氯福克酚用于制備治療人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物的用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了氯福克酚用于制備治療人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物的用途，其中氯福克酚是一種治療上呼吸道感染藥物，其相對于人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞及人正常星形膠質(zhì)細胞、人胚腎細胞，人神經(jīng)干細胞，可顯著特異性抑制膠質(zhì)瘤干細胞活性，且經(jīng)氯?？朔犹幚砗竽z質(zhì)瘤干細胞的自我更新、腫瘤球形成、裸鼠體內(nèi)成瘤能力也明顯降低。體內(nèi)實驗，利用斑馬魚膠質(zhì)瘤移植瘤模型、裸鼠膠質(zhì)瘤移植瘤模型，在體驗證該藥物對膠質(zhì)瘤的治療效果。具體而言，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)用于治療上呼吸道感染藥物——氯?？朔涌赏ㄟ^靶向性抑制膠質(zhì)瘤干細胞達到用于制備治療人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物目的。本發(fā)明為人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供了新的治療藥物。
【專利說明】
氯福克酚用于制備治療人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及腫瘤治療領(lǐng)域，具體涉及氯?？朔佑糜谥苽渲委熑松窠?jīng)膠質(zhì)瘤的藥物 的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的來源于神經(jīng)上皮的原發(fā)性顱內(nèi)惡性腫瘤，其惡性程度高、 生長迅速、浸潤性強，具有高發(fā)病率的特點。雖然目前腫瘤綜合治療技術(shù)已取得長足進步， 但因其位于腦部重要位置，且伴隨微血管增生，呈現(xiàn)明顯的浸潤性生長等特點，傳統(tǒng)的手 術(shù)、放療都無法徹底根治，而導(dǎo)致其復(fù)發(fā)率高、病死率高和治愈率低。目前臨床上化療的藥 物以烷基化藥物為主，但傳統(tǒng)烷化劑副作用大，易產(chǎn)生耐藥性；新型烷化劑替莫唑胺 (temozo I omi de，TMZ)雖毒副作用小，且長時間用藥耐受性好，但TMZ治療后引起的骨髓增生 異常綜合征（my elodysplastic syndrome，MDS)、急性髓性白血?。╝cute myeloid leukemia，AML)以及急性成淋巴細胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)的報 道與日倶增，具體原因也在進一步研究中。因此，尋找新一代治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的有效藥物， 改善神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療迫在眉睫。
[0003] 近年來，科學(xué)家們結(jié)合膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展的機理，在其新藥探索與開發(fā)方面做出 了諸多努力。研究顯示，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展主要與RTK/RAS/PI3K通路，p53通路，RB通路 中的相應(yīng)關(guān)鍵分子的異常表達或突變相關(guān)。因而近年來的研究都在開發(fā)相應(yīng)的藥物分子的 抑制劑用以抵消某種關(guān)鍵分子的作用效果，但都只是在臨床前研究結(jié)果中表現(xiàn)出強的治療 前景，在I、Π 期臨床結(jié)果，或是批準(zhǔn)上市后表現(xiàn)得不盡人意或療效頗微。如EGFR的抑制劑： 吉非替尼和埃羅替尼被證實患者服用后極易產(chǎn)生耐藥，而且有療效的患者非常罕見，并且 病人服用之后無進展生存期皆未有所延長。同時EGFR/Her2抑制劑拉帕替尼，EGFR的單克隆 抗體西妥昔單抗都被證實對膠質(zhì)瘤的治療效果頗微;除此以外還有mTOR相關(guān)抑制劑:雷帕 霉素、替西羅莫司、依維莫司、地磷莫司，脫乙酰酶(Histone deactyIase，HDAC)抑制劑:伏 立諾他等單獨治療或與替莫唑胺聯(lián)合治療都被證實沒有或只有極小的作用效果。與此同 時，研究還針對膠質(zhì)瘤微血管形成豐富的特點，開發(fā)了被證實有部分效果的抗血管生成的 分子如貝伐單抗、西地尼布，它們可以快速的減少癌旁水腫，有效的延長了患者的無進展生 存期，但是也無法逆轉(zhuǎn)病程的進展。接受抗血管療法的患者最終也無法成功治愈，還是無法 改變大多數(shù)患者在診斷后數(shù)月死亡的現(xiàn)狀。總體而言，盡管國內(nèi)外科學(xué)家，藥物公司在膠質(zhì) 瘤的新藥探索中付出諸多人力物力，目前都沒有找到一種新的，有效的藥物分子。由于膠質(zhì) 瘤復(fù)雜的發(fā)病機制，目前我們尚不知道在不同發(fā)病機理導(dǎo)致的膠質(zhì)瘤患者中哪個關(guān)鍵分子 需要被抑制。此外，另一些科學(xué)家提出，膠質(zhì)瘤組織內(nèi)細胞存在異質(zhì)性，以上探索的藥物分 子之所以結(jié)果頗微，可能與我們沒有針對對膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展起到重要作用的細胞類型 有關(guān)。
[0004] 1994年，Lapidot等從白血病患者身上首次分離獲得腫瘤干細胞，腫瘤干細胞理論 逐漸被接受。隨后Singh等在膠質(zhì)瘤中分離得到極少數(shù)具有自我更新及分化能力的CD133+ 膠質(zhì)瘤干細胞，且其相對于CD133_的細胞具有更強的體內(nèi)成瘤能力，僅100個細胞就可在裸 鼠內(nèi)誘導(dǎo)形成腫瘤。Jian Chen等通過細胞體內(nèi)示蹤技術(shù)，從在體的水平，證明了膠質(zhì)瘤干 細胞的存在。隨著研究的深入，膠質(zhì)瘤干細胞的特點性質(zhì)，以及與膠質(zhì)瘤的關(guān)系逐漸被揭 示。研究表明膠質(zhì)瘤干細胞是膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的根本原因，且膠質(zhì)瘤干細胞可通過激活Wnt 信號通路誘導(dǎo)腫瘤血管形成，增強腫瘤的低氧應(yīng)激以及侵襲能力等。不僅如此，Bao等證實 膠質(zhì)瘤干細胞也能產(chǎn)生放化療抗性。然而，目前神經(jīng)膠質(zhì)瘤的化療藥物只針對整個腫瘤組 織，病人在接受一段時間的治療后，腫瘤組織縮小取得一定的效果，但是對化療產(chǎn)生抵抗的 膠質(zhì)瘤干細胞可通過增殖和分化進一步形成新的腫瘤組織，從而促使腫瘤復(fù)發(fā)。由此可見， 膠質(zhì)瘤干細胞與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，及放化療抗性的形成，腫瘤的復(fù)發(fā)息息相關(guān)，是膠質(zhì)瘤 難以攻克的一個重要因素。因此，我們設(shè)想，是否可以通過獲得靶向性膠質(zhì)瘤干細胞的藥 物，并結(jié)合傳統(tǒng)的放化療，達到最終徹底消滅整個腫瘤組織的目的。
[0005] 近幾年，國內(nèi)外科學(xué)家分別在不同腫瘤中報道了幾種能靶向腫瘤干細胞的藥物， 其中包括一些新的藥物分子和已在臨床上使用的藥物分子。如天然的多酚白藜蘆醇，具有 抗菌活性的離子載體鹽霉素，衣霉素，滅絳蟲活性的藥物氯硝柳胺，以及用以治療糖尿病的 藥物二甲雙胍及用以治療肝癌的藥物索拉非尼，都利用裸鼠成瘤模型，驗證了藥物相對于 目前的一線藥物TMZ更具抑瘤效果。但是以上藥物都無法在保證安全性的前提下，發(fā)揮靶向 腫瘤干細胞的功能，因而效果有限。
[0006] 氯福克酚是一種抗菌藥物，主要用于治療有革蘭氏陽性菌引起的上呼吸道，耳， 鼻，喉的感染。目前，主要用于法國和意大利，其首先法國在1980年期間批準(zhǔn)上市。該要對革 蘭氏陽性菌的抑制可能是通過抑制胞壁質(zhì)的合成、影響能量代謝實現(xiàn)的，但它不影響DNA、 RNA及蛋白的合成。而革蘭氏陰性菌對氯福克酚的抵抗可能是由于其不能通過革蘭氏陰性 菌外膜的原因。其給藥方式為口服及直腸栓劑（1.5g/人，每日，主要給藥方式)置肛給藥的 方式。臨床觀察結(jié)果顯示，該藥物的副作用不大，但在該藥物使用過程中，部分患者會出現(xiàn) 斑狀丘疹或直腸擴張等副作用。目前對于氯福克酚的報道，主要集中于其對革蘭氏陽性菌 的抑制，及在上呼吸道感染后的治療。而在2014年有一篇文獻由蘇州大學(xué)和約翰霍普金斯 醫(yī)學(xué)院合作的文章報道了氯福克酚可以通過誘導(dǎo)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、抑制細胞蛋白翻譯及細 胞周期阻滯等發(fā)揮對前列腺癌的抑制作用，如此揭示了氯?？朔拥囊至鲎饔?。
[0007] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)相對于膠質(zhì)瘤細胞株、人正常星形膠質(zhì)細胞株、人胚腎細胞，人神經(jīng)干 細胞，氯?？朔釉诩毎綄嶒炇曳蛛x得到的四株膠質(zhì)瘤干細胞株具有特異性抑制效 果。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明從細胞水平驗證了氯?？朔涌商禺愋砸种颇z質(zhì)瘤干細胞的自我更 新能力，腫瘤球形成能力;并通過斑馬魚、裸鼠膠質(zhì)瘤移植模型驗證了氯?？朔訉δz質(zhì)瘤的 治療效果。由此，氯?？朔訉⒑苡锌赡艹蔀樯窠?jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供新的有力治療藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 基于上述目的，本發(fā)明提供了一種氯?？朔佑糜谥苽渲委熑松窠?jīng)膠質(zhì)瘤的藥物的 用途。
[0009] 在一個具體的實施方案中，所述藥物通過抑制膠質(zhì)瘤干細胞的細胞活性以治療所 述人神經(jīng)膠質(zhì)瘤。
[0010] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述藥物通過抑制膠質(zhì)瘤干細胞的自我更新、腫瘤球 形成，及體內(nèi)腫瘤形成的能力以治療所述人神經(jīng)膠質(zhì)瘤。
[0011] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述藥物通過誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細胞凋亡以治療所述人神 經(jīng)膠質(zhì)瘤。
[0012] 在一個可選的實施方案中，所述膠質(zhì)瘤干細胞包括但不限于：U87MG SLC、 U251SLC、GSC2、GSC5。
[0013] 在一個可選的實施方案中，所述藥物還通過抑制膠質(zhì)瘤細胞以治療所述人神經(jīng)膠 質(zhì)瘤。
[0014] 在一個可選的實施方案中，所述膠質(zhì)瘤細胞包括但不限于:U251、U87MG、N3。
[0015] 在一個可選的實施方案中，所述人神經(jīng)膠質(zhì)瘤處于I到IV級。
[0016] 術(shù)語的定義
[0017] "膠質(zhì)瘤干細胞"：存在于膠質(zhì)瘤組織內(nèi)存在的一類極少數(shù)的具有自我更新能力， 多項分化能力，體內(nèi)成瘤能力的細胞，它與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，復(fù)發(fā)以及膠質(zhì)瘤對放療化療 抗性形成密切相關(guān)。
[0018] "MTS方法"：一種用比色法來檢測細胞增殖和細胞毒實驗中的活細胞數(shù)量的檢測 試劑。MTS是一種新型四唑化合物，PMS是一種電子偶聯(lián)劑。PMS具有增強的化學(xué)穩(wěn)定性，這使 它可與MTS混合形成穩(wěn)定的溶液。MTS被細胞生物還原成為一種有色的甲臜產(chǎn)物，可直接溶 解于培養(yǎng)基中。這種轉(zhuǎn)化很可能是在代謝活躍的細胞中的脫氫酶產(chǎn)生的NADPH或NADH的作 用下完成的。在490nm處檢測到的甲臜產(chǎn)物的量與培養(yǎng)中的活細胞數(shù)成正比。
[0019] "相對細胞存活率"：運用據(jù)上MTS方法檢測吸光度值后，根據(jù)吸光值A(chǔ)計算相對細 胞存活率，相對細胞存活率=(實驗組A/對照組A) X 100%。
[0020] "自我更新"：指干細胞(此處特指膠質(zhì)瘤干細胞)通過對稱或者不對稱分裂產(chǎn)生至 少一個保留干細胞特性子細胞的過程，自我更新能夠維持干細胞具有多分化的潛能，對于 組織特異性干細胞而言，自我更新是維持其終生具有分化潛能的基礎(chǔ)。
[0021] "腫瘤球形成能力"：指腫瘤干細胞(此處特指膠質(zhì)瘤干細胞)在體外含EGF，bFGF的 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，會形成腫瘤球的能力。
[0022] 綜上，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)臨床藥物氯?？朔涌捎糜谥苽渲委熑松窠?jīng)膠質(zhì)瘤的藥物，從而 為人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供新的有力藥物，具有顯著的社會效益和經(jīng)濟效益。
【附圖說明】
[0023] 圖1:氯?？朔犹禺愋砸种颇z質(zhì)瘤干細胞的細胞活性。MTS(四唑化物)方法檢測氯 ?？朔釉诓煌瑵舛龋ī?3以]?、1以]\1、3以]\1、1(^]\1、3(^]\〇下對四株膠質(zhì)瘤干細胞株(1]87]\?；31^(：、 1]2513^：、6302、6305)，三株膠質(zhì)瘤細胞株〇]251、1]871?；、似(從病人腫瘤組織分離得到的原 代膠質(zhì)瘤細胞））、三種人正常細胞株（人正常星形膠質(zhì)細胞（HA)、人神經(jīng)干細胞 (Hlp56NSC)、人胚腎細胞(293ET))作用48小時后細胞存活率，"--"表示Ι(^Ι>10 6μΜ。
[0024] 圖2Α和圖2Β:氯?？朔犹禺愋砸种颇z質(zhì)瘤干細胞。將帶由綠色熒光標(biāo)記的GSC2-GFP(圖2Α)或U87MG SLC-GFP(圖2Β)與不帶熒光標(biāo)記的HA 1:1混勻于體系中，而后氯?？朔?分別在1以1、3以1、1(^1、3(^1濃度下作用24小時，而后流式細胞儀分析不同處理組下存活細 胞中GSC2-GFP或U87MG SLC-GFP及HA的比例，并結(jié)合共培養(yǎng)模型在不同濃度、不同作用時間 下的細胞存活率，統(tǒng)計分析共培養(yǎng)模型中各細胞成分的相對細胞存活率。
[0025]圖3A至圖3H:氯?？朔右种颇z質(zhì)瘤干細胞腫瘤球的生長與維持。96孔細胞培養(yǎng)皿 中每孔加入IOOyL含5000個GSC2的單細胞懸浮液，自然生長4天后，吸去原培養(yǎng)基，每孔加入 含各濃度藥物的IOOyL新鮮培養(yǎng)基，并使其藥物濃度分別為:ΟμΜ(對照，圖3A)、0.03μΜ(圖 3B)、0·lμM(圖3C)、0·3μM(圖3D)、lμM(圖3E)、3μM(圖3F)、10μM(圖3G)、30μM(圖3H)，藥物作 用時間為48小時，利用體外實驗?zāi)M臨床上膠質(zhì)瘤干細胞形成腫瘤后檢測氯?？朔拥囊种?效果。氯?？朔涌娠@著減小腫瘤球的體積、數(shù)量，且低濃度(〇.〇3μΜ、0.1μΜ)6302可長出突 起，呈現(xiàn)明顯的分化樣特征，高濃度下（1〇μΜ、30μΜ)，可使腫瘤球邊緣細胞死亡并直至整個 腫瘤球;圖3Α至圖3Η為光鏡下檢測形態(tài)改變。
[0026]圖4:圖3Α至圖3Η中實驗的數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果。
[0027]圖5:氯?？朔右种颇z質(zhì)瘤干細胞的自我更新能力。將GSC5細胞稀釋為25、50、100、 200個/100yL，氯福克酚在1以1、3以11、1(^1、3(^1濃度下處理2周，而后統(tǒng)計無腫瘤球孔百分 比，縱坐標(biāo)表示無腫瘤球孔百分比的對數(shù)值。
[0028]圖6A和圖6B:氯?？朔訉δz質(zhì)瘤干細胞的作用效果一定程度上是不可逆的。藥物 處理GSC2 24小時，48小時后分別撤藥物，換上新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時后利用MTS的方 法檢測各處理組細胞存活率，并比較其與一直用藥物處理組的細胞活性改變。"1天"、"2天" 表示藥物處理24小時或48小時后MTS檢測；"藥物繼續(xù)作用"表示藥物處理24小時、48小時后 撤藥物，并繼續(xù)加入相應(yīng)藥物濃度的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時后MTS檢測；"撤去藥物"表示藥 物處理24小時、48小時后撤藥物，并加入不含藥物的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時后MTS檢 測 。
[0029]圖7A和圖7B:氯福克酚在30μΜ濃度下，可明顯抑制其裸鼠原位腫瘤球形成能力。氯 ?？朔釉?0μΜ濃度下對GSC2預(yù)處理時間24小時，而后收集活細胞，取部分細胞臺盼藍染色 后細胞計數(shù)，細胞顱內(nèi)成瘤，IO 5個活細胞/只（5只裸鼠），并設(shè)置DMSO對照組（5只裸鼠）， DMSO處理組（圖7Α)，及氯?？朔宇A(yù)處理組（圖7Β)裸鼠原位成瘤后HE染色結(jié)果。
[0030] 圖8A和圖8B:氯?？朔涌娠@著抑制斑馬魚膠質(zhì)瘤移植瘤模型的腫瘤生長。48小時 斑馬魚胚胎的卵黃囊內(nèi)注射3000個帶有綠色熒光標(biāo)記的U87MG SLC-GFP，自然生長48小時 后，氯?？朔?〇μΜ濃度下對其治療48小時（圖8B)，熒光顯微鏡檢測斑馬魚卵黃囊部位綠色 熒光的強弱，用以判斷氯?？朔訉Π唏R魚移植瘤模型的抑瘤效果，圖8Α為對照組。
[0031] 圖9Α至圖9C:氯?？朔涌娠@著抑制斑裸鼠移植瘤模型的腫瘤生長，且副作用較小。 將GSC2細胞接種于15只5周大的Balb/C裸鼠腋下皮下，接種數(shù)目為IO 5個/只，當(dāng)裸鼠皮下腫 瘤長至約IOOmm3，將其分為DMSO組、及氯?？朔铀幬锝o藥組，給藥劑量為20mg/kg，腹腔注射 給藥，給藥時間為11天，期間記錄兩組裸鼠腫瘤的體積（圖9A和圖9B)及體重（圖9C)變化。
[0032] 圖10A-1至圖10A-5:氯?？朔涌烧T導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細胞凋亡。氯?？朔釉讦苔?對照，圖 IOA-1)、ΙμΜ(圖 10Α-2)、3μΜ(圖 10Α-3)、1 ΟμΜ(圖 10Α-4)、30μΜ(圖 10Α-5)濃度下處理GSC2 12 小時后，AnnexinV/PI雙染，流式分析各處理組內(nèi)細胞的凋亡情況，圖10Α-1至圖10Α-5中 (門：P2)發(fā)現(xiàn)氯?？朔涌擅黠@誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細胞的凋亡。
[0033] 圖10B-1至圖10B-5:氯福克酚可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細胞凋亡。氯?？朔釉讦苔?對照，圖 10Α-1)、1μΜ(圖 10Α-2)、3μΜ(圖 10Α-3)、10μΜ(圖 10Α-4)、30μΜ(圖 10Α-5)濃度下處理 24 小時 后，AnnexinV/PI雙染，流式分析各處理組內(nèi)細胞的凋亡情況，圖10Β-1至圖10Β-5中（門： P2)發(fā)現(xiàn)氯?？朔涌擅黠@誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細胞的凋亡。
【具體實施方式】
[0034] 下面將通過下述非限制性實施例進一步說明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在不 背離本發(fā)明精神的情況下，可以對本發(fā)明做出許多修改，這樣的修改也落入本發(fā)明的范圍。
[0035] 下述實驗方法如無特別說明，均為常規(guī)方法，所使用的實驗材料如無特別說明，均 可容易地從商業(yè)公司獲取。
[0036] 實施例1:MTS法檢測細胞存活率
[0037] (1)按照產(chǎn)品說明書配制以下溶液：
[0038] a、DPBS:依次加入0 · 2gKCl，8 · OgNaCl，0 · 2gKH2P〇4，1 · 15gNa2HP〇4至IL，調(diào)pH至 7.35，之后加入0.1 gMgCl2.6H20,充分混勻至溶液清澈后，加入0.133gCaCl2.2H 20后，在此充 分混勻至溶液清澈。用0.2μΜ濾器過濾除菌兩次后，分裝保存在4°C ;
[0039] b、PMS溶液的配制：使用DPBS配制0.92mg/mL的PMS溶液，用0.2μΜ濾器過濾除菌兩 次后，分裝于用錫泊紙包裹好的EP管中，避光保存-20°C ;
[0040] c、MTS溶液的配制:按照Img MTS粉末用0.5mL DPBS來溶解的比例配制，輕輕混勻， 約15min，至MTS完全溶解。測量pH，使其保存在6.0-6.5之間。用0.2μΜ濾器過濾除菌兩次后， 分裝于用錫泊紙包裹好的EP管中，避光保存-20°C ;
[0041 ] d、MTS/PMS溶液的配制：分別融化MTS和PMS，37°C孵育15min，之后按照4 · 2mg MTS 粉末溶于2. ImL DPBS中，使用時加入0.1 mL PMS的比例來配制。
[0042] (2)對于氯?？朔訉δz質(zhì)瘤干細胞細胞活性的影響檢測，實驗用96孔細胞培養(yǎng)板 用100ug/mL多聚賴氨酸包被過夜，次日生理鹽水洗兩遍，晾干后待用。將細胞消化后重懸為 單細胞懸液，細胞計數(shù)，鋪于96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)（U87MG SLC(5000個/孔）、U251SLC(10000 個/孔）、GSC2(10000個/孔）、GSC5(10000個/孔）），生長過夜。次日加入氯?？朔?購自美國 MicroSource公司），其化學(xué)式如式I所不，氯?？怂峄瘜W(xué)分子式為C21H26CI2O,結(jié)構(gòu)簡式為 <：1。1。。（<：1)。。。1(：。2。。（。。。20)(：((：)((：)(：(：((：)((：)(：，其系統(tǒng)名稱為2-[(2,4-dichlorophenyl )methyl ]_4_(2，4，4_trimethylpentan-2-yl )phenol。并設(shè)置如下濃度梯 度:0.3μΜ、ΙμΜ、3μΜ、ΙΟμΜ、30μΜ，每個藥物濃度3個復(fù)孔，作用48小時。
[0043]
[0044] (3)對于三株膠質(zhì)瘤細胞株(U251 (購自美國ATCC)、U87MG(購自美國ATCC)、Ν3(從 病人腫瘤組織分離得到的原代膠質(zhì)瘤細胞，獲贈于天壇醫(yī)院江濤老師實驗室））、三種人正 常細胞株(人正常星形膠質(zhì)細胞(ΗΑ，購自美國ATCC)、人神經(jīng)干細胞(Hlp56NSC，本實驗室建 立的細胞株）、人胚腎細胞(293ET，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞中心））則無需 包被實驗用96孔細胞進行包被。其細胞鋪板濃度均為:5000個/孔。其它操作如上。
[0045] (4)氯福克酚作用48小時后，根據(jù)需要配制相應(yīng)體積的MTS/PMS檢測液，然后按照 檢測液:培養(yǎng)基=1:5的比例加入無血清培養(yǎng)基。最終每孔體系120yL，37°C，5%C02孵育2小 時。根據(jù)MTS還原后產(chǎn)生的甲臜產(chǎn)物的吸光度光譜，在吸收峰490nm讀取數(shù)據(jù)。并減去630nm 所讀取的數(shù)據(jù)，用以減去細胞碎片等造成的噪音值，以及其它非特異性吸光度值。
[0046] (5)根據(jù)吸光值A(chǔ)計算細胞存活率，細胞存活率=(實驗組A/對照組）X 100%。計算 IC50值，并繪制劑量反應(yīng)曲線。
[0047] 結(jié)果見圖1，氯?？朔犹禺愋砸种颇z質(zhì)瘤干細胞的細胞活性。
[0048]實施例2:真核細胞慢病毒感染
[0049] 具體步驟如下：
[0050] (1)感染前將GSC2、U87MG SLC、HA細胞消化為單細胞懸液，計數(shù)后以相應(yīng)密度（1-3 X IO5個/mL)接種于6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，體系為2mL，讓GSC2、U87MG SLC自然生長2小時，HA細 胞自然生長直至細胞貼壁(大約4小時）；
[0051] (2)分別往GSC2細胞培養(yǎng)基中加入帶有綠色熒光的含LV3載體(帶嘌呤霉素篩選標(biāo) 記），往U87MG SLC細胞培養(yǎng)基中加入帶有綠色熒光的含pLenti6載體帶殺稻瘟素 (Blasticidin)篩選標(biāo)記，購自Promega公司）的慢病毒2yL，往HA細胞培養(yǎng)基中加入帶有紅 色熒光的慢病毒(不帶篩選標(biāo)記)2yL，充分混勻，過夜培養(yǎng)；
[0052] (3)次日上午，移去含病毒培養(yǎng)基，各加入新鮮培養(yǎng)基2mL，讓其自然生長；
[0053] (4)48小時~72小時，熒光顯微鏡下觀察細胞，檢測是否有相應(yīng)熒光表達，以確定 是否感染成功；
[0054] (5)確定有熒光表達后，用相應(yīng)濃度的殺稻瘟素篩選穩(wěn)定表達綠色熒光的U87MG SLC細胞，用相應(yīng)濃度的嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達綠色熒光的GSC2細胞，并通過挑選單克隆的 方法篩選穩(wěn)定表達紅色熒光的HA細胞。
[0055]實施例3:流式細胞分析
[0056] 預(yù)先用lOOyg/mL的多聚賴氨酸包被6孔及96孔細胞培養(yǎng)板，37°C過夜，生理鹽水洗 兩遍，晾干。將穩(wěn)定表達綠色熒光的GSC2-GFP細胞及穩(wěn)定表達紅色熒光的HA細胞，消化為單 細胞，新鮮培養(yǎng)基重懸，細胞計數(shù)，均稀釋為5 X IO4個/mL，兩種細胞1:1充分混勻，分為五 管，分別加入氯福克酚，混勻，使其濃度分別為ΟμΜ、1μΜ、3μΜ、ΙΟμΜ、30μΜ。分別加入6孔細胞 培養(yǎng)板(2mL)及96孔細胞培養(yǎng)板（100yL，每組3個復(fù)孔），分別待其作用24小時，MTS方法檢測 96孔細胞培養(yǎng)板中各處理組細胞活性，并分別收集6孔細胞培養(yǎng)板中細胞，PBS洗兩遍，各用 IOOyL重懸細胞，流式分析各處理組活細胞中GSC2-GFP、HA-RFP所占比例。并結(jié)合共培養(yǎng)模 型經(jīng)藥物處理后細胞活性變化，統(tǒng)計分析共培養(yǎng)模型中各細胞成分的相對細胞存活率。共 培養(yǎng)模型--U87MG SLC-GFP+HA-RFP的操作如上；
[0057]結(jié)果見圖2A、圖2B，相對于人正常星形膠質(zhì)細胞，氯?？朔涌商禺愋缘囊种乒才囵B(yǎng) 模型中膠質(zhì)瘤干細胞的細胞活性。
[0058]實施例4:腫瘤球形成實驗
[0059] 96孔細胞培養(yǎng)皿包被后每孔加入IOOyL含5000個GSC2單細胞懸浮液，自然生長4天 后，吸去原培養(yǎng)基，每孔加入各濃度氯?？朔拥腎OOyL新鮮培養(yǎng)基，藥物濃度分別為:0.03μ Μ、0.1μΜ、0.3μΜ、1μΜ、3μΜ、10μΜ、30μΜ，藥物作用時間為處理48小時后鏡下觀察各處理組腫 瘤球的形態(tài)變化，并同時統(tǒng)計各處理組腫瘤球數(shù)目；
[0060]結(jié)果見圖3Α至圖3Η和圖4,利用該體外實驗?zāi)M臨床上膠質(zhì)瘤干細胞形成腫瘤后 檢測氯?？朔拥囊种菩Ч?，發(fā)現(xiàn)氯?？朔涌娠@著減小腫瘤球的體積、數(shù)量，且低濃度(0.03μ M、0. lyM)GSC2可長出突起，呈現(xiàn)明顯的分化樣特征，高濃度下（10μΜ、30μΜ)，可使腫瘤球邊 緣細胞死亡并直至整個腫瘤球。
[0061]實施例5:有限稀釋實驗 [0062] 步驟如下：
[0063] (1)將懸浮培養(yǎng)的GSC5腫瘤球細胞收集到15mL離心管中，加入0.5mL ACCUTASE酶 (購自sigma公司）37°C消化5mins，將細胞吹成單細胞，離心去上清；
[0064] (2)加入新鮮的Neurobasal培養(yǎng)基(購自gibco公司），并取部分細胞臺盼藍染色后 細胞計數(shù)；
[0065] (3)計算所需細胞液的體積，設(shè)置細胞濃度梯度，200，100，50，25個/孔，每種濃度 設(shè)置10個重復(fù)孔。設(shè)置DMSO對照組，及氯?？朔应苔?、1μΜ、3μΜ、ΙΟμΜ藥物處理組；
[0066] (4)將細胞接種于96孔板中，IOOyL/孔，37°C，5%C02，孵箱中培養(yǎng)，2周后統(tǒng)計無腫 瘤球孔的比例；
[0067] 結(jié)果見圖5,氯?？朔釉?μΜ、3μΜ、10μΜ濃度下可顯著抑制膠質(zhì)瘤干細胞克隆形成， 即能明顯抑制膠質(zhì)瘤干細胞的自我更新能力。
[0068]實施例6:回復(fù)試驗(Recovery assay)
[0069] (1)用100ug/mL多聚賴氨酸包被96孔細胞培養(yǎng)板
[0070] (2 )ACCUTASE酶將GSC5消化為單細胞，新鮮Neurobasal培養(yǎng)基重懸，將細胞鋪于預(yù) 先包被的96孔細胞培養(yǎng)板，過夜；
[0071] (3)加入氯福克酚，使其濃度為0.03以]?、0.1以]\1、0.3以]\1、1以]\1、3以]\1、1(^]\1、3(^]\1，每個濃 度9個復(fù)孔；
[0072] (4)作用24小時后，往每個濃度的3個復(fù)孔中加入20yL MTS/PMS混合試劑，檢測其 細胞活性。吸去其它6個復(fù)孔加藥培養(yǎng)基，往其中3個孔中加入新鮮培養(yǎng)基，另外3個復(fù)孔中 加入相同濃度的含氯?？朔优囵B(yǎng)基；
[0073] (5)繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，MTS檢測細胞活性。
[0074]藥物作用48小時，而后檢測恢復(fù)48小時的情況，操作如上。
[0075]結(jié)果見圖6A和圖6B，氯福克酚對膠質(zhì)瘤干細胞的作用效果一定程度上是不可逆 的。
[0076]實施例7:裸鼠原位成瘤
[0077] 收集經(jīng)氯?？朔?0μΜ度下預(yù)處理24小時后細胞，PBS洗兩遍，部分細胞臺盼藍染 色，細胞計數(shù)。取細胞原位注射于5~7周齡Balb/C裸鼠顱內(nèi)紋狀體，IO5個細胞/只，每組5 只，并設(shè)置DMSO對照組。
[0078]結(jié)果見表1、圖7A和圖7B，氯?？朔宇A(yù)處理膠質(zhì)瘤干細胞GSC2,可顯著抑制其裸鼠 原位成瘤能力。
[0079]表 1
L 0081J 實施例8:斑馬魚膠質(zhì)瘤移植模型給藥實驗
[0082] 往48小時斑馬魚胚胎的卵黃囊內(nèi)注射3000個帶有綠色熒光標(biāo)記的U87MG SLC-GFP，讓其自然生長48小時，利用熒光顯微鏡檢測斑馬魚體內(nèi)腫瘤形成情況，而后往斑馬魚 孵化液中加入氯福克酚，使其濃度為1〇μΜ，藥物處理48小時，熒光顯微鏡檢測斑馬魚卵黃囊 部位綠色熒光的強弱，用以判斷氯?？朔訉Π唏R魚移植瘤模型體內(nèi)腫瘤的抑制效果。
[0083]結(jié)果見圖8Α和圖8Β，氯?？朔涌娠@著抑制斑馬魚移植瘤模型體內(nèi)腫瘤的生長。 [0084] 實施例9:
[0085]裸鼠腋下皮下成瘤:將離心消化后的重懸于PBS的GSC2單細胞接種于15只5周大的 Balb/C裸鼠腋下皮下，接種數(shù)目為IO5個/只，記錄裸鼠的腫瘤大小(裸鼠腫瘤體積=長*寬2/ 2)，當(dāng)裸鼠皮下腫瘤長至約IOOmm3時，將其分為DMSO組、及氯?？朔铀幬锝o藥組，給藥劑量 為20mg/kg，腹腔注射給藥，給藥時間為11天，期間記錄兩組裸鼠腫瘤的體積及體重變化。 [0086]結(jié)果見圖9A至9C，氯福克酚可顯著抑制斑裸鼠移植瘤模型的腫瘤生長，且其副作 用較小。
[0087] 實施例10:AnnexinV/PI雙染檢測細胞凋亡
[0088] 具體步驟如下；
[0089] (1)氯?？朔釉?以]\1、3以]\1、1(^]\1、3(^]\1濃度下處理6302 12小時或24小時；
[0090] (2)收集細胞，PBS洗兩遍；
[0091] (3)取50yL 1*結(jié)合緩沖液(binding buffer)重懸細胞，使細胞密度約為1*106個/ mL ；
[0092] (4)加入2.5yL FTIC AnnexinV和2.5yL PI;
[0093] (5)避光情況下，室溫孵育15min;
[0094] (6)往體系中加入200yLl*結(jié)合緩沖液（binding buffer)，各處理管分別過細胞 篩；
[0095] (7)流式細胞儀分析；
[0096] 所用AnnexinV/PI雙染試劑盒購自BD pharmingen，產(chǎn)品批號為556547。
[0097] 結(jié)果見圖10A-1至圖10B-5,氯?？朔涌烧T導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細胞細胞凋亡。
[0098]綜上，本發(fā)明在細胞水平證實氯?？朔酉鄬τ谀z質(zhì)瘤細胞(U251、U87MG、N3(從病 人腫瘤組織分離得到的原代膠質(zhì)瘤細胞））、人正常星形膠質(zhì)細胞（HA)、人胚腎細胞 (293ET)，人神經(jīng)干細胞(H1P56NSC)對實驗室分離得到的四株膠質(zhì)瘤干細胞(U87MG SLC、 1]2513^：、6302、6305)具有明顯的特異性抑制效果(48小時作用的1(：5()值為：7.65~10.534 M)。并進一步通過克隆形成實驗，腫瘤球抑制實驗，原位成瘤實驗等證實氯?？朔涌擅黠@抑 制膠質(zhì)瘤干細胞的自我更新，腫瘤球形成及腫瘤形成能力。而后本發(fā)明利用斑馬魚膠質(zhì)瘤 移植瘤模型、裸鼠膠質(zhì)瘤皮下移植瘤模型，在體水平證明了氯?？朔訉δz質(zhì)瘤的治療作用。 且本發(fā)明發(fā)現(xiàn)氯?？朔用黠@的誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細胞細胞凋亡，在一定程度上解釋了氯?？朔?發(fā)揮對膠質(zhì)瘤干細胞抑制作用及其發(fā)揮對膠質(zhì)瘤抑瘤效果的機制。
[0099]因此，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)臨床藥物氯?？朔涌赏ㄟ^抑制人神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞達到治 療人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的目的。眾所周知，小分子化合物在體內(nèi)發(fā)揮功能都需倚靠相關(guān)的關(guān)鍵基 團，而在此基礎(chǔ)上其它基團的改變雖能產(chǎn)生不同的化合物，但也能發(fā)揮其目的功能。因此， 任何在此基礎(chǔ)上對氯?？朔拥男揎?，修改后達到與本發(fā)明相同效果的研究均用于本發(fā)明。
【主權(quán)項】
1. 氯?？朔佑糜谥苽渲委熑松窠?jīng)膠質(zhì)瘤的藥物的用途。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的氯?？朔佑糜谥苽渲委熑松窠?jīng)膠質(zhì)瘤的藥物的用途，其中所 述藥物通過抑制膠質(zhì)瘤干細胞的細胞活性以治療所述人神經(jīng)膠質(zhì)瘤。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的氯?？朔佑糜谥苽渲委熑松窠?jīng)膠質(zhì)瘤的藥物的用途，其中所 述藥物通過抑制膠質(zhì)瘤干細胞的自我更新、腫瘤球形成，及體內(nèi)腫瘤形成的能力以治療所 述人神經(jīng)膠質(zhì)瘤。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的氯?？朔佑糜谥苽渲委熑松窠?jīng)膠質(zhì)瘤的藥物的用途，其中所 述藥物通過誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細胞凋亡以治療所述人神經(jīng)膠質(zhì)瘤。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的氯?？朔佑糜谥苽渲委熑松窠?jīng)膠質(zhì)瘤的藥物的 用途，其中，所述膠質(zhì)瘤干細胞包括但不限于:U87MG SLC、U251SLC、GSC2、GSC5。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的氯?？朔佑糜谥苽渲委熑松窠?jīng)膠質(zhì)瘤的藥物的用途，其中所 述藥物還通過抑制膠質(zhì)瘤細胞以治療所述人神經(jīng)膠質(zhì)瘤。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的氯?？朔佑糜谥苽渲委熑松窠?jīng)膠質(zhì)瘤的藥物的用途，其中，所 述膠質(zhì)瘤細胞包括但不限于:U251、U87MG、N3。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的氯福克酚用于制備治療人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物的用途，其中，所 述人神經(jīng)膠質(zhì)瘤處于I到IV級。
【文檔編號】A61K31/055GK105943522SQ201610333673
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月19日
【發(fā)明人】彭小忠, 胡艷, 韓為, 強伯勤
【申請人】中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所