專利名稱：穩(wěn)定的干擾素組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般是涉及藥物的組合物，更具體涉及蛋白質(zhì)的穩(wěn)定的液體或凍干的制劑，包括干擾素-β制劑。
發(fā)明的背景干擾素是一個糖蛋白家族，它們自細胞的分泌由許多信號所誘導，這些信號包括病毒，雙鏈RNA，其他的多核苷酸，抗原和有絲分裂原。干擾素呈現(xiàn)出各種各樣的生物活性，包括抗病毒，抗增殖以及免疫調(diào)節(jié)活性。至少已經(jīng)有三種不同類型的人類干擾素，α，β和γ，依據(jù)許多因素被區(qū)分開來，包括抗病毒和抗增殖活性。
干擾素-β(IFN-β)第一個被確認對于治療多發(fā)性硬化癥(MS)有效，并證實能減少那些復(fù)發(fā)和緩解型MS病人的發(fā)作次數(shù)，干擾素-β組合物在乙型和丙型肝炎感染的治療中也十分有用。
和所有以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的藥物一樣，在把干擾素-β當作治療藥物的使用過程中必須克服的主要障礙之一就是由于它的藥物制劑的不穩(wěn)定性所導致的藥物作用的喪失。威脅到藥物制劑中多肽的活性和療效的物理不穩(wěn)定性包括變性，可溶以及不可溶的聚集物的形成，化學的不穩(wěn)定性包括水解，形成酰亞胺，氧化，消旋和脫酰胺作用。已經(jīng)知道這些變化中的一些變化能導致感興趣的蛋白質(zhì)的藥物活性的降低或喪失。在其他的情況下，這些變化的確切效應(yīng)還不為人知，但是所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物由于它的潛在的不良副作用而不能被作為藥物接受。
藥物制劑中多肽的不穩(wěn)定性直接影響它們的藥理作用，正如為批準以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)藥物而提出的標準強調(diào)多肽的活性和分子特征的改變必須最小。例如，1995年11月30號，國際人用藥物注冊技術(shù)要求協(xié)調(diào)會議(一個歐盟，日本和美國三方組織，從事制訂與藥物相關(guān)的政策建議供實施)提出的關(guān)于生物技術(shù)，生物產(chǎn)品穩(wěn)定性試驗的報告中指出無論什么地方經(jīng)過長期的，加速的，和/或應(yīng)激的穩(wěn)定性研究而發(fā)現(xiàn)有意義的質(zhì)或量的改變，這種改變表明降解產(chǎn)物形成，就應(yīng)該討論潛在的危險以及考慮在長期穩(wěn)定性方案中鑒定和定量降解產(chǎn)物。
結(jié)果是需要另外的蛋白質(zhì)藥物組合物，包括干擾素-β組合物，包含生理上相容的穩(wěn)定劑，能夠大大的減少雜質(zhì)，以達到穩(wěn)定蛋白質(zhì)和提高藥理作用的目的。
發(fā)明概述提供了包含作為治療活性成份的干擾素-β和作為賦形劑的高度提純的甘露醇的組合物，與包含非高純度的甘露醇的干擾素-β組合物相比它以在儲存過程中穩(wěn)定性提高為特征。還提供了制備這些組合物的方法。
附圖的概述

圖1是對利用葡萄糖制備的干擾素-β粉狀物和在50℃下保溫一周的凍干粉末的RP-HPLC色譜圖的對比。保持50℃的制劑中可以看到糖基化的干擾素-β加合物的形成出現(xiàn)在第二個(B1)峰(大約在流份48)，在干擾素-β主峰(大約在流份49-50)之前。見例1。
圖2是利用葡萄糖配制的干擾素-β粉狀物的譜圖。可以發(fā)現(xiàn)除了在19878amu(原子質(zhì)量單位)有干擾素-β的主峰外還有一些小峰。見例1。
圖3是從粉狀組合物凍干并在50℃下儲存一周后的以葡萄糖配制的干擾素-β樣品的質(zhì)譜圖。和圖2對比，幾個主要的峰是代表干擾素-β加合物的。見例1。
圖4是對用USP甘露醇配制的干擾素-β粉狀物和在50℃下保溫一周的凍干粉末的RP-HPLC色譜圖的對比。保持在50℃下的制劑未見糖基化干擾素-β加合物的形成(出現(xiàn)B1峰)。見例1。
圖5是利用USP甘露醇配制的干擾素-β粉狀物的質(zhì)譜圖。干擾素-β在19880amu可以發(fā)現(xiàn)有一峰。見例1。
圖6是利用USP甘露醇配制的低壓凍干的干擾素-β粉末在50℃下保溫一周的質(zhì)譜圖。在圖中可看見另外的峰的形成(代表加合物)。見例1。
圖7是用未提純的甘露醇配制的干擾素-β的質(zhì)譜圖。在譜中能看見許多另外的峰的形成(代表加合物)。見例1。
圖8是以甲醇提取過的甘露醇配制的干擾素-β的質(zhì)譜圖，這種甘露醇和圖7使用的是同一批。加合物峰的大小和數(shù)量都大量減少。見例1。
圖9是利用高純度的甘露醇(經(jīng)甲醇提取，碳處理，超濾，重結(jié)晶)配制的干擾素-β制劑的質(zhì)譜圖。除了代表未改變的干擾素-β的主峰外只能看到三個小峰。見例1。
圖10是不用甘露醇所配制的干擾素-β的質(zhì)譜圖。從圖中我們可以看出圖9中呈現(xiàn)的主要次級峰不是因為與高純度的甘露醇作用而形成的，它們在沒有賦形劑時也會出現(xiàn)。見例1。
圖11是和上面圖9同一天利用USP甘露醇配制的干擾素-β的質(zhì)譜圖。此譜證實了利用USP甘露醇配制的干擾素-β形成了附加的峰(加合物)，這在含有高純度的甘露醇的干擾素-β制劑中是不出現(xiàn)的。見例1。
圖12給出了利用葡萄糖配制的干擾素-β制劑的穩(wěn)定性評價數(shù)據(jù)，如例2所描述。
圖13給出了含有高純度甘露醇的干擾素-β制劑的穩(wěn)定性評價數(shù)據(jù)，如例2所述。
圖14給出了含有高純度甘露醇的干擾素-β制劑(批號006)的穩(wěn)定性評價數(shù)據(jù)，如例3所述。
圖15給出了含有高純度甘露醇的干擾素-β制劑批號(008)的穩(wěn)定性評價數(shù)據(jù)，如例3所述。
圖16給出了含有高純度甘露醇的干擾素-β制劑(批號009)的穩(wěn)定性評價數(shù)據(jù)，如例3所述。
圖17表示各種甘露醇樣品呈現(xiàn)的還原活性。樣品1-3是沒有經(jīng)過甲醇提取，碳過濾，或超濾的USP甘露醇；樣品4-6是經(jīng)過甲醇提取的USP甘露醇，樣品7-9是經(jīng)甲醇提取，碳處理，超濾，重結(jié)晶的甘露醇。
發(fā)明的詳述本發(fā)明是研究穩(wěn)定性提高的干擾素-β藥物組合物以及它們的制備方法。這樣的組合物包含干擾素-β和高純度的甘露醇。高純度的甘露醇通過減少降解產(chǎn)物的形成來提高配方的穩(wěn)定性。穩(wěn)定的干擾素-β配方優(yōu)點在于它更安全(由于減少了潛在的有害的副作用)以及更經(jīng)濟(由于提高了制劑的貨架壽命)。
所揭示的組合物由于使用了高純度的甘露醇而穩(wěn)定性提高了。這項發(fā)明有個新的發(fā)現(xiàn)就是未經(jīng)高度提純的甘露醇擁有還原的活性，它能夠和干擾素-β作用而產(chǎn)生不希望有的加合物(降解的產(chǎn)物)，然而高度提純的甘露醇不擁有這種還原的活性，在干擾素-β配方中不能促使這些加合物的形成。這里所提供的實驗結(jié)果(見實驗部分的例1)表明導致干擾素-β中加合物形成的不純甘露醇所呈現(xiàn)出的還原的活性不是還原性糖的活性，這是因為由于未高度純化的甘露醇的存在而形成的加合物可以與由于擁有還原性糖的活性的賦形劑(例如葡萄糖)存在的而形成的加合物清楚的區(qū)分開來。
這里所使用的“高純度的甘露醇”指的是還原活性較低的甘露醇。高度提純的甘露醇的還原活性要比USP甘露醇的百萬分之二十還要小，它由這里其他地方所述的還原活性的測定法所測定。在各種各樣的實施方案中，高純度的甘露醇的還原活性低于百萬分之十九，低于百萬分之十八，低于百萬分之十七，低于百萬分之十六，低于百萬分之十五，低于百萬分之十四，或低于百萬分之十三。在一種實施的方案中，高度提純的甘露醇是經(jīng)過下列步驟處理的USP(美國藥典)或ACS(美國化學會)級別的甘露醇1)甲醇提取，2)碳處理，3)超濾和4)重結(jié)晶。高純度的甘露醇達到足以穩(wěn)定配方的濃度。這項發(fā)明中的配方可以有少到約的0.1％的高純度的甘露醇或多達約7.5％的高純度的甘露醇(重量/體積)。在各種各樣的實施方案中，甘露醇的濃度約為0.2％到7.0％，約0.25％到2.5％，和約1.25％。
揭示了含有作為治療活性成分的干擾素-β和作為賦形劑的高純度甘露醇的液體和凍干的藥物組合物。對本發(fā)明來說，關(guān)于藥物組合物或配方的“液體”這個詞意思包括“含水的”一詞。關(guān)于干擾素-β的藥物配方的“凍干”這詞指的是許多小瓶在減壓條件下迅速凍干，這些小瓶各自裝有在此提出的單位劑量的本發(fā)明的干擾素配方。在上面所描述的凍干中使用的凍干機在商業(yè)上是可得到的，并容易被本專業(yè)的技術(shù)人員們所使用。在這項發(fā)明的一種實施方案中，液體組合物是凍干的。
這項發(fā)明提出的液體或凍干的干擾素-β制劑是“穩(wěn)定的”。“穩(wěn)定的”組合物或擁有“提高了的穩(wěn)定性”或“改善了的穩(wěn)定性”的組合物，是所需的組合物，與利用未經(jīng)高度提純的甘露醇配制的干擾素-β組合物相比擁有提高了的儲存穩(wěn)定性。這種穩(wěn)定性的提高的表現(xiàn)是，與用未經(jīng)高度提純的甘露醇配制所得的配方相比，儲存時干擾素-β加合物或是降解產(chǎn)物減少。加合物或降解產(chǎn)物的形成可以使用這里所提到的質(zhì)譜測定來測量。這項發(fā)明中利用高純度甘露醇配制的穩(wěn)定的干擾素-β組合物的特征是與不用甘露醇配制的干擾素-β組合物對比，沒有附加的峰，這些峰能在利用USP甘露醇配制的干擾素-β中觀察到，這是通過這里提到的質(zhì)譜測定所發(fā)現(xiàn)的。例如圖9中所呈現(xiàn)的利用高純度的甘露醇配制的干擾素-β的質(zhì)譜圖，它和圖10中所呈現(xiàn)的不利用甘露醇配制的干擾素-β的質(zhì)譜圖相對比沒有附加的峰。相比之下，圖11所呈現(xiàn)的利用USP甘露醇配制的干擾素-β的質(zhì)譜圖，它和不利用甘露醇配制的干擾素-β的質(zhì)譜圖對比就有許多的附加的峰(加合物)。該項發(fā)明中的穩(wěn)定的干擾素-β藥物組合物保持了它們的效價，并且在30℃下儲存可包含少于0.02mg/ml的糖基化的干擾素-β大概可達兩年時間，如果在25℃下存儲可以至少兩年。
本發(fā)明的穩(wěn)定的藥物制劑包含干擾素-β和它的變體。這里使用的“干擾素-β”指的是干擾素-β或它的變體，有時指干擾素-β樣的多肽。人干擾素-β的變體，也許是天然存在的(例如在干擾素-β基因座存在的等位基因變體)或是重組產(chǎn)生的，它們與成熟的天然干擾素-β序列有相同的，相似的或是基本相似的氨基酸序列。干擾素-β的保留其活性的片段或截短的形式也包括在內(nèi)。這些有生物活性的干擾素-β片段或截短的形式是利用本領(lǐng)域熟知的DNA重組技術(shù)從全長的干擾素-β氨基酸序列除去氨基酸殘基而得到的。干擾素-β多肽可以是糖基化的也可以是未糖基化的，就象文獻中報導的那樣，糖基化的以及未糖基化的干擾素-β都表現(xiàn)出質(zhì)相似的特異性活性，因此糖基部分與干擾素-β的生物活性無關(guān)，對干擾素-β的生物活性也不起作用。
這里所指的干擾素-β變體包括成熟的天然干擾素-β序列的變異蛋白質(zhì)(muteins)(例如美國專利第5,814,485號，這里引用供參考)，在那里對于生物活性并不必要的一個或多個半胱氨酸殘基被故意剔除或用其他氨基酸代替以消除分子間交聯(lián)或形成不正確的分子內(nèi)二硫鍵的位點。這一類型干擾素-β的變體包括那些序列，它們含有甘氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、或甲硫氨酸替代了成熟的天然氨基酸序列第17個氨基酸位點上的半胱氨酸。絲氨酸和蘇氨酸是更優(yōu)越的取代物，因為它們和半胱氨酸化學結(jié)構(gòu)相似。絲氨酸取代最為優(yōu)選。例如干擾素-β的變體，其在成熟的天然序列中的第17個氨基酸半胱氨酸被絲氨酸替代(美國專利第5,814,485號)。第17位的半胱氨酸也可以使用該領(lǐng)域已知的方法剔除(例如美國專利第4,588,584號，這里引用供參考)，導致成熟的干擾素-β變異蛋白質(zhì)，它比成熟的天然干擾素-β短一個氨基酸。例如美國專利第4,530,787；4,572,798和4,588,585號。因此，本發(fā)明也包含有一處或多處突變的干擾素-β變體，這些突變例如可以改善它們的藥理作用。
熟練的技術(shù)人員將會意識到通過編碼干擾素-β的核苷酸序列的變異可導入附加的變化，從而改變干擾素-β的氨基酸序列，卻不改變干擾素的生物活性。這樣，一個編碼和成熟的天然干擾素-β氨基酸序列不同的干擾素-β變體的獨立的核酸分子，就可以創(chuàng)造出來，通過在這里所揭示的相應(yīng)的核苷酸序列中引入一個或多個核苷酸取代物、添加或刪除核苷酸，這樣被編碼的干擾素-β將會被引入一個或多個氨基酸取代物、添加或刪除氨基酸。變異可以通過標準的技術(shù)導入，例如定點誘變和以PCR介導的誘變。本發(fā)明也包括這樣的干擾素-β變體。
例如，保守性氨基酸替換可以通過一個或多個預(yù)測的，最好是非必需氨基酸殘基來實現(xiàn)?！胺潜匦琛卑被釟埢强梢詮囊吧偷母蓴_素-β序列改變而不改變它的生物活性的殘基，然而“必需的”氨基酸殘基是生物活性所必需的?！氨Ｊ匦园被崽鎿Q”是指它的氨基酸殘基被有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基所替換。在本技術(shù)中已經(jīng)定義了有相似的側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，有酸性側(cè)鏈的(例如天冬氨酸、谷氨酸)，有不帶電荷的極性側(cè)鏈的(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，有非極性側(cè)鏈的(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，有β-分枝側(cè)鏈的(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及有芳香側(cè)鏈的(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。保守的氨基酸殘基，或者存在于保守的基元中的氨基酸殘基都不作這樣的替換。
或者，干擾素-β變體核苷酸序列可通過隨機導入沿著整個或部分干擾素-β的編碼序列導入突變而得到，例如通過飽和誘變作用，所得到的突變體可篩選干擾素-β生物活性來鑒別保留活性的突變體。誘變后，被編碼的蛋白質(zhì)可以重組表達，蛋白質(zhì)的生物活性可以使用這里所講的標準測量技術(shù)來測定。
一般地，具有生物活性的干擾素-β變體將和作為對比基礎(chǔ)的參考干擾素-β多肽，例如天然的人干擾素-β，至少具有80％，更理想的約90％-95％或更多，最理想的約96％-99％或是更多的氨基酸序列一致性?！靶蛄幸恢滦浴币馕吨斠蛔凅w特定的連續(xù)氨基酸序列片段排成一行并和參考分子的氨基酸序列作比較時，在變體多肽和作為參考的多肽分子中發(fā)現(xiàn)相同的氨基酸殘基。
為了進行序列一致性的測定要將兩個序列最佳地排列，變體的氨基酸序列的連續(xù)片段跟參考分子氨基酸序列相比可能有附加的或被刪除的氨基酸殘基。用于和參考氨基酸序列相比較的連續(xù)片段將至少含有20個連續(xù)的氨基酸殘基。通過排布缺口障礙可以進行校糾正，以增加和變體氨基酸序列中包括缺口相關(guān)的序列一致性。本領(lǐng)域的序列排列方法是為人熟知的。
因此，兩個序列之間的一致性百分率測定可以使用數(shù)學算法來完成。一個較好的用于序列比較的數(shù)學算法的非限制性例子就是Myers和Miller算法(1988)Comput.Appl.Biosci.411-7。這樣的一種算法在ALIGN程序(version2.0)中使用，它是GCG排列軟件包的一部分。PAM120權(quán)重殘基表，當作氨基酸序列比較時，缺口長度障礙為12和缺口障礙為4的就可以與ALIGN程序一起使用。另外一個較好的用于作序列比較的數(shù)學算法的非限制性例子是Karlin和Altschul算法(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877，經(jīng)修改的Karlin和Altschul算法(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877。這樣的種算法被包括在NBLAST和XBLAST程序中，Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215403-410。BLAST氨基酸序列可以用XBLAST程序來搜索，評分＝50，字長＝3，以此來獲得和感興趣的多肽相似的氨基酸序列。為了獲得用于比較的有缺口的排列，有缺口的BLAST可以被使用，如Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.253389-3402所述?；蛘?，PIS-BLAST可用來進行交互搜索，這種研究可以發(fā)現(xiàn)分子間的遠緣聯(lián)系。見Altschul et al.(1997)supra.當使用BLAST，有缺口的BLAST或PSI-BLAST程序時，可使用缺省參數(shù)。見http://www.ncbi.nlm.nih.gov。也見ALIGN程序(Dayhoff(1978)Atlas of ProteinSequence and Structure 5Suppl.3，國家生物醫(yī)學研究基金會，華盛頓，哥倫比亞特區(qū))以及威斯康辛序列分析包程序，Version 8(從遺傳學計算機集團，麥迪遜，威斯康辛，可得)，例如GAP程序，在此程序中使用了缺省參數(shù)。
當考慮氨基酸序列一致性的百分率時，由于保守性氨基酸替換，一些氨基酸殘基位置可以不同，這種保守以氨基酸替換并不影響蛋白質(zhì)功能的特性。在這些例子中，序列一致性百分率可上調(diào)，從而說明了保守性置換的氨基酸的相似性。這樣的調(diào)節(jié)在本技術(shù)中為人熟知。例如見Myers和Miller(1988)Comput.Appl.Biosci.411-17。
本發(fā)明所包括的生物活性干擾素-β變體也包括這樣的干擾素-β多肽，這些多肽鏈和例如聚乙二醇(PEG)或白蛋白共價聯(lián)結(jié)。這些共價雜交的干擾素-β分子擁有某些所希望的藥理特性，例如在病人給藥后，它會有延長的血清半衰期。創(chuàng)制PEG-干擾素加合物的方法有對單甲氧基聚乙二醇進行化學修飾以得出和干擾素-β反應(yīng)的活性化合物。制備和使用PEG-聯(lián)結(jié)的多肽的方法已經(jīng)被描述了，例如在Delgado et al.(1992)Crit.Rev.Ther.Drug.Carrier.Syst.9249-304。創(chuàng)制白蛋白結(jié)合多肽的方法包括為感興趣的多肽(例如干擾素-β)與白蛋白的編碼序列的結(jié)合，這種方法已在美國專利第5,876,969號中描述了，這里引入作參考。這些雜交的干擾素-β分子將和USP甘露醇中存在的雜質(zhì)起反應(yīng)，并且在用高純度的甘露醇配制時會變得更加穩(wěn)定。
本發(fā)明所包括的具有生物活性的干擾素-β變異體應(yīng)該保留干擾素-β的活性，尤其是結(jié)合干擾素-β受體的能力。在一些實施方案中，干擾素-β變體保留至少大約25％、50％、75％、85％、90％、95％、98％、99％或更多的參考干擾素-β多肽，例如天然的人干擾素-β的生物活性。與參考干擾素-β多肽相比活性有所提高的干擾素-β變體也包括在內(nèi)。干擾素-β變體的生物活性可以用本技術(shù)已知的任何方法來測定。這樣的測定方法的例子見于Fellous et al.(198)Proc.Natl.Acad.Sci USA 793082-3086；Czerniecki et al.(1984)J.Virol.49(2)490-496；Mark et al.(1984)proc.Natl.Acad.Sci.USA 815662-5666；Branca et al.(1981)Nature 277221-223；Williams et al.(1979)Nature 282582-586；Herberman et al.(1979)Nature 277221-223；Anderson et al.(1982)J.Biol.Chem.257(19)11301-11304；以及這里所描述的干擾素-β效價測定(見例2)。
本發(fā)明制劑的干擾素可以來源于任何一種動物物種，包括但不局限于鳥、犬、牛、豬、馬和人。當制劑要用于治療哺乳動物的干擾素-β失調(diào)時，優(yōu)選使用來源于哺乳動物物種的干擾素-β；更優(yōu)選是來源于和接受這種失調(diào)的治療的相同種類的哺乳動物。
本發(fā)明所包括的干擾素-β多肽和變體多肽的非限制性例子提出于Nagata etal.(1980)Nature 284316-320；Goeddel et al.(1980)Nature 287411-416；Yelverton etal.(1981)Nucleic Acids Res.9731-741；Streuli et al.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.782848-2852；EP028033B1和EP109748B1。也見美國專利第4,518,584號，第4,569,908號，第4,588,585號，第4,738,844號，第4,753,795號，第4,769,233號，第4,793,995號，第4,914,033號，第4,959,314號，第5,545,723號，第5,814,485號。這些揭示在這里引用作參考。這些引用也為干擾素-β多肽哪些殘基和區(qū)域可以被改變而不喪失生物活性提供指導。
在這項發(fā)明的一個實施方案中， 穩(wěn)定的藥物組合物中的干擾素-β是成熟的天然干擾素-β多肽。在另外的一個實施方案中，這些組合物中的干擾素-β是成熟的干擾素-β多肽，但它在第17號位點由絲氨酸代替了上面討論的成熟天然序列同一位點的半胱氨酸。然而，本發(fā)明包括了另外的實施方案，在這些實施方案中穩(wěn)定的藥物組合物中的干擾素-β就是指任何有生物活性的干擾素-β多肽或變體，正如本文其他地方所述。
在這項發(fā)明的一些實施方案中， 干擾素-β是重組產(chǎn)生的?！爸亟M產(chǎn)生的干擾素-β”是指和成熟的天然干擾素-β相比具有相似的生物活性，并且是依靠DNA重組技術(shù)來制備的。可以通過培養(yǎng)被包含一個編碼干擾素-β多肽的核苷酸序列的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，來制得干擾素-β。宿主細胞能夠轉(zhuǎn)錄核苷酸序列并產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)，它可以是原核的(例如E.coli)，也可以是真核的(例如酵母菌、昆蟲或哺乳動物細胞)。干擾素-β的重組生產(chǎn)的例子見于Mantei et al.(1982)Nature297128；Ohno et al.(1982)Nucleic Acids Res.10967；Smith et al.(1983)Mol.Cell.Biol.32156以及美國專利第4,462,940號，第5,702,699號，第5,814,485號，這里引用作參考。又見美國專利第5,795,779號，它在中國倉鼠卵巢細胞(CHO)中利用重組技術(shù)制得干擾素-β-1a；這里引用作參考。人干擾素基因已經(jīng)利用重組DNA(“rDNA”)技術(shù)克隆，并在E.coli中表達(Nagola et la.(1980)Nature 284316；Goeddel et al.(1980)Nature 287411；Yelverton et al.(1981)Nuc.Acid Res.9731；Streuliet al.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.782848)?；蛘撸蓴_素-β可以利用本技術(shù)已知的方法，用為表達感興趣的干擾素-β蛋白而基因工程化的轉(zhuǎn)基因動物或植物來制造。
或者，干擾素-β可以化學合成，可利用那些多肽領(lǐng)域中的技術(shù)員熟知的任何技術(shù)。例如Li et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.802216-2220，Sterward和Young(1984)Solid Phase Peptide synthesis(Pierce Chemical Company，Rockford，Illinois)，Baraney和Merrifield(1980)The PeptidesAnalysis，synthesis，Biology，ed.Gross和Meinhofer；Vol.2(Academic Press，紐約，1980)，pp.3-254，它是討論固相肽合成技術(shù)的；Bodansky(1984)Principles of Peptide Synthesis(Springer-Verlag，柏林)，Gross和Meinhofer，eds.(1980)The PeptidesAnalysis，synthesis，Biology，Vol.1(Academic Press，紐約)，討論經(jīng)典的溶液合成。干擾素-β也可以利用同時合成多種多肽的方法化學制備。例如，Houghten(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.825131-5135以及美國專利第4,631,211號。
本發(fā)明所包括的組合物少則可含有大約0.01mg/ml的干擾素-β，多則可含有大約15mg/ml的干擾素-β(重量/體積)。在各種實施方案中，干擾素-β的濃度是大約0.015mg/ml至12.5mg/ml，大約0.025mg/ml至10mg/ml，大約0.05mg/ml至8mg/ml，大約0.075mg/ml至6mg/ml，大約0.1mg/ml至4mg/ml，大約0.125mg/ml至2mg/ml，大約0.175mg/ml至1mg/ml，大約0.2mg/ml至0.5mg/ml，大約0.225mg/ml至0.3mg/ml，大約0.25mg/ml。
在一些實施方案中，這項發(fā)明的配方包含藥學上可接受的載體?！八帉W上可接受的載體”是指本技術(shù)中通常使用的，能夠方便儲存、給藥、和/或發(fā)揮它的治療成份的治療效應(yīng)的載體。載體也會減少干擾素-β的任何不良副作用。一種合適的載體應(yīng)該是穩(wěn)定的，那就是不會和組合物中其他的成份起反應(yīng)。當在治療劑量和濃度時，它不會在接受治療者中產(chǎn)生出明顯的局部或系統(tǒng)的副反應(yīng)。這樣的載體在本技術(shù)中普遍為人們所知。本發(fā)明合適的載體是那些經(jīng)常使用的穩(wěn)定的大分子，諸如白蛋白、明膠、膠原、多糖、單糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、固定油、油酸乙酯、脂質(zhì)體、葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露糖、右旋糖、右旋糖酐、纖維素、山梨醇、聚乙二醇(PEG)等。緩釋載體，諸如透明質(zhì)酸也是適用的。特別見Prisell et al.(1992)Int.J.Pharmaceu.8551-56和美國專利第5,166,311號。組合物其他可接受的成份包括，但不局限于，藥學上可接受的等滲性試劑包括水、鹽、糖、多元醇、氨基酸、緩沖劑。合適的緩沖劑的例子包括磷酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、醋酸鹽和其他有機酸和它們的鹽，以及影響滲透性的鹽，諸如氯化鈉、磷酸鈉、硫酸鈉、氯化鉀，也可包括上面列出的緩沖劑。
在本發(fā)明的一些實施方案中，人白蛋白是藥學上可接受的載體。人白蛋白可以是天然存在的或重組制得的；這兩種形式這里統(tǒng)稱為“人白蛋白”。這項發(fā)明中的配方可含有少則大約0.01％的人白蛋白，多則大約15％的人白蛋白(重量/體積)。在各種實施方案中人白蛋白濃度大約為0.025％至12.5％，大約0.05％至10％，大約0.1％至9％，大約0.25％至8％，大約0.5％至7％，大約0.6％至2％，大約0.7％至1.75％，大約0.75％至1.5％，大約1.2％至1.3％，大約1.25％。
藥物組合物可附加的包含一種增溶劑或提高溶解度的試劑。包含胍鹽基團的化合物，最理想的是精氨酸，對于干擾素-β來說是合適的溶解性提高試劑。這樣的提高溶解性試劑的例子有精氨酸以及能保持提高干擾素-β溶解度能力的精氨酸類似物。這樣的類似物，包括但不限于含有精氨酸的二肽和三肽。其他合適的增溶劑見于美國專利第4,816,440號；第4,894,330號；第5,004,605號；第5,183,746號；第5,643,566號；以及Wang et al.(1980)J.Parenteral Drug Assoc.34452-462，這里引用作參考。
本發(fā)明包括的增溶劑的非限制性例子有表面活性劑(清潔劑)，它們具有合適的疏水-親水平衡而能夠增溶干擾素-β。強效的天然或人工合成的陰離子表面活性劑如脂肪酸堿金屬鹽和烷基硫酸堿金屬鹽是可以使用的。這樣的試劑通常有10到14個碳原子。十二烷基硫酸鈉(SDS)和月桂酸鈉是特別理想的增溶劑。能在這項發(fā)明的組合物中使用的其他增溶劑的例子包括但不局限于十二烷基磺酸鈉、癸基硫酸鈉、十四烷基硫酸鈉、十本烷基磺酸鈉、豆蔻酸酸鈉、辛酸鈉、十二烷基N-肌氨酸鈉、十四烷基N-肌氨酸鈉。經(jīng)典的使用表面活性劑或乳化劑使藥物具有穩(wěn)定性的方法，例如見于Levine et al.(1991)J.Parenteral Sci.Technol.45(3)160-165。另外的合適的表面活性劑見于美國專利第4,507,281號；第4,816,440號；第5,183,746號；這里引用作參考。
除了以上揭示的那些試劑外，其他的穩(wěn)定劑，如乙二胺四乙酸(EDTA)或它的一種鹽如EDTA二鈉，也可以加入液體的藥物組合物來進一步提高穩(wěn)定性。EDTA能充當金屬離子的清除劑，而這些金屬離子已經(jīng)知道能催化許多氧化反應(yīng)，因此EDTA提供了一種額外的穩(wěn)定劑。
在干擾素-β制劑應(yīng)用于哺乳動物如人類時，組合物的等滲性也是要考慮的問題。因此，在一實施方案中，干擾素-β可注射的液體組合物將和病人血清或體液具有相同的或相似的等滲性。為達到等滲性，可以在溶液中以適宜濃度加入一種鹽，如氯化鈉、氯化鉀或磷酸鹽緩沖液。
配方的pH值也是要考慮的一個問題。這項發(fā)明的穩(wěn)定的干擾素-β配方的pH值大概在3.0到9.0范圍之內(nèi)。合適的pH值范圍包括例如大概在4.0到8.8，大概在5.0到8.6，大概在6.0到8.4，大概在6.8到8.2，大概在6.9到8.0，大概在7.0到7.8，大概在7.1到7.7，大概在7.2到7.6，大概在7.3到7.5。
將穩(wěn)定的液態(tài)干擾素-β制劑或可重新溶解的穩(wěn)定的凍干干擾素-β藥物制劑的藥物有效劑量給予患者?！八幬镉行┝俊笔侵钢委煛㈩A(yù)防、診斷一種疾病或狀況有用的劑量。典型的給藥途徑包括但不局限于口服給藥、鼻腔給藥、肺部給藥、腸道外給藥，它包括經(jīng)皮膚、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)注射或滴注。在一個實施方案中給藥方式是注射，優(yōu)選皮下注射。這項發(fā)明的組合物的注射液形態(tài)包括但不局限于溶液、懸浮液、乳狀液。典型的治療有效劑量的干擾素-β包含組合物大約0.01μg/kg到5mg/kg，理想的有大約0.05μg/kg到1000μg/kg，更加理想的有大約0.1μg/kg到500μg/kg，更理想的仍為0.5μg/kg到30μg/kg。
在一種實施方案中，含有干擾素-β的穩(wěn)定藥物組合物配制成一個單位劑量，是可注射或滴注的形式如溶液、懸浮液或乳狀液。而且，它可以凍結(jié)儲存或制備成干燥的形式，如凍干粉末，它可以在給藥前通過各種各樣的方法轉(zhuǎn)換成液體溶液、懸浮液、或乳劑包括口服或經(jīng)腸道外給藥。穩(wěn)定的藥物組合物可以通過膜過濾滅菌，可以存儲在單位劑量或多劑量的容器中，如密封的小瓶或安瓿中。本技術(shù)普遍知道的配制藥物組合物的另外的方法可以用來進一步提高這里所揭示的藥物組合物的儲存穩(wěn)定性，只要它們不負面地影響所揭示的高純度甘露醇的有益作用。關(guān)于藥學上可接受的載體、穩(wěn)定劑等的配方和選擇的細致的討論見于Remington’sPharmaceutical Sciences(1990)(18th ed.，Mack Pub.Co.，Eaton，賓夕法尼亞)，這里引用作參考。
在一些實施方案中，這項發(fā)明的液體組合物被裝在注射器中(本發(fā)明“預(yù)充填的”注射器)。在一種實施方案中，裝有這項發(fā)明組合物的預(yù)充填的注射器將被冷凍。這種被冷凍的預(yù)充填的注射器對于儲存和運輸是有用的。
以下的例子是用來說明的，而不是用來限制的。
實驗例1穩(wěn)定性提高了的干擾素-β藥物制劑的開發(fā)I.前言包含作為賦形劑的葡萄糖的干擾素-β藥物配方在本技術(shù)中是已知的。當這樣的制劑在37℃或更高的溫度下保溫時，這些配方中的葡萄糖會形成和干擾素-β的共價加合物，它能在RP-HPLC(反相高效液相色譜法)中發(fā)現(xiàn)。利用USP甘露醇制備的干擾素-β在相同的條件下不會形成RP-HPLC中可檢出的共價加合物。然而，USP甘露醇含有的雜質(zhì)可與干擾素-β形成加合物，它會被電噴霧質(zhì)譜檢出。USP甘露醇中的雜質(zhì)的本性還不知道。這些加合物(或降解產(chǎn)物)的形成被認為對藥物來說是不理想的甚至是不可接受的，因為現(xiàn)在以多肽為基礎(chǔ)的藥物的指導方針是強調(diào)減少制劑中降解產(chǎn)物形成的重要性。降解產(chǎn)物被認為是不理想的或不能接受的，因為它們提高了以多肽為基礎(chǔ)的藥物引起所不希望的副反應(yīng)的機會。本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)是當干擾素-β利用高純度的甘露醇配制時，即甘露醇的還原活性跟未經(jīng)高度純化的甘露醇配制相比低于百萬分之二十時，配制的干擾素-β的穩(wěn)定性提高了。本發(fā)明的進一步的新發(fā)現(xiàn)在于USP甘露醇通過以甲醇提取、碳處理、超濾、重結(jié)晶純化后，它將使得甘露醇制品的還原活性少于百萬分之二十。
II.方法這些實驗中所使用的干擾素-β-1b本質(zhì)上是由E.coli生產(chǎn)的，基本如美國專利第4,462,940號和第5,702,699號中所描述的那樣；這里引用作參考。十二烷基硫酸鈉和鹽類通過色譜法從干擾素-β中除去；干擾素-β-1b在pH為11.5-12.0的條件下與人白蛋白溶液合并；利用HCl將溶液的pH值調(diào)整到7.5；加入含有賦形劑(甘露醇或葡萄糖)的溶液使得最終濃度達到1.25％。人白蛋白在制劑中最終濃度是1.25％w/v。
利用RP-HPLC為質(zhì)譜測定法制備了來源于這些配方的干擾素-β-1b。這個方法可使得糖基化的干擾素-β-1b量化，它在色譜圖上形成一個單獨的峰(B1)。采用這個方法，糖基化的干擾素-β-1b的檢測限度是0.02mg/ml。當這個峰的數(shù)量小于0.02mg/ml時，兩個峰的面積就加和，與未經(jīng)配制的參考干擾素-β比較可獲得干擾素-β-1b的總含量。當峰面積大于0.02mg/ml時，它的濃度是單獨測定和報告的。
以下的設(shè)備和它們各自廠商的使用指南被用于分析。
溶劑輸送系統(tǒng)Waters 626梯度泵注射系統(tǒng)Waters 717+自動進樣器200ml注射環(huán)帶有聚四氟乙烯隔片的聚丙烯自動進樣器小瓶溫度設(shè)定在4℃的冷凍自動進樣器84％的乙腈用作針頭的洗滌液柱加熱器Waters 600將柱加熱器的溫度設(shè)定在40℃柱BAKERBOND寬孔丁基C4 RP-柱，3005μm，4.6mm(ID)250mm，J.T.Baker部件數(shù)22010。
柱在溶劑流的方向上連接，如柱上的標記所示，并放入柱加熱器中。
檢測器Waters 486紫外檢測器。
波長設(shè)定為214nm。
數(shù)據(jù)系統(tǒng)輸入是無衰減的。
數(shù)據(jù)系統(tǒng)P.E.Nelson Turbochrom數(shù)據(jù)系統(tǒng)。
凍干的干擾素-β制劑樣品加1.20ml的0.54％的氯化鈉溶解，輕輕倒轉(zhuǎn)混合，并在室溫下保溫30±5分鐘。校準物是未經(jīng)配制的干擾素-β參比物。校準物儲備溶液被稀釋到約0.5mg/ml，被稀釋的校準物溶液的濃度是由紫外吸光度來測定的(6次的平均值)。被稀釋的校準物溶液的最終濃度是紫外吸光度讀數(shù)的平均值除以1.7(干擾素-β-1b的消光系數(shù))。被稀釋的校準物溶液的濃度由吸光度測定到3位有效數(shù)字。校準物溶液然后被稀釋到0.25mg/ml用作工作校準溶液。
自動進樣器被設(shè)置為間隔70分鐘每次注入20μl。數(shù)據(jù)系統(tǒng)的電壓值是1伏，進樣速率是每秒一點，聚數(shù)時間是70分鐘。洗脫劑A是0.1％的TFA(三氟醋酸，HPLC級)，洗脫劑b分是84％的乙腈(HPLC級)和0.084％TFA(HPLC級)。洗脫劑流速設(shè)置為1.0ml/分(70％的洗脫劑A和30％的洗脫劑B)，使柱平衡一小時。在檢測器基線和系統(tǒng)被平衡之后，梯度空白被分析。當在第二個梯度空白沒有明顯的峰呈現(xiàn)時就開始分析。
干擾素-β的濃度由對應(yīng)于未修飾的干擾素-β(“B”峰)和糖基化的干擾素-β(“B1”峰)的峰面積的總和測定。例如，當校準物溶液是0.25mg/ml的未配制的干擾素-β時，干擾素-β的濃度(mg/ml)＝(試驗樣品總的峰面積B1+B/校準物總的峰面積B+B1)×0.25mg/ml。
電噴霧質(zhì)譜(ES-MS)數(shù)據(jù)利用色譜圖的組分獲得。在分析前每一個峰的組分被收集和濃縮。電噴霧質(zhì)譜的獲得是使用API100單一四極質(zhì)譜儀(Perkin-ElmerSciex Instruments，Thornhill，Ontario，加拿大)，它接至哈佛注射泵(HarvardApparatus，South Natick，MA)以及Rheodyne 8125注射器(帶有100μM i.d.熔融石英)。質(zhì)譜通過掃描140-2500范圍內(nèi)的質(zhì)量/電荷比(m/z)，以正的模式記錄下來，使用的階梯大小是0.2道爾頓，掃描速度為6秒/掃描140-2500。質(zhì)譜儀使用聚丙二醇混合物來進行校準，這種混合物包含3.3×10-5M PPG425，1×10-4M PPG 1000和2×10-4PPG 2000(Aldrich化學公司)，將它們?nèi)苡诤?mM醋酸銨的50∶50∶0.1的水∶甲醇∶蟻酸(v∶v∶v)混合液中。一份蛋白質(zhì)在49∶40∶1的水∶乙腈∶乙酸中的溶液(2μL，20-50pM)以20μml/分鐘的速度引入質(zhì)譜儀的離子源。由于蛋白質(zhì)是在低pH值時引入離子源的，堿性部位(例如精氨酸、賴氨酸、組氨酸殘基側(cè)鏈的氮原子)被不同程度的質(zhì)子化，導致分子離子帶有多種電荷狀態(tài)，例如[M+H]+、[M+2H]2+，這依賴于可以被質(zhì)子化的部位的數(shù)量。檢測器記錄下各種電荷狀態(tài)的分子離子的m/z比值，通過使用Biotoolbox軟件(Perkin-Elmer SciexInstruments)可使質(zhì)譜解卷積而獲得蛋白質(zhì)的分子量。在20kDa之內(nèi)分子量測量的準確性在2kDa內(nèi)。
甘露醇的還原活性按USP方案的改良法測定。該方案測定在堿溶液中有二辛可寧酸(BCA，Pierce，根據(jù)制造商的指導制備)存在時的Cu2+的還原。BCA與Cu1+終合時，此終合物呈藍色，在562nm時有吸收峰(A)。
兩個甘露醇樣品(500μl的150mg/ml甘露醇溶液)在各自條件下進行測定，使用具有已知的還原活性的葡萄糖溶液連續(xù)稀釋時，標準曲線就產(chǎn)生了。在每一試驗樣品，標準樣品，和空白中加入預(yù)先制備的BCA溶液500μl，并在60℃條件下保溫40分鐘。葡萄糖標準品是符合線性曲線的，甘露醇試驗樣品的還原活性(百萬分率)的計算是((甘露醇樣品的A562/標準曲線的斜率)/(以mg/ml為單位的甘露醇含量)(1000))×106。
III.結(jié)果和討論使用質(zhì)譜儀在葡萄糖配方中檢測到糖基化，就是使干擾素-β-1b分子量增加162道爾頓的倍數(shù)處。干擾素-β-1b多肽的分析表明這些加合物是由于還原性糖和蛋白質(zhì)賴氨酸殘基發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生的(Amadori反應(yīng))。圖1對葡萄糖制劑的配方粉末和在50℃下儲存一周的凍干制劑的RP-HPLC色譜圖進行對比。這張圖表明在凍干狀態(tài)時葡萄糖配方中的干擾素-β-1b在50℃時容易發(fā)生反應(yīng)而得出B1峰。配制的粉末(圖2)的ES-MS沒有和葡萄糖加合物相關(guān)的峰出現(xiàn)(加162)。作為對比，保溫的凍干葡萄糖制劑(圖3)的質(zhì)譜圖顯示出廣泛的修飾。因此，葡萄糖就和干擾素-β-1b發(fā)生反應(yīng)而形成可被RP-HPLC檢出的產(chǎn)物，它的結(jié)構(gòu)是靠ES-MS證實的。
相反，用USP甘露醇制備的干擾素-β-1b制劑不會形成在RP-HPLC中可檢出的B1峰的物質(zhì)。圖4是把利用甘露醇配制的粉末和在50℃保持一周的凍干制劑作比較。明顯地，沒有B1峰的形成。然而，圖5中配制的粉末的質(zhì)譜圖在20040處出現(xiàn)了峰，而圖6中的經(jīng)保溫的凍干甘露醇制劑的質(zhì)譜圖在20201處出現(xiàn)新的峰。甘露醇形成的加合物的數(shù)量不能用ES-MS來定量；然而，加合物的信號經(jīng)常接近儀器的檢測限。這些峰的形成機制還不知道。甘露醇和干擾素-β-1b發(fā)生反應(yīng)不會形成葡萄糖或右旋糖和干擾素-β-1b發(fā)生反應(yīng)所形成的物質(zhì)；B1峰沒有形成。因此，數(shù)據(jù)顯示需要較純的甘露醇，以阻止干擾素-β-1b加合物的形成。
為了降低甘露醇的雜質(zhì)，將它以甲醇提取，然后測試它對干擾素-β-1b穩(wěn)定性的影響。利用三批不同的經(jīng)甲醇提取過的甘露醇來配制干擾素-β-1b，將配制的粉末和最終容器中的測試樣品用上面描過述的RP-HPLC和ES-MS方法來測定。圖7是利用未經(jīng)處理的甘露醇配制的干擾素-β-1b的質(zhì)譜圖，圖8是用經(jīng)過甲醇提取的同一批的甘露醇配制的干擾素-β-1b的質(zhì)譜圖。所有三批都表現(xiàn)出相似的圖譜。圖17表示甲醇處理會除去超過一半的還原活性。明顯地，甲醇處理除去了和干擾素-β-1b絡(luò)合的雜質(zhì)，但一些雜質(zhì)經(jīng)過該處理不能完全除去。
為了減少甘露醇中留下的雜質(zhì)，另三個步驟加入了提純過程。這些步驟是碳處理、超濾、重結(jié)晶。三批經(jīng)過甲醇提取、碳處理、超濾和重結(jié)晶的甘露醇如上面一樣被測試了。比色法還原活性的測定證明了附加的純化步驟降低了還原活性含量至大概10ppm(見圖17，樣品7-9)。一種制劑是利用高純度的甘露醇制備的。利用高純度的甘露醇所配制的制劑的質(zhì)譜圖(圖9)沒有發(fā)現(xiàn)附加的峰，這些峰不存在于不利用甘露醇制備的制劑粉末的質(zhì)譜圖中，它在同一天進行測定作為陰性對照(圖10)。利用USP甘露醇制備的制劑也在同一天進行質(zhì)譜測定作為陽性對照(圖11)。這樣對于甘露醇的附加處理就產(chǎn)生了一種還原性低的產(chǎn)物，并且通過ES-MS看來它不會和干擾素-β-1b發(fā)生反應(yīng)。
例2包含高純度甘露醇的干擾素-β配方的穩(wěn)定性短期加速研究I.前言正如上面所述干擾素-β-1b的實驗性制劑是利用葡萄糖和甘露醇來制備的，并且進行了加速穩(wěn)定性研究來對比這些配方。在兩種不同的條件下對配方的穩(wěn)定性進行測試。第一種是將制劑處于高溫應(yīng)激下進行測試，而第二種是將制劑處于室溫下長期儲存進行穩(wěn)定性測試。在25℃下儲存3個月后，含高純度甘露醇的制劑沒有發(fā)現(xiàn)變化，并且在37℃下儲存3個月或在50℃儲存1個月后，制劑的效價沒有發(fā)生變化。
II.方法每一配方的樣品在8℃、25℃或37℃下儲存三個月。并且，在兩個月時，將每種溫度條件下的樣品取出，并在50℃下存儲一個月。轉(zhuǎn)移到50℃條件下的目的是為了加劇也許已經(jīng)在儲存的前兩個月中發(fā)生的潛在的變化，這樣就可以更好地測定是否在25℃和37℃下儲存兩個月會使得產(chǎn)物回到原來的8℃儲存條件時加速降解。
下面測定了干擾素-β-1b的比活性。A549人肺癌細胞(ATCC CCL 185)和鼠腦心肌炎病毒株EMC(ATTC VR-129B)自美國標準菌庫獲得。利用1.2ml稀釋液(0.54％NaCl)重配制劑樣品，將它用生長/試驗培養(yǎng)基連續(xù)稀釋，和干擾素-β-1b的標準品一起加入到96孔的測定板上。每一孔中稀釋了的干擾素-β的體積是100μl。在生長/試驗培養(yǎng)基(加Earle鹽和2.2g/L的重碳酸鈉，8.9％的胎牛血清，1.79mM的L-谷氨酰胺，89U/ml的青霉素以及89μg鏈霉素/ml的Eagle MEM)中的A549細胞以1×104細胞/孔的濃度加入。測定板然后在增濕的37℃±2℃，5±1％CO2的培養(yǎng)箱中溫育。在溫育結(jié)束時，細胞被EMC病毒感染，復(fù)感染率在5和16之間。測定板然后在增濕的37±2℃，5±1％CO2的培養(yǎng)箱中溫育24±1個小時。細胞被預(yù)先溫熱的(37℃)MTT(溴化3-[4，5-位二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑，5mg/ml，50μl/孔)所染色，象前面一樣溫育3.5到4.5小時。從細胞中吸出培養(yǎng)基，將100μl染色增溶溶液(81％v/v2-丙醇，3％w/v十二烷基硫酸鈉，0.04NHCl)加入每一孔。測定板然后在環(huán)境溫度于黑暗中溫育30-60分鐘。接著在微量測定板振蕩器上振蕩8±3分鐘。最后，在微量測定板分光光度計上測量每一孔在570nm處的吸光度。干擾素-β活性標準品的活性符合線性回歸曲線，試驗樣品的活性就根據(jù)該曲線來測定。每個樣品的比活性根據(jù)所用樣品的質(zhì)量來計算。
干擾素-β-1b濃度的RP-HPLC分析如上述進行。通過還原的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)Western印跡法來監(jiān)測加合物的形成，表現(xiàn)為干擾素-β-1b帶的分子量有明顯的上升。
III.結(jié)果和討論在研究中甘露醇制劑的效價(比活性)基本上保持不變，然而葡萄糖制劑的效價卻提高了。暴露在37℃條件下一個月對效價沒有影響(見圖14和15)。對于甘露醇干擾素-β-1b配方來說，糖基化的干擾素-β-1b的量仍低于在研究時的檢測限，即使是在50℃條件下。相對地，在37℃條件下2個月和在50℃條件下2周后檢測到葡萄糖制劑中的糖基化。廣泛的糖基化使得色譜圖改變太多而不能測定出干擾素-β-1b的總含量。葡萄糖制劑在37℃下儲存2個月或在50℃下儲存一個月后，所形成的加合物也可以通過還原的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的Western印跡法來檢出，但在25℃條件下儲存3個月后不能檢出。相對地，對于甘露醇制劑來說，在任何儲存條件下都不會觀察到還原的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的Western印跡的改變。
例3含有高純度甘露醇的干擾素-β配方的長期穩(wěn)定性。
三批(N006，N008，N009)含有高純度甘露醇的干擾素-β-1b制劑在4℃、25℃、30℃條件下儲存，一年中每隔三個月測定一次穩(wěn)定性，第二年每隔六個月測定一次。利用上面描述過的方法測定穩(wěn)定性。
所有的三批在4℃和30℃下經(jīng)過24個月后都保持了效價。圖16-18給出了數(shù)據(jù)。另外，在所有的溫度和時間測試點三批都顯示不高于0.02mgs/ml的峰B1(糖基化的干擾素-β)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會僅僅利用傳統(tǒng)的實驗方法，認識或是能弄清這里所描述的關(guān)于干擾素-β的本發(fā)明的具體實施方案的等價方法。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會僅僅利用傳統(tǒng)的實驗方法認識或能弄清，上面用干擾素-β作為例子所提供的實驗和配方，在總體上對于蛋白質(zhì)尤其是藥用蛋白質(zhì)來講是適用的。藥用蛋白包括但不局限于以下蛋白質(zhì)人生長激素、所有干擾素、所有白細胞介素、集落刺激因子(GM-CSF、G-CSF、M-CSF)、β-葡糖腦苷脂酶、促甲狀腺素、依那西普(etanercept)、單克隆抗體(如阿昔單抗、巴利昔單抗、帕利珠單抗、利妥昔單托和transtuzumab)、凝血因子(例如第VIIa因子和第VIII因子)、酶(例如尿激酶、天(門)冬酰胺酶、阿尼普酶、阿替普酶)。這樣的等價物將包含在下面的權(quán)利要求書中。
所有在本說明書中提到的出版物和專利申請體現(xiàn)了本發(fā)明所屬領(lǐng)域中技術(shù)人員的水平。這里所有的出版物和專利申請在相同程度上被引用供作參考，就像每一出版物或?qū)＠暾埵菍ｉT和各自被引證而包括在說明書中一樣。
權(quán)利要求
1.組合物，包含干擾素-β或其變體以及高純度甘露醇。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，所述組合物的特征在于穩(wěn)定性提高。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，所述組合物是凍干的。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，所述組合物是液態(tài)的。
5.如權(quán)利要求1所述的組合物，含有約每單位體積0.25％-5％重量的高純度甘露醇。
6.如權(quán)利要求1所述的組合物，含有0.01mg/ml-15mg/ml的干擾素-β或其變體。
7.如權(quán)利要求1所述的組合物，所述配方的pH值約為3.0-9.0。
8.如權(quán)利要求1所述的組合物，還含有人白蛋白。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，含有約每單位體積0.01％-15％重量的人白蛋白。
10.組合物，含有約0.01mg/ml-15mg/ml的重組人干擾素-β，約每單位體積0.25％-5％重量的高純度甘露醇和約每單位體積0.01％-15％重量的人白蛋白，所述組合物的pH值約為3.0-9.0。
11.如權(quán)利要求10所述的組合物，所述組合物是凍干的。
12.如權(quán)利要求10所述的組合物，所述組合物是液態(tài)的或是冷凍的。
13.組合物，含有約0.01mg/ml-15mg/ml的重組人干擾素-β，約每單位體積0.25％-5％重量的高純度甘露醇，約每單位體積0.01％-15％重量的人白蛋白和使得所述組合物具有等滲性的足量氯化鈉，所述組合物的pH值約為3.0-9.0。
14.如權(quán)利要求13所述的組合物，所述組合物是凍干的。
15.如權(quán)利要求13所述的組合物，所述組合物是液態(tài)的或冷凍的。
16.組合物，含有約0.05mg/ml-1mg/ml的重組人干擾素-β，約每單位體積0.25％-2.5％重量的高純度甘露醇和約每單位體積0.25％-2.5％重量的人白蛋白，所述組合物的pH值約為6.8-8.2。
17.如權(quán)利要求16所述的組合物，還含有使得組合物具有等滲性的足量氯化鈉。
18.如權(quán)利要求16所述的組合物，所述組合物是液態(tài)的，所述液態(tài)組合物被冷凍或凍干。
19.如權(quán)利要求17所述的組合物，所述組合物是液態(tài)的，所述液態(tài)組合物被冷凍或凍干。
20.組合物，含有約0.25mg/ml的重組人干擾素-β，約每單位體積1.25％重量的高純度甘露醇和約每單位體積1.25％重量的人白蛋白，所述組合物的pH值約為7.3-7.5。
21.如權(quán)利要求20所述的組合物，還含有使得組合物具有等滲性的足量氯化鈉。
22.如權(quán)利要求20所述的組合物，所述組合物是液態(tài)的，所述液態(tài)組合物被冷凍或凍干。
23.如權(quán)利要求21所述的組合物，所述組合物是液態(tài)的，所述液態(tài)組合物被冷凍或凍干。
24.如權(quán)利要求1所述的組合物，所述干擾素-β是具有成熟天然人干擾素-β氨基酸序列的多肽。
25.如權(quán)利要求24所述的組合物，所述干擾素-β是糖基化的或未糖基化的。
26.如權(quán)利要求1所述的組合物，所述干擾素-β是重組制造的。
27.預(yù)充填注射器，含有權(quán)利要求1所述的組合物。
28.如權(quán)利要求27所述的預(yù)充填注射器，所述組合物是冷凍的。
29.組合物，含有干擾素-β或其變體和還原活性低于百萬分之二十的甘露醇。
30.組合物，含有藥用多肽和高純度甘露醇。
31.如權(quán)利要求30所述的組合物，所述藥用多肽選自人生長激素、干擾素、白細胞介素、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、粒細胞集落刺激因子、巨噬細胞集落刺激因子、β-葡糖腦苷脂酶、促甲狀腺素、依那西普、單克隆抗體、VIIa因子、VIII因子、尿激酶、天(門)冬酰胺酶、阿尼普酶、阿替普酶。
32.制備以穩(wěn)定性提高為特征的包含干擾素-β或其生物活性變體的制劑的方法，所述方法包括制造包含干擾素-β或其生物活性變體和高純度甘露醇的制劑，所述高純度甘露醇的含量足以穩(wěn)定所述干擾素-β或其變體。
33.用權(quán)利要求32所述方法制造的制劑。
34.制造干擾素-β或其生物活性變體的制劑的方法，包括以下步驟a)通過色譜法從干擾素-β中除去十二烷基硫酸鈉和鹽類；b)在pH約11.5-12.0的條件下將所述干擾素-β與人白蛋白溶液混合；c)用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.5；d)加入高純度甘露醇溶液。
35.用權(quán)利要求34所述方法制造的制劑。
36.如權(quán)利要求34所述的方法，還包括將所述制劑凍干的步驟。
37.提高藥物組合物中干擾素-β或其變體的穩(wěn)定性的方法，該方法包括在組合物中加入高純度甘露醇，高純度甘露醇的加量足可穩(wěn)定干擾素-β或其變體。
38.如權(quán)利要求34所述的方法，還包括加入氯化鈉，氯化鈉的加量足可使組合物具有等滲性。
39.用權(quán)利要求38中的方法制造的制劑。
40.如權(quán)利要求38所述的方法，還包括將所述制劑凍干的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供了含有干擾素－β和高純度的甘露醇的穩(wěn)定藥物配方。和利用非高純度甘露醇配制的干擾素－β相比，高純度的甘露醇通過減少干擾素－β加合物的形成穩(wěn)定了組合物。文中也提供了提高在液體或凍干的組合物中的干擾素－β或其變體的穩(wěn)定性的方法以及提高這樣的組合物儲存穩(wěn)定性的方法。
文檔編號A61K47/10GK101057967SQ20071010923
公開日2007年10月24日 申請日期2001年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月7日
發(fā)明者S·N·沃爾夫, M·S·霍拉 申請人:諾華疫苗和診斷公司