專利名稱：作為整聯(lián)蛋白拮抗劑的間－氮雜環(huán)氨基苯甲酸化合物及其衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用作αvβ3整聯(lián)蛋白拮抗劑的、用于藥物組合物中的及通過抑制或拮抗αvβ3整聯(lián)蛋白用于治療αvβ3介導(dǎo)的病癥的方法中的藥物制劑(化合物)。
背景技術(shù)：
整聯(lián)蛋白是介導(dǎo)細(xì)胞粘著的一組細(xì)胞表面的糖蛋白，并因此是多種生物過程中發(fā)生的細(xì)胞粘著作用的有用的介體。整聯(lián)蛋白是由非共價(jià)鍵連接的α和β多肽亞單位組成的雜二聚物。目前，已鑒定了11個(gè)不同的α亞單位和6個(gè)不同的β亞單位。不同的α亞單位可以與不同的β亞單位結(jié)合形成不同的整聯(lián)蛋白。
鑒定為αvβ3整聯(lián)蛋白(也稱為玻聯(lián)蛋白受體)已被確認(rèn)是在多種病癥或疾病中起一定作用的整聯(lián)蛋白，這些疾病包括腫瘤轉(zhuǎn)移、實(shí)體瘤生長(zhǎng)(瘤形成)、骨質(zhì)疏松、佩吉特氏病、噁性腫瘤的體液血鈣過多、血管生成(包括腫瘤血管生成)、視網(wǎng)膜病(包括黃斑變性)、關(guān)節(jié)炎(包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、牙周病、牛皮癬和平滑肌細(xì)胞遷移(例如再狹窄)。此外，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)這些制劑可以用作抗病毒劑、抗真菌劑和抗微生物劑。因此，選擇性抑制或拮抗αvβ3的化合物會(huì)對(duì)治療這些病癥有利。
現(xiàn)已表明αvβ3整聯(lián)蛋白及其它含αv的整聯(lián)蛋白與一些含Arg-Gly-Asp(RGD)的基質(zhì)大分子結(jié)合。含RGD序列的化合物模擬細(xì)胞外基質(zhì)配體以與細(xì)胞表面受體結(jié)合。但是，還已知RGD肽總的來說對(duì)RGD依賴整聯(lián)蛋白是非選擇性的。例如，大多數(shù)結(jié)合αvβ3的RGD肽也結(jié)合αvβ5、αvβl和αIIbβ3。已知對(duì)血小板αIIbβ3(也稱為纖維蛋白原受體)的拮抗作用阻斷人血小板凝集。當(dāng)治療與整聯(lián)蛋白αvβ3有關(guān)的病癥或疾病時(shí)，為了避免出血副作用，開發(fā)選擇性拮抗αvβ3而不拮抗αIIbβ3的化合物將是有利的。
通過以下3個(gè)步驟發(fā)生腫瘤細(xì)胞的侵染1)腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)連接；2)將該基質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)水解；及3)這些細(xì)胞移動(dòng)通過被溶解的屏障。此過程可以反復(fù)發(fā)生并導(dǎo)致由遠(yuǎn)處原發(fā)腫瘤位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移。
Seftor等(Proc．Natl．Acad．Sci．USA，Vol．89(1992)1557-1561)指出αvβ3整聯(lián)蛋白在黑素瘤細(xì)胞侵染中具有生物功能。Montgomery等(Proc．Natl．Acad．Sci．USA，Vol．91(1994)8856-60)指出在人黑素瘤細(xì)胞上表達(dá)的整聯(lián)蛋白αvβ3提高了存活信號(hào)，對(duì)細(xì)胞的編程性死亡有保護(hù)作用。通過αvβ3整聯(lián)蛋白細(xì)胞粘著受體介入調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移路徑來阻止腫瘤轉(zhuǎn)移將是有利的。
Brooks等(Cell，Vol．79(1994)1157-1164)指出αvβ3的拮抗劑為腫瘤腫瘤形成提供了治療手段(抑制實(shí)體瘤生長(zhǎng))，這是由于αvβ3拮抗劑的系統(tǒng)給藥引起了多種組織學(xué)不同的人腫瘤的急劇退化。
粘著受體整聯(lián)蛋白αvβ3被鑒定為小雞和人血管生成的標(biāo)記物，于是該受體在血管生成或新血管形成中起關(guān)鍵作用。血管生成的特征為平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞的侵染、遷移和增殖。αvβ3的拮抗劑通過選擇性提高新脈管系統(tǒng)中細(xì)胞的編程性死亡抑制此過程。新血管生長(zhǎng)或血管生成還是一些病癥的原因，如糖尿病視網(wǎng)膜病和黃斑變性視網(wǎng)膜病(Adonis等，Amer．J．Ophthal．Vol．118，(1994)445-450)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Peacock等，J．Exp．Med．，Vol．175，(1992)，1135-1138)。因此，αvβ3拮抗劑將是治療這些與新血管生成有關(guān)病癥的有利的治療目標(biāo)(Brooks等，Science，Vol．264，(1994)，569-571)。
已報(bào)道細(xì)胞表面受體αvβ3是連接骨的破骨細(xì)胞上的主要整聯(lián)蛋白。破骨細(xì)胞引起骨吸收，且當(dāng)此骨吸收活性超過骨形成活性時(shí)，其導(dǎo)致骨質(zhì)疏松(骨損失)，這會(huì)造成骨折次數(shù)、殘疾和死亡率的增高。已表明αvβ3拮抗劑是體外[Sato等，J．Cell．Biol．，Vol．111(1990)1713-1723]和體內(nèi)[Fisher等，Endocrinology，Vol．132(1993)1411-1413]骨破碎活性的強(qiáng)抑制劑。對(duì)αvβ3的拮抗作用導(dǎo)致骨吸收的降低，因此保持骨形成和骨吸收濃度飽和活性的正常平衡。因此，提供破骨細(xì)胞αvβ3的拮抗劑是有利的，該拮抗劑能有效地抑制骨吸收，因此可用于治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松。
在平滑肌細(xì)胞遷移中αvβ3整聯(lián)蛋白的作用也使其成為預(yù)防或抑制新內(nèi)膜增生的治療目標(biāo)，此增生在血管手術(shù)后導(dǎo)致再狹窄(Choi等，J．Vasc．Surg．Vol．19(1)(1994)125-34)。通過藥劑預(yù)防或抑制新內(nèi)膜增生來防止或抑制再狹窄將是有利的。
White(Current Biology，Vol．3(9)(1993)595-599)報(bào)告了腺病毒用αvβ3進(jìn)入宿主細(xì)胞。該病毒顆粒的胞吞似乎需要該整聯(lián)蛋白，該病毒染色體組透過進(jìn)入宿主細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中可能也需要該整聯(lián)蛋白。因此，抑制αvβ3的化合物將會(huì)用作抗病毒劑。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及如下通式的化合物及其藥用鹽 其中X和Y是相同或不同的鹵素基團(tuán)。
上述化合物可以存在多種異構(gòu)體形式，且本發(fā)明包括所有的這些異構(gòu)體形式。還包括互變異構(gòu)體以及這些異構(gòu)體和互變異構(gòu)體的藥用鹽。
更具體地講，本發(fā)明涉及如下化合物或其藥用鹽 其中R是H或烷基。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含上述化合物的藥物組合物。這些化合物和組合物用于選擇性抑制或拮抗整聯(lián)蛋白，因此在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中涉及選擇性抑制或拮抗αvβ3整聯(lián)蛋白的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及治療或抑制需要治療的哺乳動(dòng)物的與如下疾病有關(guān)的病癥骨質(zhì)疏松、噁性腫瘤的體液血鈣過多、佩吉特氏病、腫瘤轉(zhuǎn)移、實(shí)體瘤生長(zhǎng)(腫瘤形成)、血管生成(包括腫瘤血管生成)、視網(wǎng)膜病(包括糖尿病視網(wǎng)膜病和黃斑變性)、關(guān)節(jié)炎(包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、牙周病、牛皮癬和平滑肌細(xì)胞遷移和再狹窄。此外，這些藥物制劑可以用作抗病毒劑和抗微生物劑。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及上述式I-XVI表示的一類化合物。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案是下式的化合物 本發(fā)明還涉及含治療有效量的上述化合物的藥物組合物。
本發(fā)明還涉及選擇性抑制或拮抗αvβ3整聯(lián)蛋白的方法，更具體地講，涉及抑制骨吸收、牙周疾病、骨質(zhì)疏松、噁性腫瘤的體液血鈣過多、佩吉特氏病、腫瘤轉(zhuǎn)移、實(shí)體瘤生長(zhǎng)(腫瘤形成)、血管生成(包括腫瘤血管生成)、視網(wǎng)膜病(包括糖尿病視網(wǎng)膜病和黃斑變性)、關(guān)節(jié)炎(包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、平滑肌細(xì)胞遷移和再狹窄的方法，該方法使用治療有效量的能達(dá)到這種抑制的上述化合物和藥用載體。
下面給出了本文中使用的多種術(shù)語的定義在本文中，術(shù)語“烷基”或“低級(jí)烷基”指含約1至約10個(gè)碳原子的，更優(yōu)選1至約6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烴基。這些烷基的實(shí)例為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、異己基等。
在本文中，術(shù)語“鹵素”或“鹵原子”指溴、氯或碘。
在本文中，術(shù)語“鹵代烷基”指在一個(gè)或多個(gè)碳原子上取代有一個(gè)或多個(gè)相同或不同的鹵素基團(tuán)的上述烷基。鹵代烷基的實(shí)例包括三氟甲基、二氯乙基、氟丙基等。
術(shù)語“組合物”在本文中指通過將一種以上物質(zhì)或組份混和而成的產(chǎn)品。
術(shù)語“藥用載體”在本文中指藥學(xué)上可接受的物質(zhì)、組合物或載體，如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包囊物質(zhì)，它們攜帶或轉(zhuǎn)運(yùn)某種化學(xué)試劑。
術(shù)語“治療有效量”指引起研究者或醫(yī)生所針對(duì)的組織、系統(tǒng)或動(dòng)物的生物或醫(yī)藥反應(yīng)的藥物或藥劑的量。
以下為縮略語及可在本文中交互使用的相應(yīng)含義1H-NMR= 質(zhì)子核磁共振AcOH= 乙酸Ar= 氬氣CH3CN=乙腈
CHN分析=碳／氫／氮元素分析CHNCl分析= 碳／氫／氮／氯元素分析CHNS分析= 碳／氫／氮／硫元素分析DI水=去離子水DMA=N，N-二甲基乙酰胺DMAP= 4-(N，N-二甲基氨基)吡啶DMF=N，N-二甲基甲酰胺EDCl= 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽EtOAc= 乙酸乙酯EtOH= 乙醇FAB MS= 快原子轟擊質(zhì)譜g= 克HOBT= 1-羥基苯并三唑水合物HPLC= 高效液體色譜IBCF= 氯甲酸異丁基酯KSCN= 硫氰酸鉀L= 升LiOH= 氫氧化鋰MEM=甲氧基乙氧基甲基MEMCl= 甲氧基乙氧基甲基氯化物MeOH= 甲醇mg= 毫克MgSO4= 硫酸鎂ml= 毫升mL= 毫升MS= 質(zhì)譜MTBE= 甲基叔丁基醚N2=氮?dú)釴aHCO3=碳酸氫鈉NaOH= 氫氧化鈉Na2SO4= 硫酸鈉
MMM= N-甲基嗎啉NMP= N-甲基吡咯烷酮NMR= 核磁共振P2O5= 五氧化磷PTSA= 對(duì)甲苯磺酸RPHPLC=反向高效液相色譜RT= 室溫TFA= 三氟乙酸THF= 四氫呋喃TMS= 三甲基甲硅烷基Δ= 加熱反應(yīng)混和物上述化合物可以存在多種異構(gòu)形式，本發(fā)明包括所有這些異構(gòu)形式。還包括互變異構(gòu)形式及這些異構(gòu)體和互變異構(gòu)體的藥用鹽。
在本文的結(jié)構(gòu)式和通式中，穿過環(huán)鍵畫出的鍵可以是存在于環(huán)上的任何原子。
術(shù)語“藥用鹽”指上述化合物與其陰離子一般適于人使用的酸接觸制備的鹽。藥用鹽的實(shí)例包括鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、蘋果酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽等。所有的這些藥用鹽可以通過常規(guī)方法制備(其它藥用鹽的實(shí)例見Berge等，J．Pharm．Sci．，66(1)，1-19(1977)。
為了選擇性抑制或拮抗αvβ3整聯(lián)蛋白，本發(fā)明的化合物可以以單位劑型的形式口服、非腸道或通過吸入噴霧或者局部給藥，該單位劑型中含有常規(guī)藥用載體、輔劑和賦形劑。術(shù)語非腸道在本文中包括，例如，皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、胸骨內(nèi)、輸液技術(shù)或腹膜內(nèi)給藥。
本發(fā)明的化合物可以通過任何適宜的途徑，以適于這些途徑的藥物組合物的形式并以治療要求的有效劑量給藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員用類似于醫(yī)藥領(lǐng)域的預(yù)臨床和臨床試驗(yàn)?zāi)苋菀椎卮_定預(yù)防或阻斷病癥的噁化或治療該病癥需要的化合物的有效量。
此外，本發(fā)明提供了通過選擇性抑制或拮抗αvβ3細(xì)胞表面受體治療其所介導(dǎo)的病癥的方法，該方法包括使用治療有效量的、選自上述類型化合物的化合物，其中一種或多種化合物與一種或多種無毒、藥用載體和／或稀釋劑和／或輔劑(在本文中統(tǒng)稱為“載體”物質(zhì))及需要的其它活性組份結(jié)合給藥。更具體地講，本發(fā)明提供了抑制αvβ3細(xì)胞表面受體的方法。本發(fā)明最優(yōu)選的方案提供了抑制骨吸收、治療骨質(zhì)疏松、抑制噁性腫瘤體液血鈣過多、治療佩吉特氏病、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤形成(實(shí)體瘤生長(zhǎng))、抑制血管生成(包括腫瘤血管生成)、治療糖尿病視網(wǎng)膜病和黃斑變性、抑制關(guān)節(jié)炎、牛皮癬和牙周病，及抑制平滑肌細(xì)胞遷移包括再狹窄的方法。
根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，并與已應(yīng)用的化合物比較，上述化合物可以用于治療上述病癥的患者。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到選擇本發(fā)明最適當(dāng)?shù)幕衔锸潜绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員力所能及的，且這種選擇依賴于多種因素，包括對(duì)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果的評(píng)價(jià)和動(dòng)物模型。
對(duì)這些病癥之一的患者進(jìn)行治療，包括給此患者使用一定量的上述化合物，該用量在控制病癥或延長(zhǎng)該患者的存活時(shí)間方面是有效的，這方面超過了不進(jìn)行此治療的預(yù)期結(jié)果。在本文中，使用“抑制”病癥指減緩、干擾、阻止或停止此病癥，而不一定指根除該病癥。據(jù)信延長(zhǎng)患者的存活時(shí)間，除其本身具有的顯著有利作用外，也指示了該病癥被有利地控制到了某種程度。
如上所述，本發(fā)明的化合物可以用于多種生物、預(yù)防或治療領(lǐng)域?？梢哉J(rèn)為這些化合物可用于預(yù)防或治療其中αvβ3整聯(lián)蛋白起一定作用的任何疾病或病癥。
這些化合物和／或含這些化合物的組合物的給藥方案基于多種因素，包括患者的類型、年齡、體重、性別和醫(yī)療情況；該病癥的嚴(yán)重性；給藥途徑；及所用特定化合物的活性。因此，劑量方案可以作很大變化。劑量水平為約0．01mg至約1000mg每千克體重每天對(duì)治療上述病癥是有利的，并更優(yōu)選約0．01mg至約100mg每千克體重每天。
通過注射給藥的活性組份被配制為組合物，其中，例如，可以用鹽水、葡萄糖或水作為適宜的載體。適宜的每日劑量一般為約0．01至10mg／kg體重每天，根據(jù)上述因素，注射以多次劑量的形式進(jìn)行。
為了給需要此治療的哺乳動(dòng)物用藥，治療有效量的這些化合物通常與一種或多種適于該給藥途徑的輔劑結(jié)合。這些化合物可以與如下物質(zhì)混和乳糖、蔗糖、淀粉、烷酸的纖維素酯、纖維素烷基醚、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、氧化鎂、磷酸和硫酸的鈉和鈣鹽、明膠、阿拉伯膠、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮和／或聚乙烯醇，并制成片劑或膠囊以便于給藥?；蛘?，這些化合物可以溶解于水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、芐醇、氯化鈉和／或多種緩沖劑中。其它輔劑和給藥方式是藥學(xué)領(lǐng)域熟知的。
用于本發(fā)明的藥物組合物可以進(jìn)行常規(guī)藥學(xué)處理如滅菌和／或可以含有常規(guī)藥物輔劑如防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑、緩沖劑等。
制備本發(fā)明化合物的總體合成順序見方案I-III。其中對(duì)本發(fā)明的各個(gè)方面的解釋及確切方法進(jìn)行了適當(dāng)描述。下列方案和實(shí)施例只是用來舉例說明本發(fā)明，而不是限制其范圍或?qū)嵸|(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易地理解這些方案和實(shí)施例中描述的條件和方法的已知變化形式，可以用來合成本發(fā)明的化合物。
除非另外說明，所用所有的起始物和儀器是商購的。
方案I 方案I說明了用于制備本發(fā)明的四氫嘧啶并苯甲酸部分的方法，該部分可以與Gly-β-氨基酸酯偶聯(lián)。簡(jiǎn)言之，在方案I中，用Austr．J．Chem．，34(6)，1319-24(1981)所述方法將二羥基苯甲酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-氨基-5-羥基-苯甲酸。將該產(chǎn)物與硫氰酸銨在熱的稀鹽酸中反應(yīng)，正常處理后達(dá)到3-硫脲基-5-羥基苯甲酸。將此硫脲中間體通過用碘代甲烷在乙醇中回流反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)镾-甲基衍生物。1，3-二氨基-2-羥基丙烷與所得此中間體在熱DMA中反應(yīng)。冷卻，形成沉淀并過濾分離此兩性離子產(chǎn)物。通過從稀鹽酸中凍干可以得到鹽酸鹽?；蛘?，通過除去揮發(fā)物并濃縮可以從原反應(yīng)混和物中分離出該產(chǎn)物。將所得產(chǎn)物溶解在水中并將pH調(diào)節(jié)至約5-7，此時(shí)沉淀出兩性離子產(chǎn)物，將其過濾分離。如上所述可以獲得鹽酸鹽，或簡(jiǎn)單地溶解于稀鹽酸中并濃縮得到固體，并將其干燥。
方案IA 方案IA說明了用于制備本發(fā)明的四氫嘧啶并苯甲酸部分的方法，該部分可以與Gly-β-氨基酸酯偶聯(lián)。簡(jiǎn)言之，在方案IA中，1，3-二氨基-2-羥基丙烷與二硫化碳在適當(dāng)?shù)娜軇┤缫掖?水中反應(yīng)，回流，冷卻，進(jìn)入鹽酸，再回流，冷卻并通過過濾收集產(chǎn)物5-羥基四氫嘧啶-2-硫酮并干燥。通過將硫酮和碘代甲烷在乙醇中回流反應(yīng)將此環(huán)狀硫脲中間體轉(zhuǎn)變?yōu)镾-甲基衍生物。通過減壓除去揮發(fā)物可容易地分離出所需的2-甲硫基醚-5-羥基嘧啶鹽酸鹽。于是，將存在于二氯甲烷∶DMA(約10∶1)的2-甲硫基醚-5-羥基嘧啶鹽酸鹽和一當(dāng)量的三乙胺冷卻至約冰浴溫度，并加入一當(dāng)量的二叔丁基二碳酸酯(BOC酸酐)。常規(guī)處理得到BOC-2-甲硫基醚-5-羥基嘧啶，為油狀物。
用Aust．J．Chem．，34(6)，1319-24(1981)的方法將3，5-二羥基苯甲酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-氨基-5-羥基-苯甲酸。
通過BOC-2-甲硫基醚-5-羥基嘧啶和3-氨基-5-羥基-苯甲酸在熱DMA中反應(yīng)，制備所需的終產(chǎn)物，3-羥基-5-[(5-羥基-1，4，5，6-四氫-2-嘧啶基)氨基]苯甲酸鹽酸鹽。通過冷卻，形成沉淀并過濾分離出兩性離子產(chǎn)物。例如，通過從稀氫氯酸中凍干可以獲得鹽酸鹽。
方案II
方案II說明了用于制備本發(fā)明的N-甘氨酸基-氨基-3-(3，5-二鹵代-2-羥基)苯基丙酸乙酯部分的方法，該部分可以與四氫嘧啶并苯甲酸部分偶聯(lián)。簡(jiǎn)言之，通過直接鹵化反應(yīng)可以制備3，5-鹵代水楊醛，例如，將5-溴代水楊醛在乙酸中漿化并向其中加入一當(dāng)量或一當(dāng)量以上的氯，得到3-氯-5-溴-2-羥基苯甲醛。一些產(chǎn)物沉淀并可通過過濾回收。通過用水稀釋濾液并分離沉淀可以回收其余的產(chǎn)物。將此固體合并并干燥得到3-氯-5-溴-2-羥基苯甲醛。通過5-氯代水楊醛與N-碘代琥珀酰亞胺在DMF中反應(yīng)并將此反應(yīng)混和物進(jìn)行常規(guī)處理可以制備3-碘代-5-氯水楊醛。通過存在于乙腈中的5-溴水楊醛與碘化鉀和氯胺T反應(yīng)可以制備5-溴水楊醛，經(jīng)處理得到一種物質(zhì)，當(dāng)該物質(zhì)用己烷處理時(shí)，得到所需的3-溴-5-氯水楊醛。
用改進(jìn)的Perkin反應(yīng)由水楊醛可以容易地制備香豆素(例如，Vogel＇s Textbook of Practical Organic Chemistry，第5版，1989，1040頁)。將此鹵代香豆素轉(zhuǎn)變?yōu)?-氨基氫化香豆素(見J．G．Rico，Tett．Let．，1994，35，6599-6602)，在酸性醇中其會(huì)容易地開環(huán)，得到3-氨基-3-(3，5-鹵代-2-羥基)苯基丙酸酯。
將3-氨基-3-(3，5-鹵代-2-羥基)苯基丙酸酯轉(zhuǎn)變?yōu)镹-甘氨酸基-3-氨基-3-(3，5-鹵代-2-羥基)苯基丙酸酯，即通過與Boc-N-甘氨酸基-N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)得到Boc-N-甘氨酸基-3-氨基-3-(3，5-鹵代-2-羥基)苯基丙酸酯，將其轉(zhuǎn)變?yōu)镹-甘氨酸基-3-氨基-3-(3，5-鹵代-2-羥基)苯基丙酸酯的HX鹽(其中X是鹵素基團(tuán))，例如，通過在乙醇中用HCl除去BOC保護(hù)基。
用于制備本發(fā)明化合物的氨基酸化合物可以按照本文中已給出及以下的方法以及在共同未決USSN Attorney Docket 3076中描述和要求保護(hù)的方法制備，該申請(qǐng)與本申請(qǐng)同時(shí)申請(qǐng)并將其引入本文作為參考。
方案III 方案III說明了用于制備本發(fā)明的各種化合物的方法。用已知的方法將3-羥基-5-[(1，4，5，6-四氫-5-羥基-2-嘧啶基)氨基]苯甲酸活化偶聯(lián)。接著，溶解于適宜的溶劑如DMA后，加入一當(dāng)量的NMM。將此反應(yīng)混和物冷卻至冰浴溫度并加入IBCF。向混和酸酐中間體中加入甘氨酸基-β-氨基酸酯和NMM。該反應(yīng)完畢后，通過制備HPLC純化此產(chǎn)物，并通過用堿如氫氧化鋰在適當(dāng)?shù)娜軇?二噁烷／水或乙腈／水)中處理將此酯水解為酸?；蛘撸梢允褂眠m宜的酸如TFA。通過制備HPLC或通過在pH 5-7分離此兩性離子來分離產(chǎn)物，并通過標(biāo)準(zhǔn)方法將其轉(zhuǎn)變?yōu)樗璧柠}。
實(shí)施例A制備下式的化合物 步驟1制備下式的化合物 向備有機(jī)械攪拌器和冷凝器的2L圓底燒瓶中加入3，5-二氯水楊醛(200g，1．05mol，1當(dāng)量)、乙酸酐(356g，3．49mol)和三乙胺(95．0g，0．94mol，0．90當(dāng)量)。將反應(yīng)溶液在回流下加熱過夜。再將深褐色的反應(yīng)混合物冷卻至50℃，攪拌下加入水(1L)。1小時(shí)后，將混合物過濾，濾液與乙醇(1L)合并。將混合物在45℃下加熱1小時(shí)，冷卻至室溫，過濾，固體(餾分A)用乙醇(0．5L)洗滌。將合并后的乙醇溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮得到一種油(餾分B)。將來自餾分A的固體溶解于二氯甲烷(1．5L)中，將形成的溶液通過硅膠墊(1300mL體積)。將形成的深褐色溶液濃縮至油狀，將其用己烷(1．3L)研制，得到一種固體，將其通過過濾和洗滌(己烷)分離后得到一種基本上純的6，8-二氯香豆素(163g)。以類似的方式處理餾分B的油獲得另一份產(chǎn)物31g；將油溶于二氯甲烷(0．5L)中并通過硅膠墊(0．5L體積)，用己烷研制。總的分離收率為194g或86％收率的褐色固體。
MS和NMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟2制備下式的化合物 向備有機(jī)械攪拌器的3頸2L圓底燒瓶中加入6，8-二氯香豆素(160g，0．74mol)(步驟1制備)和無水THF(375mL，Aldrich Sure Seal)。將形成的混合物冷卻至低于-40℃(干冰／丙酮浴)，在保持溫度-40℃下加入雙(三甲基甲硅烷基)氨基鋰(0．80mol，800mL，1M的THF溶液)。加完后，將冷卻浴撤去。0．5小時(shí)后，混合物升溫至-5℃。加入氯化氫(0．5L，4M的二噁烷溶液)在乙醇(1．25L)中的溶液使反應(yīng)停止。將溫度保持在低于0℃下過夜。將反應(yīng)混合物濃縮至其原始體積的大約一半，并使其在乙酸乙酯(3L)和水(2L)間分配。有機(jī)層用氯化氫水溶液(3×1L，0．5NHCl)洗滌。合并后的水層的pH值通過加入10％氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)至約7，用二氯甲烷萃取(3×2L)。合并后的有機(jī)層用硫酸鎂干燥，過濾，在攪拌下加入4M氯化氫的二噁烷(210mL)溶液。在沉淀完成后，過濾0 除去固體。將濾液濃縮至很小的體積并加入甲基叔丁基醚。將獲得的固體與開始形成的固體合并，合并后的產(chǎn)物用甲基叔丁基醚洗滌，過濾分離，干燥(過周末真空爐干燥)，獲得所需產(chǎn)物(172g，收率74％)。
MS和NMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟3制備下式的化合物
在惰性氣氛(Ar)下，向備有磁性攪拌棒的火焰干燥的圓底燒瓶(0．5L)中加入N-t-Boc-甘氨酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(Sigma，15．0g，0．055mol)、無水DMF(Aldrich Sure Seal，200mL)和來自步驟2的產(chǎn)物(21．67g，0．055mol)。將反應(yīng)混合物冷卻至大約0℃(鹽冰浴)，加入N-甲基嗎啉(5．58g，0．056mol)和催化量的DMAP，使反應(yīng)過夜進(jìn)行。將反應(yīng)混合物濃縮成泥漿狀，使其在乙酸乙酯(0．4L)和堿水(2×0．2L，飽和碳酸氫鈉水溶液)間分配。有機(jī)層依次用檸檬酸水溶液(2×0．2L，10w／v)、碳酸氫鈉水溶液(2×0．2L)及鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥。在55℃下真空除去揮發(fā)性物質(zhì)，得到一種油(22．5g，收率92％)，其放置后會(huì)固化。
MS和NMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟4制備下式的化合物 采用下述過程使步驟3獲得的產(chǎn)物脫保護(hù)得到胺的鹽酸鹽。在備有攪拌棒的火焰干燥的圓底燒瓶(0．1L)中，向步驟3的產(chǎn)物(14．0g，0．032mol)中加入無水二噁烷(40mL)。于0℃下向其中加入4．0N氯化氫的二噁烷溶液(2當(dāng)量，6．32mL)，使反應(yīng)進(jìn)行直至氣體釋放停止，反應(yīng)完成。真空除去揮發(fā)性物質(zhì)，將殘余物用乙醚(50mL)研制。過濾收集固體，用乙醚洗滌，干燥，得到所需的產(chǎn)物(12．5g)。
MS和NMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
實(shí)施例B制備下式的化合物 步驟1制備下式的化合物 向3-溴-5-氯水楊醛(175．0g，743．2mmol)在乙酸酐(280．5mL，3．0mol)中的懸浮液中加入三乙胺(103．6mL，743．2mmol)。將反應(yīng)溶液在回流下加熱4．5小時(shí)。將溶液冷卻，真空濃縮。向褐色殘余物中加入無水乙醇(730mL)。將混合物在0℃下貯藏14小時(shí)。過濾收集褐色固體，用冷乙醇洗滌。真空干燥固體得到所需產(chǎn)物(123．0g，收率64％)。1H NMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟2制備下式的化合物
在-76℃下，向香豆素(40．0g，154．1mmol)在THF(400mL)的懸浮液中邊攪拌邊滴入雙(三甲基甲硅烷基)氨基鋰(154．1mL，1M的THF溶液)。滴加過程在10分鐘內(nèi)完成。然后，將反應(yīng)混合物攪拌5分鐘，升溫至-20℃，再攪拌15分鐘。在5分鐘內(nèi)，向該溶液中加入于THF(28mL)中的乙酸(9．25g，154．1mmol)。將混合物升溫至室溫，真空除去揮發(fā)性物質(zhì)。將殘余物溶解于乙醚(850mL)中，用飽和碳酸氫鈉水溶液(2×100mL)和鹽水(2×40mL)洗滌，用硫酸鎂干燥。將醚溶液濃縮至約160mL，冷卻至0℃。向該懸浮液中加入4M氯化氫的二噁烷(56．3mL，225mmol)溶液，將混合物在0℃下攪拌30分鐘。對(duì)懸浮液過濾，濾餅用乙醚洗滌。真空下干燥固化，得到所需產(chǎn)物，為鹽酸鹽，二噁烷的溶劑化物(45．0g)。1H NMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟3制備下式的化合物 在10分鐘內(nèi)，向無水乙醇(533mL)中的內(nèi)酯(142．2g，354．5mmol)的懸浮液中加入4M氯化氫的二噁烷溶液(157．8mL，631．1mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2．5小時(shí)。真空除去揮發(fā)性物質(zhì)。將殘余物溶于乙酸乙酯(450mL)中，將溶液在0℃下保持15小時(shí)。過濾收集黃褐色沉淀物，用冷乙酸乙酯洗滌。將固體在真空中干燥，得到所需產(chǎn)物，為鹽酸鹽(100．4g，收率79％)。1H NMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟4制備下式的化合物
在惰性氣氛(Ar)下，向備有磁性攪拌棒的火焰干燥的圓底燒瓶(0．1L)中加入N-t-Boc-甘氨酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(Sigma，2．72g，0．010mol)、無水THF(Aldrich Sure Seal，50mL)和來自步驟3的產(chǎn)物(3．10g，0．01mol，在P2O5上真空干燥)。將反應(yīng)混合物冷卻至大約0℃(鹽冰浴)，加入三乙胺(1．01g，0．010mol)，使反應(yīng)過夜進(jìn)行。將反應(yīng)混合物濃縮成半固體，以與實(shí)例A步驟3類似的方式進(jìn)行處理。在55℃下從有機(jī)層中真空除去揮發(fā)性物質(zhì)，得到一種油(4g，收率83％)，其放置后會(huì)固化。
MS和NMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟5制備下式的化合物 采用下述過程使步驟4獲得的產(chǎn)物脫保護(hù)得到胺的鹽酸鹽。在備有攪拌棒的火焰干燥的圓底燒瓶(0．1L)中，向步驟4的產(chǎn)物(4．0g，0．0084mol)中加入無水二噁烷(20mL)。再加入4．0N氯化氫的二噁烷(20mL)溶液，使反應(yīng)進(jìn)行直至氣體釋放停止，反應(yīng)完成(約1小時(shí))。真空除去揮發(fā)性物質(zhì)，將殘余物用乙醚(50mL)研制。過濾收集固體，用乙醚洗滌，干燥，得到淺褐色固體(2．7g，收率78％)。
MS和NMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
實(shí)施例C制備下式的化合物
步驟1制備下式的化合物 向3，5-二溴水楊醛(100g，357mmol)在乙酸酐(164．8mL，1．8mol)中的懸浮液中加入三乙胺(45mL，375mmol)。將反應(yīng)溶液在氬氣氛下回流加熱過夜。將溶液冷卻至室溫，形成固體。深褐色的反應(yīng)混合物用熱己烷(3×300mL)和飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌。將形成的固體溶解于乙酸乙酯(2L)中，用水洗滌。有機(jī)層用硫酸鈉干燥，濃縮，過濾收集褐色固體。將固體進(jìn)行真空干燥，得到基本上純的6，8-二溴香豆素(94．2g，收率87％)。MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟2制備下式的化合物 在-78℃下，向在THF(100mL)中的6，8-二溴香豆素(20．0g，0．066mol)(步驟1制備)中邊攪拌邊滴入雙(三甲基甲硅烷基)氨基鋰(66mL，1M的THF溶液)。滴加過程在10分鐘內(nèi)完成。然后，將反應(yīng)混合物攪拌5分鐘，升溫至0℃，再攪拌15分鐘。在1分鐘內(nèi)，向該溶液中加入乙酸(3．95g)。將混合物升溫至室溫，真空除去揮發(fā)性物質(zhì)。將殘余物溶解于己烷(500mL)中，用飽和碳酸氫鈉水溶液(2×100mL)洗滌，用硫酸鈉干燥。將有機(jī)溶液濃縮得到一種油，將其立即溶解于乙醚(400mL)中，在0℃下用30分鐘邊攪拌邊加入4M氯化氫的二噁烷(30mL)溶液。真空除去過量的氯化氫，對(duì)懸浮液過濾，濾餅用乙醚洗滌。真空下干燥固化，得到所需產(chǎn)物，為鹽酸鹽，二噁烷的溶劑化物(19．9g)。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟3制備下式的化合物 在1分鐘內(nèi)，將步驟2制備的內(nèi)酯(15g)溶解于無水乙醇(400mL)中，使無水氯化氫氣體通過1分鐘。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2．5小時(shí)。RPHPLC顯示反應(yīng)完成。真空除去揮發(fā)性物質(zhì)得到一種黑色的殘余物。將殘余物用乙醚(500mL)研制，將混合物攪拌過夜。過濾收集黃褐色的沉淀物，用乙醚洗滌。將固體在真空中干燥，得到所需產(chǎn)物，為鹽酸鹽(15．2g)。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟4制備下式的化合物 在惰性氣氛(Ar)下，向備有磁性攪拌棒的火焰干燥的圓底燒瓶(0．2L)中加入N-t-Boc-甘氨酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(Sigma，8．1g，0．030mol)、無水DMF(Aldrich Sure Seal，50mL)和來自步驟3的產(chǎn)物(12g，0．03mol，在P2O5上真空干燥)。將反應(yīng)混合物冷卻至大約0℃(鹽冰浴)，加入N-甲基嗎啉(3．03g，0．030mol)和催化量的DMAP，使反應(yīng)升溫至室溫過夜進(jìn)行。將反應(yīng)混合物濃縮成半固體，以與實(shí)例A步驟3類似的方式進(jìn)行處理。在55℃下從有機(jī)層中真空除去揮發(fā)性物質(zhì)，得到一種油(15．7g，收率93％)，其放置后會(huì)固化。
MS和NMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟5制備下式的化合物 采用下述過程使步驟4獲得的產(chǎn)物脫保護(hù)得到胺的鹽酸鹽。在備有攪拌棒的火焰干燥的圓底燒瓶(0．1L)中，向步驟4的產(chǎn)物(13．0g，0．0084mol)中加入無水二噁烷(40mL)。再加入4．0N氯化氫的二噁烷(30mL)溶液，使反應(yīng)進(jìn)行直至氣體釋放停止，反應(yīng)完成(約1小時(shí))。真空除去揮發(fā)性物質(zhì)，將殘余物用乙醚(50mL)研制。過濾收集固體，用乙醚洗滌，干燥，得到固體(10．6g，收率93％)。
MS和NMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
實(shí)施例D制備下式的化合物 步驟1制備3-氯-5-溴水楊醛
在室溫下，向備有機(jī)械攪拌器和氣體加料管的5L圓底燒瓶中加入5-溴水楊醛(495g，2．46mol)和乙酸以形成一種漿液。向該混合物中以中等速度通入氯氣，直至略微摩爾過量的氯(1 83g，1．05mol)溶解。在加完后，使反應(yīng)過夜進(jìn)行。過濾收集形成的固體，將濾液在水(2．5L)中稀釋。將混合物劇烈攪拌20分鐘，過濾收集產(chǎn)物，用水洗滌。將合并后的固體進(jìn)行真空干燥，得到所需的3-氯-5-溴水楊醛(475g，收率82％)。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟2制備6-溴-8-氯香豆素 向備有機(jī)械攪拌器和冷凝器的5L圓底燒瓶中加入3-氯-5-溴水楊醛(554．1g，2．35mol，1當(dāng)量)、乙酸酐(1203g，11．8mol，5當(dāng)量)和三乙胺(237．4g，2．35mol，1當(dāng)量)。將反應(yīng)溶液回流(131-141℃)加熱過夜。將深褐色反應(yīng)混合物冷卻至50℃，攪拌下加入冰(2L)(冰浴冷卻)。1小時(shí)后，將混合物過濾，使濾液與乙醇(1L)合并。向此混合物中加入乙醇(300mL)，將反應(yīng)混合物攪拌1小時(shí)。過濾收集形成的沉淀物，用水乙醇(3×1．3L)洗滌，真空干燥，再用流化床干燥器干燥?？偡蛛x率為563g，或92％。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟3制備3-氨基-3-(2-羥基-3-氯-5-溴)苯基丙酸乙酯
向備有機(jī)械攪拌器的三頸5L圓底燒瓶中加入6-溴-8-氯香豆素(300g，1．16mol)(步驟2制備)和無水THF(900mL，Aldrich Sure Seal)。將形成的混合物冷卻至低于-45℃(干冰／丙酮浴)，加入雙(三甲基甲硅烷基)氨基鋰(0．80mol，800mL的1M的THF溶液和0．6L的己烷溶液，1．2當(dāng)量)，同時(shí)在低于-45℃下保持0．5小時(shí)。在另一個(gè)5L的燒瓶中于-15℃下將乙醇(2．5L)和氯化氫(4N氯化氫的二噁烷溶液，1L)合并。通過加入冷卻下的氯化氫／乙醇溶液使香豆素反應(yīng)停止。在0．5小時(shí)后，將形成的反應(yīng)混合物溫度升至-8．3℃。將反應(yīng)混合物在0℃下過夜，濃縮至約2．5L，在乙酸乙酯(3L)與水(4L)間進(jìn)行分配。有機(jī)層用氯化氫水溶液(4×1．2L，0．5N氯化氫)洗滌。合并后水層的pH值通過加入10％氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)至約8，再用二氯甲烷進(jìn)行萃取(1×7L和3×2L)。將合并后的有機(jī)層干燥(硫酸鎂，900g)，過濾，攪拌下加入4M氯化氫的二噁烷溶液(400mL)。在沉淀完成后，過濾收集固體。將混合物濃縮至2．5L，加入己烷(2．5L)，過濾分離沉淀物。將濾餅用二氯甲烷／己烷(1∶2)洗滌，抽濾干燥，在40℃的真空爐中干燥，獲得所需產(chǎn)物(251g，收率60％)。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟5制備下式的化合物 采用與實(shí)施例B步驟4基本相同的過程及對(duì)各異構(gòu)體具體的相對(duì)用量制備上述化合物。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟6制備下式的化合物 采用與實(shí)施例B步驟4基本相同的過程及對(duì)各異構(gòu)體具體的相對(duì)用量制備上述化合物。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
實(shí)施例E制備下式的化合物 步驟1制備3-碘-5-氯水楊醛 將N-碘琥珀酰亞胺(144．0g，0．641mol)加至5-氯水楊醛(100g，0．638mol)的二甲基甲酰胺(400mL)溶液中。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2天。再加入N-碘琥珀酰亞胺(20．0g)，繼續(xù)攪拌2天。將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯稀釋(1L)，用鹽酸(300mL，0．1N)、水(300mL)、硫代硫酸鈉(5％，300mL)和鹽水(300mL)洗滌，用硫酸鎂干燥，濃縮至干，得到所需的醛(162g，收率90％)為淡黃色固體。
MS和NMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟2制備6-氯-8-碘香豆素 將3-碘-5-氯水楊醛(100g，0．354mol)、乙酸酐(300mL)和三乙胺(54mL)的混合物在回流下加熱18小時(shí)。在冷卻后，所需的香豆素以深褐色結(jié)晶物沉淀出來。將其過濾，用己烷／乙酸乙酯(4∶1，200mL)洗滌，空氣干燥。收率60g(55％)。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟3制備(R，S)-4-氨基-3，4-二氫-6-氯-8-碘香豆素鹽酸鹽 在-78℃下，將六甲基二甲硅氮烷化鋰(21．62mL，1 M，21．62mmol)加至6-氯-8-碘香豆素(6．63g，21．62mmol)的四氫呋喃(100mL)溶液中。將反應(yīng)混合物在該溫度下攪拌30分鐘，然后在0℃下攪拌1小時(shí)。向反應(yīng)混合物中倒入乙酸乙酯(300mL)和飽和碳酸鈉(200mL)溶液中。分離出有機(jī)層，用鹽水(200mL)洗滌，用硫酸鎂干燥，濃縮，得到一種殘余物。將此殘余物加至無水乙醚(200mL)中，再在0℃下加入二噁烷／HCl(4N，30mL)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1小時(shí)，過濾，真空干燥，得到所需粉末狀產(chǎn)物(4．6g，收率59％)。(RPHPLCRf 6．8分鐘；梯度10％乙腈-90％乙腈15分鐘，然后100％乙腈6分鐘。水和乙腈均包含0．1％TFA。Vydac C18蛋白肽柱，2mL／分鐘流速，在254nm下檢測(cè))。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟4制備(R，S)-3-氨基-3-(5-氯-2-羥基-3-碘)苯基丙酸乙酯鹽酸鹽 將氯化氫氣體鼓泡通入4-氨基-3，4-二氫-6-氯-8-碘香豆素鹽酸鹽(22．0g，61．09mmol)的乙醇(250mL)溶液中，保持反應(yīng)混合物在0-10℃直接飽和。在回流6小時(shí)后，通過蒸餾除去大多數(shù)溶劑。將冷卻后的殘余物加至無水乙醚中，并攪拌2小時(shí)。開始的的膠狀物轉(zhuǎn)化成結(jié)晶物質(zhì)。將結(jié)晶產(chǎn)物過濾，干燥，得到所需產(chǎn)物(20g，收率81％)，為一種灰白色結(jié)晶粉末。(Rf7．52分鐘，條件同步驟3)。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟5制備(R，S)-3-(N-BOC-gly)-氨基-3-(5-氯-2-羥基-3-碘)苯基丙酸乙酯 將BOC-gly(2．16g，12．31mmol)、HOBT(1．67g，12．31mmol)、EDCI(2．36g，12．31mmol)和DMF(50mL)的混合物在0℃下攪拌1小時(shí)。向反應(yīng)混合物中加入3-氨基-3-(5-氯-2-羥基-3-碘)丙酸乙酯鹽酸鹽(5．0g，12．31mmol)，再加入三乙胺(3．5mL)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18小時(shí)，真空除去DMF，將殘余物在乙酸乙酯(300mL)及碳酸氫鈉(200mL)間分配。有機(jī)層用鹽酸(1N，100mL)、鹽水(200mL)洗滌，用硫酸鎂干燥，濃縮，得到所需固體產(chǎn)物(6g，收率93％)。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟6制備(R，S)-3-(N-gly)-氨基-3-(5-氯-2-羥基-3-碘)苯基丙酸乙酯鹽酸鹽 在0℃下，將二噁烷／HCl(4N，20mL)加至3-(N-BOC-gly)-氨基-3-(5-氯-2-羥基-3-碘)丙酸乙酯(6．0g，11．39mmol)中，并在室溫下攪拌3小時(shí)。將反應(yīng)混合物濃縮，在加入甲苯(100mL)后再次濃縮。將獲得的殘余物懸浮于乙醚中，過濾，干燥，得到所需產(chǎn)物，為一種結(jié)晶粉末(5．0g，收率95％)。(RPHPLCRf 8．3分鐘，條件同步驟3)。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
實(shí)施例F制備下式的化合物 步驟1制備3-碘-5-溴水楊醛在備有磁性攪拌器的500mL圓底燒瓶中的5-溴水楊醛(20．0g，0．1mol)和碘化鉀(17g，0．1mol)的乙腈(150mL)和水(50mL)溶液中加入氯胺T(23g，0．1mol)。將混合物反應(yīng)1小時(shí)。使反應(yīng)混合物在鹽酸(10％，200mL)與乙酸乙酯間進(jìn)行分配。用硫酸鈉干燥有機(jī)層，過濾，真空濃縮。向殘余物中加入己烷，再將反應(yīng)混合物在50℃下加熱15分鐘。過濾除去未溶解的物質(zhì)。將濾液真空濃縮，得到淡黃色的3-碘-5-溴水楊醛(26g)。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟2 采用與實(shí)施例E步驟2-6基本相同的過程制備上述化合物，其中，在步驟2中，采用當(dāng)量的來自步驟1的產(chǎn)物3-碘-5-溴-水楊醛代替3-碘-5-氯水楊醛。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
實(shí)施例H制備下式的化合物 步驟1將乙醇(375mL)和去離子水(375mL)加至備有機(jī)械攪拌器、Claisen接管、加料漏斗、回流冷凝器和熱電偶的2L 3-頸圓底燒瓶中。向反應(yīng)燒瓶中加入1，3-二氨基-2-羥基丙烷(125．04g，1．39mol)(Aldrich)，攪拌至溶解。經(jīng)加料漏斗在25-33℃下以滴加的方式于35分鐘內(nèi)滴加入二硫化碳(84mL，1．39mol)得到一種乳白色的混合物。用冰浴保持溫度。將反應(yīng)混合物在73．4℃下回流2小時(shí)，將反應(yīng)混合物用冰浴冷卻至25℃，并在保持溫度25-26℃下以滴加的方式加入濃鹽酸(84mL)，將反應(yīng)混合物在78．4℃下回流21小時(shí)。再將反應(yīng)溶液冷卻至2℃，通過真空過濾收率產(chǎn)物。白色的固體用冰浴冷卻的乙醇∶水(1∶1)(50mL)洗滌3次，在40℃下真空干燥，得到5-羥基四氫嘧啶-2-硫酮(63．75g，收率34．7％)，為白色固體。
步驟2將步驟1制備的5-羥基四氫嘧啶-2-硫酮(95g，0．72mol)，無水乙醇(570mL)和甲基碘(45mL，0．72mol)加至備有機(jī)械攪拌器和熱電偶的2L圓底燒瓶中。將反應(yīng)混合物在78℃下回流5小時(shí)，然后，冷卻至室溫。將反應(yīng)混合物進(jìn)行真空濃縮，得到一種白色固體(194．72g)。用乙醚(500mL)研制該白色固體三次，真空干燥，得到2-甲基硫醚-5-羥基嘧啶氫碘酸鹽(188．22g，收率95．4％)，為一種白色固體。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟3將2-甲基硫醚-5-羥基嘧啶氫碘酸鹽(150．81g，0．55mol)，二氯甲烷(530mL)，二甲基乙酰胺(53mL)和三乙胺(76．7mL，0．55mol)加至備有回流冷凝器、機(jī)械攪拌器和靜態(tài)氮?dú)馊肟诘?L 3頸圓底燒瓶中。將混合物用冰浴冷卻，在4℃下加入二碳酸二叔丁酯(120．12g，0．55mol)。將反應(yīng)混合物在42．5℃下加熱18小時(shí)，得到一種淺黃色溶液。將反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移至2L的分液漏斗中用去離子水(200mL)洗滌3次，用硫酸鎂干燥，過濾，真空濃縮，得到Boc-2-甲基硫醚-5-羥基嘧啶(134．6g，收率99．35％)，為一種淺黃色粘稠油。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟4將Boc-2-甲基硫醚-5-羥基嘧啶(50．3g，0．204mol)，3-氨基-5-羥基苯甲酸(Aust．J．Chem．(1981)34(6)，1319-24)(25．0g，0．1625mol)和50mL無水DMA在100℃下加熱攪拌2天。形成一種漿狀沉淀。將反應(yīng)物冷卻至室溫，濾出沉淀，用CH3CN洗滌，再用乙醚洗滌，干燥。將此固體在水中形成漿液，用濃鹽酸酸化，形成一種溶液。將此溶液冷凍，冷凍干燥，得到所需產(chǎn)物，為一種白色固體(14．4g)。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
實(shí)施例I制備下式的化合物 步驟1制備雷福爾馬茨基試劑 在備有冷凝器、溫度探針和機(jī)械攪拌器的4L燒瓶中加入鋅金屬(180．0g，2．76mol，-30-100目)和THF(1．25L)。在攪拌下，經(jīng)注射器加入1，2-二溴乙烷(4．74mL，0．05mol)(或者，可代之以室溫下1小時(shí)加入TMSCl(0．1當(dāng)量)]。在通入惰性氣體后(3N2／真空循環(huán))，鋅在THF中的懸浮液加熱回流(65℃)，并在該溫度下保持1小時(shí)。然后，將混合物冷卻至50℃，經(jīng)50mL注射器和注射泵(加料速度設(shè)置為4．1mL／分鐘)，于1．5小時(shí)內(nèi)再加入溴代乙酸叔丁酯(488g，369mL，2．5mol)。在整個(gè)加入過程中反應(yīng)溫度保持在50℃+／-5℃。在加完后，將反應(yīng)混合物在50℃下攪拌1小時(shí)。隨后，使混合物冷卻至25℃，使沉淀出的產(chǎn)物沉降。采用粗玻璃濾棒和部分真空轉(zhuǎn)移裝置(20mm Hg)，將THF母液潷析進(jìn)入2L的圓底燒瓶中。由此從混合物中除去了約65％的THF，加入1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP，800mL)，再攪拌5分鐘。將反應(yīng)混合物過濾以除去殘余的鋅。分析表明，所需的雷福爾馬茨基試劑的滴定度為1．57M，摩爾收率為94％?；蛘?，可通過過濾從原始反應(yīng)混合物中分離出固體試劑。濾餅用THF洗滌，直至獲得白色固體，在氮?dú)庵懈稍?，獲得所需的產(chǎn)物，為一種單THF溶劑化物，其可在-20℃下(干燥)貯藏很長(zhǎng)時(shí)間。通常的收率為85-90％。
步驟22A．制備下式的化合物 在室溫下，將碳酸鉀(粉末，在100℃真空爐中干燥，8．82g，60mmol)加至3，5-二氯水楊醛(11．46g，60mol)的DMF(40mL)溶液中，得到一種亮黃色的漿液。再加入MEMCl(純，7．64g，61mmol)，并保持浴溫為20℃。然后，將混合物在22℃下攪拌6小時(shí)，再加入MEMCl(0．3g，2．4mmol)。將混合物再攪拌0．5小時(shí)，將反應(yīng)混合物倒入冷水(200mL)中，沉淀出產(chǎn)物。在壓力過濾器上對(duì)漿液過濾，濾餅用水(2x50mL)洗滌，在氮?dú)猓婵障赂稍?，得到產(chǎn)物(14．94g，89％)，為一種灰白色固體。1HNMR(CDCl3，TMS)3．37(s，3H)，3．54-3．56(m，2H)，3．91-3．93(m，2H)，5．30(s，2H)，7．63(d，1H)，7．73(d，1H)，10．30(s，1H)；13C NMR(CDCl3，TMS)d(ppm)59．03，70．11，99．57，126．60，129．57，130．81，132．07，135．36，154．66，188．30。DSC48．24℃(內(nèi)90．51J／g)；微量分析計(jì)算值C11H12Cl2O4C47．33％；H4．33％；Cl25．40％；實(shí)測(cè)值C47．15％；H4．26％；Cl25．16％。
2B．制備下式的化合物 將來自步驟2A的產(chǎn)物(35．0g，0．125mol)加至備有機(jī)械攪拌器和加料漏斗的1L 3頸圓底燒瓶中，再另入THF(200mL)。將溶液在22℃下攪拌，然后一次性加入(S)-苯基氨基乙醇(glycinol)(17．20g，0．125mol)。在22℃下30分鐘后，加入硫酸鎂(20g)將混合物在22℃下攪拌1小時(shí)，在粗玻璃濾器上過濾。對(duì)濾液進(jìn)行減壓濃縮。不進(jìn)行進(jìn)一步的純化，粗產(chǎn)物亞胺直接用于步驟2C的偶合反應(yīng)。
2C．制備下式的化合物 在氮?dú)夥障?，在備有機(jī)械攪拌器和加料漏斗的1L 3頸圓底燒瓶中加入步驟1產(chǎn)生的固體試劑(91．3g，0．275mol)和NMP(200mL)。然后，將溶液冷卻至-10℃，并在350rpm下攪拌。在氮?dú)庀轮苽溆贜MP中的亞胺溶液(步驟2B制備)，然后在20分鐘內(nèi)加至上述反應(yīng)混合物中，期間，溫度保持在-5℃(夾套溫度為-10℃)。在加完后，再將混合物在-8℃下攪拌1．5小時(shí)，并在-5℃攪拌1小時(shí)。在冷卻至-10℃后，在10分鐘內(nèi)加入濃鹽酸／飽和氯化銨溶液(8．1mL／200mL)。加入MTBE(200mL)，將混合物在23℃及200rpm下再攪拌15分鐘。停止攪拌，分層。水層用MTBE(100mL)萃取。合并兩個(gè)有機(jī)層，依次用飽和氯化銨水溶液(100mL)，水(100mL)和鹽水(100mL)洗滌。溶液用硫酸鎂(30g)干燥，過濾，濃縮，得到一種橙色油(66．3g)(放置后固化)，其包含所需產(chǎn)物，為單一的非對(duì)映異構(gòu)體(由質(zhì)子和碳nmr證實(shí))。樣品通過用庚烷進(jìn)行重結(jié)晶進(jìn)行純化用于分析，得到灰白色固體的產(chǎn)物。
質(zhì)子和碳NMR及IR光譜與所需結(jié)構(gòu)一致。[α]D25=+8．7°(c=1．057，MeOH)。
微量分析計(jì)算值C25H33Cl2NO6C58．77％；H6．47％；N2．72％；Cl13．78％實(shí)測(cè)值C58．22％；H6．54％；N2．70％；Cl13．66％。
步驟3制備下式的化合物 3A．將來自步驟2的粗酯的溶液[17．40g，0．033mol(理論)]和EtOH(250mL)加至1L 3頸夾套反應(yīng)器中。將溶液冷卻至0℃，再一次性加入Pb(OAc)4(14．63g，0．033mol)。12小時(shí)后，加入15％的NaOH(30mL)溶液，減壓除去乙醇。加入另一份15％的NaOH(100mL)，混合物用MTBE(2x100mL)萃取，用水(2x100mL)和鹽水(50mL)洗滌，用硫酸鈉干燥，在硅藻土上過濾，減壓濃縮，獲得一種橙色油(12．46g)。通過薄層色譜(tlc)使油均勻，不經(jīng)進(jìn)一步純化而使用。
3B．將來自3A的油用EtOH(30mL)稀釋，加入對(duì)甲苯磺酸(1．3當(dāng)量，0．043mol，8．18g)。將溶液加熱回流8小時(shí)，冷卻至室溫，減壓濃縮。將殘余物用THF(20mL)處理，加熱回流形成溶液。將溶液冷卻至室溫，化合物結(jié)晶出來。將庚烷(30mL)和THF(10mL)加入形成液體漿液，將其過濾。濾餅用THF／庚烷(40mL，1／1)洗滌，在壓濾器上于氮?dú)夥障抡婵崭稍?小時(shí)，獲得一種白色固體(7．40g)。
質(zhì)子和碳NMR及IR光譜與所需結(jié)構(gòu)一致，基本上為一種單一的對(duì)映異構(gòu)體。
微量分析計(jì)算值C18H21C12NO6S，0．25C4H8OC48．73％；H4．95％；N2．99％；Cl15．14％實(shí)測(cè)值C48．91％；H4．95％；N2．90％；Cl14．95％。
步驟4制備下式的化合物 向備有機(jī)械攪拌棒和氮?dú)夤呐萜鞯?00mL圓底燒瓶中加入步驟3所產(chǎn)生的產(chǎn)物的游離堿(21．7g，0．065mol)，N-t-Boc-甘氨酸 N-羥基琥珀酰亞胺酯(17．7g，0．065mol)和DMF(200mL)。將反應(yīng)混合物在氮?dú)夥占笆覝叵聰嚢?．25小時(shí)，形成一種淺橙色的溶液。將反應(yīng)混合物倒入冰冷卻下的乙酸乙酯(1．2L)中。有機(jī)溶液用1M的HCl(250mL)洗滌，再用鹽水(500mL)洗滌，用硫酸鎂干燥，真空濃縮至于，獲得一種油，將其隨后在50℃下干燥，獲得無色油狀產(chǎn)物(28．12g，99％)。由乙酸乙酯／己烷制備晶種。將產(chǎn)物(約28g)溶解于乙酸乙酯(35mL)和己烷(125mL)中。用晶種使溶液種晶，形成沉淀。濾出固體，在55℃下過夜真空干燥，得到無色的固體(27．0g，95％)。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟5制備下式的化合物 將步驟4制備的Boc-保護(hù)的甘氨酸酰胺(27．0g，0．062mol)在P2O5及NaOH小粒上過夜干燥。將固體溶解于二噁烷(40mL)中并將溶液冷卻至0℃。加入等體積的4N HCl／二噁烷(0．062mol)，反應(yīng)進(jìn)行2小時(shí)。此時(shí)，轉(zhuǎn)化率為80％(RPHPLC)。將反應(yīng)混合物在4個(gè)小時(shí)內(nèi)升溫至室溫。將反應(yīng)混合物在40℃下濃縮形成一種泡沫，將其用乙醚(200mL)研制。對(duì)形成的白色固體過濾，并在P2O5上過濾，得到所需的甘氨酸β-氨基酸乙酯化合物，為鹽酸鹽(20．4g，分離收率88．5％)。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
實(shí)施例J制備下式的化合物 步驟1制備下式的化合物 按照實(shí)施例I步驟2A制備MEM保護(hù)的3-溴-5-氯水楊醛(129．42g，0．4mol)。采用等當(dāng)量的3-溴-5-氯水楊醛代替3，5-二氯水楊醛，將其加至備有機(jī)械攪拌器的2L 3頸圓底燒瓶中，再加入THF(640mL)和(S)-苯基氨基乙醇(54．86g，0．4mol)。在22℃下30分鐘后，加入硫酸鎂(80g)。將混合物在22℃下攪拌2小時(shí)，在粗玻璃濾器上過濾。對(duì)濾液進(jìn)行減壓濃縮，獲得一種淺黃色油(180．0g)，其包含所需的亞胺。不進(jìn)行進(jìn)一步的純化，粗產(chǎn)物亞胺直接用于步驟2的偶合反應(yīng)。
微量分析計(jì)算值C19H21BrClNO4C51．54％；H4．78％；N3．16％；Br18．04％；Cl8．00％實(shí)測(cè)值C50．22％；H4．94％；N2．93％；Br17．15％；Cl7．56％。
步驟2制備下式的化合物 在備有機(jī)械攪拌器的5L 3頸圓底燒瓶中，在氮?dú)夥障拢瑢碜詫?shí)施例I步驟1的試劑(332．0g，0．8mol)溶解于NMP(660mL)中。然后，將溶液冷卻至-10℃。在氮?dú)庀轮苽溆贜MP中的步驟1的亞胺溶液，然后在30分鐘內(nèi)加至上述反應(yīng)混合物中，期間，溫度保持在-5℃。在加完后，再將混合物在-8℃下攪拌1小時(shí)，并在-5℃下攪拌2小時(shí)，然后冷卻至-10℃。在10分鐘內(nèi)加入濃鹽酸／飽和氯化銨溶液(30mL／720mL)的混合物。加入MTBE(760mL)，將混合物在23℃下再攪拌30分鐘。停止攪拌，分層。水層用MTBE(320mL)萃取。合并有機(jī)層，依次用飽和氯化銨水溶液(320mL)，去離子水(320mL)和鹽水(320mL)洗滌。溶液用硫酸鎂(60g)干燥，過濾，濃縮，得到一種橙色油(221．0g)，其包含所需產(chǎn)物，為單一的非對(duì)映異構(gòu)體(由質(zhì)子NMR證實(shí))。
DSC211．80-C(內(nèi)72．56J／g)，228．34℃(98．23J／g)；微量分析計(jì)算值C25H33BrClNO6C53．72％；H5．95％；N2．50％；Br14．29％；Cl6．33％實(shí)測(cè)值C52．11％；H6．09％；N2．34％；Br12．84％；Cl6．33％。
步驟3制備下式的化合物 在氬氣氛下，將來自步驟2制備的粗酯(約111g)在乙醇(1500mL)中的溶液加至備有機(jī)械攪拌器的3L 3頸圓底燒瓶中。將反應(yīng)混合物冷卻至0℃，一次性加入四乙酸鉛(88．67g，0．2mol)。將反應(yīng)混合物在0℃下攪拌3小時(shí)，然后，在低于5℃下加入15％的NaOH(150mL)溶液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓除去乙醇。加入另一份15％的NaOH 150mL不溶液，反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(3 x 100mL)萃取，用去離子水(2 x 100mL)和鹽水(2×100mL)洗滌，用無水硫酸鎂干燥(30g)，在硅藻土上過濾，減壓濃縮，獲得所需產(chǎn)物(103g)，為一種紅色油。
步驟4制備下式的化合物 按照實(shí)施例I步驟4和步驟5制備上述化合物，只是在實(shí)施例I步驟4中代之以等當(dāng)量的來自步驟3的產(chǎn)物。MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
實(shí)施例K實(shí)施例J化合物的另一種制備過程步驟1制備下式的化合物 向?qū)嵤├鼴步驟3的產(chǎn)物(50．0g，139．2mmol)和NaHCO3(33．5g，398．3mmol)中加入二氯甲烷(500mL)和水(335mL)。將混合物在室溫下攪拌10分鐘。在迅速攪拌下，在20分鐘內(nèi)加入氯代甲酸芐酯(38．0g，222．8mmol)的二氯甲烷(380mL)溶液。50分鐘后，將反應(yīng)混合物倒入分液漏斗中，收集有機(jī)層。水相用二氯甲烷(170mL)洗滌。合并后的有機(jī)層用硫酸鎂干燥，真空濃縮。將形成的膠狀固體用己烷研制，過濾收集。將黃褐色的固體在真空中干燥，得到所需的外消旋產(chǎn)物(61．2g，收率96％)。將這種物質(zhì)進(jìn)行反相HPLC，采用手性柱，得到單純的對(duì)映異構(gòu)體。所采用的柱子為Whelk-O(R，R)，10μm粒徑，采用90∶10庚烷∶乙醇作為流動(dòng)相。采用分析HPLC(使用類似的柱子和溶劑條件)確定光學(xué)純度大于98％。1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟2制備下式的化合物 經(jīng)套管向步驟1獲得的化合物(48．5g，106．2mmol)的二氯甲烷(450mL)溶液中加入三甲基甲硅烷基碘(25．5g，127．4mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液。將橙色的溶液在室溫下攪拌1小時(shí)。滴加入甲醇(20．6mL，509．7mmol)，再將溶液攪拌15分鐘。將反應(yīng)溶液進(jìn)行真空濃縮，得到一種橙色油。將殘余物溶解于甲基叔丁基醚(500mL)中，用1NHCl(318mL)和水(1 x 200mL，1 x 100mL)萃取。水萃取液再用MTBE(100mL)反洗。向水溶液中分小批次加入固體碳酸氫鈉(40．1g，478mmol)。將堿化的含水混合物用MTBE(1×1L，2×200mL)萃取。將合并后的有機(jī)溶液用鹽水洗滌，真空濃縮，得到所需的產(chǎn)物(23．3g，68％)。1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟3制備下式的化合物 向來自步驟2的產(chǎn)物(23．3g．72．1mmol)的DMF(200mL)溶液中加入N-t-Boc-甘氨酸 N-羥基琥珀酰亞胺酯(17．9g，65．9mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌20小時(shí)。將混合物倒入乙酸乙酯(1．2L)中，用1MHCl(2×250mL)、飽和碳酸氫鈉水溶液(2×250mL)和鹽水(2×250mL)洗滌。將溶液用硫酸鎂干燥，濃縮，得到所需的產(chǎn)物(32．0g，100％)。
分析計(jì)算值C18H24BrClN2O6C，45．06；H，5．04；N，5．84，實(shí)測(cè)值C，45．17；H，5．14；N，6．12。
1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟4制備下式的化合物 向來自步驟3的產(chǎn)物(31．9g，66．5mmol)的無水乙醇(205mL)溶液中加入氯化氫的乙醇溶液(111mL，3M溶液，332．4mmol)。將反應(yīng)溶液在58℃下加熱30分鐘。將溶液冷卻，真空濃縮。將殘余物溶解于乙酸乙酯(250mL)中，并在0℃下攪拌2小時(shí)。過濾收集白色沉淀，用冷乙酸乙酯洗滌。將固體進(jìn)行真空干燥，得到所需的產(chǎn)物。(23．5g，收率85％)。
分析計(jì)算值C13H16BrClN2O4+1．0 HClC，37．53；H，4．12；N，6．73；實(shí)測(cè)值C，37．29；H，4．06；N，6．68。
1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
實(shí)施例L制備下式的化合物 步驟1制備下式的化合物 在室溫下，將碳酸鉀(粉末，在100℃真空爐中干燥，22．1g，0．16mol)加至3-氯-5-溴水楊醛(35．0g，0．15 moles)的DMF(175mL)溶液中，得到一種亮黃色的漿液。然后，在保持浴溫度為20℃下加入MEMCl(純，25．0g，0．2mol)。然后，將混合物在22℃下攪拌6小時(shí)，倒入去離子水(1200mL)中沉淀出產(chǎn)物。將漿液在壓濾器中過濾，濾餅用去離子水(2 x400mL)洗滌，在氮?dú)猓婵罩懈稍铮玫疆a(chǎn)物(46．0g，收率95％)，為一種灰白色固體。1HNMR(CDCl3，TMS)3．35(s，3H)，3．54-3．56(m，2H)，3．91-3．93(m，2H)，5．30(s，2H)，7．77(d，1H)，7．85(d，1H)，10．30(s，1H)；13CNMR(CDCl3，TMS)(ppm)59．05，70．11，71．49，99．50，117．93，129．69，129．78，132．37，138．14，155．12，188．22。DSC48．24℃(內(nèi)90．51J／g)；微量分析計(jì)算值C11H12BrClO4C40．82％；H3．74％；Cl10．95％；Br24．69％；實(shí)測(cè)值C40．64％；H3．48％；Cl10．99％；Br 24．67％。
步驟2制備下式的化合物 將來自步驟1的產(chǎn)物(32．35g，0．1mol)加至備有機(jī)械攪拌器的500mL 3頸圓底燒瓶中，隨后加入THF(160mL)和(S)-苯基氨基乙醇(13．71g，0．1mol)。在22℃下30分鐘后，加入硫酸鎂(20g)。將混合物在22℃下攪拌1小時(shí)，在粗玻璃濾器上過濾。對(duì)濾液進(jìn)行減壓濃縮，獲得一種淺黃色油(48．0g)，其包含所需的亞胺。不進(jìn)行進(jìn)一步的純化，粗產(chǎn)物直接用于下一步驟的反應(yīng)。
微量分析計(jì)算值C19H21BrClNO4C51．54％；H4．78％；N3．16％；Br18．04％；Cl8．00％實(shí)測(cè)值C51．52％；H5．02％；N2．82％；Br16．31％；Cl7．61％。
步驟3制備下式的化合物 在備有機(jī)械攪拌器的5L 3頸圓底燒瓶中，在氮?dú)夥障?，將來自?shí)施例I步驟1的試劑(332．0g，0．8mol)溶解于NMP(660mL)中。然后，將溶液冷卻至-10℃。在氮?dú)庀轮苽溆贜MP(320ML)中的步驟2的亞胺溶液，然后在30分鐘內(nèi)加至上述反應(yīng)混合物中，期間，溫度保持在-5℃。在加完后，再將混合物攪拌1小時(shí)，然后冷卻至-10℃。在10分鐘內(nèi)加入濃鹽酸／飽和氯化銨溶液(30mL／720mL)的混合物。加入MTBE(760mL)，將混合物在23℃下再攪拌1小時(shí)。停止攪拌，分層。水層用MTBE(320mL)萃取。合并有機(jī)層，依次用飽和氯化銨水溶液(320mL)，去離子水(320mL)和鹽水(320mL)洗滌。溶液用硫酸鎂(60g)干燥，過濾，濃縮，得到一種黃色油(228g)，其包含所需產(chǎn)物，為單一的非對(duì)映異構(gòu)體。DSC227．54℃(內(nèi)．61．63J／g)；微量分析計(jì)算值C25H33BrClNO6C53．72％；H5．95％；N2．50％；Br14．29％；Cl6．33％實(shí)測(cè)值C53．80％；H6．45％；N2．23％；Br12．85％；Cl6．12％。
步驟4制備下式的化合物 在氬氣氛下，將來自步驟3制備的粗酯(約111g)在乙醇(1500mL)中的溶液加至備有機(jī)械攪拌器的3L 3頸圓底燒瓶中。將反應(yīng)混合物冷卻至0℃，一次性加入四乙酸鉛(88．67g，0．2mol)。將反應(yīng)混合物在0℃下攪拌3小時(shí)，然后，在低于5℃下加入15％的NaOH(150mL)溶液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓除去乙醇。加入另一份15％的NaOH水溶液600mL，反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(2x300mL)、MTBE(2x200mL)和乙酸乙酯(2x200mL)萃取，合并有機(jī)層，用去離子水(2x200mL)和鹽水(2×100mL)洗滌，用無水硫酸鎂干燥(30g)。溶液在硅藻土上過濾，減壓濃縮，得到一種橙色油狀產(chǎn)物(96g)，其可不經(jīng)純化用于下一步驟中。
DSC233．60℃(內(nèi)，67．85J／g)；微量分析計(jì)算值C24H29BrClNO5C43712％；H5．54％；N2．65％；Br15．16％；Cl6．72％實(shí)測(cè)值C52．12％；H5．40％；N2．47％；Br14．77％；Cl6．48％。
步驟5制備下式的化合物 將來自步驟4的粗產(chǎn)物(約94g)溶解于無水乙醇(180mL)中，加入對(duì)甲苯磺酸一水合物(50．0g，0．26mol)。然后，將反應(yīng)混合物加熱回流8小時(shí)，此后，減壓除去溶劑。將殘余物固體溶解于THF(100mL)中，然后，在減壓汽提出THF。再將殘余物溶解于乙酸乙酯(500mL)中，冷卻至約5℃。濾出固體，用庚烷(2×50mL)洗滌，得到白色固體。再將固體進(jìn)行空氣干燥，得到所需的產(chǎn)物，為一種白色固體(38g)，為單一的異構(gòu)體。1HNMR(DMSO，TMS)(ppm)1．12(1，3H)，2．29(s，3H)，3．0(m，2H)，4．05(q，2H)，4．88(1，1H)，7．11(d，2H)，7．48(d，2H)，7．55(d，1H)，7．68(1H，d)，8．35(br．s，3H)；13C NMR(DMSO，TMS)(ppm)13．82，20．75，37．13，45．59，60．59，110.63，122．47，125．44，127．87，128．06，129．51，131．95，137．77，145．33，150．14，168．98；DSC69．86℃(內(nèi)，406．5J/g)，165．72℃(內(nèi)，62．27J/g)，211．24℃(外，20．56J/g)[α]D25=+4．2．(c=0．960，MeOH)；IR(MIR)(cm-1)2922，1726，1621，1591，1494．1471，1413，1376，1324，1286，1237，1207；微量分析計(jì)算值C18H21BrClNO8SC43．69％；H4．27％；N2．83％；Br16．15％，Cl7．16％，S6．48％實(shí)測(cè)值C43．40％；H4．24％；N2．73％；Br16．40％，Cl7．20％，S6．54％。
步驟6制備下式的化合物
按照實(shí)施例I步驟4和步驟5所述過程制備上述化合物，只是在實(shí)施例I步驟4中代之以等當(dāng)量的步驟5制備的中間體。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
實(shí)施例M制備下式的化合物 步驟1制備3-碘-5-氯水楊醛將N-碘琥珀酰亞胺(144．0g，0．641mol)加至5-氯水楊醛(100g，0．638mol)的二甲基甲酰胺(400mL)溶液中。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2天。再加入N-碘琥珀酰亞胺(20．0g)，繼續(xù)攪拌2天。將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯稀釋(1L)，用鹽酸(300mL，0．1N)、水(300mL)、硫代硫酸鈉(5％，300mL)和鹽水(300mL)洗滌，用硫酸鎂干燥，濃縮至干，得到所需的醛(162g，收率90％)為淡黃色固體。
MS和NMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟2制備2-O-(MEM)-3-碘-5-氯水楊醛在20℃下，將碳酸鉀(41．4g，0．30mol)加至3-碘-5-氯水楊醛(84．74g，0．30mol)的DMF(200mL)溶液中，得到一種黃色的漿液。然后，在保持溫度為反應(yīng)溫度下加入MEM-Cl(38．2g，0．305mol)。2小時(shí)后，再加入MEM-Cl(1．5g)。在攪拌1小時(shí)后，將反應(yīng)混合物倒入冰-水混合物中，攪拌。形成沉淀，過濾，真空中干燥，獲得所需保護(hù)的醛。收率95g(85％)。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟3制備下式的化合物 在室溫下，將(S)-苯基氨基乙醇(15．37g，0．112mol)加至2-O-(MEM)-3-碘-5-氯水楊醛(41．5g，0．112mol)的THF(200mL)溶液中。在攪拌1小時(shí)后，加入硫酸鎂(16g)，并繼續(xù)攪拌2小時(shí)。將反應(yīng)混合物過濾，將濾液濃縮，并在真空中干燥2小時(shí)，獲得所需的中間體亞胺。在2頸圓底燒瓶中加入來自實(shí)施例I步驟1的雷福爾馬茨基試劑(81．8g，0．2464mol)和N-甲基吡咯烷酮(300mL)，并在-10℃下繼續(xù)攪拌。在保持溫度為-10℃下，緩慢地加入亞胺在N-甲基吡咯烷酮(100mL)中的溶液。將混合物保持在該溫度下2小時(shí)，并在-5℃下1小時(shí)。在冷卻反應(yīng)混合物至-10℃后，加入濃氯化氫在飽和氯化銨中的溶液(16mL／200mL)，加入乙醚(500mL)，并在室溫下攪拌2小時(shí)。分離出醚層，水層再用乙醚(300mL)萃取。合并后的醚層用飽和氯化銨水溶液(200mL)，水(200mL)，鹽水(200mL)洗滌，用硫酸鎂干燥，濃縮，得到一種油(61．0g，收率90％)。1HNMR表明，所需的結(jié)構(gòu)基本為一種非對(duì)映異構(gòu)體，MS與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟4制備下式的化合物
將來自步驟3的粗酯(48．85g，80．61mmol)的溶液溶解于乙醇(500mL)中，并冷卻至0℃。加入四乙酸鉛(35．71g，80．61mmol)。3小時(shí)后，向反應(yīng)混合物中加入15％的NaOH(73mL)溶液。通過減壓除去大部分的乙醇。向殘余物中加入15％的NaOH 200mL，然后用乙醚(400mL)萃取。醚層用水(100mL)、鹽水(100mL)洗滌，干燥，濃縮，獲得一種橙色油。將這種油溶解于乙醇(100mL)中，加入對(duì)甲苯磺酸(19．9g)。將溶液在回流下加熱8小時(shí)，減壓濃縮。將殘余物用THF(60mL)稀釋，在回流下加熱，冷卻。濾出沉淀，用己烷／THF(300mL，1∶1)洗滌，干燥，得到所需產(chǎn)物。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟5制備S-3-(N-BOC-gly)-氨基-3-(S)-(5-氯-2-羥基-3-碘)苯基丙酸乙酯向BOC-gly-OSu(9．4g，34．51mmol)，3-(S)-氨基-3-(5-氯-2-羥基-3-碘)丙酸乙酯PTSA鹽(17．0g，31．38mmol)在DMF(200mL)在的混合物中加入三乙胺(4．8mL)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18小時(shí)。真空除去DMF，將殘余物在乙酸乙酯(600mL)與稀鹽酸(100mL)間分配。有機(jī)層用碳酸氫鈉(200mL)，鹽水(200mL)洗滌，用硫酸鎂干燥，濃縮，得到所需產(chǎn)物，為一種固體(14．2g，收率86％)。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟6制備S-3-(N-gly)-氨基-3-(5-氯-2-羥基-3-碘)苯基丙酸乙酯鹽酸鹽在0℃下，將二噁烷／HCl(4N，70mL)加至3-(S)-(N-BOC-gly)-氨基-3-(5-氯-2-羥基-3-碘)苯基丙酸乙酯(37．20g，70．62mmol)中，并在室溫下攪拌3小時(shí)。將反應(yīng)混合物濃縮，在加入甲苯(100mL)后，再進(jìn)行一次濃縮。將獲得的殘余物懸浮于乙醚中，過濾，干燥，得到所需的產(chǎn)物，為一種結(jié)晶粉末(32．0g，收率98％)。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
實(shí)施例N制備下式的化合物 步驟1制備下式的化合物 按照實(shí)施例I步驟2A制備上述化合物，只是用等當(dāng)量的2-羥基-3，5-二溴苯甲醛代替3，5-二氯水楊醛。
收率88％；淺黃色固體；m．p．46-47℃；Rf=0．6(乙酸乙酯／己烷1∶1v／v)；1H-NMR(CDCl3)d 3．37(s，3H)，J．56(m，2H)，3．92(m，2H)，5．29(s，2H)，7．91(d，1H，J=2．4Hz)，7．94(d，1H，J=2．4Hz)，10．27(s，1H)；FAB-MS m／z 367(M+)HR-MS計(jì)算值C11H12Br2O4367．9083實(shí)測(cè)值367．9077。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟2制備下式的化合物
采用實(shí)施例I步驟2B和步驟2C制備上述化合物，只是在實(shí)施例I步驟2B中代之以等當(dāng)量的步驟1的化合物。
收率90％；黃色固體；m．p．57-59℃；Rf=0．46(乙酸乙酯／己烷 1∶1v／v)；1H-NMR(CDCb)d 1．45(s，9H)；2．1(br，1H，可交換的)，2．51(d，1H，J1=9．9Hz，J2=15．3Hz)，2．66(d，1H，J1=4．2Hz，J2=15．3Hz)，3．02(br，1H，可交換的)，3．39(s，3H)，3．58-3．62(m，4H)，3．81(m，1H)，3．93(m，2H)，4．63(dd，1H，J=4．2Hz)，5．15(s，2H)，7．17-7．25(m，6H)，7．49(d，1H)；FAB-MS m／z 602(M+H)HR-MS計(jì)算值C25H34NBr2O6602．0753實(shí)測(cè)值602．0749。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟3制備下式的化合物 按照實(shí)施例I步驟3制備上述化合物(對(duì)甲苯磺酸鹽)，只是在實(shí)施例I的步驟3中代之以等當(dāng)量的步驟2制備的產(chǎn)物。收率62％；白色固體；1H-NMR(DMSO-d6)d 1．09(1，3H，J=7．2Hz)，2．27(s，3H)，2．97(dd，2H，J1=3．0Hz，J2=7．2Hz)，4．02(q，2H，J=7．2Hz)，4．87(t，1H，J=7．2Hz)，7．08(d，2H，J=4．8Hz)，7．45(m，3H)，7．57(d．1H，J=2．4Hz)，8．2(br，3H)；FAB-MS m／z 365(M+H)HR-MS計(jì)算值C11H14NBr2O3365．9340實(shí)測(cè)值365．9311。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟4制備下式的化合物 采用實(shí)施例I步驟4制備上述化合物，只是采用步驟3制備的化合物。采用實(shí)施例I步驟5的過程將形成的BOC保護(hù)的中間體轉(zhuǎn)化成所需的化合物。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
實(shí)施例P制備下述化合物 采用實(shí)施例I的過程制備上述化合物，只是采用實(shí)施例F步驟1制備的等當(dāng)量的3-碘-5-溴水楊醛代替實(shí)施例I步驟2A的3，5-二氯水楊醛。
實(shí)施例1(±)3-溴-5-氯-2-羥基-β-[[2-[[[3-羥基-5-[(1，4，5，6-四氫-5-羥基嘧啶-2-基)氨基]苯基]羰基])氨基]乙酰基]氨基]苯丙酸，三氟乙酸鹽制備下式的化合物
在冰浴溫度下，向?qū)嵤├鼿的產(chǎn)物(0．4g，0．0014mol)，實(shí)施例B的產(chǎn)物(0．58g，0．0014mol)，三乙胺(0．142g，0．0014mol)，DMAP(17mg)和無水DMA(4mL)中加入EDCl(0．268g，0．0014mol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜。將形成的中間體經(jīng)反相制備HPLC分離。向水(10mL)和CH3CN(5mL)中的該酯中加入LiOH(580mg，0．0138mol)。在室溫下攪拌1小時(shí)后，用TFA將pH值降至2，產(chǎn)物用反相制備HPLC純化，得到(冷凍干燥后)所需產(chǎn)物，為一種白色固體(230mg)。
MS和1H NMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
實(shí)施例2制備下式的化合物 按照實(shí)施例1的方法制備上述化合物，只是采用等當(dāng)量的實(shí)施例A的產(chǎn)物代替實(shí)施例B的產(chǎn)物。在冷凍干燥后，得到320mg的白色固體。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
實(shí)施例3制備下式的化合物 按照實(shí)施例1的方法制備上述化合物，只是采用等當(dāng)量的實(shí)施例F的產(chǎn)物代替實(shí)施例B的產(chǎn)物。在冷凍干燥后，得到180mg的白色固體。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
實(shí)施例4制備下式的化合物 按照實(shí)施例1的方法制備上述化合物，只是采用等當(dāng)量的實(shí)施例D的產(chǎn)物代替實(shí)施例B的產(chǎn)物。在冷凍干燥后，得到180mg的白色固體。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
實(shí)施例5制備下式的化合物 按照實(shí)施例1的方法制備上述化合物，只是采用等當(dāng)量的實(shí)施例E的產(chǎn)物代替實(shí)施例B的產(chǎn)物。在冷凍干燥后，得到250mg的白色固體。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
實(shí)施例6制備下式的化合物 按照實(shí)施例1的方法制備上述化合物，只是采用等當(dāng)量的實(shí)施例C的產(chǎn)物代替實(shí)施例B的產(chǎn)物。在冷凍干燥后，得到220mg的白色固體。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
實(shí)施例7制備下式的化合物 在氮?dú)夥障?，在冰浴溫度下，向火焰干燥的燒瓶中溶解于無水DMA(50mL)中的來自實(shí)施例H的產(chǎn)物(7．8g，0．027mol)中緩慢地加入氯代甲酸異丁酯(3．7g，0．027mole)，隨后加入N-甲基嗎啉(2．73g，0．027mol)。將溶液在冰浴溫度下攪拌15分鐘。再在冰浴溫度下向反應(yīng)混合物中加入來自實(shí)施例L的產(chǎn)物(10．0g，0．024mol)，隨后再加入N-甲基嗎啉(2．43g，0．024mol)。然后，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜。將形成的酯中間體經(jīng)反相制備HPLC分離。向水(60mL)和CH3CN(30mL)中的酯中加入LiOH(10g，0．238mol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1小時(shí)。然后，用TFA將pH值降至2。產(chǎn)物經(jīng)反相制備HPLC純化，得到(冷凍干燥后)所需產(chǎn)物，為白色固體(9．7g)。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
實(shí)施例8
(S)3，5-二氯-2-羥基-β-[[2-[[[3-羥基-5-[(1，4，5，6-四氫-5-羥基嘧啶-2-基)氨基]苯基]羰基]氨基]乙?；鵠氨基]-苯丙酸，一鹽酸鹽一水合物制備下式的化合物 步驟A向溶解于無水DME(200mL)中的來自實(shí)施例H的產(chǎn)物(9．92g，0．0345mol)中加入N-甲基嗎啉(4．0mL，0．0362mol)。將反應(yīng)混合物冷卻至-5℃(鹽-冰浴)。在1分鐘內(nèi)加入氯代甲酸異丁酯IBCF(4．48mL，4．713g，0．0345mol)，將反應(yīng)混合物在冰浴溫度下攪拌12分鐘。然后，在冰浴溫度下，向反應(yīng)混合物中加入來自實(shí)施例I的產(chǎn)物(11．15g，0．030mol)，隨后再加入N-甲基嗎啉(4．0mL，0．0362mol)。將反應(yīng)混合物升溫至室溫，并進(jìn)行至完成，然后，在50℃及真空下進(jìn)行濃縮，得到一種黑色的殘余物。將殘余物溶解于乙腈∶水(約50mL)。加入少量的TFA使pH值呈酸性。將殘余物上10 x 500cm C-18(50μ粒徑)柱，分離出所需產(chǎn)物的酯(溶劑程序100％ H2O+0．05％ TFA至30∶70 H2O+0．05％ TFA乙腈+0．05％ TFA，1小時(shí)，@100mL／分鐘溶劑程序在溶劑正面洗脫后開始)。制備RPHPLC純化導(dǎo)致形成經(jīng)冷凍干燥后的白色固體(10．5g)(50％)。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟B將步驟A得到的產(chǎn)物(約11g)溶解于二噁烷水中，溶液的pH值通過加入2．5NNaOH調(diào)節(jié)至約11．5(pH計(jì))。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌。定期通過加入堿將pH值調(diào)節(jié)至大于11。在2-3小時(shí)后，通過RPHPLC完全確認(rèn)酯轉(zhuǎn)化成酸。再將反應(yīng)混合物的pH值調(diào)節(jié)至約6，從溶液中沉淀出粘稠的油。通過潷析將這種油分離出來，用熱水(200mL)對(duì)其進(jìn)行洗滌。將形成的含水混合物冷卻，過濾收集固體，得到上述化合物(由鹽酸溶液冷凍干燥后2．6g)。將殘余物即黑色的粘稠油用熱水處理，經(jīng)冷卻后得到一種黃褐色的粉末(由鹽酸溶液冷凍干燥后4．12g)。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
實(shí)施例9(S)3-溴-5-氯-2-羥基-β-[[2-[[[3-羥基-5-[(1，4，5，6-四氫-5-羥基嘧啶-2-基)氨基]苯基]羰基]氨基]乙?；鵠氨基]苯丙酸，三氟乙酸鹽步驟1-制備下式的化合物 向來自實(shí)施例J的產(chǎn)物(1．0g，2．4mmol)，實(shí)施例H的產(chǎn)物(0．75g，2．6mmol)和4-二甲氨基吡啶(40mg)在N，N-二甲基乙酰胺(10mL)中的懸浮液中加入三乙胺(0．24g，2．4mmol)。將混合物在室溫下攪拌15分鐘，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(0．60g，3．1mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜。將混合物進(jìn)行真空濃縮，通過反相HPLC純化(開始梯度90∶10 H2O／TFA∶MeCN，保留時(shí)間22分鐘)，得到所需的產(chǎn)物(1．6g，52％)。
1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟2制備下式的化合物
向步驟1得到的酯(800mg，1．2mmol)在1∶4MeCN∶H2O(7mL)的溶液中加入氫氧化鋰(148mg，6．2mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。加入TFA(0．71mL，9．2mmol)，混合物用反相HPLC純化(開始梯度95∶5 H2O／TFA∶MeCN，保留時(shí)間24分鐘)，得到所需的產(chǎn)物(860mg，83％)。
分析計(jì)算值C22H23BrClN5O7+1．7 TFAC，39．18；H，3．20；N，8．99。
實(shí)測(cè)值C，39．11；H，3．17；N，9．07。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟3制備鹽酸鹽將步驟2的產(chǎn)物溶解于適宜的溶劑(乙腈∶水)中，將溶液緩慢地通過Bio-Rad AG2-8X(氯化物形式，200-400目，＞5當(dāng)量)離子交換柱。冷凍干燥后得到所需的鹽酸鹽形式的產(chǎn)物。
實(shí)施例10制備下式的化合物 采用實(shí)施例8的方法制備上述化合物，只是在實(shí)施例8的步驟A中采用實(shí)施例N的產(chǎn)物代替實(shí)施例I的產(chǎn)物。通過制備RPHPLC分離產(chǎn)物，經(jīng)冷凍干燥后得到THF鹽形式的所需產(chǎn)物。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
實(shí)施例11制備下式的化合物 采用實(shí)施例8的方法制備上述化合物，只是在實(shí)施例8的步驟A中采用實(shí)施例M的產(chǎn)物代替實(shí)施例I的產(chǎn)物。通過制備RPHPLC分離產(chǎn)物，經(jīng)冷凍干燥后得到THF鹽形式的所需產(chǎn)物。
MS和1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
實(shí)施例12制備下式的化合物 采用實(shí)施例8的方法制備上述化合物，只是在實(shí)施例8的步驟A中采用實(shí)施例P的產(chǎn)物代替實(shí)施例I的產(chǎn)物。通過制備RPHPLC分離產(chǎn)物，經(jīng)冷凍干燥后得到THF鹽形式的所需產(chǎn)物。
實(shí)施例13制備下式的化合物 制備2-O-(MEM)-3，5-二碘水楊醛 在20℃下，將碳酸鉀(18．5g，0．134mol)加至3，5-二碘水楊醛(50．0g，0．134mol)的DMF(150mL)溶液中，得到一種黃色的漿液。然后，在保持溫度為反應(yīng)溫度下加入MEM-Cl(15．8mL，0．134mol)。在攪拌2小時(shí)后，再加入MEM-Cl(1．5g)。在攪拌1小時(shí)后，將反應(yīng)混合物倒入冰-水混合物中，攪拌。形成沉淀，過濾，真空中干燥，獲得所需保護(hù)的醛(61g，收率99％)。
1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟2制備下式的化合物 在室溫下，將(S)-苯基氨基乙醇(17．9g，0．13mol)加至2-O-(MEM)-3，5-二碘水楊醛(41．5g，0．112mol)的THF(150mL)溶液中。在攪拌1小時(shí)后，加入硫酸鎂(20．7g)，再攪拌2小時(shí)。將反應(yīng)混合物過濾，將濾液濃縮，真空干燥2小時(shí)。在2頸圓底燒瓶中加入雷福爾馬茨基試劑(96g，0．289mol)和N-甲基吡咯烷酮(250mL)，并在-10℃下攪拌。在保持溫度為-10℃下緩慢加入亞胺的N-基吡咯烷酮(100mL)溶液。將混合物保持在該溫度2小時(shí)，并在-5℃下保持1小時(shí)。在將反應(yīng)混合物冷卻至-10℃后，加入濃鹽酸在飽和氯化銨(16mL／200mL)中的溶液。加入乙醚(500mL)，并在室溫下攪拌該混合物2小時(shí)。分離出醚層，水層再用乙醚(300mL)萃取。合并后的醚層用飽和氯化銨水溶液(200mL)，水(200mL)，鹽水(200mL)洗滌，用硫酸鎂干燥，濃縮，得到一種油(90．0g，收率99％)。NMR表明了所需的產(chǎn)物并為一種非對(duì)映異構(gòu)體。
步驟3制備下式化合物 將來自步驟2的粗酯(14．0g，20．1mmol)的溶液溶解于乙醇(100mL)中，并冷卻至0℃。一次性加入四乙酸鉛(9．20g，20．75mmol)。3小時(shí)后，向反應(yīng)混合物中加入15％的NaOH(73mL)溶液。通過減壓除去大部分的乙醇。向殘余物中加入15％的NaOH(200mL)，然后用乙醚(400mL)萃取。醚層用水(100mL)、鹽水(100mL)洗滌，干燥，濃縮，獲得一種橙色油。將這種油溶解于乙醇(100mL)中，加入對(duì)甲苯磺酸(6．08g)。將溶液在回流下加熱8小時(shí)，減壓濃縮。將殘余物用THF(60mL)稀釋，在回流下加熱，冷卻。在貯藏后，未形成沉淀。將反應(yīng)混合物濃縮，通過制備HPLC純化，得到PTSA鹽形式的氨基酸。將所獲得的固體溶解于乙醇中，并用氯化氫氣體飽和。將反應(yīng)混合物加熱回流6小時(shí)。將反應(yīng)混合物濃縮，得到所需氨基酸的PTSA鹽(12．47g)。
步驟4制備3-(N-BOC-gly)-氨基-3-(S)-(3，5-二碘-2-羥基苯基)丙酸乙酯
向BOC-gly-OSu(7．48g，27．04mmol)，3-(S)-氨基-3-(3，5-二碘-2-羥基苯基)丙酸乙酯PTSA鹽(12．47g，27．04mmol)在DMF(100mL)中的混合物中加入三乙胺(3．8mL)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18小時(shí)。真空除去DMF，將殘余物在乙酸乙酯(600mL)與稀鹽酸(100mL)間分配。有機(jī)層用碳酸氫鈉(200mL)，鹽水(200mL)洗滌，用硫酸鎂干燥，濃縮，得到所需產(chǎn)物，為一種固體(17．0g，收率96％)。1H NMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟5制備3-(N-gly)-氨基-3-(3，5-二碘-2-羥基苯基)-丙酸乙酯鹽酸鹽 在0℃下，將二噁烷／HCl(4N，40mL)加至3-(N-BOC-gly)-氨基-3-(S)-(3，5-二碘-2-羥基苯基)丙酸乙酯(17．0g，25．97mmol)中，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌3小時(shí)。將反應(yīng)混合物濃縮，在加入甲苯(100mL)后，再進(jìn)行一次濃縮。將獲得的殘余物干燥，得到所需的產(chǎn)物，為一種結(jié)晶粉末(8．0g，收率56％)。1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
步驟6將間-(5-羥基嘧啶子基(pyrimidino))馬尿酸(3．74g，12．98mmol)在二甲基乙酰胺(25mL)中的溶液加熱直至所有的物質(zhì)溶解。然后，將其冷卻至0℃，一次性加入氯代甲酸叔丁酯(1．68mL)，再加入N-甲基嗎啉(1．45mL)。10分鐘后，一次性加入3-(N-gly)-氨基-3-(3，5-二碘-2-羥基苯基)-丙酸乙酯鹽酸鹽(6．0g，10．82mmol)，再加入N-甲基嗎啉(1．45mL)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18小時(shí)。將反應(yīng)混合物濃縮，將殘余物溶解于四氫呋喃／水(1∶1，20mL)中，進(jìn)行色譜處理(反相，95∶5水∶乙腈，60分鐘，至30∶70水∶乙腈，包含0．1％TFA)。將合并的餾分濃縮。將殘余物溶解于乙腈水中，加入氫氧化鋰直至成堿性。將溶液攪拌2小時(shí)。將反應(yīng)混合物濃縮，并如前所述進(jìn)行HPLC純化，獲得作為THA鹽的所需酸。通過使其通過離子交換柱及經(jīng)過冷凍干燥，將TFA鹽轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的鹽酸鹽。1HNMR與所需結(jié)構(gòu)一致。
實(shí)施例14-18式VII、VIII、IX、XIII和XIV的化合物及其異構(gòu)體可按照本文所述的方法制備，只需采用適宜的原料和試劑，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。
在下列試驗(yàn)中檢測(cè)本發(fā)明化合物的活性。在這些試驗(yàn)中檢測(cè)的結(jié)果列于表1。玻聯(lián)蛋白粘著試驗(yàn)材料如前所述[Pytela等，Methods in Enzymology，144475-489(1987)]從人胎盤中純化人玻聯(lián)蛋白受體(αvβ3)。如前所述[Yatohgo等，Cell Structure and Function，13281-292(1988)]從新鮮冷凍血漿中純化人玻聯(lián)蛋白。通過偶聯(lián)NHS-生物素制備生物素化的人玻聯(lián)蛋白以便如前所述[Charo等，J．Biol．Chem．，266(3)1415-1421(1991)]純化玻聯(lián)蛋白，該NHS-生物素得自Pierce ChemicalCompany(Rockford，IL)。試驗(yàn)緩沖液、OPD底物片和RIA級(jí)BSA得自Simga(St．Louis，MO)?？股锼乜贵w得自Calbiochem(La Jolla，CA)。Linbro微量滴定板得自Flow Labs(Mclean，VA)。ADP試劑得自Sigma(St．Louis，MO)。方法固相受體試驗(yàn)此試驗(yàn)與以前報(bào)告的方法[Niiya等，Blood，70475-483(1987)]基本相同。在Tris緩沖鹽水中將純化的人玻聯(lián)蛋白受體(αvβ3)由貯存液稀釋至1．0g／ml，該緩沖液含1．0mM鈣離子、鎂離子和錳離子，pH 7．4(TBS+++)。將此稀釋的受體立即以100μL／孔(100ng受體／孔)轉(zhuǎn)移至Linbro微量滴定板中。將這些板密封并在4℃孵育過夜以便使此受體與孔結(jié)合。所有其余步驟在室溫下進(jìn)行。將這些測(cè)試板排空并加入存在于TBS+++的200L的1％RIA級(jí)BSA(TBS+++／BSA)以封閉暴露的塑料表面。孵育2小時(shí)后，用96孔板洗滌器用TBS+++洗滌檢測(cè)板。將被測(cè)化合物和對(duì)照進(jìn)行對(duì)數(shù)系列稀釋，開始濃度為貯液濃度2mM，并用存在于TBS+++／BSA中的2nM生物素化的玻聯(lián)蛋白作為稀釋劑。這樣便將標(biāo)記的配體與被測(cè)(或?qū)φ?配體預(yù)混和，隨后用CETUS Propette儀將50L等份轉(zhuǎn)移至被測(cè)板中；該標(biāo)記配體的最終濃度為1nM，而被測(cè)化合物的最高濃度為1．0×10-4M。競(jìng)爭(zhēng)發(fā)生2小時(shí)，然后如上所述用板洗滌器洗滌所有的孔。將親和純化的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗生物素抗體在TBS+++／BSA中1∶3000稀釋，并向每個(gè)孔中加入125μL。30分鐘后，洗滌這些板并將OPD／H2O底物在100mM／L枸櫞酸鹽緩沖液(pH5．0)中培養(yǎng)。用微量滴定板讀數(shù)器在波長(zhǎng)450nm讀取這些板的數(shù)值，并當(dāng)最大結(jié)合控制孔達(dá)到吸收基值約1．0時(shí)，記錄最后的A450以供分析。用大寫結(jié)合EXCEL寬帶程序分析數(shù)據(jù)。用兩個(gè)同樣的濃度確定平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和％CV。平均值A(chǔ)450值標(biāo)準(zhǔn)化為四個(gè)最大結(jié)合對(duì)照的平均值(沒有加入競(jìng)爭(zhēng)劑)(B-MAX)。將標(biāo)準(zhǔn)化的值實(shí)行四參數(shù)曲線算法[Rodbard等，Int．Atomic Energy Agency，Vienna，pp 469(1997)]，以半對(duì)數(shù)比例繪制，并計(jì)算相應(yīng)于抑制50％的生物素化玻聯(lián)蛋白最大結(jié)合的濃度(IC50)及相應(yīng)于所報(bào)告化合物的R2使該化合物在被測(cè)最高濃度表現(xiàn)出大于50％抑制的濃度。否則，IC50報(bào)告為超過被測(cè)的最高濃度。β-[[2-[[5-[(氨基亞氨基甲基)-氨基]-1-氧代戊基]-1-氧代乙基]氨基]-3-吡啶丙酸[USSN 08／375338，實(shí)施例1]是強(qiáng)αvβ3拮抗劑(IC50為3-10nM)，將其在每個(gè)板中作為陽性對(duì)照。
純化的IIb／IIIa受體試驗(yàn)材料由過期的血小板中純化人纖維蛋白原受體(αIIbβ3)(Pytela，R．Pierschbacher，M．D．，Argraves，S．，Suzuki，S．和Rouslahti，E．“精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸粘著受體”，Methods in Enzymology 144(1987)475-489)。按照Yatohgo，T．，Izumi，M．，Kashivagi，H．和Hayashi，M．，“由人血漿通過肝素親和色譜純化玻聯(lián)蛋白的新方法”，CellStructure and Function 13(1988)281-292所述的方法從新鮮冷凍血漿中純化人玻聯(lián)蛋白。通過偶聯(lián)NHS-生物素制備生物素化的人玻聯(lián)蛋白以便如前所述純化玻聯(lián)蛋白(Charo，I．F．，Nannizzi，L．，Phillips，D．R．，Hsu，M．A．，Scaround Bottomorough，R．M．，“用GP IIIa肽抑制纖維蛋白原與GP IIb／IIIa的結(jié)合”，J．Biol．Chem．，266(3)(1991)1415-1421)，該NHS-生物素得自Pierce Chemical Company(Rockford，IL)。試驗(yàn)緩沖液、OPD底物片和RIA級(jí)BSA得自Simga(St．Louis，MO)。抗生物素抗體得自Calbiochem(La Jolla，CA)。Linbro微量滴定板得自Flow Labs(Mclean，VA)。ADP試劑得自Sigma(St．Louis，MO)。方法固相受體試驗(yàn)此試驗(yàn)與Niiya，K．，Hodson，E．，Bader，R．，Byers-Ward，V．，Koziol，J．A．，Plow，E．F．和Ruggeri，Z．M．，“血小板活化誘導(dǎo)的膜糖蛋白IIb／IIIa復(fù)合物的增加的表面表達(dá)纖維蛋白原結(jié)合和血小板凝集的關(guān)系”，Blood 70(1987)475-483報(bào)告的基本相同。在Tris緩沖鹽水中將純化的人玻聯(lián)蛋白受體(αIIIbβ3)由貯存液稀釋至1．0μg／ml，該緩沖液含1．0mM鈣離子、鎂離子和M++，pH7．4(TBS+++)。將此稀釋的受體立即以100μL／孔(100ng受體／孔)轉(zhuǎn)移至Linbro微量滴定板中。將這些板密封并在4℃孵育過夜以便使此受體與孔結(jié)合。所有其余步驟在室溫下進(jìn)行。將這些測(cè)試板排空并加入存在于TBS+++的200μL的1％RIA級(jí)BSA(TBS+++／BSA)以封閉暴露的塑料表面。孵育2小時(shí)后，用96孔板洗滌器用TBS+++洗滌檢測(cè)板。將被測(cè)化合物和對(duì)照進(jìn)行對(duì)數(shù)系列稀釋，開始濃度為貯液濃度2mM，并用存在于TBS+++／BSA中的2nM生物素化的玻聯(lián)蛋白作為稀釋劑。這樣便將標(biāo)記的配體與被測(cè)(或?qū)φ?配體預(yù)混和，隨后用CETUS Propette儀將50μL等份轉(zhuǎn)移至被測(cè)板中；該標(biāo)記配體的最終濃度為1nM，而被測(cè)化合物的最高濃度為1．0×10-4M。競(jìng)爭(zhēng)發(fā)生2小時(shí)，然后如上所述用板洗滌器洗滌所有的孔。將親和純化的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗生物素抗體在TBS+++／BSA中1∶3000稀釋，并向每個(gè)孔中加入125μL。30分鐘后，洗滌這些板并將OPD／H2O底物在100mM／L枸櫞酸鹽緩沖液(pH5．0)中培養(yǎng)。用微量滴定板讀數(shù)器在波長(zhǎng)450nm讀取這些板的數(shù)值，并當(dāng)最大結(jié)合控制孔達(dá)到吸收基值約1．0時(shí)，記錄最后的A450以供分析。用大寫結(jié)合EXCELTM寬帶程序分析數(shù)據(jù)。用兩個(gè)同樣的濃度確定平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和％CV。平均值A(chǔ)450值標(biāo)準(zhǔn)化為四個(gè)最大結(jié)合對(duì)照的平均值(沒有加入競(jìng)爭(zhēng)劑)(B-MAX)。將標(biāo)準(zhǔn)化的值實(shí)行四參數(shù)曲線算法[Rodbard等，Int．Atomic Energy Agency，Vienna，pp 469(1997)]，以半對(duì)數(shù)比例繪制，并計(jì)算相應(yīng)于抑制50％的生物素化玻聯(lián)蛋白最大結(jié)合的濃度(IC50)及相應(yīng)于所報(bào)告化合物的R2使該化合物在被測(cè)最高濃度表現(xiàn)出大于50％抑制的濃度。否則，IC50報(bào)告為超過被測(cè)的最高濃度。β-[[2-[[5-[(氨基亞氨基甲基)-氨基]-1-氧代戊基]-1-氧代乙基]氨基]-3-吡啶丙酸[USSN 08／375338，實(shí)施例1]是強(qiáng)αvβ3拮抗劑(IC50為3-10nM)，將其在每個(gè)板中作為陽性對(duì)照。富含人血小板的血漿試驗(yàn)從志愿者人群中選擇健康的、沒有服用阿斯匹林供者。采集富含血小板的血漿并隨后如Zucker，M．B．，“用光度學(xué)方法檢測(cè)血小板凝集”，Methods in Enzymology 169(1989)117-133所述進(jìn)行ADP誘發(fā)的血小板凝集檢測(cè)。用蝶形針(butterfly)采用標(biāo)準(zhǔn)靜脈穿刺術(shù)在60ml注射器中采集血全血45ml，該注射器中裝有5ml 3．8％枸櫞酸三鈉。在此注射器中徹底混和，將此抗凝的全血轉(zhuǎn)移至50ml圓錐形聚乙烯管中。室溫下以200mg將此血離心12分鐘以沉淀非血小板細(xì)胞。將富含血小板的血漿轉(zhuǎn)移至聚乙烯管中并在室溫下保存?zhèn)溆?。將剩余的血液?000×g離心第二次離心15分鐘以獲得血小板較少的血漿。血小板計(jì)數(shù)一般為300000至500000每微升。將富含血小板血漿(0．45ml)等份入硅化比色杯中并在37℃攪拌(1100rpm)1分鐘，之后加入50μL的預(yù)稀釋的被測(cè)化合物。混和1分鐘后，通過加入50μL的200μM ADP引起凝集。在Payton雙信道凝集計(jì)量器(Payton Scientific，Buffalo，NY)中記錄凝集3分鐘。將被測(cè)化合物系列稀釋度的最大反應(yīng)(鹽水對(duì)照)的抑制百分率用來確定劑量反應(yīng)曲線。所有的化合物雙份檢測(cè)并從化合物劑量反應(yīng)曲線中用圖形計(jì)算表現(xiàn)出50％或在被測(cè)最高濃度的更大抑制的半數(shù)最大抑制(IC50)的濃度；否則，IC50報(bào)告為比此被測(cè)最大濃度更大。
權(quán)利要求
1．下式的化合物及其藥用鹽 其中X和Y為相同或不同的鹵素基團(tuán)；R是H或低級(jí)烷基。
2．選自如下的權(quán)利要求1的化合物或其藥用鹽 其中R是H或烷基。
3．選自如下的權(quán)利要求1的化合物或其藥用鹽
4．一種藥物組合物，其中含有有效量的權(quán)利要求1的化合物及藥用載體。
5．一種藥物組合物，其中含有有效量的權(quán)利要求2的化合物及藥用載體。
6．一種藥物組合物，其中含有有效量的權(quán)利要求3的化合物及藥用載體。
7．治療需要此治療的哺乳動(dòng)物的由αvβ3整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的病癥的方法，該方法包括使用抑制αvβ3有效量的權(quán)利要求1所述的化合物。
8．治療需要此治療的哺乳動(dòng)物的由αvβ3整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的病癥的方法，該方法包括使用抑制αvβ3有效量的權(quán)利要求2所述的化合物。
9．治療需要此治療的哺乳動(dòng)物的由αvβ3整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的病癥的方法，該方法包括使用抑制αvβ3有效量的權(quán)利要求3所述的化合物。
10．權(quán)利要求7的方法，其中所治療的病癥是腫瘤轉(zhuǎn)移。
11．權(quán)利要求8的方法，其中所治療的病癥是腫瘤轉(zhuǎn)移。
12．權(quán)利要求9的方法，其中所治療的病癥是腫瘤轉(zhuǎn)移。
13．權(quán)利要求7的方法，其中所治療的病癥是實(shí)體瘤生長(zhǎng)。
14．權(quán)利要求8的方法，其中所治療的病癥是實(shí)體瘤生長(zhǎng)。
15．權(quán)利要求9的方法，其中所治療的病癥是實(shí)體瘤生長(zhǎng)。
16．權(quán)利要求7的方法，其中所治療的病癥是血管生成。
17．權(quán)利要求8的方法，其中所治療的病癥是血管生成。
18．權(quán)利要求9的方法，其中所治療的病癥是血管生成。
19．權(quán)利要求7的方法，其中所治療的病癥是骨質(zhì)疏松。
20．權(quán)利要求8的方法，其中所治療的病癥是骨質(zhì)疏松。
21．權(quán)利要求9的方法，其中所治療的病癥是骨質(zhì)疏松。
22．權(quán)利要求7的方法，其中所治療的病癥是噁性腫瘤體液血鈣過多。
23．權(quán)利要求8的方法，其中所治療的病癥是噁性腫瘤體液血鈣過。
24．權(quán)利要求9的方法，其中所治療的病癥是噁性腫瘤體液血鈣過多。
25．權(quán)利要求7的方法，其中所治療的病癥是平滑肌細(xì)胞遷移。
26．權(quán)利要求8的方法，其中所治療的病癥是平滑肌細(xì)胞遷移。
27．權(quán)利要求9的方法，其中所治療的病癥是平滑肌細(xì)胞遷移。
28．權(quán)利要求7的方法，其中再狹窄被抑制。
29．權(quán)利要求8的方法，其中再狹窄被抑制。
30．權(quán)利要求9的方法，其中再狹窄被抑制。
31．權(quán)利要求7的方法，其中所治療的病癥是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
32．權(quán)利要求8的方法，其中所治療的病癥是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
33．權(quán)利要求9的方法，其中所治療的病癥是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
34．權(quán)利要求7的方法，其中所治療的病癥是黃斑變性。
35．權(quán)利要求8的方法，其中所治療的病癥是黃斑變性。
36．權(quán)利要求9的方法，其中所治療的病癥是黃斑變性。
全文摘要
本發(fā)明涉及用作α
文檔編號(hào)A61K31/675GK1291978SQ99803581
公開日2001年4月18日 申請(qǐng)日期1999年2月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月4日
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