本發(fā)明涉及納米材料領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種能高效產(chǎn)生活性氧自由基的氧化銅-鉑納米復(fù)合體在抗菌方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

由細(xì)菌感染引起的疾病，日益成為威脅人類健康的罪魁禍?zhǔn)字?。如：霍亂、肺炎、瘧疾、結(jié)核及肝炎等，都是由于細(xì)菌或微生物傳播而引起的。在生物醫(yī)學(xué)移植物、手術(shù)設(shè)備、工業(yè)管道等器械中，細(xì)菌集落和生物膜又是引起一些傳染性疾病暴發(fā)和醫(yī)院獲得性感染的主要原因。細(xì)菌集落及生物膜可以在外圍形成保護(hù)屏障，使得傳統(tǒng)的抗菌治療以及免疫響應(yīng)不能徹底清除這些病原灶。抗生素的問(wèn)世，為人類戰(zhàn)勝這些疾病提供了有效的治療途徑。但是，抗生素濫用會(huì)引起細(xì)菌耐藥性的急劇增加，導(dǎo)致許多藥物無(wú)法治療的“超級(jí)感染”，如：耐甲氧西林金黃葡萄球菌的感染等。在2002年，大約有170萬(wàn)病人遭受了醫(yī)院獲得性感染，其中一半人是由于泌尿管和中心靜脈留置導(dǎo)管滅菌不徹底而引發(fā)的二次感染。

隨著納米科技的發(fā)展，越來(lái)越多的無(wú)機(jī)納米抗菌材料也應(yīng)運(yùn)而生。無(wú)機(jī)抗菌材料具有低毒性、耐熱性、耐久性、持續(xù)性、抗菌譜廣等優(yōu)點(diǎn)，日益成為生活制品的最佳選擇。無(wú)機(jī)抗菌材料又以含金屬離子金屬氧化物型抗菌劑和半導(dǎo)體光催化型抗菌劑為主。金屬離子金屬氧化物型抗菌劑是利用金屬本身所具有的抗菌能力來(lái)達(dá)到抗菌目的，例如銀系列的抗菌材料。銀離子本身就可以通過(guò)電荷引力吸附在細(xì)菌表面，破壞細(xì)胞壁，并與菌體內(nèi)的巰基基團(tuán)反應(yīng)，使得蛋白凝聚，下調(diào)破壞細(xì)菌的細(xì)胞合成酶的活性，使細(xì)胞喪失分裂增殖能力而死亡。但是這類抗菌劑一般成本較高，穩(wěn)定性差，生物安全性評(píng)價(jià)不完善，并且長(zhǎng)期暴露于材料下也會(huì)影響人類的健康。

氧化銅-鉑納米復(fù)合體是首先通過(guò)水熱法制備得到的氧化銅納米片，然后在氧化銅納米片的分散液中，通過(guò)硼氫化鈉還原氯鉑酸得到的。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其對(duì)細(xì)菌(如大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)具有一定的抗菌作用，但抗菌效果并不十分理想。若能基于該納米復(fù)合體開(kāi)發(fā)一種使其強(qiáng)效抗菌的途徑，將對(duì)由細(xì)菌引發(fā)的傳染病的防治十分有利。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供氧化銅-鉑納米復(fù)合體在抗菌方面的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

第一方面，本發(fā)明提供了氧化銅-鉑納米復(fù)合體在抗菌方面的應(yīng)用，具體為利用氧化銅-鉑納米復(fù)合體與過(guò)氧化氫共同作用，引起細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基含量的增加，進(jìn)而引起細(xì)菌內(nèi)部氧化應(yīng)激失調(diào)，達(dá)到抑菌目的。

作為優(yōu)選，上述應(yīng)用針對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用格外顯著，因此，優(yōu)選所述細(xì)菌為大腸桿菌或金黃色葡萄球菌。

進(jìn)一步地，當(dāng)所述細(xì)菌為大腸桿菌時(shí)，所述氧化銅-鉑納米復(fù)合體的作用濃度為10～20μg/mL，所述過(guò)氧化氫的作用濃度為40～60μM。作為優(yōu)選，所述氧化銅-鉑納米復(fù)合體的作用濃度為15～20μg/mL，所述過(guò)氧化氫的作用濃度為45～55μM。更為優(yōu)選，所述氧化銅-鉑納米復(fù)合體的作用濃度為20μg/mL，所述過(guò)氧化氫的作用濃度為50μM。

進(jìn)一步地，當(dāng)所述細(xì)菌為金黃色葡萄球菌時(shí)，所述氧化銅-鉑納米復(fù)合體的作用濃度為10～20μg/mL，所述過(guò)氧化氫的作用濃度為250～450μM。作為優(yōu)選，所述氧化銅-鉑納米復(fù)合體的作用濃度為15～20μg/mL，所述過(guò)氧化氫的作用濃度為250～350μM。更為優(yōu)選，所述氧化銅-鉑納米復(fù)合體的作用濃度為20μg/mL，所述過(guò)氧化氫的作用濃度為300μM。

進(jìn)一步地，所述抗菌表現(xiàn)為抑制細(xì)菌生長(zhǎng)和/或清除細(xì)菌生物膜。

第二方面，本發(fā)明提供了一種抗菌劑，包括氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過(guò)氧化氫。該抗菌劑現(xiàn)用現(xiàn)配，針對(duì)不同細(xì)菌將氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過(guò)氧化氫按照上述優(yōu)選方案組合即可。

本發(fā)明涉及到的原料或試劑均為普通市售產(chǎn)品，涉及到的操作如無(wú)特殊說(shuō)明均為本領(lǐng)域常規(guī)操作。

在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可以相互組合，得到具體實(shí)施方式。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明利用氧化銅-鉑納米復(fù)合體材料和過(guò)氧化氫共同作用，產(chǎn)生大量活性氧自由基。在正常的生理狀態(tài)下，活性氧自由基受到機(jī)體自身的酶(超氧化物歧化酶等)和小分子(抗壞血酸等)的調(diào)節(jié)，使其處于穩(wěn)態(tài)，不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生傷害。一旦穩(wěn)態(tài)被打破，引起細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基含量的增加，進(jìn)而引起細(xì)菌內(nèi)部氧化應(yīng)激失調(diào)，達(dá)到抑菌目的。所述氧化銅-鉑納米復(fù)合體材料不僅可以有效地抑制細(xì)菌生長(zhǎng)而且還能清除細(xì)菌生物膜。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例1所述氧化銅-鉑納米復(fù)合體的透射電鏡圖。

圖2是氧化銅-鉑納米復(fù)合體對(duì)細(xì)菌胞內(nèi)活性氧自由基含量的影響圖。

圖3是不同濃度的氧化銅-鉑納米復(fù)合體對(duì)兩種細(xì)菌的抑制效果圖。

圖4是氧化銅-鉑納米復(fù)合體對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)的熒光強(qiáng)度圖。

圖5是氧化銅-鉑納米復(fù)合體對(duì)細(xì)菌生物膜破壞的效果圖。

圖6是不同濃度的過(guò)氧化氫對(duì)細(xì)菌存活率的影響圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。需要理解的是以下實(shí)施例的給出僅是為了起到說(shuō)明的目的，并不是用于對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。

下述實(shí)施例使用的原料包括：

1、來(lái)自美國(guó)典型培養(yǎng)物收藏中心(ATCC)的大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 6538。

2、液體LB培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，1mol/L NaOH調(diào)pH至7.4，高壓蒸汽滅菌20min。

3、固體LB培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，15g/L瓊脂，1mol/LNaOH調(diào)pH至7.4，高壓蒸汽滅菌20min。

4、液體TSB培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨17g/L，大豆木瓜蛋白酶消化物3g/L，氯化鈉5g/L，磷酸二氫鉀2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，1mol/L NaOH調(diào)pH至7.4，高壓蒸汽滅菌20min。

下述實(shí)施例中細(xì)菌懸浮液的制備方法為：通過(guò)無(wú)菌操作，使用接種環(huán)將兩種細(xì)菌接種于LB培養(yǎng)基中，37℃、150rpm過(guò)夜培養(yǎng)。

下述實(shí)施例中細(xì)菌生物膜的培養(yǎng)方法為：(1)通過(guò)無(wú)菌操作，在24孔板中加入900μL TSB培養(yǎng)基。(2)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌分別取100μL加入每孔。(3)將24孔板靜止于培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)，37℃，每個(gè)12小時(shí)更換新鮮TSB培養(yǎng)基。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1氧化銅-鉑納米復(fù)合體的制備

1、氧化銅納米片制備

將0.5g二水合氯化銅和0.5g CTAB溶解在15mL水中，并加入1mL氫氧化鈉溶液(0.3g/mL)；將上述反應(yīng)溶液移入20mL反應(yīng)釜中，120℃反應(yīng)6h。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)離心、洗滌，得到氧化銅納米片。

2、氧化銅-鉑納米復(fù)合體制備

首先，取660μL氧化銅納米片(170mg/L)加入到2.34mL超純水中，超聲10min，使其均勻分散。然后，向上述混合液中加入23.5μL H₂PtCl₆·6H₂O水溶液(19.3mM)。最后，在冰浴下，快速攪拌并逐滴加入1mL NaBH₄水溶液(4.8mM)，滴加結(jié)束后繼續(xù)攪拌2h。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)離心、洗滌，得到氧化銅-鉑納米復(fù)合體。氧化銅-鉑納米復(fù)合體的透射電鏡圖如圖1所示，從圖中可見(jiàn)，鉑納米顆粒均勻地分布在氧化銅片上。

實(shí)施例2氧化銅-鉑納米復(fù)合體在抗菌方面的應(yīng)用

1、氧化銅-鉑納米復(fù)合體對(duì)細(xì)菌胞內(nèi)活性氧自由基的測(cè)量

步驟：(1)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌，用0.01M的PBS洗滌，并調(diào)節(jié)其OD600＝0.1(10⁸CFU/mL)，分取20μL到1.5mL的離心管中。(2)向離心管中加入終濃度為20μg/mL氧化銅-鉑納米復(fù)合體，并同時(shí)加入過(guò)氧化氫。對(duì)于大腸桿菌過(guò)氧化氫終濃度為(50μM)，金黃色葡萄球菌過(guò)氧化氫終濃度為(300μM)。(3)將上述離心管放置于培養(yǎng)箱中，37℃、150rpm，作用3小時(shí)。(4)向上述體系中，加入熒光探針DCFH-DA(100μM)，37℃、150rpm，孵育30分鐘。(5)用酶標(biāo)儀測(cè)定激發(fā)在485nm，發(fā)射在530nm處的熒光值。(6)計(jì)算細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的含量。

2、氧化銅-鉑納米復(fù)合體對(duì)細(xì)菌存活率的評(píng)價(jià)

(A)稀釋平板法

步驟：(1)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌，用0.01M的PBS洗滌，并調(diào)節(jié)其OD600＝0.1(10⁸CFU/mL)，分取20μL到1.5mL的離心管中。(2)向離心管中加入終濃度分別為5、10、15和20μg/mL氧化銅-鉑納米復(fù)合體，并同時(shí)加入過(guò)氧化氫。對(duì)于大腸桿菌過(guò)氧化氫終濃度為(50μM)，金黃色葡萄球菌過(guò)氧化氫終濃度為(300μM)。(3)將上述離心管放置于培養(yǎng)箱中，37℃、150rpm，作用3小時(shí)。(4)通過(guò)無(wú)菌操作，將上述混合物稀釋10倍，然后取100μL涂布于LB平板上，每個(gè)處理三次重復(fù)。(5)將上述涂布的培養(yǎng)皿放置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。(6)通過(guò)統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，初步得到氧化銅-鉑納米復(fù)合體對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制情況。

(B)熒光強(qiáng)度法

步驟：(1)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌，用0.01M的PBS洗滌，并調(diào)節(jié)其OD600＝0.1(10⁸CFU/mL)，分取20μL到1.5mL的離心管中。(2)向離心管中加入終濃度為(20μg/mL)氧化銅-鉑納米復(fù)合體，并同時(shí)加入過(guò)氧化氫。對(duì)于大腸桿菌過(guò)氧化氫終濃度為(50μM)，金黃色葡萄球菌過(guò)氧化氫終濃度為(300μM)。(3)將上述離心管放置于培養(yǎng)箱中，37℃、150rpm，作用3小時(shí)。(4)通過(guò)無(wú)菌操作，將上述混合物分別加入1.5μL STYO 9和PI兩種熒光染液，每個(gè)處理三次重復(fù)。STYO 9可以標(biāo)記所有的細(xì)胞，而PI只能標(biāo)記受損的細(xì)胞，引起STYO 9的綠色熒光下降，進(jìn)而區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。(5)通過(guò)離心去除多余染液，然后用酶標(biāo)儀分別記錄激發(fā)在480nm，發(fā)射在500nm和激發(fā)在490nm，發(fā)射在550nm處的熒光信號(hào)。(6)通過(guò)統(tǒng)計(jì)熒光強(qiáng)度，進(jìn)一步得出氧化銅-鉑納米復(fù)合體對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制情況。

3、氧化銅-鉑納米復(fù)合體對(duì)細(xì)菌生物膜的破壞

步驟：(1)用0.01M PBS對(duì)上述培養(yǎng)48小時(shí)的生物膜清洗，去除殘余培養(yǎng)基。(2)向24孔板中加入終濃度分別為5、10、15和20μg/mL氧化銅-鉑納米復(fù)合體，并同時(shí)加入過(guò)氧化氫，用PBS補(bǔ)足體積至1mL。對(duì)于大腸桿菌過(guò)氧化氫終濃度為(50μM)，金黃色葡萄球菌過(guò)氧化氫終濃度為(300μM)。(3)將上述24孔板放置于培養(yǎng)箱中，37℃靜止作用3小時(shí)。(4)通過(guò)無(wú)菌操作，使用移液槍移除作用后的混合液，用PBS進(jìn)行兩次清洗。(5)向24孔板中加入500μL甲醇，固定生物膜15min。(6)每孔加入300μL結(jié)晶紫染液(1％)，靜止染色30min。(7)去除多余染液，并用PBS清洗兩次后，用數(shù)碼相機(jī)對(duì)孔底部的生物膜進(jìn)行拍照。(8)每孔加入1mL乙醇，提取吸附在生物膜上的染液，并使用酶標(biāo)儀測(cè)定其在595nm處的吸收值。(9)計(jì)算氧化銅-鉑納米復(fù)合體對(duì)細(xì)菌生物膜的破壞程度。

對(duì)比例1

本對(duì)比例與實(shí)施例2的區(qū)別在于：在實(shí)施例2的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，均不加入過(guò)氧化氫。并與實(shí)施例2所得結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)圖2～圖5。

其中，圖2為氧化銅-鉑納米復(fù)合體對(duì)細(xì)菌胞內(nèi)活性氧自由基含量的影響圖。如圖2所示，只加入過(guò)氧化氫時(shí)，細(xì)菌胞內(nèi)的活性氧自由基沒(méi)有出現(xiàn)劇增，由此推斷，該濃度下的過(guò)氧化氫不會(huì)對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。只加入氧化銅-鉑納米復(fù)合體時(shí)，細(xì)菌胞內(nèi)的活性氧自由基會(huì)有所增加。如果同時(shí)使用氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過(guò)氧化氫時(shí)，細(xì)菌胞內(nèi)的活性氧自由基會(huì)呈現(xiàn)倍數(shù)性增加。氧化銅-鉑納米復(fù)合體聯(lián)合過(guò)氧化氫時(shí)，會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌內(nèi)部活性氧自由基有2.7倍的增加；也會(huì)引起金黃色葡萄球菌內(nèi)部活性氧自由基有8.2倍的增加。

圖3為氧化銅-鉑納米復(fù)合體對(duì)兩種細(xì)菌的抑制效果圖。如圖3A和3B所示，在5μg/mL的氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過(guò)氧化氫的聯(lián)合作用下，兩種細(xì)菌的存活率已經(jīng)明顯下降至50％左右。沒(méi)有過(guò)氧化氫存在時(shí)，5μg/mL的氧化銅-鉑納米復(fù)合體對(duì)兩種細(xì)菌的存活率影響極小，可以忽略不計(jì)。在10μg/mL的氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過(guò)氧化氫的聯(lián)合作用下，兩種細(xì)菌的存活率已經(jīng)明顯下降至30％以下。若沒(méi)有過(guò)氧化氫輔助時(shí)，僅10μg/mL的氧化銅-鉑納米復(fù)合體對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)影響極小，可以忽略不計(jì)。在15μg/mL的氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過(guò)氧化氫的聯(lián)合作用下，兩種細(xì)菌的存活率已經(jīng)明顯下降至10％以下。沒(méi)有過(guò)氧化氫存在時(shí)，只15μg/mL的氧化銅-鉑納米復(fù)合體作用下，其對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)影響極小，可以忽略不計(jì)。在20μg/mL的氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過(guò)氧化氫聯(lián)用作用下，兩種細(xì)菌的存活率已經(jīng)明顯接近0％。無(wú)過(guò)氧化氫輔助時(shí)，僅氧化銅-鉑納米復(fù)合體作用時(shí)，細(xì)菌依舊維持很高的存活率。圖3C和3D分別為對(duì)應(yīng)處理?xiàng)l件下平板菌落圖，從平板圖中可以明顯發(fā)現(xiàn)，5μg/mL的氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過(guò)氧化氫的聯(lián)合作用抑菌效果要好于單獨(dú)的氧化銅-鉑納米復(fù)合體的抑菌效果。10μg/mL的氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過(guò)氧化氫的聯(lián)用能在一定程度上抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，使得平板上的細(xì)菌菌落數(shù)有明顯減少。而無(wú)過(guò)氧化氫存在時(shí)，僅10μg/mL的氧化銅-鉑納米復(fù)合體時(shí)，平板上依舊會(huì)形成大量的細(xì)菌菌落。15μg/mL的氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過(guò)氧化氫的聯(lián)用能顯著地抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。20μg/mL的氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過(guò)氧化氫的聯(lián)用能強(qiáng)烈地抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，平板上僅有很少的菌落。由此可知，氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過(guò)氧化氫的聯(lián)用抑菌效果要優(yōu)于單獨(dú)的氧化銅-鉑納米復(fù)合體或過(guò)氧化氫的抑菌效果。

圖4為細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)的熒光強(qiáng)度對(duì)比圖。當(dāng)細(xì)菌受到損傷時(shí)，紅色熒光分子就會(huì)滲透至細(xì)菌內(nèi)部，標(biāo)記其核酸，使得綠色的熒光強(qiáng)度下降。如圖所示，細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，其綠色熒光強(qiáng)度越高，紅色熒光強(qiáng)度就會(huì)越低，其兩者的比值就會(huì)很大。單獨(dú)的過(guò)氧化氫，能使的兩者的熒光比值下降，說(shuō)明過(guò)氧化氫對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)還是產(chǎn)生了部分影響。熒光標(biāo)記法相對(duì)于平板計(jì)數(shù)法更加靈敏地顯示出細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)。在氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過(guò)氧化氫的連用下，熒光比值會(huì)降低到0，說(shuō)明氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過(guò)氧化氫共同作用，產(chǎn)生活性氧自由基，用于抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。僅氧化銅-鉑納米復(fù)合體或過(guò)氧化氫作用時(shí)，熒光比值并沒(méi)有出現(xiàn)顯著性下降，說(shuō)明其單獨(dú)使用的抑菌效果不如聯(lián)合作用的抑菌效果。

圖5所制備的氧化銅-鉑納米復(fù)合體對(duì)細(xì)菌生物膜破壞的效果圖。如圖5A和5B所示，5μg/mL氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過(guò)氧化氫聯(lián)用時(shí)，不能有效地分解細(xì)菌生物膜。10μg/mL氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過(guò)氧化氫聯(lián)用時(shí)，能部分地分解細(xì)菌生物膜。15μg/mL氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過(guò)氧化氫聯(lián)用時(shí)，能很大程度地分解細(xì)菌生物膜。20μg/mL氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過(guò)氧化氫聯(lián)用時(shí)，能有效地分解細(xì)菌生物膜。圖5C和5D是對(duì)應(yīng)24孔板中的殘存細(xì)菌生物膜照片，相對(duì)于空白組而言，5μg/mL氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過(guò)氧化氫聯(lián)合處理組中仍有大量殘留生物膜。10μg/mL氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過(guò)氧化氫聯(lián)合處理組中，孔底殘留的生物膜有所減少。而單獨(dú)10μg/mL的氧化銅-鉑納米復(fù)合體處理下，孔底部的細(xì)菌生物膜并沒(méi)有出現(xiàn)裂解，在孔底部依舊有大量細(xì)菌生物膜滋生。15μg/mL氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過(guò)氧化氫聯(lián)用處理組中，孔底殘留的生物膜有大量減少。然而，單獨(dú)15μg/mL氧化銅-鉑納米復(fù)合體作用時(shí)，其對(duì)細(xì)菌生物膜并沒(méi)有任何影響，孔底部依舊有大量生物膜。20μg/mL氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過(guò)氧化氫聯(lián)用的處理組中，孔底僅有少許殘留的細(xì)菌生物膜，因此其著色效果最差。由此可知，氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過(guò)氧化氫的聯(lián)用能夠有效地分解細(xì)菌生物膜，并且其分解效果要優(yōu)于單獨(dú)的氧化銅-鉑納米復(fù)合體或過(guò)氧化氫作用的效果。

實(shí)施例3

本實(shí)施例通過(guò)比較過(guò)氧化氫濃度對(duì)細(xì)菌存活率的影響，對(duì)過(guò)氧化氫的用量進(jìn)行優(yōu)化。

步驟：(1)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌，用0.01M的PBS洗滌，并調(diào)節(jié)其OD600＝0.1(10⁸CFU/mL)，分取20μL到1.5mL的離心管中。(2)向離心管中加入不同濃度的過(guò)氧化氫。使對(duì)于大腸桿菌過(guò)氧化氫終濃度分別為5μM、10μM、25μM、50μM、100μM，金黃色葡萄球菌過(guò)氧化氫終濃度分別為10μM、30μM、100μM、300μM、900μM。(3)將上述離心管放置于培養(yǎng)箱中，37℃、150rpm，作用12小時(shí)。(4)用酶標(biāo)儀測(cè)定吸收在600nm處的值。(6)計(jì)算細(xì)菌存活率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，細(xì)菌的存活率會(huì)隨著過(guò)氧化氫濃度的增加而下降。對(duì)于大腸桿菌，所選的過(guò)氧化氫濃度在50μM以下時(shí)，其對(duì)細(xì)菌的存活率影響較小，當(dāng)過(guò)氧化氫濃度使用量達(dá)到100μM以上時(shí)，細(xì)菌的存活率出現(xiàn)急劇下降。對(duì)于金黃色葡萄球菌而言，所選的過(guò)氧化氫濃度在300μM以下時(shí)，其對(duì)細(xì)菌的存活率影響較小，當(dāng)過(guò)氧化氫濃度使用量達(dá)到900μM以上時(shí)，細(xì)菌的存活率出現(xiàn)急劇下降。由于本抗菌體系中，是考慮到氧化銅-鉑納米復(fù)合體和過(guò)氧化氫的聯(lián)合抑菌效應(yīng)。故此，首選過(guò)氧化氫濃度的最佳選擇條件為在某一濃度下，其本身對(duì)細(xì)菌的存活率不會(huì)造成很大影響，同時(shí)又能保證其用量充分。

綜上所述，本發(fā)明針對(duì)大腸桿菌選擇50μM的過(guò)氧化氫，針對(duì)金黃色葡萄球菌選擇300μM的過(guò)氧化氫。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。