一種水稻葉色調(diào)控蛋白及其編碼基因與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種葉色調(diào)控蛋白質(zhì)，如(A)Seq ID No：3所示的氨基酸序列；或(B)在(A)所限定的氨基酸序列中添加和/或取代和/或缺失一個或幾個氨基酸且具有調(diào)控葉色功能的由(A)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還公開了編碼上述蛋白質(zhì)的核酸(如SEQ ID No：1所示等)、含有該核酸的重組載體、轉(zhuǎn)化體、利用該核酸調(diào)控植物葉色的方法，以及上述蛋白、核酸等在調(diào)控植物葉色或植物雜交種純度鑒定中的應(yīng)用：本發(fā)明利用水稻白條紋葉突變體，通過圖位克隆技術(shù)克隆到了FS1基因，利用轉(zhuǎn)基因互補實驗鑒定該基因的功能，進(jìn)一步闡明了水稻葉綠體發(fā)育的遺傳機制及其作用機理，為生產(chǎn)實踐打下了基礎(chǔ)。
【專利說明】
一種水稻葉色調(diào)控蛋白及其編碼基因與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體的說，涉及一種水稻葉色調(diào)控蛋白及其編碼 基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 葉片作為植物進(jìn)行光合作用和呼吸作用的主要器官，能通過光合作用把光能轉(zhuǎn)變 為化學(xué)能，是人類主要的物質(zhì)和能量來源。在水稻中，葉片是光合作用的主要部分，水稻將 近有95%的干物質(zhì)積累是由光合作用合成的。葉色突變是指葉色表型發(fā)生了變異，主要表 現(xiàn)為不正常的白化、黃化、淺綠、綠白、白翠、黃綠和條紋等。突變基因直接或間接影響葉綠 素的合成和降解，改變?nèi)~綠素含量，所以大部分葉色突變體同時也是葉綠素突變體。葉色 突變通常在苗期表達(dá)，目前在水稻中已經(jīng)定位約80個葉色突變位點，并已成功克隆出多個 葉色相關(guān)基因。例如，水稻白條紋葉基因Stl(Stripe 1)編碼核糖核酸還原酶RNR小亞基 RNRS1，RNR調(diào)節(jié)DNA合成和修復(fù)過程中脫氧核糖核苷酸的形成速率，該基因功能缺失后導(dǎo) 致白條紋葉出現(xiàn)。
[0003] 水稻葉色突變體是研究葉綠體發(fā)育的良好材料，葉色基因為揭示葉綠體發(fā)育的分 子機制提供了切入點，如何發(fā)掘更多的葉色突變體，了解它們的分子作用機理，為生產(chǎn)實踐 提供理論基礎(chǔ)，實屬當(dāng)前重要研發(fā)課題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種能調(diào)控植物葉色的蛋白質(zhì)及其核酸，以及由 此獲得的重組載體、轉(zhuǎn)化體，和調(diào)控水稻葉色的方法及應(yīng)用。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種葉色調(diào)控蛋白質(zhì)，如（A)或（B)所示的序 列：
[0006] (A)Seq ID No :3所示的氨基酸序列；
[0007] (B)在（A)所限定的氨基酸序列中添加和/或取代和/或缺失一個或幾個氨基酸 且具有調(diào)控葉色功能的由（A)衍生的蛋白質(zhì)。
[0008] 上述SEQ ID No :3所示的蛋白質(zhì)屬于一類表達(dá)蛋白，為具有Hd結(jié)構(gòu)域的磷酸水解 酶類似蛋白。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種編碼上述蛋白質(zhì)的核酸。
[0010] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)，所述核酸為編碼上述蛋白質(zhì)的基因，所述基因如（a)、 (b)或（c)所示的序列：
[0011] (a)Seq ID No :1所示的核苷酸序列；
[0012] (b)其編碼區(qū)序列如Seq ID No : 2所示；
[0013] (c)在（a)所限定的核苷酸序列中添加和/或取代和/或缺失一個或多個核苷酸 而生成的可編碼具有調(diào)控葉色功能的蛋白質(zhì)的突變基因、等位基因或衍生物。
[0014] 上述Seq ID No :1所示的核苷酸序列被命名為水稻白條紋葉基因FS1，是一種從 水稻突變體fsl中克隆的新基因，其包括編碼FS1蛋白的編碼區(qū)序列（Seq ID N〇:2所示）。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種含有上述核酸的重組載體。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種含有上述核酸的轉(zhuǎn)化體。
[0017] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述轉(zhuǎn)化體的宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞或農(nóng)桿菌細(xì) 胞。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種調(diào)控植物葉色的方法，用上述的核酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，再將轉(zhuǎn) 化后的植物細(xì)胞培育成植株。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種上述的蛋白質(zhì)、核酸、重組載體或轉(zhuǎn)化體在如下（al)或（a2) 中的應(yīng)用：
[0020] (al)調(diào)控植物的葉色；
[0021] (a2)植物雜交種純度的鑒定。
[0022] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)，所述的植物為單子葉植物。
[0023] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)，所述單子葉植物為水稻。
[0024] 本發(fā)明利用水稻白條紋葉突變體，通過圖位克隆技術(shù)首次在水稻中克隆到了 FS1 (FINE STRIPE 1)基因，利用轉(zhuǎn)基因互補實驗鑒定該基因的功能，通過對FS1基因的功 能解讀，進(jìn)一步闡明了水稻葉綠體發(fā)育的遺傳機制及其作用機理，為生產(chǎn)實踐打下了基礎(chǔ)， 在生產(chǎn)實踐中可用以調(diào)整植物葉色或進(jìn)行植物雜交種純度的鑒定，提高水稻產(chǎn)量。
【附圖說明】
[0025] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0026] 圖1是突變體fsl與野生型材料的表型對比圖；
[0027] 圖2是突變體fsl與野生型葉肉細(xì)胞葉綠體結(jié)構(gòu)的對比圖；
[0028] 圖3是圖2的局部放大圖；
[0029] 圖4是突變體fsl與野生型葉綠素含量對比圖；
[0030] 圖5是FS1基因在水稻第1染色體上的初步定位圖；
[0031] 圖6是FS1基因的精細(xì)定位圖；
[0032] 圖 7 是 pCAMBIA1300-FSl 載體圖譜；
[0033] 圖8是功能互補實驗轉(zhuǎn)基因水稻植株的表型；
【具體實施方式】
[0034] 本發(fā)明的蛋白質(zhì)和核酸，是通過圖位克隆技術(shù)及轉(zhuǎn)基因互補實驗獲得的，獲得步 驟如下：
[0035] -、突變體fsl的分離和遺傳分析：
[0036] 本發(fā)明的水稻白條紋葉突變體fsl來自粳稻品種中花11 (Nipponbare)EMS(Ethyl Methyl Sulfonate)誘變產(chǎn)生的突變。通過與野生型的正反交實驗，證明該突變體受隱性單 基因控制，如圖1所示。
[0037] 二、突變體fsl與野生型葉肉細(xì)胞葉綠體結(jié)構(gòu)、葉綠素含量比較：
[0038] 突變體fsl葉肉細(xì)胞葉綠體中類囊體數(shù)目明顯下降，嗜鋨顆粒增加，淀粉含量明 顯減少（如圖2、3所示）。
[0039] 突變體fsl葉綠素a，葉綠素b和類胡蘿卜素含量相比野生型都顯著減少。（如圖 4所示）
[0040] 三、圖位克隆FS1基因：
[0041] 1)FS1的初步定位：
[0042] 為了分離FS1基因，本發(fā)明首先組建了一個定位群體，由fsl與秈稻品種 NJ06(Indica)雜交組配成匕定位群體，再通過圖位克隆的方法，利用STS、SSR等分子標(biāo)記 對FS1位點進(jìn)行初步定位，將其初步定位在第1染色體上，并介于RM3252與gcw47兩標(biāo)記 之間，見圖5。
[0043] 2)FS1的精細(xì)定位：
[0044] 通過對RM3252和gcw47兩個標(biāo)記之間的BAC序列分析，發(fā)展新的STS標(biāo)記將FS1 精確定位于BAC P0482C06上、gcw56和gcw24標(biāo)記之間50. 5kb范圍之內(nèi)（圖6,通過分析 此區(qū)段開放閱讀框（0RF)推測候選基因。
[0045] 3) FS1基因的鑒定和功能分析：
[0046] 通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，結(jié)果表明本發(fā)明獲得了使突變體恢復(fù)正常表型的轉(zhuǎn)基因水稻 (圖8)，證明了本發(fā)明正確克隆了 FS1基因，氨基酸序列分析表明FS1編碼一個具有HD結(jié) 構(gòu)域的磷酸水解酶類似蛋白。
[0047] 實施例1 :
[0048] 1、水稻材料
[0049] 水稻（Oryza sativa L.)突變體fsl，原始野生材料為粳稻品種"中花11"。fsl 來自中花llEMS(Ethyl Methyl Sulfonate)誘變產(chǎn)生的突變（如圖1所示）。fsl突變體 在中國浙江省境內(nèi)獲得。
[0050] fsl通過與野生型水稻（即，粳稻品種"中花11 "）的正反交實驗，證明該突變體 受隱性單基因控制。
[0051] 2、分析和定位群體：
[0052] 純合的fsl突變體和秈稻品種NJ06號進(jìn)行雜交，F(xiàn)i代自交，得到6500株F 2群體； 并從6500株匕群體中挑選出1900株具有白條紋表型的個體作為定位群體。在灌漿期每 株取1克左右的嫩葉，用來提取總DNA。
[0053] 3、SSR和STS標(biāo)記定位FS1基因：
[0054] 采用水稻微量DNA的快速提取方法從水稻葉片中提取用于基因定位的基因組 DNA。取大約0. 2g水稻葉片，經(jīng)液氮冷凍，在直徑5cm的小研缽中磨成粉狀，轉(zhuǎn)移到1. 5ml 離心管里提取DNA，獲得的DNA沉淀溶解于150 y 1超純水中。每一個PCR反應(yīng)用1 y 1 DNA 樣品。
[0055] 3. 1 FS1基因的初步定位：從fsl與NJ06號雜交組合的F2群體1900個隱性個體 中隨機選取200個隱性個體，組成的小群體進(jìn)行SSR分析，根據(jù)公布的粳稻和秈稻創(chuàng)建的分 子遺傳圖譜，選取近似均勻分布于各條染色體上的SSR引物，根據(jù)已知的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR 擴增。具體如下：
[0056] PCR 反應(yīng)體系為：100ng/yl 水稻基因組 DNA lyl, 10XPCR Buffer lyl，2mM dNTP 1 y 1，10 y M 引物 2 y 1，5U/ y 1 rTaq0.0 5 y 1，ddH20 4. 95 y 1，總體系為 10 y 1。
[0057] PCR擴增條件具體為：94°C預(yù)變性4分鐘；94°C變性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延 伸30秒，38個循環(huán)；
[0058] 經(jīng)4%瓊脂糖凝膠電泳分離和Gelred染色，檢測PCR產(chǎn)物的多態(tài)性，將FS1初步定 位在第1號染色體短臂上STS標(biāo)記和RM3252和gcw47之間。
[0059] 3. 2 FS1基因的精細(xì)定位：利用fsl與NJ06號組合的F2群體中共計 1700(1900-200 = 1700)株隱性個體，在初定位的基礎(chǔ)上繼續(xù)設(shè)計STS標(biāo)記，最終將FS1精 確定位于BAC P0482C06上、gcw56和gcw24標(biāo)記之間50. 5kb范圍之內(nèi)。引物序列如表1所 示：
[0060] 表1 FS1基因的定位標(biāo)記序列
[0062] 4、基因預(yù)測和比較分析：
[0063] 根據(jù)精細(xì)定位的結(jié)果，在50. 5kb范圍內(nèi)根據(jù)Rice Genome Annotation Project http://rice. plantbiology. msu. edu/)的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)在此IX間內(nèi)共有12個候選基因，其中 BAC克隆P0482C06上498454-506264區(qū)間被預(yù)測為編碼具有18個外顯子的Hddomain磷酸 水解酶蛋白。采用PCR方法分別從fsl和野生型品種基因組中擴增出這些候選基因進(jìn)行測 序分析。最終只發(fā)現(xiàn)fsl在該基因第17個外顯子發(fā)生了堿基A到T的替換，導(dǎo)致編碼蛋白 發(fā)生了變化。將這些結(jié)果分別重復(fù)驗證兩次，發(fā)現(xiàn)突變體fsl基因與野生型比較都有突變 事件的發(fā)生（測序引物序列見表2)。該基因在水稻中為一新的基因，編碼一個具有Hd結(jié)構(gòu) 域的磷酸水解酶。水稻中的FS1基因與大腸桿菌中的完全不同，同源性也較遠(yuǎn)。
[0064] PCR 反應(yīng)體系為：100ng/ y 1 水稻基因組 DNA 2 y 1，K0D Buffer 25 y 1，2mM dNTP 10 y 1，10 y M 引物 4 y 1，K0D Fx 1 y 1，ddH20 8 y 1，總體系為 50 y 1。
[0065] PCR擴增條件具體為：94°C預(yù)變性2分鐘；98°C變性10秒，60°C退火30秒，68°C延 伸90秒，35個循環(huán)；
[0066] 經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后切膠送測序公司測序（南京金斯瑞生物技術(shù)有限公 司），結(jié)果分析。
[0067] 表2 FS1基因的測序引物
[0069] 實施例2
[0070] 植物轉(zhuǎn)化
[0071] 將BAC克隆P0482C06用BamHI和Hindlll完全酶切，電泳分離后，回收12160bp 的DNA片段連接到pCAMBIA1300中，獲得了互補載體pCAMBIA1300-FSl，該克隆覆蓋了整個 0RF的基因組區(qū)域（即包含了 SEQ ID No :1所示的核苷酸序列），還包括ATG上游2, 400-bp 啟動子序列和TGA下游1959-bp終止子序列（如圖7所示），該載體可以表達(dá)有上述核苷酸 序列編碼的多肽或其同源類似物。這個質(zhì)粒通過電擊的方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)株系EHA105中轉(zhuǎn)化水稻。我們分別利用突變體幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織，經(jīng)過誘 導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)3周后，挑選生長旺盛愈傷用作轉(zhuǎn)化的受體。用含有雙元質(zhì)粒載體的EHA105 菌株侵染水稻愈傷，在黑暗、25°C條件下共培養(yǎng)3天后，在含有300mg/LG418的篩選培養(yǎng)基 上培養(yǎng)。篩選抗性愈傷在含有250mg/L G418預(yù)分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天左右。將預(yù)分化的 愈傷轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上在光照條件下培養(yǎng)。一個月左右得到抗性轉(zhuǎn)基因植株。對植株進(jìn)行 鑒定和連續(xù)的觀察，發(fā)現(xiàn)植株葉色恢復(fù)正常。通過上述轉(zhuǎn)基因技術(shù)，結(jié)果表明：本發(fā)明獲得 了使突變體恢復(fù)正常表型的轉(zhuǎn)基因水稻（如圖8所示）。
[0072] 由上述實驗結(jié)果可以確定，SEQ ID No :3所不的蛋白質(zhì)序列具有調(diào)控葉色的功能。 通過常規(guī)方法在上述氨基酸序列中添加和/或取代和/或缺失一個或幾個氨基酸而得到的 具有調(diào)控葉色功能的由上述序列衍生的蛋白質(zhì)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以合理預(yù)期其也屬于本 發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0073] 上述蛋白質(zhì)編碼的核酸可為cDNA或RNA或是如SEQ ID No :1所示的基因序列，該 基因的編碼區(qū)序列如SEQ ID No :2所示。通過常規(guī)方法在上述SEQ ID No :1所示的核苷酸 序列中添加和/或取代和/或缺失一個或多個核苷酸而得到的可編碼具有調(diào)控葉色功能的 蛋白質(zhì)的突變基因、等位基因或衍生物，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以合理預(yù)期其也屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
[0074] 上述實施例中僅列舉了 PCAMBIA1300作為重組載體的表達(dá)載體，以及以農(nóng)桿菌株 系EHA105作為轉(zhuǎn)化體的宿主細(xì)胞的優(yōu)選實施例，實際上，上述表達(dá)載體可以選擇現(xiàn)有較為 成熟的PCAMBIA1301或其他衍生植物表達(dá)載體等。上述轉(zhuǎn)化體的宿主細(xì)胞還可選擇大腸桿 菌細(xì)胞或植物細(xì)胞等。
[0075] 在生產(chǎn)實踐中，可將上述核酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)化后的植物細(xì)胞培育成植株。 通過該轉(zhuǎn)基因方法，利用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞以影響水稻葉綠體的發(fā)育，進(jìn)而可以 調(diào)控植物葉色，如影響水稻等單子葉植物的白條紋。
[0076] 另外，在生產(chǎn)實踐中，還可以將上述蛋白質(zhì)、核酸、重組載體或轉(zhuǎn)化體應(yīng)用在植物 雜交種純度的鑒定上。
[0077] 以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。有必要指出，本發(fā)明不局限于以上 實施例，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變 形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0078]
















【主權(quán)項】
1. 一種葉色調(diào)控蛋白質(zhì)，其特征在于，如（A)或（B)所示的序列： (A) Seq ID No :3所示的氨基酸序列； (B) 在（A)所限定的氨基酸序列中添加和/或取代和/或缺失一個或幾個氨基酸且具 有調(diào)控葉色功能的由（A)衍生的蛋白質(zhì)。2. -種編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸為編碼權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì) 的基因，所述基因如（a)、（b)或（c)所示的序列： (a) Seq ID No :1所示的核苷酸序列； (b) 其編碼區(qū)序列如Seq ID No :2所示； (c) 在（a)所限定的核苷酸序列中添加和/或取代和/或缺失一個或多個核苷酸而生 成的可編碼具有調(diào)控葉色功能的蛋白質(zhì)的突變基因、等位基因或衍生物。4. 一種含有權(quán)利要求2或3所述核酸的重組載體。5. -種含有權(quán)利要求2或3所述核酸的轉(zhuǎn)化體。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化體的宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì) 胞或農(nóng)桿菌細(xì)胞。7. -種調(diào)控植物葉色的方法，其特征在于，用權(quán)利要求2或3所述的核酸轉(zhuǎn)化植物細(xì) 胞，再將轉(zhuǎn)化后的植物細(xì)胞培育成植株。8. -種權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，或權(quán)利要求2或3所述的核酸，或權(quán)利要求4所述的 重組載體，或權(quán)利要求5或6所述的轉(zhuǎn)化體的應(yīng)用，其特征在于： (al)調(diào)控植物的葉色； 或（a2)植物雜交種純度的鑒定。9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8中所述的方法或應(yīng)用，其特征在于，所述的植物為單子葉植物。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法或應(yīng)用，其特征在于，所述單子葉植物為水稻。
【文檔編號】C12N15/82GK105820221SQ201510932901
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2015年12月14日
【發(fā)明人】郭龍彪, 錢前, 葛常偉, 任德勇, 薛大偉, 胡江, 胡時開, 董國軍, 曾大力
【申請人】中國水稻研究所