，初步說(shuō)明人重組干擾素a2b噴霧劑在一定程度上是可以抑制風(fēng)疹病毒減毒活疫苗在上呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)的繁殖。
權(quán)利要求
1.一種由人干擾素制備的藥物組合物在制備預(yù)防或/和治療呼吸道病毒感染藥物方面的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的呼吸道病毒可以是濾泡性口腔炎病毒VSV、副流感病毒、流感病毒、禽流感病毒、SARS冠狀病毒、鼻病毒、麻疹病毒、腸道病毒、腺病毒、皰疹病毒、漢坦病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的禽流感病毒是低致病性禽流感H9H2或高致病性禽流感H5N1。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的鼻病毒是鼻病毒14型。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的皰疹病毒是單純皰疹病毒-1或單純皰疹病毒-2。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的腸道病毒是腸道病毒CoxB1。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的腺病毒是腺病毒7型。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的組合物含有如下重量份的組分人干擾素1-99其它輔料1-99。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于，所述的人干擾素為人干擾素α2b、α1b、β及干擾素ω、干擾素κ、干擾素λ、干擾素ε等其它I型干擾素。
10.根據(jù)權(quán)利要求3-6所述的組合物，其特征在于，所述的人干擾素為人干擾素α2b或重組人干擾素α2b。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種由人干擾素制備的藥物組合物在制備預(yù)防或/和治療呼吸道病毒感染藥物方面的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。上述組合物含有如下重量份的組分人干擾素1－99其它輔料1－99。上述的人干擾素可以是人干擾素α2b、α1b、β及干擾素ω、干擾素κ、干擾素λ、干擾素ε等其它I型干擾素，所述的人干擾素為重組人干擾素或/和用其他方法制備的人干擾素。上述輔料可以是磷酸緩沖液、人白蛋白、甘露醇、氯化鈉、聚糖、苯甲醇其中的全部或任意部分的組合，用量為藥劑學(xué)上的有效劑量，以實(shí)現(xiàn)緩沖、穩(wěn)定、防腐作用。上述藥物組合物在制備預(yù)防或/和治療呼吸道病毒感染藥物，特別是SARS病毒、副流感病毒、流感病毒等引起的呼吸道感染的藥物方面有很好的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P31/16GK1927389SQ20051010243
公開(kāi)日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2005年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月10日
發(fā)明者候云德 申請(qǐng)人:北京金迪克生物技術(shù)研究所, 北京遠(yuǎn)策藥業(yè)有限責(zé)任公司