調(diào)控AKT3基因表達(dá)的miRNA-382的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及能調(diào)節(jié)AKT3基因表達(dá)的小分子非編碼 RNA miRNA-382的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年全國(guó)累計(jì)登記吸毒人員295.5萬(wàn)名，其中濫用阿片類毒品人員 145.8萬(wàn)名、濫用合成毒品人員145.9萬(wàn)名，分別占49.3%和49.4%。
[0003] 1874年，英國(guó)倫敦圣瑪莉醫(yī)院的化學(xué)家萊特，在嗎啡中加入醋酸酢等物質(zhì)，首次提 煉出鎮(zhèn)痛效果更佳的半合成化衍生物，二乙酸嗎啡，運(yùn)就是最早合成的海洛因。海洛因成癒 是指任何原因引起的非醫(yī)療目的地濫用海洛因等阿片類藥物，濫用個(gè)體在難W自制的強(qiáng)迫 性反復(fù)連續(xù)用藥過程中，形成了藥理學(xué)和毒理學(xué)的精神依賴性與生理依賴性，一旦中斷用 藥即可出現(xiàn)戒斷癥狀和體征，使濫用個(gè)體處于一種阿片藥物的慢性中毒狀態(tài)。海洛因成癒 是一種慢性、復(fù)發(fā)性腦病，長(zhǎng)期成癒性藥物的使用可使神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生可塑性變化，分子和細(xì) 胞發(fā)生適應(yīng)性變化，運(yùn)些過程設(shè)及表觀遺傳學(xué)修飾。
[0004] MicroRNA,即miRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的小分子 非編碼RNA，其大小長(zhǎng)約20~25個(gè)核巧酸。成熟的miRNA是由較長(zhǎng)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過一系列 核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的，隨后組裝進(jìn)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing (3〇1啡1心1?15〇，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別祀信使1?酷，即1111?酷，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同 指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解祀mRNA或者阻遏祀mRNA的翻譯。最近的研究表明，miRNA參與各種各樣 的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、細(xì)胞增殖和調(diào)亡、脂肪代謝等等。研 究表明，miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平通過誘導(dǎo)mRNA的降解或抑制其翻譯從而抑制祀基因的表達(dá)，起 到調(diào)控基因表達(dá)的作用。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在神經(jīng)元細(xì)胞分化、突觸可塑性及藥物成癒過程 中發(fā)揮了重要的作用;在動(dòng)物組織和人類組織中均存在有穩(wěn)定表達(dá)的miRNA,且不會(huì)被內(nèi)源 性RNA酶降解，從而為成癒性疾病神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制研究提供了全新的視角。
[0005] 在我國(guó)海洛因吸食者占吸毒人員近50%，對(duì)于海洛因成癒治療主要將美沙酬口服 液作為治療藥物，對(duì)海洛因成癒者進(jìn)行長(zhǎng)期維持治療，目的是減輕其對(duì)海洛因的依賴，而美 沙酬本身具有成癒性，只是相比海洛因成癒性小，所W目前并沒有針對(duì)海洛因成癒的有效 藥物。因此，本領(lǐng)域迫切需要尋找能夠治療或抑制海洛因成癒的安全、有效的方法，并與之 相配合使用的藥物和檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述海洛因成癒無(wú)有效治療方式和藥物的技術(shù)問題，本發(fā)明公開了調(diào)控 AKT3基因表達(dá)的miRNA-382的用途，所述miRNA-382能特異性、高效性的與祀基因 AKT3結(jié)合， 下調(diào)祀基因表達(dá)，從而為海洛因復(fù)吸成癒提供一種有效的抑制方法，并基于此提供了 miRNA-382和AKT3基因在制備海洛因復(fù)吸藥物的用途。
[0007] 本發(fā)明人通過大量科學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠海洛因成癒和戒斷復(fù)吸后中腦伏隔核區(qū) miRNA-382表達(dá)量發(fā)生顯著變化，并由此推斷大鼠海洛因復(fù)吸行為與miRNA-382表達(dá)量有 關(guān)，通過科學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miRNA-382過表達(dá)可顯著抑制大鼠海洛因復(fù)吸行為。
[000引本發(fā)明公開了一種調(diào)控AKT3基因表達(dá)的miRNA-382在制備抑制海洛因復(fù)吸藥物中 的用途，所述miRNA-382核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述AKT3 mRNA核巧酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009] 在本發(fā)明公開的調(diào)控AKT3基因表達(dá)的miRNA-382在制備抑制海洛因復(fù)吸藥物中的 用途的一種較佳的實(shí)施例中，所述miRNA-382通過調(diào)節(jié)AKT3的表達(dá)量，W抑制海洛因復(fù)吸行 為。
[0010] 在本發(fā)明公開的調(diào)控AKT3基因表達(dá)的miRNA-382在制備抑制海洛因復(fù)吸藥物中的 用途的一種較佳的實(shí)施例中，過表達(dá)調(diào)節(jié)所述miRNA-382通過構(gòu)建含所述miRNA-382目標(biāo)基 因的慢病毒LV-miRNA-382并用所述LV-miRNA-382感染宿主細(xì)胞實(shí)現(xiàn)。
[0011] 在本發(fā)明公開的一種調(diào)控AKT3基因表達(dá)的miRNA-382在制備抑制海洛因復(fù)吸藥物 中的用途的一種較佳的實(shí)施例中，所述LV-miRNA-382的過表達(dá)慢病毒載體為化i-MCS-SV40-EGFP。
[0012] 本發(fā)明還公開了一種結(jié)合miRNA-382的AKT3基因在制備海洛因復(fù)吸藥物中的用 途，所述miRNA-382核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述AKT3 mRNA核巧酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0013] 在本發(fā)明公開的結(jié)合miRNA-382的AKT3基因在制備海洛因復(fù)吸藥物中的用途的一 種較佳的實(shí)施例中，所述miRNA-382通過調(diào)節(jié)AKT3的表達(dá)量，W抑制海洛因復(fù)吸行為。
[0014] 相較于相關(guān)技術(shù)，本發(fā)明提供的調(diào)控AKT3基因表達(dá)的miRNA-382的用途具有W下 有益效果：
[0015] -、成功建立大鼠海洛因自身給藥模型，為其他相關(guān)成癒性藥物研究提供參考。
[0016] 二、成功驗(yàn)證miRNA-382在海洛因自身給藥大鼠伏隔核中的表達(dá)變化，并與忍片結(jié) 果一致，并證明miRNA-382與大鼠海洛因成癒和復(fù)吸相關(guān)，為后續(xù)研究提供依據(jù)。
[0017] S、通過構(gòu)建LV-miRNA-382慢病毒表達(dá)載體可升高miRNA-382在伏隔核表達(dá)，干預(yù) AKT3mRNA表達(dá)，抑制海洛因成癒戒斷后線索誘導(dǎo)的復(fù)吸。
[001引四、通過包裝慢病毒LV-siRNA-AKT3驗(yàn)證AKT3蛋白表達(dá)與海洛因復(fù)吸相關(guān)。
[0019] 五、miRNA-382可用于作為針對(duì)海洛因成癒治療和抗復(fù)吸的基因藥物，干預(yù)AKT3表 達(dá)可作為潛在治療海洛因復(fù)吸的藥物祀標(biāo)，有望彌補(bǔ)現(xiàn)有無(wú)治療海洛因成癒和復(fù)吸的基因 藥物空白。
【附圖說明】
[0020] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使 用的附圖作簡(jiǎn)單的介紹。顯而易見，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可W根據(jù)運(yùn)些附圖獲得其它的 附圖，其中：
[0021 ]圖1為大鼠海洛因成癒模型建立折線圖；
[0022] 圖2(a)為戒斷后線索誘導(dǎo)海洛因復(fù)吸大鼠的伏隔核差異表達(dá)miRNA的聚類圖；
[0023] 圖2(b)為圖2(a)的部分放大圖；
[0024]圖3為大鼠海洛因成癒戒斷線索誘導(dǎo)后miRNA-382的RT-PCR表達(dá)量柱狀圖；
[002 引 圖 4(a)為 LV-miRNA-382表達(dá)載體 Ubi-MCS-SV40-EGFP 圖譜；
[0026] 圖 4 (b)為L(zhǎng)V-S iRNA-AKT3表達(dá)載體 Ue-MCS-Ub i -EGFP 圖譜；
[0027] 圖5為L(zhǎng)V-miRNA-382轉(zhuǎn)染腦區(qū)位置圖，圖5中（a)為4倍顯微鏡圖，圖5中（b)為10倍 顯微鏡圖，圖5中（C)為20倍顯微鏡圖；
[0028] 圖6為海洛因成癒模型大鼠伏隔核注射LV-miRNA-382后復(fù)吸行為測(cè)試柱狀圖；
[0029] 圖7為海洛因成癒模型大鼠伏隔核注射LV-miRNA-382的RT-PCR實(shí)驗(yàn)miRNA-382表 達(dá)量柱狀圖；
[0030] 圖8(a)為大鼠海洛因成癒戒斷14天線索誘導(dǎo)后與空白對(duì)照組AKT3蛋白聚丙締酷 胺凝膠電泳圖；
[0031] 圖8(b)為大鼠海洛因成癒戒斷14天線索誘導(dǎo)后與空白對(duì)照組AKT3蛋白表達(dá)量柱 狀圖；
[0032] 圖9為大鼠海洛因成癒戒斷14天線索誘導(dǎo)后與空白對(duì)照組RT-PCR實(shí)驗(yàn)AKT3 mRNA 表達(dá)量柱狀圖；
[0033] 圖10(a)為海洛因成癒模型大鼠伏隔核注射LV-miRNA-382后AKT3蛋白聚丙締酷胺 凝膠電泳圖；
[0034] 圖10(b)為海洛因成癒模型大鼠伏隔核注射LV-miRNA-382后AKT3蛋白表達(dá)量柱狀 圖；
[00巧]圖11為海洛因成癒模型大鼠伏隔核注射LV-miRNA-382后RT-PCR實(shí)驗(yàn)AKT3 mRNA表 達(dá)量柱狀圖；
[0036] 圖12為海洛因成癒模型大鼠伏隔核注射LV-siRNA-AKT3后復(fù)吸行為測(cè)試柱狀圖；
[0037] 圖13(a)為海洛因成癒模型大鼠伏隔核注射LV-siRNA-AKT3后AKT3蛋白聚丙締酷 胺凝膠電泳圖；
[0038] 圖13(b)為海洛因成癒模型大鼠伏隔核注射LV-siRNA-AKT3后AKT3蛋白表達(dá)量柱 狀圖；
[0039] 圖14為海洛因成癒模型大鼠伏隔核注射LV-siRNA-AKT3后RT-PCR實(shí)驗(yàn)AKT3 mRNA 表達(dá)量柱狀圖；
[0040] 圖15為AKT3WT和AKT3 mu化nt的表達(dá)載體SV40-LUC-MCS構(gòu)建圖譜；
[0041 ] 圖16為雙巧光素酶檢測(cè)miRNA-382干預(yù)AKT3基因后相對(duì)巧光表達(dá)量柱狀圖。
【具體實(shí)