專利名稱：一種三維殼聚糖多孔支架的制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于多孔材料制備技術領域，涉及一種三維殼聚糖多孔支架，尤其涉及一種三維殼聚糖多孔支架的制備方法。
背景技術：
殼聚糖(chitosan)是由自然界廣泛存在的幾丁質(chitin)經(jīng)過脫乙酰作用得到的，近年來在細胞培養(yǎng)和細胞產(chǎn)物研究領域，殼聚糖支架材料的研究非常廣泛。在細胞培養(yǎng)的技術研究領域，多孔支架的制備方法有很多，常采用的有多孔浙濾法、冷凍干燥法、乳液冷凍干燥法等。Ikada等人以明膠水凝膠中的水作致孔劑，采用冷凍干燥的方法制備出多孔支架，但由于水凝膠在冷凍過程中熱傳導速率不同，導致冷凍速率和冷凍溫度對支架的影響較大，從而使得支架的孔徑在制備過程中不易控制，孔與孔之間的聯(lián)通性較差。并且傳統(tǒng)的冷凍干燥法制備出的殼聚糖支架在可塑性能、微觀結構及孔與孔之間的連通性均難以滿足細胞培養(yǎng)的技術這一研究領域的要求。因此本領域迫切需要提供一種微觀結構均勻、易成型、孔與孔之間連通性較好的多孔殼聚糖支架材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種三維殼聚糖多孔支架的制備方法，可制得微觀結構均勻、易成型、孔與孔之間連通性較好的三維殼聚糖多孔支架。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用如下技術方案—種三維殼聚糖多孔支架的制備方法，所述方法包括步驟SI、溶液配制步驟；配制溶有設定量醋酸銨的殼聚糖酸溶液，配制V/V為O. 2% -5%的戊二醛溶液，配置殼聚糖乳液，配制硼氫化鈉溶液；步驟S2、冷凍干燥步驟；將步驟SI中所得的殼聚糖乳液倒入模具中進行冷凍干燥來制孔；步驟S3、高溫烘干步驟；將冷凍干燥后支架放入烘箱中干燥；步驟S4、支架的洗滌步驟；將烘干后的支架放入乙醇中浸泡，以除去支架中的正戊醇；再用去離子水清洗支架，用硼氫化鈉除去游離的戊二醛，再用去離子水洗滌，即得到三維殼聚糖多孔支架。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，所述方法具體包括如下步驟步驟SI、溶液配制步驟；配制溶有設定量醋酸銨的殼聚糖酸溶液先量取Iml醋酸加入IOOml的容量瓶中定容，制得V/ν為1%醋酸溶液；稱取O. IOg的醋酸銨加入V/V為I %醋酸溶液中，再稱取 3. Og殼聚糖，加入溶有醋酸銨的V/V為I %的醋酸溶液中；
配制V/V為1%戊二醛溶液量取Iml純戊二醛并加蒸餾水定容至100ml，4°C保存
備用;配置殼聚糖乳液將溶有一定量醋酸銨的殼聚糖酸溶液攪拌2min后，緩慢加入 IOml正戊醇和O. 3ml的戊二醛，再繼續(xù)攪拌IOmin后，即可得到殼聚糖乳液；將所得的殼聚糖乳液均勻的涂抹在模具上，放置24h即可；配制5%的硼氫化鈉溶液稱取5. Og的硼氫化鈉加入IOOml的容量瓶中定容，制得5%的硼氫化鈉溶液；步驟S2、冷凍干燥步驟；將步驟SI中所得的殼聚糖乳液倒入模具中進行冷凍干燥來制孔，具體參數(shù)設定為預凍溫度為_75°C,預凍時間為Ih 次干燥的隔板溫度為_20°C,時間為20h ；步驟S3、高溫烘干步驟；將冷凍干燥后支架放入96 °C的烘箱中干燥35min ；步驟S4、支架的洗滌步驟；將烘干后的支架放入70%的乙醇中浸泡24h，以除去支架中的正戊醇，再用去離子水反復清洗支架3次，用5%的硼氫化鈉除去游離的戊二醛，再用大量的去離子水洗滌， 即得到三維殼聚糖多孔支架。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，殼聚糖脫乙酰度為80-91%。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，采用乳液冷凍干燥法來制孔，進行緩慢凍干，使醋酸銨以晶體的形式析出，并均勻分布在殼聚糖支架中，再高溫96°C烘干，使醋酸銨分解產(chǎn)生氨氣來制孔；同時還采用正戊醇來制孔，再用乙醇來除去支架中殘余的正戊醇，在除去致孔劑的同時，還對支架進行了消毒，對細胞無毒性。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，所述方法得到的支架孔徑為10-60 μ m，孔隙率為 93%。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，所述正戊醇與殼聚糖酸溶液的體積比為I : 10。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，所述殼聚糖酸溶液中，醋酸銨與殼聚糖的質量比為 I 30。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提出的三維殼聚糖多孔支架的制備方法，采用乳液冷凍干燥法，配制溶有一定量醋酸銨的殼聚糖酸溶液，再在其內(nèi)加入IOml正戊醇，得到殼聚糖乳液。先對殼聚糖乳液進行冷凍干燥，再將冷凍干燥的支架96°C高溫烘干35min,最后將烘干后的支架放入70%的乙醇中浸泡24h，以除去支架中的正戊醇來制孔，即得到三維殼聚糖多孔支架。即通過冷凍干燥法將支架中的冰晶升華來制小孔，可增強孔與孔之間的連通性；并通過醋酸銨的分解產(chǎn)生氣體和正戊醇從支架中的的溶出來制孔，增大支架的孔隙率并增強支架的連通性。采用乳液冷凍干燥法來制孔，進行緩慢凍干，使醋酸銨以晶體的形式析出，并均勻分布在殼聚糖支架中，再高溫96°C烘干，使醋酸銨分解產(chǎn)生氨氣來制孔。同時還采用正戊醇來制孔，再用乙醇來除去支架中殘余的正戊醇，在除去致孔劑的同時，還對支架進行了消毒，對細胞無毒性。本發(fā)明選用的殼聚糖是天然生物高分子，來源極為廣泛、安全無毒，價格低廉，與合成高分子相比，具有良好的生物相容性和生物可降解性，因此殼聚糖水凝膠制備的微載體具有很高的環(huán)境友好性和生物安全性。本發(fā)明方法所制得的支架孔隙率高，孔與孔之間的聯(lián)通性好。并可用于細胞培養(yǎng)的技術研究。


圖I為本發(fā)明三維殼聚糖多孔支架的制備方法的流程圖。
具體實施例方式下面結合附圖詳細說明本發(fā)明的優(yōu)選實施例。實施例一請參閱圖1，本發(fā)明揭示了三維殼聚糖多孔支架的制備方法，所述方法包括步驟SI溶液配制步驟；配制溶有設定量醋酸銨的殼聚糖酸溶液，配制V/V(體積比)為O. 2% -5%的戊二醛溶液，配置殼聚糖乳液，配制硼氫化鈉溶液；步驟S2冷凍干燥步驟；將步驟SI中所得的殼聚糖乳液倒入模具中進行冷凍干燥來制孔；步驟S3高溫烘干步驟；將冷凍干燥后支架放入烘箱中干燥；步驟S4支架的洗滌步驟；將烘干后的支架放入乙醇中浸泡，以除去支架中的正戊醇；再用去離子水清洗支架，用硼氫化鈉除去游離的戊二醛，再用去離子水洗滌，即得到三維殼聚糖多孔支架。具體地，本發(fā)明三維殼聚糖多孔支架的制備方法具體包括如下步驟(I)、制備過程所用的溶液的配制①、溶有一定量醋酸銨的殼聚糖酸溶液的配制先量取Iml醋酸加入IOOml的容量瓶中定容，制得I % (V/V)醋酸溶液；稱取O. IOg 的醋酸銨加入I % (V/V)醋酸溶液中，再稱取3. Og殼聚糖，加入溶有醋酸銨的I % (V/V)醋酸溶液中即可；②、1% (V/V)戊二醛溶液的配制量取Iml純戊二醛并加蒸餾水定容至100ml，4°C保存?zhèn)溆?；③、殼聚糖乳液的配制將溶有一定量醋酸銨的殼聚糖酸溶液攪拌2min后，緩慢加入IOml正戊醇和O. 3ml 的戊二醛，再繼續(xù)攪拌IOmin后，即可得到殼聚糖乳液；④、5%的硼氫化鈉的配制稱取5. Og的硼氫化鈉加入IOOml的容量瓶中定容，制得5%的硼氫化鈉溶液；本發(fā)明中醋酸銨的濃度會影響其分解時產(chǎn)生氣體的量，一般醋酸銨的濃度越高， 產(chǎn)生的氨氣越多，孔隙率就越高，但是過多的氣體含量，會造成支架的機械強度降低；并且正戊醇的含量，過高可增大支架的孔隙率，并降低支架的機械強度，過低則支架的孔隙率不高；因而本發(fā)明中以O. IOg醋酸鈉和IOml正戊醇加入IOOml殼聚糖溶液中為最佳配比。 在進行凍干時是以水做致孔劑的，因而殼聚糖溶液的濃度會影響支架中水的相對含量，一般是水的相對含量越高，制得的孔就越多，但水的相對含量越高，則殼聚糖的相對含量就越低，這會使支架的機械強度降低，因而本發(fā)明以3g殼聚糖的含量最佳。(2)、冷凍干燥將步驟(I)中所得的殼聚糖乳液均勻的涂抹在模具上，放置24h后進行冷凍干燥來制孔。冷凍干燥制孔過程控制預凍溫度為_75°C，預凍時間為Ih;—次干燥的隔板溫度為-20°C，時間為20h。(3)、高溫烘干將冷凍干燥后支架放入96 °C的烘箱中干燥35min。(4)、支架的洗滌將烘干后的支架放入70%的乙醇中浸泡24h，以除去支架中的正戊醇，再用去離子水反復清洗支架3次，用5%的硼氫化鈉除去游離的戊二醛，再用大量的去離子水洗滌， 即得到三維殼聚糖多孔支架。利用上述方法所得的三維殼聚糖多孔支架經(jīng)掃描電鏡進行掃描，可以看出孔徑為 10-60 μ m,孔與孔之間的連通性好，支架表面的孔隙率高達93%，并且支架的大孔中還有許多10-20μπι的小孔，可以增強支架的連通性。本發(fā)明所用的所有試劑均為醫(yī)藥純均來自上海國藥集團；本發(fā)明所用的凍干機， 型號為ES，儀器名字為Advantage PLUS冷凍型干燥機，生產(chǎn)廠家為美國Virtis公司；本發(fā)明所用的掃描電鏡的型號為Quanta x50系列掃描電子顯微鏡(美國FEI公司)。綜上所述，本發(fā)明提出的三維殼聚糖多孔支架的制備方法，采用乳液冷凍干燥法， 配制溶有一定量醋酸銨的殼聚糖酸溶液，再在其內(nèi)加入IOml正戊醇，得到殼聚糖乳液。先對殼聚糖乳液進行冷凍干燥，再將冷凍干燥的支架96°C高溫烘干35min，最后將烘干后的支架放入70%的乙醇中浸泡24h，以除去支架中的正戊醇來制孔，即得到三維殼聚糖多孔支架。即通過冷凍干燥法將支架中的冰晶升華來制小孔，可增強孔與孔之間的連通性；并通過醋酸銨的分解產(chǎn)生氣體和正戊醇從支架中的的溶出來制孔，增大支架的孔隙率并增強支架的連通性。采用乳液冷凍干燥法來制孔，進行緩慢凍干，使醋酸銨以晶體的形式析出，并均勻分布在殼聚糖支架中，再高溫96°C烘干，使醋酸銨分解產(chǎn)生氨氣來制孔。同時還采用正戊醇來制孔，再用乙醇來除去支架中殘余的正戊醇，在除去致孔劑的同時，還對支架進行了消毒，對細胞無毒性。本發(fā)明選用的殼聚糖是天然生物高分子，來源極為廣泛、安全無毒，價格低廉，與合成高分子相比，具有良好的生物相容性和生物可降解性，因此殼聚糖水凝膠制備的微載體具有很高的環(huán)境友好性和生物安全性。本發(fā)明方法所制得的支架孔隙率高，孔與孔之間的聯(lián)通性好。并可用于細胞培養(yǎng)的技術研究。這里本發(fā)明的描述和應用是說明性的，并非想將本發(fā)明的范圍限制在上述實施例中。這里所披露的實施例的變形和改變是可能的，對于那些本領域的普通技術人員來說實施例的替換和等效的各種部件是公知的。本領域技術人員應該清楚的是，在不脫離本發(fā)明的精神或本質特征的情況下，本發(fā)明可以以其它形式、結構、布置、比例，以及用其它組件、 材料和部件來實現(xiàn)。在不脫離本發(fā)明范圍和精神的情況下，可以對這里所披露的實施例進行其它變形和改變。
權利要求
1.一種三維殼聚糖多孔支架的制備方法，其特征在于，所述方法包括步驟Si、溶液配制步驟；配制溶有設定量醋酸銨的殼聚糖酸溶液，配制V/V為O. 2% -5%的戊二醛溶液，配置殼聚糖乳液，配制硼氫化鈉溶液；步驟S2、冷凍干燥步驟；將步驟SI中所得的殼聚糖乳液倒入模具中進行冷凍干燥來制孔；步驟S3、高溫烘干步驟；將冷凍干燥后支架放入烘箱中干燥；步驟S4、支架的洗滌步驟；將烘干后的支架放入乙醇中浸泡，以除去支架中的正戊醇；再用去離子水清洗支架，用硼氫化鈉除去游離的戊二醛，再用去離子水洗滌，即得到三維殼聚糖多孔支架。
2.根據(jù)權利要求I所述的三維殼聚糖多孔支架的制備方法，其特征在于所述方法具體包括如下步驟步驟SI、溶液配制步驟；配制溶有設定量醋酸銨的殼聚糖酸溶液先量取Iml醋酸加入IOOml的容量瓶中定容， 制得V/V為1%醋酸溶液；稱取O. IOg的醋酸銨加入V/V為I %醋酸溶液中，再稱取3. Og殼聚糖，加入溶有醋酸銨的V/V為I %的醋酸溶液中；配制V/V為I %戊二醛溶液量取Iml純戊二醛并加蒸餾水定容至100ml，4°C保存?zhèn)溆?；配置殼聚糖乳液將溶有一定量醋酸銨的殼聚糖酸溶液攪拌2min后，緩慢加入IOml正戊醇和O. 3ml的戊二醛，再繼續(xù)攪拌IOmin后，即可得到殼聚糖乳液；將所得的殼聚糖乳液均勻的涂抹在模具上，放置24h即可；配制5%的硼氫化鈉溶液稱取5. Og的硼氫化鈉加入IOOml的容量瓶中定容，制得5% 的硼氫化鈉溶液；步驟S2、冷凍干燥步驟；將步驟SI中所得的殼聚糖乳液倒入模具中進行冷凍干燥來制孔，具體參數(shù)設定為預凍溫度為_75°C,預凍時間為Ih 次干燥的隔板溫度為_20°C,時間為20h ；步驟S3、高溫烘干步驟；將冷凍干燥后支架放入96°C的烘箱中干燥35min ；步驟S4、支架的洗滌步驟；將烘干后的支架放入70%的乙醇中浸泡24h，以除去支架中的正戊醇，再用去離子水反復清洗支架3次，用5%的硼氫化鈉除去游離的戊二醛，再用大量的去離子水洗滌，即得到三維殼聚糖多孔支架。
3.根據(jù)權利要求2所述的三維殼聚糖多孔支架的制備方法，其特征在于殼聚糖脫乙酰度為80-91%。
4.根據(jù)權利要求2所述的三維殼聚糖多孔支架的制備方法，其特征在于采用乳液冷凍干燥法來制孔，進行緩慢凍干，使醋酸銨以晶體的形式析出，并均勻分布在殼聚糖支架中，再高溫96°C烘干，使醋酸銨分解產(chǎn)生氨氣來制孔；同時還采用正戊醇來制孔，再用乙醇來除去支架中殘余的正戊醇，在除去致孔劑的同時，還對支架進行了消毒，對細胞無毒性。
5.根據(jù)權利要求2所述的三維殼聚糖多孔支架的制備方法，其特征在于 所述方法得到的支架孔徑為10-60 μ m，孔隙率為93%。
6.根據(jù)權利要求2所述的三維殼聚糖多孔支架的制備方法，其特征在于 所述正戊醇與殼聚糖酸溶液的體積比為I : 10。
7.根據(jù)權利要求2所述的三維殼聚糖多孔支架的制備方法，其特征在于 所述殼聚糖酸溶液中，醋酸銨與殼聚糖的質量比為I : 30。
全文摘要
本發(fā)明揭示了一種三維殼聚糖多孔支架的制備方法，所述方法包括步驟S1、溶液配制步驟；配制溶有設定量醋酸銨的殼聚糖酸溶液，配制V/V為0.2％-5％的戊二醛溶液，配置殼聚糖乳液，配制硼氫化鈉溶液；步驟S2、冷凍干燥步驟；將步驟S1中所得的殼聚糖乳液倒入模具中進行冷凍干燥來制孔；步驟S3、高溫烘干步驟；將冷凍干燥后支架放入烘箱中干燥；步驟S4、支架的洗滌步驟；將烘干后的支架放入乙醇中浸泡，以除去支架中的正戊醇；再用去離子水清洗支架，用硼氫化鈉除去游離的戊二醛，再用去離子水洗滌，即得到三維殼聚糖多孔支架。本發(fā)明三維殼聚糖多孔支架的制備方法可制得微觀結構均勻、易成型、孔與孔之間連通性較好的三維殼聚糖多孔支架。
文檔編號A61L31/06GK102580167SQ20121010125
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月31日 優(yōu)先權日2012年3月31日
發(fā)明者劉寶林, 劉穎斌, 周杰, 李琳, 韓寶三 申請人:上海理工大學