本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的，涉及一種microRNA在制備治療白血病的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

白血病是一類造血干細胞惡性克隆性疾病?？寺⌒园籽〖毎驗樵鲋呈Э?、分化障礙、凋亡受阻等機制在骨髓和其他造血組織中大量增殖累積，并浸潤其他組織和器官，同時正常造血受抑制。臨床可見不同程度的貧血、出血、感染發(fā)熱以及肝、脾、淋巴結(jié)腫大和骨骼疼痛。據(jù)報道，我國各地區(qū)白血病的發(fā)病率在各種腫瘤中占第六位。臨床上，手術(shù)或放療針對局限白血病是有效的，但是對于轉(zhuǎn)移者是難以治愈的，針對轉(zhuǎn)移性白血病治療仍然缺乏有效的藥物。miRNA是調(diào)節(jié)基因表達的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達進行調(diào)控，參與細胞周期、凋亡、發(fā)育、分化和新陳代謝等生理過程。miRNA在細胞中表達失調(diào)

會導致癌癥在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生，最新研究表明，一些miRNA在白血病中異常表達，但何種miRNA與白血病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)仍未達成共識。

因此有必要尋找與白血病發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的miRNA，從而為臨床上治療轉(zhuǎn)移性白血病提供一種有效手段。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種抑制白血病發(fā)展的含有miRNA的藥物組合物，為臨床上治療轉(zhuǎn)移性白血病提供可能。

本發(fā)明的發(fā)明人在對白血病的轉(zhuǎn)移機制進行研究的過程中發(fā)現(xiàn)miR-5001在白血病系Daudi、Jurkat細胞中表達顯著性降低，同時發(fā)現(xiàn)miR-5001能夠抑制癌細胞增殖和遷移、促進細胞凋亡，miR-5001能夠抑制裸鼠體內(nèi)前列腺腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。白血病細胞中miR-5001的表達量高低可作為癌細胞轉(zhuǎn)移的一個分子標記物。

本發(fā)明的一個方面提供了miR-5001在制備治療白血病的藥物中的應(yīng)用，所述miR-5001的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

可選的，所述應(yīng)用包括制備抑制白血病細胞遷移、侵襲和增殖的藥物。

可選的，所述應(yīng)用包括將miR-5001與載體結(jié)合后與抗腫瘤藥物和/或藥物可接受的輔料復(fù)配制成藥物組合物。

本發(fā)明的一個方面提供了miR-5001在制備抑制白血病細胞高轉(zhuǎn)移性細胞系Daudi和/或Jurkat的遷移能力的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物以miR-5001為活性成分，其中，所述miR-5001的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

可選的，所述藥物組合物含有與載體結(jié)合的miR-5001和/或藥物可接受的輔料。

在本發(fā)明所提供的藥物組合物中，載體可以為本領(lǐng)域常用的適合于miRNA在宿主細胞中表達的載體種類，例如，所述載體可以為脂質(zhì)體、殼聚糖或慢病毒表達載體。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述表達載體為慢病毒表達載體，優(yōu)選的，所述慢病毒表達載體可以為pWPXL、pMD2.G或psPAX2慢病毒表達載體。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述藥物組合物還任選地包含一種或多種其他對白血病有效的腫瘤藥物，可選的，所述藥物組合物中含有鉑類抗腫瘤藥物，還可以包含以鉑類抗腫瘤藥為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案中常規(guī)使用的其他腫瘤藥物，這些其他腫瘤藥物是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。

可選的，所述抗腫瘤藥物為絲裂霉素、順鉑或卡鉑。

當將miR-5001與鉑類抗腫瘤藥物聯(lián)合使用時，鉑類抗腫瘤藥物的用量可以減少至常規(guī)化療方案中用量的20-80％。

本發(fā)明中，所述藥物組合物的給藥途徑為靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)灌注或局部注射等，也可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的靶向給藥技術(shù)進行腫瘤靶向給藥。

本發(fā)明所提供的藥物組合物能夠通過miR-5001對白血病細胞轉(zhuǎn)移能力的抑制作用來抑制白血病的發(fā)展過程，抑制效率高達50％，見圖3。

附圖說明

圖1為miR-5001抑制細胞增殖及克隆形成實驗結(jié)果。

其中，(A)為miR-5001轉(zhuǎn)染Daudi，Q-PCR檢測miR-5001的表達量；(B)為miR-5001轉(zhuǎn)染Daudi后檢測細胞增殖；(C)為細胞克隆形成能力檢測。

圖2為miR-5001能夠抑制白血病細胞周期進程的柱狀圖。

圖3為miR-5001抑制白血病細胞遷移和侵襲結(jié)果圖。

其中，(A)為miR-5001轉(zhuǎn)染Daudi細胞后Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲，視野內(nèi)細胞遷移和侵襲的數(shù)量，(B)為miR-5001轉(zhuǎn)染Jurkat細胞后Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲，視野內(nèi)細胞遷移和侵襲的數(shù)量。

具體實施方式

下面通過具體實施方式對本發(fā)明進行詳細說明。

在本發(fā)明中，術(shù)語“miR-5001”是指包含SEQ ID No.1所示序列或其同源序列的微小RNA。本領(lǐng)域中已知各種來源的miR-5001，例如，人、鼠、兔等，這些同源序列均包含在本發(fā)明的術(shù)語miR-5001中。本發(fā)明的術(shù)語中還包含上述天然存在的miR-5001序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸，或經(jīng)過生物學化學修飾后仍具有miR-5001生物活性的衍生RNA。

本發(fā)明中，人工合成的以及可以通過購買市售商品方式獲得的具有miR-5001生物學活性的miR-5001模擬物也屬于本發(fā)明的保護范圍。

此外，本發(fā)明所述的miR-5001也可以為前體形式，miR-5001前體是指在被施用對象的細胞內(nèi)或體內(nèi)可以被加工成為miR-5001的前體。獲得天然存在的miR-5001前體的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。

本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，miR-5001的初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)過一系列的加工后，形成成熟的miR-5001。miR-5001前體只有在加工成成熟的miR-5001后才具有相應(yīng)的生物學功能。

本發(fā)明所提供的組合物可以用于治療白血病。所述組合物中含有有效量的本發(fā)明的miR-5001。

在本發(fā)明中，所述藥物可接受的輔料包括各種賦形劑、稀釋劑和佐劑。輔料其本身并不是必要的活性成分，且使用后沒有過分的毒性。這類輔料包括但不限于：生理鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇等。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述組合物的形式適合于：直接裸microRNA注射法、脂質(zhì)體包裹RNA直接注射法、繁殖缺陷細菌攜帶質(zhì)粒DNA法或復(fù)制缺陷腺病毒攜帶目的DNA法等。

本發(fā)明的miR-5001的有效劑量可以隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等進行相應(yīng)的調(diào)整。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員綜合各因素來確定。所述因素包括但不限于：miR-5001的藥代動力學參數(shù)、被治療的患者的健康狀況、體重、給藥途徑等。

本發(fā)明中，所述藥物組合物的給藥途徑為靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)灌注或局部注射等，也可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的給藥技術(shù)進行給藥。

本發(fā)明的藥物組合物可以與其它治療手段聯(lián)合，用于白血病的治療。

實施例1

本實施例證明miR-5001對白血病細胞增殖及克隆形成的抑制作用

用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000將miR-5001的模擬物miR-5001mimics(miR-5001模擬物)轉(zhuǎn)染前列腺細胞系Daudi，并用Q-PCR檢測其表達量如圖1A，結(jié)果表明，miR-5001mimics轉(zhuǎn)染DAUDI后細胞中miR-5001表達量顯著性上升，證明mimics能夠模擬miR-5001的表達。miR-5001mimics轉(zhuǎn)染DAUDI細胞24、36、48、72和96h后，體外用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖，如圖1B，miR-5001能夠顯著性抑制白血病細胞的增殖。

用軟瓊脂培養(yǎng)克隆形成實驗檢測細胞群體依賴性和增殖能力。取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細胞，用0.25％的胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，把細胞懸浮在10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液中備用。將細胞懸液倍數(shù)稀釋接種于軟瓊脂培養(yǎng)板中，靜置培養(yǎng)10-14天，計算克隆形成率，如圖1C，結(jié)果表明miR-5001能夠顯著性抑制DAUDI的克隆形成能力。

實施例2

本實施例證明miR-5001抑制白血病細胞細胞周期進程的作用

將miR-5001mimics轉(zhuǎn)染Daudi后，培養(yǎng)24小時后，收取細胞并進行PI染色，利用流式細胞術(shù)檢測細胞周期的比例，其中，G1/G0為細胞靜息期，S為DNA合成期，G2/M為有絲分裂期，G2/M比例越低，說明細胞增殖較慢。

結(jié)果見圖2：miR-5001mimics轉(zhuǎn)染Daudi能夠顯著降低G2/M期細胞比例，證明miR-5001能夠顯著抑制Daudi細胞周期進程，從而抑制細胞分裂。

實施例3

本實施例證明miR-5001對白血病細胞遷移和侵襲的抑制作用。

miR-5001mimics轉(zhuǎn)染Daudi和Jurkat細胞，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，再將細胞轉(zhuǎn)移至Transwell培養(yǎng)皿中，觀察48小時。利用Transwell侵襲實驗驗證細胞的遷移和侵襲能力，如圖3，結(jié)果表明miR-5001mimics轉(zhuǎn)染Daudi和Jurkat后，導致兩種白血病細胞遷移和侵襲能力明顯下降。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。