以盤基網(wǎng)柄菌吡喃酮衍生物或二氫盤基網(wǎng)柄菌吡喃酮衍生物為有效成分的骨橋蛋白產(chǎn)生 ...的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及能夠預防或改善因骨橋蛋白（osteopontin ;0ΡΝ)產(chǎn)生充進而引起的 疾?。ɡ?，癌轉(zhuǎn)移）的、以盤基網(wǎng)柄菌吡喃酮（Dictyopyrone)衍生物或二氫盤基網(wǎng)柄菌 P比喃酮（Dihydrodictyopyrone)衍生物為有效成分的OPN產(chǎn)生抑制劑。
【背景技術(shù)】
[0002] OPN是被鑒定為構(gòu)成鈣沉積的骨組織的基質(zhì)（matrix)的主要非骨膠原性蛋白質(zhì) 且分子量為41kDa的分泌型酸性磷酸化糖蛋白質(zhì)。已確認其在乳汁、尿、腎小管、破骨細胞、 成骨細胞、巨噬細胞、活化T細胞以及較多的腫瘤組織中表達廣泛。OPN被認為在骨基質(zhì)中 發(fā)揮連接破骨細胞和羥磷灰石的架橋的作用（非專利文獻1)，但是除此以外還報告稱具有 參與細胞粘著、細胞迀移、一氧化氮產(chǎn)生的抑制、腫瘤或免疫系統(tǒng)的多種功能。
[0003] OPN表達與腫瘤的發(fā)展相關(guān)，并且表示與癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。在肺癌、肝癌、乳癌或 前列腺癌的患者的血漿中檢測出OPN(非專利文獻2)，報告稱與正常部位相比癌部位的OPN mRNA上升（非專利文獻3)，并且報告稱神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的OPN表達也具有與惡性度相關(guān)的傾 向（非專利文獻4)。OPN表達與腫瘤的相關(guān)在動物模型中也被確認（非專利文獻5)。根據(jù) 這樣的與OPN相關(guān)的最近的見解認為抑制促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移以及侵襲的OPN的產(chǎn)生是防 止癌轉(zhuǎn)移的抗癌劑的一種新靶點（非專利文獻6)。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)文獻： 非專利文獻： 非專利文南犬 I :Miyauchi A, Alvarez J, Greenfield EM, Teti A, Grano M, Colucci S, Zambonin-Zallone A,Ross FP,Teitelbaum SL,Cheresh D,Hruska KA. (1991) Recognition of osteopontin and related peptides by an alpha v beta 3integrin stimulates immediate cell signals in osteoclasts. J Biol Chem 266,20369-20374. 非專利文獻 2:Senger DR，Perruzzi CA,Gracey CF,Papadopoulos A，Tenen DG. (1988)Secreted phosphoproteins associated with neoplastic transformation: close homology with plasma proteins cleaved during blood coagulation. Cancer Res 48,5770 - 5774. 非 專利 文南犬 3 ：Brown LFj Papadopo μ Los-Seigiou A, Brygida B，Manseau EJ，Tognazzi K，Perruzzi CA, Dvorak HF, Senger DR. (1994)Osteopontin expression in human carcinoma. Am J Pathol. 145, 610 - 623. 非專利文獻 4 :Saitoh Y，Kuratsu JI，Takeshima H，Yamamoto S，Ushio Y (1995) Expression of osteopontin in human glioma. Lab Invest 72,55-63. 非專利文獻 5 :Suzuk M，Mose E，Galloy C，and Tarin T(2007)Osteopontin Gene Expression Determines Spontaneous Metastatic Performance of Orthotopic Human Breast Cancer Xenografts. Am J Pathol 171,682 - 692. 非專利文獻6:Weber GF(2001)Review:The metastasis gene osteopontin:a candidate target for cancer therapy. Biochim Biophys Acta 1552,61-85. 非專利文獻 7 :Kikuchi H，Sasaki Kj Sekiya J，Maeda M，Amagai A，Kubohara Y and Oshima Y(2004)Dihydrodictyopyrone A and C:new members of dictyopyrone family isolated from Dictyostelium cellular slime molds Bioorg Med Chem 12,3203-3214. 非專利文獻8 :Matsuura M，Suzuki T，Suzuki M，Tanaka R，Ito E and Saito T(2011) Statin-mediated reduction of osteopontin expression induces apoptosis and cell growth arrest in ovarian clear cell carcinoma. Oncol Rep 25,41-47. 非 專利 文南犬 9 :Haruhisa Kikuchij Koji Nakamura, Yuzuru Kuboharaj Naomi Gokanj Kohei Hosakaj Yasuo Maedad and Yoshiteru Oshima，Tetrahedron Letters 48(2007)5905-5909.。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明要解決的問題： 如上所述，通過抑制OPN的產(chǎn)生，以此可以防止癌轉(zhuǎn)移。作為具有OPN產(chǎn)生抑制作用的 藥物，已知有作為PPAR-γ (Peroxysome Proliferator-Activated Receptor-γ ;過氧化物 酶體增殖物激活受體γ)激動劑的胰島素抵抗性改善藥（曲格列酮、匹格列酮、羅格列酮）、 非甾體抗炎藥（例如，吲哚美辛或布洛芬）以及作為HMG-CoA還原酶抑制劑的他汀類高膽 固醇血癥治療藥（例如，瑞舒伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他 汀、西立伐他汀、匹伐他汀以及美伐他?。?。
[0006] 另一方面，細胞性粘菌是廣泛分布于土壤表層中的一種原生生物，在生態(tài)循環(huán)中 同時具備動物性與植物性、單細胞與多細胞這樣的較大不同的性質(zhì)，并且包括如細胞運動、 細胞質(zhì)分裂或分化等的構(gòu)成多細胞生物的產(chǎn)生系統(tǒng)的主要過程。與天然化學中以往經(jīng)常利 用的生物種大為不同，因此期待產(chǎn)生各種新型化合物。
[0007] 本發(fā)明的目的是提供能夠預防因 OPN產(chǎn)生亢進而引起的疾?。ɡ绨┺D(zhuǎn)移）的 OPN產(chǎn)生抑制劑。
[0008] 解決問題的手段： 本發(fā)明人等為了發(fā)現(xiàn)抑制OPN的基因表達的化合物，而使用在OPN啟動子的控制下表 達報告基因的熒光素酶的細胞株，并且將如盤基網(wǎng)柄菌（D.discoideum)那樣的細胞性粘 菌的二次代謝產(chǎn)物作為對象進行了篩選。
[0009] 其結(jié)果是，本發(fā)明人等在盤基網(wǎng)柄菌吡喃酮衍生物以及二氫盤基網(wǎng)柄菌吡喃酮衍 生物中發(fā)現(xiàn)了抑制熒光素酶表達的化合物。
[0010] 本發(fā)明人等又發(fā)現(xiàn)了這樣的抑制在OPN啟動子控制下的熒光素酶活性的化合物 會降低人小細胞肺癌細胞株A549或人肝癌細胞株H印G2所產(chǎn)生的OPN量。本發(fā)明人等進 一步通過細胞劃痕實驗（Wound-Healing assay)發(fā)現(xiàn)盤基網(wǎng)柄菌P比喃酮衍生物以及二氫盤 基網(wǎng)柄菌吡喃酮衍生物抑制OPN的生理功能的細胞迀移能力，并且通過基質(zhì)膠侵襲實驗發(fā) 現(xiàn)盤基網(wǎng)柄菌吡喃酮衍生物以及二氫盤基網(wǎng)柄菌吡喃酮衍生物抑制細胞的轉(zhuǎn)移以及侵襲 能力，從而完成本發(fā)明。
[0011] 具體而言，本發(fā)明涉及以盤基網(wǎng)柄菌吡喃酮衍生物或二氫盤基網(wǎng)柄菌吡喃酮衍生 物為有效成分的骨橋蛋白產(chǎn)生抑制劑。
[0012] 報告稱在盤基網(wǎng)柄菌吡喃酮衍生物以及二氫盤基網(wǎng)柄菌吡喃酮衍生物中存在具 有抑制人白血病細胞K562細胞的增殖的活性的化合物（非專利文獻7)，但是OPN產(chǎn)生抑制 劑作用至今未被報道。
[0013] 作為盤基網(wǎng)柄菌吡喃酮衍生物，優(yōu)選的是化學式1或化學式2表示的化合物。
[0016] 作為二氫盤基網(wǎng)柄菌吡喃酮衍生物，優(yōu)選的是化學式3或化學式4表示的化合物。
[0019] 發(fā)明效果： 本發(fā)明的以盤基網(wǎng)柄菌吡喃酮衍生物以及二氫盤基網(wǎng)柄菌吡喃酮衍生物為有效成分 的OPN產(chǎn)生抑制劑是具有不同于胰島素抵抗性改善藥或他汀類高膽固醇血癥治療藥的作 用機理的OPN產(chǎn)生抑制劑。
【附圖說明】
[0020] 圖1示出通過添加化合物3 (化學式3示出的化合物）而產(chǎn)生的A549細胞的OPN 產(chǎn)生抑制效果的圖表； 圖2示出通過添加化合物3 (化學式3示出的化合物）而產(chǎn)生的H印G2細胞的OPN產(chǎn) 生抑制效果的圖表； 圖3示出通過添加化合物3 (化學式3示出的化合物）而產(chǎn)生的A549細胞的創(chuàng)傷恢復 抑制效果的圖表； 圖4示出通過添加化合物3 (化學式3示出的化合物）而產(chǎn)生的A549細胞的基質(zhì)侵襲 抑制效果的圖表； 圖5示出相對于由SVS (simvastatin ;辛伐他汀）所產(chǎn)生的OPN產(chǎn)生量抑制效果的、通 過添加 MVA (mevalonic acid ;甲輕戊酸）而產(chǎn)生的恢復效果的圖表； 圖6示出相對于由化合物3所產(chǎn)生的OPN產(chǎn)生量抑制效果的、通過添加 MVA而產(chǎn)生的 影響的圖表。
【具體實施方式】
[0021] 關(guān)于本發(fā)明的實施形態(tài)，適當參照附圖進行說明。本發(fā)明不限于以下記載。
[0022] < A :0ΡΝ啟動子控制下的熒光素酶表達抑制效果的確認方法> 在pGL-3basic載體（Promega)的多克隆位點中組入人OPN啟動子序列（從一 765至 23)而形成的報告載體pOPNl-luc在轉(zhuǎn)染至動物細胞中時表達熒光素酶。將該pOPNl-luc 與表達噪呤霉素耐性基因（puromycin-N-acetyl-transferase gene)的 pPUR(Clontech) 一起轉(zhuǎn)染至人非小細胞肺癌細胞株A549,并且選擇了能夠在嘌呤霉素添加培養(yǎng)基中增殖且 表達熒光素酶的細胞。將選擇的細胞命名為A549/0PN1UC細胞，并且使用于后述的OPN啟 動子控制下的熒光素酶表達抑制效果的觀察中。
[0023] 將被試化合物添加到A549/0PN1UC細胞的培養(yǎng)液中，并且觀察了對細胞內(nèi)的熒光 素酶表達量的影響。在這里，考慮到在被試化合物具有細胞毒性或細胞增殖抑制效果的情 況下，因依賴于被試化合物的濃度的活細胞數(shù)量的減少而總熒光素酶表達量下降，無法正 確地評價被試化合物在OPN啟動子控制下的熒光素酶表達抑制效果。因此，首先實施作 為通過顯色測定對細胞增殖能力或細胞生存能力進行定量的方法的WST(water-soluble tetrazolium salt;水溶性四氮唑鹽）實驗，并且求出被試化合物對于細胞增殖的 IC50 (50%細胞增殖抑制濃度）。之后，實施熒光素酶活性測定，求出被試化合物對于OPN啟 動子控制下的熒光素酶表達的EC50 (50%熒光素酶表達抑制濃度）。
[0024] Al) WST 實驗 使A549/0PN1UC細胞在添加了 10%胎牛血清（FCS)以及1%青霉素-鏈霉素（P/S)的 DMEM培養(yǎng)基中達到3X 104cells/mL并懸浮于其中，并且將它向96孔板的各孔內(nèi)分別注入 100 μ L。由于將試驗重復實施三次（triplicate)，因此作為對照組以及各濃度的被試化合 物添加用孔，每個分別準備了三個孔。在分注后，將96孔板在二氧化碳培養(yǎng)器（37°C，5% CO2條件下）中培養(yǎng)24±4小時。
[0025] 將被試化合物通過二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide ;DMS0)形成50mmol/L溶液， 并且保存在一 80°C。為了 WST實驗，準備了將該被試化合物溶液通過DMSO稀釋為兩倍稀 釋系列（通常是0. 31mmol/L~20mmol/L的范圍）而濃度分別以兩倍變化的被試化合物溶 液。
[0026] 在加入了細胞懸浮液的各孔內(nèi)分別注入0. 5 μ L僅DMSO(對照）或者稀釋的被試 化合物（待測樣品）的溶液（稀釋200倍）。通過渦旋混合器（vortex mixer)混合后，將 96孔板在二氧化碳培養(yǎng)器（37°C，5% CO2條件下）中培養(yǎng)48±4小時。之后，將預混WST-I 試劑（Pr