生物活性玻璃復合聚乳酸的蛋白、多肽緩釋微球及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明是一種新型的生物活性玻璃復合聚乳酸的蛋白、多肽緩釋微球及其制備方法，主要涉及醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著生物技術(shù)的高速發(fā)展，多肽、蛋白質(zhì)類藥物不斷涌現(xiàn)。目前已有35種重要治療藥物上市，生物技術(shù)與生物制藥企業(yè)的發(fā)展也日益全球化。生物技術(shù)藥物研究的重點是應用DNA重組技術(shù)開發(fā)可應用于臨床的多肽、蛋白、酶、激素、疫苗、細胞生長因子及單克隆抗體等。但這些藥物在胃腸道內(nèi)穩(wěn)定性差，易變性，易被消化酶降解，不易吸收。影響了它們口服給藥的生物利用度，目前蛋白質(zhì)類藥物大多采用注射方式給藥，因此如何減少注射次數(shù)/提高藥效成為蛋白、多肽類藥物注射給藥面臨的一個主要問題。
目前多肽、蛋白質(zhì)類藥物常用的劑型是注射用溶液劑或凍干粉針劑，多肽類藥物在血液中的半衰期一般很短，靜脈注射后很快就被清除或降解，因此需要經(jīng)常給藥，給病人帶來較多不便。因此，開展多肽、蛋白質(zhì)類生物大分子藥物緩擇或控釋制劑的研究已成為該類藥物制劑研究的熱點。目前研究最多的是微粒遞釋系統(tǒng)，即采用生物可降解聚合物為囊材包裹多肽、蛋白質(zhì)藥物制成微球制劑，使其在體內(nèi)達到緩擇或控程目的。聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)以其良好的生物相容性及生物降解性被美國FDA批準為藥用高分子材料?，F(xiàn)已有數(shù)個多肽類藥物長效注射微球產(chǎn)品批準上市，如曲普瑞林、丙氨瑞林、醋酸戈舍瑞林、奧曲肽此類微球制劑能使藥物延長釋放達I個月，甚至3個月。因此，以生物可降解聚合物為囊材的微囊化技術(shù)是開發(fā)研制多肽緩、控釋劑型的有效途徑，頗具發(fā)展前景。
[0003]目前國內(nèi)、外將蛋白、多肽類藥物制成緩釋微球的研究報道較多(ManishDiwanet al，Internat1nal Journal of Pharmaceutics, 252(1-2)，111-122;Jintian He etal, Internat1nal Journal of Pharmaceutics, 416(1)，69-76;)又例如在中國發(fā)明專利(公開號CN101536984A)-注射用重組人血管內(nèi)皮抑制素多孔緩釋微球及其制備方法中公開了一種以可生物降解乳酸-羥基乙酸聚合物為基質(zhì)的，包括重組人血管內(nèi)皮抑制素和致孔劑的注射用多孔緩釋微球及其制備方法，該方法可以使重組人血管內(nèi)皮抑制素在體內(nèi)緩慢釋放，并且可以通過致孔劑造成的表面多孔結(jié)構(gòu)達到藥物的完全釋放目的。但由于微球釋放過程中聚乳酸類材料降解產(chǎn)生的低PH值微觀環(huán)境，使蛋白類藥物降解、失活。能夠成功保持蛋白類藥物在微球制備工藝及體外釋放過程中的生物學活性并進行體內(nèi)研究的報道很少，目前唯一上市的蛋白類緩釋注射微球是美國Genentech，Inc公司采用低溫噴霧提取法開發(fā)的重組人生長激素PLGA微球(Nutropin Depot?)。然而使用這種方法需要相應的設(shè)備，樣品需要量大，成本高，難于推廣，并且這種方法只能改善保持蛋白在緩釋微球制備過程中活性的保持，還不能實現(xiàn)長期釋放過程的蛋白的活性保持，美國Genentech，Inc公司已經(jīng)于2004年停止該產(chǎn)品的生產(chǎn)和銷售。
[0004]目前國內(nèi)、外也有向聚乳酸類生物降解微球中加上Mg(0H) 2等堿性顆粒的研究。有研究發(fā)現(xiàn)在聚乳酸類生物降解微球中加上Mg(OH)2等堿性顆粒.模型藥物BSA的聚集情況得到改善，蛋白失活情況得到了改善(Zhu G et a I, Pharm Res.2000 Mar; 17(3): 351-357 ；Kang J et al ,B1materials.2002 Jan; 23( I): 239-45.) 0 但在常規(guī)向PLGA生物降解微球中加入Mg(OH)2顆粒的制備方法中Mg(0H)2不能全程中和PLGA的降解產(chǎn)物乳酸，只能在微球釋放前期起到維持蛋白類藥物穩(wěn)定的作用，在微球釋放的中后期，蛋白類藥物還是會由于處在低PH值的環(huán)境中而易于降解、失活。并且由于不同型號的聚乳酸類生物材料具有不同的降解速度，常規(guī)加入Mg(OH)2顆粒的方法，不能同步中和不同型號的聚乳酸類生物材料的降解所產(chǎn)生的低PH微觀環(huán)境。這樣常規(guī)向PLGA生物降解微球中加入Mg(OH)2顆粒的制備方法還是難于保持蛋白、多肽類藥物在儲存和釋放過程中的穩(wěn)定性。
[0005]生物活性玻璃(B1glass)是20世紀60年代由Larry Hench教授發(fā)明的基于Na2〇-CaO-S12為主體的透明生物活性材料，在其植入體內(nèi)后，接觸體液后，可以在材料界面誘發(fā)特殊的生理響應，緩慢形成具有堿性基團的碳酸羥基磷灰石(速率受Na2O-CaO-S12比例影響)，可引起組織間特殊生物反應從而導致移植材料與骨組織之間的成骨，能夠幫助骨組織以更快的速度再生和修復。經(jīng)過20多年的前期基礎(chǔ)及性能的完善，在90年代經(jīng)美國食品及藥品監(jiān)督管理局(FDA)正式批準應用于骨、齒科臨床，用于修復因各種原因?qū)е碌墓侨睋p，并取得良好的治療效果。目前國內(nèi)、外生物活性玻璃作為一種重要的醫(yī)學材料已經(jīng)廣泛應用于生物醫(yī)學等領(lǐng)域。但目前尚未有將生物活性玻璃應用于蛋白類緩釋注射微球制備的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明為了提高蛋白、多肽類藥物在儲存和釋放過程中的穩(wěn)定性采用的技術(shù)方案是:采用乳化溶劑揮干的方法制備生物活性玻璃復合的蛋白多肽類聚乳酸類緩釋微球體系。并在傳統(tǒng)微球制備方法的基礎(chǔ)上，添加生物活性玻璃，通過調(diào)整生物活性玻璃的組成的比例，達到與PLGA近似于同步的降解速率，通過碳酸羥基磷灰石的緩慢形成來中和PLGA緩慢降解過程中產(chǎn)生的低PH，從而同步提高蛋白、多肽類藥物在微球儲存和釋放過程中的穩(wěn)定性。
[0007]本發(fā)明主要包括主藥(蛋白或多肽類藥物)、生物活性玻璃、表面活性劑，聚乳酸類生物醫(yī)學材料等其它輔料組成。其中按重量份計，蛋白或多肽類藥物5?30份，聚乳酸類生物降解材料30?90份，生物活性玻璃5?50份。
[0008]所述的蛋白、多肽類藥物，包括但不局限于以下蛋白、多肽類藥物:溶菌酶、牛胰島素、人胰島素、骨膠原形成蛋白(BMP)，血管生長因子(VEGF)、醋酸奧曲肽、降鈣素、重組人生長激素、醋酸亮丙瑞林、重組人干擾素等。
[0009]本發(fā)明所選用聚乳酸類生物醫(yī)學材料作為緩釋材料，包括聚乳酸(PLA)或者PLGA。
[0010]表面活性劑選自吐溫40、60，80或者司盤40、60，80。
[0011]生物活性玻璃的S12: CaO: P2O5摩爾比可在26:70:4?70:15:15之間；
本專利還提供制備上述蛋白、多肽類藥物緩釋微球的制劑的方法，包括如下步驟:
(I)生物活性玻璃的制備
1)取2.98份的濃硝酸與22.35份的乙醇混合均勻，得到溶液I；
2)溶液I加入24.17份的正硅酸乙酯，100rmp預水解30min，得到溶液2;
3)向溶液2中再加入1.7份的P2O5,100rmp攪拌30min，得到溶液3 ； 4)向溶液3中加入17份的四水硝酸鈣，100rmp攪拌Ih，充分溶解形成清澈溶膠；
5)將步驟4)中制備好的溶膠倒入燒杯，置60°C烘箱中72h，形成凝膠；
6)將步驟5)中得到的凝膠在130 0C干燥72h;
7)將步驟6)所得凝膠球磨、篩分，并將所得的干凝膠粉在700°C煅燒得到生物活性；
(2)蛋白、多肽緩釋微球的制備
1)將蛋白、多肽類藥物溶解于水或者緩沖液中，備用；
2)將生物活性玻璃加入到步驟I的水相中，渦旋混勻，作為內(nèi)水相；
3)將聚乳酸類生物材料用有機溶劑溶解，并加上SpanSO混勻作為有機相，備用;所述的有機溶劑包括二氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯等；
4 )將步驟2)的內(nèi)水相加入到步驟3)的有機相中，使內(nèi)水相和有機相混勻，然后在2000rpm磁力攪拌下得到初乳；
5)將上述初乳，加入到1ml的1%-2%(w/v)的聚乙烯醇水溶液中，在4000-6000rpm的轉(zhuǎn)速下高速攪拌2min，得到復乳；
6)將復乳加入到90ml的0.1%-0.3%(?八)的聚乙烯醇溶液中，在20-40°(:的溫度下，在2000-4000rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌3-5小時后揮干有機溶劑，離心收集微球，用注射用水洗滌，冷凍干燥，制得蛋白、多肽類藥物緩釋微球。
[0012]對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在制備生物活性玻璃時，能根據(jù)原料的量來調(diào)節(jié)生物活性玻璃中S12: CaO: P2O5的比例。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點是:在采用乳化溶劑揮干的方法制備蛋白類、多肽類藥物緩釋微球制備過程中，復合無機生物醫(yī)學材料-生物活性玻璃，通過調(diào)整生物活性玻璃的組成的比例，達到與聚乳酸類生物降解材料近似于同步的降解速率，通過碳酸羥基磷灰石的緩慢形成來中和聚乳酸類生物降解材料緩慢降解過程中產(chǎn)生的低PH，從而同步提高蛋白、多肽類藥物在微球儲存和釋放過程中的穩(wěn)定性。
【附圖說明】
[0014]
圖1是根據(jù)實施例1制備的溶菌酶無機、有機復合緩釋微球的體外釋放曲線圖。
[0015]圖2是根據(jù)實施例1制備的溶菌酶無機、有機復合緩釋微球的體外釋放過程中的活性保持測定圖。
[0016]圖3是根據(jù)實施例1制備的重組人干擾素無機、有機復合緩釋微球的體外釋放過程中樣品的UV⑶圖譜。
[0017]圖4是根據(jù)實施例1制備的重組人干擾素無機、有機復合緩釋微球的體外釋放過程中樣品的FTIR圖譜。
[0018]
實施實例
本發(fā)明通過以下實施實例作更詳細的描述，但不能將其解釋為限