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一種腫瘤細(xì)胞靶向性穿膜肽的制作方法

文檔序號(hào):1254592閱讀:347來源:國知局
一種腫瘤細(xì)胞靶向性穿膜肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】,具體涉及一種腫瘤細(xì)胞靶向性穿膜肽、多核苷酸分子、用途以及含其的靶向給藥系統(tǒng)。本發(fā)明公開了一種腫瘤細(xì)胞靶向性穿膜肽,其特征在于其含有具有細(xì)胞穿膜肽活性的CPPs結(jié)構(gòu)域和具有對腫瘤細(xì)胞特異性靶向親和的EGF第三環(huán)樣人工模擬肽結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明所述腫瘤細(xì)胞靶向性穿膜肽表現(xiàn)出了顯著的穿膜作用效果,同時(shí)具有細(xì)胞特異性和種屬特異性兩種新型特性,可用于腫瘤疾病的診斷、治療過程中所需藥物的開發(fā)應(yīng)用。
【專利說明】一種腫瘤細(xì)胞靶向性穿膜肽

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】,具體涉及一種腫瘤細(xì)胞靶向性穿膜肽、多核苷酸分子、 用途以及含其的靶向給藥系統(tǒng)。

【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞膜由脂質(zhì)雙分子層組成,其內(nèi)部由疏水性的非極性分子構(gòu)成。細(xì)胞膜是物質(zhì) 進(jìn)出細(xì)胞的一道屏障,許多生物大分子如多肽、蛋白質(zhì)、DNA是不能自由跨越細(xì)胞膜進(jìn)行物 質(zhì)和信息傳遞的。這一屏障雖然對機(jī)體有保護(hù)作用,但也使許多有應(yīng)用前景的藥物被摒棄。
[0003] 近年來,國外學(xué)者在對一些病毒轉(zhuǎn)染特性的研究中相繼發(fā)現(xiàn)了一類蛋白結(jié)構(gòu) 域,如:人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV-1)的反式轉(zhuǎn)錄激活因 子(TAT)、果蠅艇角同源異形域(ANTP)、單純皰疹病毒I型VP22轉(zhuǎn)錄因子,不僅具有細(xì) 胞穿透能力,而且具有介導(dǎo)異源蛋白、寡聚核苷酸、脂質(zhì)體等大分子直接透過細(xì)胞膜進(jìn)入 細(xì)胞的功能,將其命名為細(xì)胞穿膜肽(cell-penetrating peptides, CPPs)細(xì),也被稱之 為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(protein transduction domain,PTD),細(xì)胞穿膜膚(cell penetrating peptides,CPPs)又稱為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域或膜轉(zhuǎn)導(dǎo)肽,是一種由30個(gè)或者更少氨基酸組成的能 夠穿透細(xì)胞膜的多肽,能夠運(yùn)載包括藥物在內(nèi)的許多物質(zhì),共有的性質(zhì):1)具有凈正電荷 性和兩親性;2)穿膜轉(zhuǎn)運(yùn)效率高;3)可以導(dǎo)入近乎所有的細(xì)胞;4)可以攜帶多種活性物 質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞;5)可以通過固相合成或原核表達(dá)制備,方法成熟簡便。大量研究表明,CPPs 具有強(qiáng)大的運(yùn)載潛能,CPPs攜帶的物質(zhì)可以為蛋白質(zhì)(綠色熒光蛋白、RNA酶、半乳糖苷酶 等)、多肽(100個(gè)氨基酸殘基以下)、DNA、化學(xué)小分子藥物、寡核苷酸(100bp以下)、反義 核酸、肽核酸、納米顆粒、熒光素、有機(jī)分子、腺病毒載體、成像物質(zhì)、脂質(zhì)體及鐵顆粒等,運(yùn) 載能力可以達(dá)到120kDa(如半乳糖苷酶)、40nm(如鐵顆粒),沒有明顯的證據(jù)表明運(yùn)載極 限。CPPs可以通過化學(xué)結(jié)合或基因融合等方式攜帶各種生物大分子。CPPs與藥物的連接 方式有兩種:非共價(jià)連接和共價(jià)連接。但CPPs這種非特異性地穿膜特征雖然體現(xiàn)了 CPPs 在體內(nèi)應(yīng)用上的廣泛性,但在實(shí)際應(yīng)用過程中也將導(dǎo)致生物活性藥物給藥量的加大,藥物 治療效率的降低,不良反應(yīng)增加的憂慮。因此,對CPPs穿膜轉(zhuǎn)運(yùn)方式的改進(jìn)不僅在臨床應(yīng) 用上具有非常廣闊的應(yīng)用前景,而且也具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
[0004] 大量研究證實(shí),在大多數(shù)常見的腫瘤細(xì)胞表面都有表皮生長因子受體(EGFR)過 度表達(dá)或者突變。EGFR異常高表達(dá)的腫瘤包括乳腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、卵巢 癌、膀胱癌、腎癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、鼻咽癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等(Salomon等,Crit Rev Oncol Hematol. 1995,19:183)。腫瘤細(xì)胞表面EGFR的過度表達(dá)以及腫瘤細(xì)胞的生長依賴于生長 因子的特點(diǎn)使得EGFR成為了目前腫瘤專一性治療研究的一大熱點(diǎn)。EGFR被作為識(shí)別腫瘤 細(xì)胞的專一'I"生導(dǎo)向祀標(biāo),大量用于腫瘤專一'I"生治療藥物的開發(fā)與研究(Seshacharyulu等, Expert Opin Ther Targets. 2012,16:15)。但由于正常人體細(xì)胞表面也存在有EGFR,這些 EGFR是正常細(xì)胞發(fā)揮其日常生理功能所必需。因此,雖然EGFR是一個(gè)非常適宜的腫瘤專一 性治療靶向物,但在利用其進(jìn)行腫瘤治療靶向藥物的開發(fā)過程中,如何盡量避免其對正常 細(xì)胞的影響,減少藥物不良反應(yīng)的發(fā)生,穩(wěn)定發(fā)揮和提高藥物的療效是廣大藥物開發(fā)研究 人員必須考慮和面對的問題。
[0005] 研究發(fā)現(xiàn),在自然界人體中,EGFR除了與動(dòng)物本人自身分泌的EGF等生長因子能 與其EGFR專一性結(jié)合發(fā)揮作用外,人體分泌的許多其它生長因子,甚至包括一些由病毒分 泌的生長因子由于其空間結(jié)構(gòu)的某一部分與動(dòng)物來源的生長因子類似,也能與EGFR進(jìn)行不 同程度的結(jié)合,誘導(dǎo)相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。這些生長因子包括人轉(zhuǎn)化生長因子-a (hTGF- α ), 人表皮調(diào)節(jié)素(hEPR),人β細(xì)胞素(hBTC),二性調(diào)節(jié)素(Amphiregulin),肝素結(jié)合EGF樣 生長因子(HB-EGF),Heregulin,Betacelluin等等。病毒來源的有如痘苗病毒生長因子 (VGF),Shope纖維瘤病毒生長因子(SVGF),粘液瘤病毒生長因子(MVGF)等。通過對此類生 長因子的序列比對研究發(fā)現(xiàn),能與EGFR結(jié)合的EGF類多肽具有類似的結(jié)構(gòu)和功能,分子內(nèi) 都有6個(gè)Cys殘基,可形成3個(gè)二硫鍵,并將50-90個(gè)左右的氨基酸肽鏈折疊成三環(huán)結(jié)構(gòu) (見圖1A,引自Cell, Vol. 110, 775 - 787, S印tember20, 2002),并共同具有絲裂原功能,在 TGF- β存在的條件下可引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化,在軟瓊脂錨著實(shí)驗(yàn)中可形成細(xì)胞集落,這類TGF- α 和病毒生長因子多肽被稱之為EGF樣多肽。后續(xù)研究表明,EGF樣多肽中三環(huán)結(jié)構(gòu)是其生物 活性所必須的。以EGF為例,A環(huán)的R41殘基在Site2處,B環(huán)的K28、C31、N32、C33殘基在 Sitel 處,C 環(huán)的 Q43、R45、L47 殘基在 Site3 處分別與 EGFR 上 Domain I 與 Domain III 部位 的3個(gè)不同部位專一性結(jié)合(見圖1B,引自Cell, Vol. 110, 775 - 787, S印tember20, 2002)。 在這其中,EGF的第三環(huán)(C環(huán))上的氨基酸殘基更是插入到EGFR結(jié)合位點(diǎn)的深處發(fā)揮作用 (Ogiso等,Cell,2002,110:775)。EGF和EGF樣多肽在一級結(jié)構(gòu)某些固定部位的氨基酸殘 基是非常保守的,為維持其生物活性所必需,它們起到維持空間構(gòu)象和提供氫鍵和非極性 疏水結(jié)合的作用。這些保守氨基酸任何缺失或大段缺失突變,都會(huì)導(dǎo)致這些生長因子與其 受體結(jié)合活性的降低或完全喪失,從而影響其生物學(xué)功能。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題為提供一種腫瘤細(xì)胞靶向性穿膜肽,以提高治療藥物 的藥理作用效果,盡量減少對正常細(xì)胞的影響,減輕藥物不良反應(yīng)的發(fā)生。
[0007] 為此,本發(fā)明一方面公開了一種新型腫瘤細(xì)胞靶向性穿膜肽,其特征在于其含有 具有細(xì)胞穿膜肽活性的CPPs結(jié)構(gòu)域和EGF第三環(huán)樣人工模擬肽結(jié)構(gòu)域。
[0008] 本發(fā)明的發(fā)明思路為將EGF第三環(huán)樣模擬肽氨基酸殘基序列與細(xì)胞穿膜肽序列 融合構(gòu)成一種新型靶向型細(xì)胞穿膜肽,通過EGF第三環(huán)樣模擬肽結(jié)構(gòu)域能與腫瘤細(xì)胞表面 表達(dá)豐富的EGFR專一性結(jié)合的特性,實(shí)現(xiàn)新型細(xì)胞穿膜肽在體內(nèi)運(yùn)輸?shù)哪[瘤靶向性,從而 發(fā)揮穿膜肽的專一性靶向轉(zhuǎn)運(yùn)作用,將藥物分子在體內(nèi)進(jìn)行專一性的靶向投送傳遞進(jìn)入腫 瘤細(xì)胞,達(dá)到控制腫瘤細(xì)胞生長,減少對正常細(xì)胞的不良影響的治療疾病的目的。
[0009] 本發(fā)明通過對EGF與EGFR受體結(jié)合立體3D模型的分析,特別是我們認(rèn)為對在 EGF與EGFR結(jié)合過程中影響作用貢獻(xiàn)最大的第三環(huán)(C環(huán))的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析研究,結(jié)合 對各種EGF樣多肽的氨基酸殘基一級結(jié)構(gòu)序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對分析的結(jié)果(Sato等,F(xiàn)EBS Letters. 2003, 553:232 ;McFadden 等,D01:10. 1006/rwcy. 2000. 03014),采用人工設(shè)計(jì)的 方式,構(gòu)建模擬EGF第三環(huán)與EGFR結(jié)合區(qū)域的人工模擬肽(簡稱S3模擬肽),將其作為專一 性識(shí)別腫瘤細(xì)胞的靶向序列,其與CPPs融合構(gòu)成靶向穿膜肽,構(gòu)建成一種能夠?qū)R恍詢?yōu)先 定向結(jié)合到腫瘤細(xì)胞表面并實(shí)施穿膜運(yùn)輸?shù)男滦桶邢蛐痛┠る?,用于腫瘤疾病的診斷、治 療過程中所需藥物的開發(fā)應(yīng)用。
[0010] 在一實(shí)施方式中,所述腫瘤細(xì)胞靶向性穿膜肽具有下式:R1-L-R2或R2-L-R1,其 中L是連接肽(模型結(jié)構(gòu)示意圖見圖2),連接肽優(yōu)選為卷曲連接肽,包括例如:
[0011] (GGGGS)N或(GGGS)N或(GGS)N或(EFGG) N或(VDGG)N,其中N是大于或等于1的 整數(shù);
[0012] R1為EGF第三環(huán)樣人工模擬肽的氨基酸序列,其氨基酸序列如XaalC -^aa3-^aa4-^aa5^-^aa7-^aa8-^aa9^^ -^aal2-^aal3-^aal4-^aal5^
[0013] Xaal :1?、¥、1、隊(duì)6、1(、¥中之一,優(yōu)選為1?;
[0014] Xaa3 :S、H、R、D、E、Q、V、G 中之一,優(yōu)選為 S ;
[0015] Xaa4 :H、I、S、E、V、A、V 中之一,優(yōu)選為 Η;
[0016] Xaa5 :G、S、V、A、Υ 中之一,優(yōu)選為 G 或 S ;
[0017] Xaa7 :T、V、I、S、D 中之一,優(yōu)選為 T ;
[0018] Xaa8 :G、S、A 中之一,優(yōu)選為 G 或 S ;
[0019] Xaa9 :I、S、A、V、E、D 中之一,優(yōu)選為 I ;
[0020] Xaal2 :Q、E、R、H、K 中之一,優(yōu)選為 Q ;
[0021] Xaal3 :H、I、Y、R、E、G、A、L 中之一,優(yōu)選為 H、A、L或 I ;
[0022] Xaal4 :V、F、R、A 中之一,優(yōu)選為 V ;
[0023] Xaal5 :D、F、V、S 中之一,優(yōu)選為 V ;
[0024] R2為細(xì)胞穿膜肽的氨基酸序列。
[0025] 在一實(shí)施方式中,所述R1的氨基酸序列包括但不局限于表1所示序列如SEQ ID NO. 1-20 所示。
[0026] 表1人工合成的部分S3模擬肽系列序列
[0027]

【權(quán)利要求】
1. 一種腫瘤細(xì)胞靶向性穿膜肽,其特征在于其含有具有細(xì)胞穿膜肽活性的CPPs結(jié)構(gòu) 域和具有對腫瘤細(xì)胞特異性靶向親和的EGF第三環(huán)樣人工模擬肽結(jié)構(gòu)域。
2. 如權(quán)利要求1所述的腫瘤細(xì)胞靶向性穿膜肽,其特征在于所述腫瘤細(xì)胞靶向穿膜肽 具有下式:R1-L-R2或R2-L-R1,其中L是卷曲型連接肽; R1為EGF第三環(huán)樣人工模擬肽結(jié)構(gòu)域,其氨基酸序列如XaalC Xaa3Xaa4Xaa5Y Xaa7Xaa8Xaa9RC -^aal2-^aal3-^aal4-^aal5^ Xaal :R、V、I、N、G、K、L 中之一; Xaa3 :S、H、R、D、E、Q、V、G 中之一; Xaa4 :H、I、S、E、K、Q、P、V、N 中之一; Xaa5 :G、N、V、A、L、I 中之一; Xaa7 :T、V、F、I、H、S、D 中之一; Xaa8:G、S、A 中之一; Xaa9 :I、S、A、V、E、D 中之一; Xaal2 :Q、E、T、H、K 中之一; Xaal3 :H、T、Y、R、E、G、A、L 中之一; Xaal4 :V、F、R、A 中之一; Xaal5:D、F、V、S 中之一; R2為具有細(xì)胞穿膜肽活性的CPPs結(jié)構(gòu)域。
3. 如權(quán)利要求1或2中所述的腫瘤細(xì)胞靶向性穿膜肽,其特征在于所述R1氨基酸序列 如 SEQ ID NO. 1-20 所示。
4. 如權(quán)利要求1或2中所述的腫瘤細(xì)胞靶向性穿膜肽,其特征在于所述CPPs結(jié) 構(gòu)域?yàn)槿嗣庖呷毕莶《巨D(zhuǎn)錄激活因子TAT,單純皰疹病毒I型VP22轉(zhuǎn)錄因子,果蠅同 源觸角蛋白的 Penetratin,Transportan,ARF,BagP,CytC,hCT,hLF,hClock,TCTP, MPG,MAP, Pep-1, SynBl, Polyomavirus Vpl, Bac, NF-KB, SV40T antigen, HATF3, hCT, pVEC, Integrin, DPV6, S413PV, Poly-P,EC-SOD羧基末端肝素結(jié)合域中的一種。
5. 如權(quán)利要求1所述的腫瘤細(xì)胞靶向性穿膜肽,其特征在于所述腫瘤細(xì)胞靶向穿膜肽 為其氨基酸序列如SEQ ID NO. 21-27中之一所示的肽。
6. -種靶向選擇性的給藥系統(tǒng),其特征在于其由權(quán)利要求1所述腫瘤細(xì)胞靶向性穿膜 肽與抗癌藥物或示蹤劑或生物活性物質(zhì)或載體連接組成。
7. 如權(quán)利要求6所述的給藥系統(tǒng),其特征在于所述給藥系統(tǒng)為權(quán)利要求1所述所述腫 瘤細(xì)胞靶向性穿膜肽序列通過連接肽共價(jià)連接凋亡素蛋白形成融合蛋白形成的給藥系統(tǒng)。
8. 如權(quán)利要求7所述的給藥系統(tǒng),其特征在于所述融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO. 28-32中之一所示。
9. 如權(quán)利要求6所述的給藥系統(tǒng),其特征在于所述抗癌藥物為阿霉素、紫杉醇、多西紫 杉醇、絲裂霉素、柔紅霉素、順鉬、卡鉬、喜樹堿、羥基喜樹堿、長春新堿、博萊霉素、5-氟尿嘧 啶、環(huán)磷酞胺、吉西他濱、甲氨蝶吟、卡培他濱、洛莫司汀、依托泊苷中之一。
10. 權(quán)利要求1所述腫瘤細(xì)胞靶向性穿膜肽在制備腫瘤細(xì)胞靶向性物質(zhì)中應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104140457SQ201310170530
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2013年5月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月8日
【發(fā)明者】趙健, 王富軍, 傅云龍, 張濤鑄, 單含文, 任偉揚(yáng), 謝先文 申請人:浙江日升昌藥業(yè)有限公司
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